Elektronový transport a oxidativní fosforylace

Transkript

1 Elektronový transport a oxidativní fosforylace Mitochondrie Elektronový transport xidativní fosforylace Kontrolní systém oxidativního metabolismu. Moto: dpočívající lidské tělo spotřebuje asi 420 kj energie za hodinu, což odpovídá spotřebě 100 W žárovky. 51 Energie se získává elektrochemicky v mitochondriích při napětí 0, 2 V (v el. síti 220 V), ale proud odpovídá 500 Amp, což reprezentuje transmembránový pohyb přibližně 3 x protonů za sekundu. Tento pohyb vede k tvorbě ATP.

2 Mitochondrie Mitochondrie jsou místem eukaryotního oxidačního metabolismu. Mitochondrie obsahují: Pyruvátdehydrogenasu, enzymy citrátového cyklu, enzymy katabolismu mastných kyselin a enzymy, spolu s proteiny, elektronového transportního řetězce a oxidativní fosforylace. 52

3 Mitochondrie Vn j membr na Vnit n membr na Kristy Matrix Mezimembr nov prostor Drsn endoplazmatick retikulum 53

4 Mitochondriální transportní systém Vnější mitochondriální membrána, stejně jako bakteriální, obsahuje poriny, proteiny, které dovolují volnou difůzi molekul do 10 kd. Je tedy ekvivalentní s cytosolem. Vnitřní membrána, která je hmotnostně složena ze 75 % z proteinů, volně propouští 2, C 2 a 2. Jinak obsahuje řadu transportních proteinů, které kontrolují průchod metabolitů jako jsou ATP, ADP, pyruvát, Ca 2+ a fosfát. Redukované ekvivalenty (NAD) se transportují z cytosolu do mitochondrie, buď malát-aspartátovým člunkem nebo glycerol-3-fosfátovým člunkem. 54 NAD transportované glycerol-3-fosfátovým člunkem poskytuje po oxidaci jen 2 ATP!

5 Malát-aspartátový člunek - C C Cytosol Vnit n mitochondrion ln membr na Mitochondrie - C C C - NAD + Mal t Mal t C - NAD + Mal tdehydrogenasa NAD - C Mal tdehydrogenasa NAD - C C xaloacet t xaloacet t C C - Aminokyselina Aspart taminotransferasa C - Aminokyselina Aspart taminotransferasa - Ketokyselina - C Aspart t Aspart t - Ketokyselina - C + 3 N C + 3 N C C - C - 55 Glukoneogeneze PEP PEP

6 Glycerol-3-fosfátový člunek: NAD NAD + Cytosolick glycerol- 3- fosf t dehydrogenasa C C 2- P 3 2- P 3 Dihydroxyacetonfosf t Cytosol Glycerol- 3- fosf t Mitochondrion ln glycerol- 3- fosf t dehydrogenasa E- FAD 2 E- FAD Q 2 Q Vnit n mitochondri ln membr na 56 Matrix

7 Translokátor ADP ATP Většina v mitochondrii vytvořeného ATP se využívá v cytoplasmě. Vnitřní mitochondriální membrána obsahuje ADP-ATP translokátor transportující ATP do cytosolu a ADP z cytosolu do mitochondrie. Translokátor je dimer identických 30 kd podjednotek s jedním vazebným místem pro ADP i ATP, které vzájemně kompetují. Translokátor mění konformaci při vazbě buď ADP nebo ATP. 57 Export ATP (4 záporné náboje) proti importu ADP (3 záporné náboje) je elektrogenní antiport poháněný rozdílem membránového potenciálu.

