Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Transkript

1 Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

2 OBVSB/Obecná virologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

3 Patogeneze virové infekce Od infekce k nemoci Doc. RNDr. Milan Navrátil, CSc. Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

4 Cílem je seznámit posluchače s procesem reprodukce (replikace) virů Klíčová slova: adsorpce, penetrace, vlastní replikace, maturace, uvolnění Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

5 EVOLUČNÍ KONFLIKT JE ZÁKLADEM VIROVÉ PATOGENEZE Hostitel i virus se snaží získat reprodukční výhody nové viry se vyvíjejí průběžně přirozená selekce preferuje viry s nízkou patogenitou/virulencí (tj. neeradikují hostitele) -?většina? virových infekcí je bezpříznaková - choroba/nemoc je nezvyklý následek infekce

6 JAK POROVNAT SÍLU VIRŮ Patogenita porovnává sílu chorob vyvolaných různými mikroorganismy (např. virus vztekliny je více patogenní než virus spalniček). Virulence porovnává sílu chorob vyvolaných různými kmeny téhož mikroorganismu.

7 PATOGENEZE VIROVÉ INFEKCE Patogeneze (virové infekce) je proces vyjadřující komplex interakcí mezi virem a hostitelem, jehož výsledkem je nemoc. Virová patogeneze zahrnuje veškeré pochody a mechanismy, které se podílejí na vzniku choroby, a to na úrovni infikovaných buněk, orgánů a jedinců. Virové infekce často vede ke vzniku klinických příznaků choroby. Patogeneze zahrnuje všechny aspekty virové infekce organismu od vstupu viru do organismu, přes molekulární mechanismy jeho replikace a cytopatologie, až po šíření viru v organismu, interakce s obrannými mechanismy organismů. Choroba (disease) je škodlivou odchylkou od normálního průběhu fyziologických procesů trvající dostatečně dlouhou dobu, aby se životně důležité funkce narušily nebo zpomalily.

8 PODMÍNKY VZNIKU CHOROBY Pro vznik choroby jsou nezbytné tři důležité faktory: náchylný hostitel, virulentní patogen a příznivé vnější podmínky. Virus Host Environment

9 PROČ STUDUJEME VIROVOU PATOGENEZI? 1. Vývoj nových vakcín 2. Využití cytokinů a jiných modulátorů imunity 3. Nová generace antivirových léčiv 4. Nové postupy terapie 5. Nová preventivní opatření 6..

10 CHOROBA Choroba je škodlivou odchylkou od normálního průběhu fyziologických procesů trvající dostatečně dlouhou dobu, aby se životně důležité funkce narušily nebo zpomalily. V humánní a veterinární medicíně se uplatňují pro stanovení chorobného stavu organismu určité parametry; normy biologických konstant (např. normální tep, teplota, glykémie, ph krve, sedimentace). Ve fytopatologii obdobné objektivní míry normálnosti (zdraví) chybí. Za nemocnou se považuje ta rostlina, která má příznaky choroby obvykle pozorovatelné vizuálně. Někteří autoři považují za nemocné všechny infikované rostliny.

11 PATOGEN A INFEKČNOST Patogen je buněčný nebo nebuněčný organismus, který je schopen způsobovat chorobu na jednom hostiteli nebo okruhu hostitelů. Infekčnost je schopnost mikroorganismu způsobovat onemocnění po vniknutí do těla hostitele. V rostlinné virologii tento termín vyjadřuji i kvantitu určitého viru v pletivech hostitele, schopnost množit se v něm, ale i stabilitu viru in vitro v prostředí mimo hostitele.

12 REAKCE BUŇKY NA VIROVOU INFEKCI Produktivní infekce Vnímavá (permisivní) buňka Ne-vnímavá (nepermisivní) buňka

13 CYTOPATICKÝ EFEKT 1. Inhibice syntézy buněčných makromolekul inhibice syntézy buněčných RNA zamezení iniciace translace (asociace ribozómů s buněčnou mrna) inhibice syntézy buněčné DNA 2. Upřednostění syntézu viru specifických makromolekul syntéza časných makromolekul specifických pro virus (mrna, časné proteiny) hromadění strukturních virových proteinů toxických pro buňku inkorporace proteinů a glykoproteinů specifických pro virus do membránového systému buňky (důsledkem je imunitní cytolýza) syntéza virové genomické DNA nebo RNA 3. Aktivace buněčných lyzozómů

14 CYTOPATICKÝ EFEKT 4. Změny buněčných mikrofibril a mikrotubulů 5. Přestavba membrán endoplazmatického retikula, jádra a buněčné membrány změna permeability cytoplazmatické membrány pro ionty a vodu únik makromolekul z buňky 6. Imunitní cytolýza rozrušení antigenně změněné cytoplazmatické membrány, lýze buňky (protilátky, komplement, lymfocyty)