8 Konformační změny ADP-ATP translokátoru CYTSL MI TCNDRI E ATP / ADP ATP / ADP 58 KNFRMACE 2 KNFRMACE 1

9 Transport fosfátů K syntéze ATP z ADP a P i je nutné transportovat fosfát z cytosolu do mitochondrie. Fosfátový nosič lze charakterizovat jako elektrochemický P i - symport poháněný rozdílem ( p) (transmembránový protonový gradient). Vytvořený transmembránový protonový gradient nevede pouze k syntéze ATP, ale také k transportu ADP a P i. 59

10 Termodynamika elektronového transportu. Elektronové nosiče přenášející elektrony z NAD a FAD 2 na kyslík jsou lokalizovány ve vnitřní mitochondriální membráně. xidace NAD je silně exergonická. Měřítkem afinity substrátu k elektronům je standardní redukční potenciál (ξ o ). Čím vyšší hodnota, tím větší afinita k elektronům. Poloreakce oxidace NAD kyslíkem jsou: NAD e - NAD ξ o = - 0, 315 V ½ e - 2 ξ o = 0, 815 V NAD je donor elektronů, 2 akceptor. Celková reakce: ½ 2 + NAD 2 + NAD + 60 ξ o = 0, 815 V (-0, 315 V) = 1, 130 V!!!

11 xidace NAD ve vnitřní mitochondriální membráně xidace NAD poskytuje G o = kj.mol -1 volné energie. K syntéze jednoho molu ATP z ADP a P i je třeba 30, 5 kj.mol -1. Energetický rozdíl G o = kj.mol -1 nelze přímo převést na několik ATP. Ve vnitřní mitochondriální membráně je soustava tří proteinových komplexů přes které putují elektrony z NAD ke kyslíku. Celková volná energie je tak rozdělena na tři menší části z nichž každá se podílí na tvorbě ATP oxidativní fosforylací. xidace NAD poskytne přibližně 3 ATP. 61 Termodynamická efektivita za standardních biochemických -1-1).

12 Komplexy sekvence elektronového transportu Komplexy jsou řazeny podle vzrůstajícího redukčního potenciálu. Komplex I: Katalyzuje oxidaci NAD koenzymem Q (CoQ). NAD CoQ (oxidovaný) NAD + + CoQ (redukovaný) ξ o = 0, 360 V; G o = - 69, 5 kj.mol -1 Komplex III: Katalyzuje oxidaci CoQ (red.) cytochromem c. CoQ (redukovaný) + 2 cytochrom c (oxidovaný) CoQ (oxidovaný) + 2 cytochrom c (redukovaný) ξ o = 0, 190 V; G o = - 36, 7 kj.mol -1 Komplex IV: Katalyzuje oxidaci redukovaného cytochromu c kyslíkem terminálním akceptorem elektronů. 2 cytochrom c (red.) + ½ 2 2 cytochrom c (oxid.) ξ o =0, 580 V; G o = kj.mol -1.

13 Komplex II. Komplex II: Katalyzuje oxidaci FAD 2 koenzymem Q. FAD 2 + CoQ (oxid.) FAD + CoQ (red.) ξ o = 0, 085 V; G o = - 16, 4 kj.mol -1 Redoxní reakce neposkytuje dostatečné množství energie pro tvorbu ATP. Funkcí je, pouze předávat elektrony z FAD 2 do elektronového transportního řetězce. Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec: Rotenon rostlinný toxin používaný indiány na Amazonce k lovu ryb, také insekticid) Amytal barbiturát. Antimycin - antibiotikum. Proč lze inhibici rotenonem zrušit přídavkem sukcinátu?? 63

14 Přehled elektronového transportu mitochondrie NAD NAD + ( V) 2e KMPLEX I ᄚ ᄚ = V ( G = kj.mol - 1 ) ADP + P i Rotenon, amytal ATP 0 ( V) Sukcin t 2e - FAD 2 KMPLEX I I CoQ ( V) ᄚᄚ (V) +0.2 Fumar t KMPLEX I I I ᄚᄚ = V ( G = kj.mol - 1 ) ADP + P i ATP Antimycin A Cytochrom c ( V) KMPLEX I V ᄚᄚ = V ( G = kj.mol - 1 ) ADP + P i CN - ATP 2e / ( V)

15 Inhibitory blokující elektronový transportní řetězec C 3 C 3 3 C C 2 C C 3 N N C 3 Rotenon C 3 Amytal N C - Kyanid 3 C N C 3 65 N C Antimycin A ( ) 5 3 C C 3 C 3

16 Mitochondriální elektronový transport Mezimembr nov prostor Cyt c Cyt c 1 Vnit n mitochondri ln membr na FMN FeS FeS Q FeS Cyt b L Cyt a Cu A Matrix Cyt b Cyt a 3 - Cu B NAD 1/ KMPLEX I KMPLEX I I I KMPLEX I V

17 Komplex I NAD koenzym Q oxidoreduktasa Komplex I je největší protein v mitochondriální membráně 43 podjednotek o celkové hmotnosti 900 kd. Komplex I obsahuje jednu molekulu FMN a 6 až 7 komplexů (klastrů) železo-síra. Klastry jsou prostetickými skupinami proteinů železo-síra nebo jinak nehemové proteiny. FMN je pevně vázaný na proteiny; zatímco CoQ je, díky svému hydrofobnímu isoprenoidnímu řetězci, volně pohyblivý v lipidové dvojvrstvě membrány. U savců obsahuje řetězec 10 C 5 isoprenoidních jednotek (Q 10 ). U některých organismů je kratší 6 nebo 8 jednotek. 67

18 Klastry železo-síra. Přechod elektronů mezi Fe 2+ a Fe 3+. Cys Cys Cys Cys Cys Fe S 2- Fe S 2- Fe Fe S 2- Fe S 2- Cys S 2- Fe Cys S 2- [2Fe- 2S] [4Fe- 4S] Cys 68

19 xidační stavy 2 C 2- P 3 3 C C C 3 3 C C C 3 FMN a koenzymu Q (CoQ): 3 C C C 3 3 C N N 3 C C 3 C 3 N N C 3 3 C C C n I soprenoidn jednotky Flavinmnonukleotid (FMN) (oxidovan nebo chinonov forma) Koenzym Q (CoQ) nebo ubichinon (oxidovan nebo chinonov forma) R 3 C N N 3 C C 3 C 3 N N 3 C R FAMN (radik lov nebo semichinonov forma) Koenzym Q nebo ubisemichinon (radik lov nebo semichinonov forma) R 3 C N N 3 C C 3 C 3 N N 3 C R 69 FMN 2 (redukovan nebo hydrochinonov forma) Koenzym Q 2 nebo ubichinol (redukovan nebo hydrochinonov forma)

20 Přenos elektronů a translokace protonů v komplexu I. Tok elektronů z NAD na CoQ probíhá stupňovitě mezi redox centry. NAD se účastní vždy jen dvouelektronové výměny. FMN a CoQ mohou přenášet jak dva, tak jeden elektron a proto tvoří elektronovou spojku mezi dvouelektronovým NAD a jednoelektronovými akceptory cytochromy. Při toku elektronů mezi redox centry komplexu I jsou transportovány čtyři protony z matrix do mezimembránového prostoru. 70

21 Komplex II (sukcinát-koenzym Q oxidoreduktasa) Komplex II obsahuje enzym citrátového cyklu sukcinátdehydrogenasu. Přenáší elektrony z FAD 2 na CoQ. Komlex II obsahuje sukcinátdehydrogenasu s kovalentně vázaným FAD, několik klastrů Fe-S a jeden cytochrom b 560. Komplexy I a II nejsou v sérii. Komplex II přenáší elektrony z sukcinátu na CoQ. CoQ je mobilní sběrač elektronů. 71 Cytochrom b 560 slouží pravděpodobně k odstraňování kyslíkatých radikálů vznikajících vedlejšími reakcemi.

22 Cytochromy-hemové transportní proteiny. Během transportu elektronů alternují mezi Fe 2+ a Fe 3+. PRTEI N C 3 Cys 2 C C C C 3 C 3 C C 3 3 C S C C 3 Cys 2 3 S 3 C 1 N + N 4 C 3 C N + N C 3 C N + N C C 3 Fe 2+ Fe 2+ Fe 2+ C 8 N N + 5 C 3 3 C N N + C 3 3 C N N + C C C - - C C - - C C 72 em a em b (Fe- protoporfyrin I X) em c