15 FÁZE VIROVÉ PATOGENEZE Vstup viru do hostitele Primární pomnožení Šíření v hostiteli; buněčný a tkáňový tropismus Imunní odpověď Sekundární pomnožení Celkový výsledek infekce Poškození buňky Subklinické infekce (bez projevů) Akutní infekce (choroba) Persistentní infekce (chronická, latentní, pomalá) Transformace

16 PŘÍKLADY MECHANISMŮ PŮSOBENÍ VIRŮ NA HIOSTITELE V PRŮBĚHU PATOGENEZE Cytotoxicita (HSV) Imunopathogenicita (HBV), Imunosuprese (HIV, CMV) Produkce toxinů (rotavirus) Pozměněný růst buňky (HPV, HHV)

17 HLAVNÍ VSTUPNÍ BRÁNY VIROVÉ INFEKCE 1. Kůže Herpes, Pox, ARBO 2. Respirační sl. Rhino, Orthomyx, Paramyxo, Adeno 3. Trávicí trakt Rota, Pico, Calici, Astro, Hepatitis A 4. Pohlavní sl. Herpes simplex, HIV, Hepatitis B 5. Spojivka Rhino, Entero 72, Adeno 6. Matka - plod HIV, CMV, Rubella, HSV

18 vstupní brána primární pomnožení lymfatické uzliny KREV periferní nervy ganglia fagocyty RES CNS kosterní svaly vnitřní orgány

19 PŘÍKLADY KONEČNÝCH FÁZÍ INFEKCE ORGANISMU Cytocidní produktivní infekce (lytická), při které proběhne reprodukce virů zakončená kompletní morfogenezí nový virionů; buňka je však tak poškozená, že odumírá (příklad). Produktivní infekce bez cytocidních změn, při které proběhne reprodukce virů zakončená kompletní morfogenezí nový virionů, avšak po jejich uvolnění buňka neodumírá, ale obnovuje svoji funkci (virus chřipky, mimo cytocidní kmeny). Perzistentní infekce, během které se virové částice tvoří trvale, buňka se ale nepoškodí. Pokud se jedná o dělící buňku, virus může přecházet do dceřiných buněk (řada rostlinných virů). Interakce viru s buňkou vede k její transformaci, při které se mění vlastnosti buňky (morfologie, genom, karyotyp) a dochází k poruchám buněčného dělení a růstu. Abortivní infekce, při které virus pronikne do buňky, ale vzhledem k absenci některých enzymů nebo faktorů v buňce jsou syntetizovány jen některé složky reprodukčního cyklu viru. Kompletní částice se netvoří, nebo jsou defektní.

20 1. Primární infekce hostitele spojená s překonáním epitelové bariéry. 2. Zahájení množení viru ve vnímavých buňkách v místě inokulace. 3. Překonání lokálních obraných mechanismů (interakce viru s makrofágy, interferon) 4. Přímé poškození buněk v místě vstupu 5. Zápalová reakce tkáně v místě vstupu. 6. Překonání cévní bariéry 7. Šíření viru krevními a lymfatickými dráhami 8. Průnik viru do nervových zakončení 9. Pomnožení viru x imunitní odpověď virulence virového kmene tvorba interferonu tvorba protilátek buněčná imunitní odpověď 10. Usídlení viru v cílovém orgánu 11. Poškození buněk (tkání) vlivem imunitní cytolýzy 12. Vznik imunokomplexů jejich vznik a ukládání 13. Přetrvávání viru v organizmu statická (neproduktivní) forma latence dynamická forma latence

21 VIROVÁ INFEKCE A NÁDORY Pokud se viry podílejí na vzniku zhoubných nádorů, nečiní tak izolovaně, ale v součinnosti s dalšími genetickými změnami buněk, které obvykle mají jiný původ. Jako nádorové označujeme buňky, které se trvale a nekoordinovaně množí, protože se vyprostily z kontrolních mechanizmů, jež regulují jejich růst. Schopnost vyvolat nádorové bujení nezískává buňka najednou, ale v důsledku postupných genetických změn. Prvotní genetickou změnu buňky označujeme jako iniciaci a zásahy, které ji vyvolávají označujeme jako karcinogeny; mohou být chemické fyzikální a virové

22 ONKOGENY jsou geny, které kódují proteiny regulující buněčný růst a diferenciaci buňky, a jejich poruchy vedou ke ztrátě růstové kontroly a transformaci buňky normální v buňku nádorovou. Onkogeny byly objeveny při výzkumu retrovirů.