23 emové skupiny redukovaných Fe 2+ cytochromů mají charakteristická absorpční spektra ve viditelné oblasti (Soretovy pásy). Cytochrom a Cytochrom b Cytochrom c ABSRBANCE Cytochrom c Cytochrom c Vlnov d lka (nm)

24 Komplex III (Koenzym Q cytochrom c oxidoreduktasa) Komplex III (také jako cytochrom bc 1 ) transportue elektrony z redukovaného CoQ na cytochrom c. bsahuje: Dva cytochromy typu b, jeden c 1 a jeden klastr [2Fe-2S], znám také jako Rieskeho centrum. Transport elektronů a pumpování protonů probíhá tzv. Q cyklem. CoQ 2 podstupuje dva cykly reoxidace za tvorby stabilních meziproduktů semichinonů CoQ. Existují dvě nezávislá centra pro koenzym Q: Q o vážící CoQ 2 a Q i vážící semichinon CoQ.. 74

25 Reakce Q cyklu První cyklus: CoQ 2 + cytochrom c 1 (Fe 3+ ) CoQ. + cytochrom c 1 (Fe 2+ ) + 2 (mezimembránový prostor) V druhém cyklu nejdříve další CoQ 2 opakuje první cyklus. CoQ 2 + CoQ. + cytochrom c 1 (Fe 3+ ) + 2 (z matrix) CoQ + CoQ 2 + cytochrom c 1 (Fe 2+ ) + 2 (do mezimembrány) Z každých dvou CoQ 2 vstupující do Q cyklu, je jeden regenerován. Celková reakce: CoQ cytochrom c 1 (Fe 3+ ) + 2 (z matrix) CoQ + 2 cytochrom c 1 (Fe 2+ ) + 4 (do mezimembránového prostoru). 75 Elektrony jsou následně přenášeny na cytochrom c, který je

26 První část Q cyklu. M E Z I M E M B R ᄚ N V ᄚ Z KMPLEXU I Q 2 Q 2 2 Q - e - e - FeS- protein b Q - L e - P R e - b e - Q Q S c 1 Q Q T o i R PRVN CYKLUS M A T R I X 76

27 Druhá část Q cyklu M E Z I M E M B R ᄚ N V ᄚ Z KMPLEXU I Q 2 Q 2 2 Q - Q 2 e - e - e - FeS- protein b L e - P R S T R e - b Q Q c 1 Q o DRU CYKLUS Q - Q i 2 M A T R I X 77

28 Komplex IV (cytochrom c oxidasa) Komplex IV katalyzuje jednoelektronovou oxidaci čtyřech redukovaných cytochromů c a současnou čtyřelektronovou redukci jedné molekuly 2. 4 Cytochrom c (Fe 2+ ) cytochrom c (Fe 3+ ) Komplex IV obsahuje čtyři redoxní centra: cytochrom a, cytochrom a 3, atom mědi značený jako Cu B a dvojici atomů mědi označovaných jako Cu A centrum. Redukce 2 cytochrom c oxidasou je postupný složitý proces. Cytochrom c oxidasa má dva kanály translokace protonů. Čtyři tzv. chemické nebo skalární protony jsou odňaty z matrix během redukce kyslíku za tvorby dvou molekul vody. Proces je spojen s translokací čtyř tzv. pumpovaných nebo vektorových protonů z matrix do mezimembránového prostoru. Při reakci komplexu IV je celkově transportováno přes vnitřní mitochondriální membránu celkem osm protonů (matrix) cytochrom c (Fe 2+ )

29 xidativní fosforylace-atpsynthasa (Komplex V). Energetické spojení. Volná energie transportu protonů se uplatní při tvorbě ATP. Vn j mitochondri ln membr na Mezimembr nov prostor Vnit n mitochondri ln membr na Vysok [ ] e N zk [ ] 1/ ADP + P i ATP

30 Chemiosmotická hypotéza oxidativní fosforylace Peter Mitchell ( ), Nobelova cena za Fyziologii a medicínu Mitchell, P., Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. Nature 191, (1961). Volná energie elektronového transportu je realizována pumpováním z mitochondriální matrix do mezimembránového prostoru za tvorby elektrochemického gradientu přes membránu. Elektrochemický gradient je posléze uplatněn při syntéze ATP. Tato volná energie se nazývá protonmotivní síla. Naměřený membránový potenciál přes membránu jaterní mitochondrie je 0, 168 V (v matrix negativní). Naměřené p v matrix je o 0, 75 jednotky vyšší než v mezimembránovém prostoru. G pro transport protonů z matrix je 21, 5 kj.mol -1 endergonní proces. Rušení gradientu, syntéza ATP, je proces exergonní!! 80

31 ATP synthasa protony pumpující ATP synthasa, F 1 F o - ATPasa. ATP synthasa je multipodjednotkový transmembránový protein o celkové molekulové hmotnosti 450 kd. ATP synthasa je složena ze dvou funkčních jednotek (komponent), F o a F 1. (F o vyslovuj ef nula - o znamená na oligomycin citlivá komponenta). F o je ve vodě nerozpustný transmembránový protein obsahující více jak osm různých typů podjednotek. F 1 je vodě rozpustný periferní membránový protein složený z pěti typů podjednotek, které lze jednoduše oddělit od F o působením močoviny. F 1 komponenta ATPsynthasy má podjednotkové složení α 3 β 3 γ δ ε. Rozpuštěná F 1 komponenta (oddělená od F o ) hydrolyzuje, ale nesyntetizuje ATP. F o komponenta je složena z vícečetných podjednotek. V E.coli např. existují tři transmembránové komponenty: a, b, a c - ve formě a 1 b 2 c 9-12 komplexu. 81

32 Schematický nákres komponentového složení F 1 F o - ATPasy z E. coli 3 3 b c ab 2 82

33 83 Rentgenostrukturní snímek kvasničného F 1 -c 10 komplexu.

34 Model F 1 F o -ATPasy z E. coli. Komplex γ ε -c 12 je rotor a část α β α β δ stator. komplex je 84

35 Mechanismus rotace F 1 F o -ATPasy. Protony z mezimembránového prostoru vstupují do podjednotky c, kde reagují s podjednotkou a a vystupují ven až se c kruh otočí o jednu otočku (černá šipka), kdy se podjednotka c znovu setká s podjednotkou a. 85

36 Pohyb protonů přes membránu pohání rotaci c kruhu. Mezimembr nov prostor Matrix Nem e rotovat ob ma sm ry Rotace ve sm ru hodinov ch ru i ek 86

37 Mechanismus vazebné změny tvorba ATP z ADP a P i F 1 komponenta má tři reaktivní katalytické protomery (α β jednotky), každý ve jiném konformačním stavu. L - váže substrát a produkt slabě (L = loosely) T - váže pevně (T = tightly) - neváže vůbec, je otevřený ( = open) Uvolněná energie translokací protonů se realizuje přechodem mezi těmito stavy. Fosfoanhydridová vazba ATP je syntetizována jen ve stavu T a ATP se uvolňuje ve stavu. Tři stupně: ADP a P i se váží do stavu L. Průchod protonů mění konformaci L na T. ATP je syntetizované ve stavu T, druhé ATP se dostává pohybem 87 rotoru do stavu a oddisociuje.