23 ONKODNAVIRY Virové onkogeny v pravém slova smyslu. Produkty onkogenů jsou nezbytné pro množení viru. Replikace viru obvykle vede ke smrti buňky transformována může tedy být pouze buňka, ve které se virus nemůže pomnožit. Buňky transformované viry obsahují virový genetický materiál, který může, ale nemusí být zabudován do buněčných chromozómů. K transformaci buňky není potřeba celého virového genomu, ale pouze té jeho části, která kóduje onko-protein.

24 PAPOVAVIRIDAE Polyomavirus SV 40 myší polyomavirus Papillomavirus benigní nádory kůže a sliznic ADENOVIRIDAE HERPESVIRIDAE HEPADNAVIRIDAE POXVIRIDAE EB virus (karcinom nosohltanu) HSV-2 (karcinom děložního čípku) virus hepatitidy B (nádory jater) virus ptačích neštovic virus králičího fibromu (benigní kož. nádory)

25 ONKORNAVIRY Virové onkogeny odpovědné za nádorotvorný účinek jsou zcizené (pozměněné protoonkogeny). Produkty onkogenů se nepodílejí na množení (reprodukci) viru. Replikace viru je obvykle kompatibilní s životností buňky. RETROVIRY virus Rousova sarkomu leukemické retroviry Charakteristické znaky nádorových RNA virů: reverzní transkripce virové RNA a integrace virové cdna do hostitelského chromouómu exprese integrovaného proviru okogeny zcizené geny z hostitelské buňky (např. transdukcí) virová cdna po integraci do genomu host. buňky může svým promotorem nebo enhancerem aktivovat expresi buněčných onkogenů

26 OBRANA ORGANISMU VŮČI VIROVÉ INFEKCI Nespecifické obrané mechanismy Anatomicko morfologické chemické Komplement Zánět Fagocytóza Cytokiny, interferon Specifická protivirová obrana Imunitní systém, protilátková-humorální a buněčná obrana

27 Virové vakcíny Aktivní imunizace Pasívní imunizace PROFYLAXE A LÉČBA VIROVÝCH CHOROB Terapie virových infekcí Inhibice adsorbce viru na vnímavou buňku. Zábrana uvolnění virové nukleové kyseliny. Interference s transkripcí a translací virových genů (Acyklovir). Inhibitory DNA polymeráz. Inhibitory RNA polymeráz (Ribavirin). Inhibitory reverzní transkriptázy (Zidovudin, Didanosin). Interferon alfa.

28 PATOGENEZE ROSTLIN Patogeneze rostlin zahrnuje řadu následných kroků: 1. Vstup viru do rostliny 2. Rozvoj infekce a reakce hostitelské rostliny 3. Průběh choroby

29 ROZVOJ INFEKCE A REAKCE HOSTITELSKÉ ROSTLINY lokální příznaky infekce systémovými příznaky

30 PROTIVIROVÁ OBRANA ROSTLIN Rezistence Suprese umlčování virů Je známa celá řada proteinů enzymů, které se objevují (nebo se zvyšuje jejich množství) v buňkách po infekci virem. Jedná se například o peroxidázy, polyfenoloxidázy, ribonukleázy PR proteiny (pathogenesis related proteins).

31 OZDRAVOVÁNÍ ROSTLIN Meristémová kultura Termoterapie Chemoterapie

32 EKOLOGIE VIRŮ Studium virů v přírodě i laboratoři vede k získání řady informací o dynamice jejich interakcí s okolním prostředí, tj. ekologie. Viry, jak je všeobecně chápáno způsobují škody zemědělcům, významně ovlivňují zdravotní stav lidské populace, ale jsou i nedílnou součástí nedotknuté přírody. Virózy jednotlivých hostitelů i jejich populací jsou výsledkem interakcí mezi virem, hostitelem a prostředím. Ekosystém virů není však reprezentován pouze výše uvedenou interakcí, ale zahrnuje i prostor a čas, ve kterých jednotlivé faktory působí a mění se. Dr. Milan Navrátil

33 Ekologie virů se zabývá vztahy mezi viry, hostitelem a okolním prostředím. Studium ekologie virů zahrnuje i sledování vztahů hostitelských organismů, protože mají velký význam pro dynamiku virové nákazy, její šíření a cirkulaci. Cirkulace představuje uzavřený okruh přenosů. Epidemiologie je věda o příčinách, rozšíření a frekvenci výskytu virových chorob a rozšíření a přenosu virů vyvolávajících choroby.