38 Mechanismus vazebné změny tvorby ATP. ADP P i L ADP + P i L T ATP 1 T ATP 88

39 Mechanismus vazebné změny tvorby ATP. ADP P i L ENERGI E ADP P i T T ATP 2 L ATP 89

40 Mechanismus vazebné změny tvorby ATP. ADP P i ATP 2 ATP T T L ATP 3 L 90

41 F 1 F o -ATPasa je točivý stroj. Model Masamitsu Futai. Sferoid α 3 β 3 z E. coli F 1 F o -ATPasy byl upoután hlavou dolů na skleněnou desku. Šest postupných is zbytků (zvané is-tag) bylo mutagenezí navázáno na N-konec α podjednotky, která je lokalizována na vrcholu α 3 β 3. is-tag komplet byl uchycen na povrch skleněné desky potažené křenovou peroxidasou (přilnavá ke sklu) konjugované s Ni 2+ - nitriloctovou kyselinou [ Ni 2+ - N( C) 3 ], která váže pevně istagy. Část F o směřuje nad povrch. Glu jedné z podjednotek c byl mutagenezí zaměněn za Cys a ten kovalentně spojen s avidinem. Fluorescenčně značený a biotynylovaný (na jednom konci) filament svalového proteinu aktinu byl navázán na c podjednotku přes můstek tvořený straptavidinem (bakteriální protein, který silně váže biotin ke všem čtyřem vazebným místům). Takto sestaven se otáčí rotor opačným směrem, pumpuje protony zevnitř ven na úkor hydrolýzy ATP. 91 Pozorováno fluorescenčním mikroskopem v roztoku 5 mm MgATP.

42 F 1 F o -ATPasa je točivý stroj. Model Masamitsu Futai Aktinov filamentum ATP + 2 ADP + P i 92

43 Poměr P / Poměr P / reprezentuje relaci mezi množstvím syntetizovaného ATP (P) a množství redukovaného kyslíku (). Tok dvou elektronů přes komplexy I, III a IV vede ke translokaci 10 protonů. Zpětný tok těchto protonů pře ATPasu poskytuje 3 ATP. Elektrony z FAD 2, vynechávají komplex I, vedou ke translokaci 6 protonů, což poskytuje jen 2 ATP. U aktivně respirujících mitochondrií nebývá poměr P / celé číslo. Peter ikle prověřoval P / poměry a prokázal, že aktuální hodnoty jsou blíže číslů 2, 5 a 1, 5 a 1. 93

44 Rozpojovače oxidativní fosforylace. Probíhá respirace netvoří se ATP. MATRI X Vysok [ ] CYTSL N zk [ ] N 2 N 2 Difuze N 2 N 2 + N 2 N 2 N 2 N 2 2,4- Dinitrofenol (DNP) 2,4- Dinitrofenol (DNP) 94

45 95 Kontrolní mechanismy oxidativní fosforylace Dospělá žena spotřebuje denně kj metabolické energie. To odpovídá volné energii hydrolýzy 200 molů ATP na ADP a P i. Celkové množství v těle přítomného ATP je méně než 0, 1 molu!!! ATP musí být nutně recyklován a jeho produkce regulována, protože se neprodukuje nikdy více ATP než je potřeba. xidativní fosforylace (od NAD k cytochromu c) je v rovnováze: ½ NAD cytochrom c (Fe 3+ ) + ADP + P i ½ NAD + cytochrom c (Fe 2+ ) + ATP G 0 K eq = ([NAD + ] / [NAD]) ½.[c 2+ ] / [c 3+ ]. [ATP] /[ADP].[P i ] Reakci nelze ovlivnit přídavkem ATP, protože cytochrom c oxidasová reakce je ireversibilní!! Reakce se ovlivní dostupností cytochromu c (c 2+ ) a tedy poměry [NAD] / [NAD + ] a [ATP] / [ADP].[P i ]. Čím vyšší je poměr [NAD] / [NAD + ] a nižší [ATP] / [ADP]. [P i ], tím vyšší je koncentrace cytochromu c a vyšší

46 Reaktivní kyslíkaté radikály (RS) Čtyřelektronová redukce kyslíku cytochrom c oxidasou je rychlá a precizní. Přesto vznikají kyslíkaté radikály, které reagují s různými buněčnými součástmi. Nejznámější je superoxidový radikál: 2 + e Superoxidový radikál je prekurzorem silnějších oxidačních radikálů jako jsou protonovaný a hydroxylový radikál. Antioxidační mechanismus: superoxiddismutasa (SD) přítomná téměř ve všech buňkách. Katalyzuje přechod 2 -. na peroxid vodíku. Vytvořený peroxid vodíku je degradován katalasou na vodu a kyslík: nebo glutathionperoxidasou: 2 GS 2 2 GSSG Dalšími potenciálními antioxidanty jsou rostlinné sloučeniny jako 96 askorbát (vitamin C) a α -tokoferol (vitamin E). Pravděpodobně