34 V užším slova smyslu je epidemiologie vědní obor zabývající se nákazami lidí. Epizootologie pak vědní obor zabývající se infekcemi zvířat. Virus poliomyelitidy Arboviry jednoduchá cirkulace složitá cirkulace

35 INFEKČNOST a IMUNITA Infekčnost je stav infikovaného organismu, během kterého se může z infekčního zdroje infikovat další jedince množství vylučovaného viru délka období, po které se virus vylučuje stabilita viru vůči podmínkám prostředí cesta, kterou se virus vylučuje výskyt (klinických) projevů choroby Živočišná populace je vnímavá nebo imunní.

36 INCIDENCE (akutní choroby) počet případů na obyvatel Bratislavy v roce 1991 počet ochoření xxxx časový úsek 1991 lokalita Bratislava PREVALENCE (chronická ochoření) počet ochoření časový úsek lokalita xxxx k určitému dni, měsíci (chybí časový údaj) Bratislava

37 Virus Biologická charakteristika viru, především potom způsob přenosu (šíření) a hostitelská specifita, hlavní měrou ovlivňují (určují) charakter interakce virus hostitel, a tedy i úroveň (hladinu) poškození populace hostitelů a návazných interakcí v daném ekosystému. Velký význam pro překonání genetických a fyziologických bariér má vysoká přirozená variabilita virů

38 Hostitel Existence vnímavého hostitele je třetí (vedle viru a přenosu) určující podmínkou existence virové populace v ekosystému. Druhy vyznačující se vysokou přirozenou genetickou variabilitou (diverzitou) jsou schopné vytvořit v interakci s virem rovnovážný stav, který se nevyznačuje fatálním dopadem virové infekce na populaci hostitele. Posun od genetické variability ke genetické homogenitě hostitelských populací (kulturní plodiny, plemena živočichů) a systémy pěstování ve velkoplošných monokulturách nebo velkochovy významně snižují odolnost hostitelské populace vůči virům.

39 Přenos/šíření viru Velikost virových populací a jejich variabilita ve spojení s lidskými zásahy do přirozených biologických systémů umožňují rychle a efektivně zvýšit efektivnost přenosu. Jedná se především o zootechnické a agrotechnické zásahy (např. velkochovy, monokultury, přemnožení), globalizaci/internacionalizaci ekonomiky umožňující přemísťování infikovaného materiálu na dlouhé vzdálenosti mezi regiony nebo i kontinenty. Významným zdrojem infekce mohou být i genové sbírky a pěstitelský nebo chovatelský materiál. Podobné faktory působí i přímo v lidské populaci (např. cestování na velkou vzdálenost, nahromadění lidí v dopravních prostředcích nebo školách).

40 Přenos a šíření rostlinných virů 1. Přímý přenos reprodukčním rostlinným materiálem - vegetativní přenos: rouby a očka, řízky, odkopky a sadbový materiál Semenem Pylem Kokoticí (C. campestris, C. europea ap.) 2. Přenos pomocí vektorů (zoochorie) - mšice (dále pak brouci, molice, křísi, mery ). Nepersitentní přenos Persitentní přenos Trtransovariální přenos 3. Přenos zoosporami hub 4. Mechanický přenos mechanická inokulace

41 Přenos a šíření živočišných virů Kapénková infekce aerosoly Alimentární infekce kontaminovanou potravou Pohlavním stykem Krví a krevními deriváty Přímým kontaktem Oděrky a poraněními Pokousáním Vektory

42 Klimatické podmínky Klimatické podmínky (teplota, světlo ap.) mohou ovlivnit predispozici hostitele k virové infekci a především pak modulují průběh choroby (rychlost rozvoje choroby, klinické příznaky, symptomy).

43 VIRUS PROSTŘEDÍ HOSTITEL PŘENOS

44 ZDROJ PROSTŘEDÍ VEKTOR PŘENOS VNÍMAVÁ POPULACE

45 LETALITA (smrtnost) % zemřelých z celkového počtu nemocných určitou nemocí MORTALITA (úmrtnost) počet úmrtí na počet infikovaných jedinců MORBIDITA (chorobnost) počet výskytu choroby za určité období (měsíc, rok) určitý počet obyvatelstva/lokalitu

46 Geografické rozšíření virů Sporadické infekce Endemické infekce Epidemie Pandemie Přírodní ohniska infekce Přírodní ohnisko nákazy definujeme jako místo, kde původce choroby, jeho specifický vektor, a zvířata (reservoáry) původce choroby existují neomezeně dlouhý čas v přírodních podmínkách nezávisle na člověku. Příklad: Arboviry

47 DIAGNOSTIKA VIRŮ Biologické testy ELISA test (přímá detekce virů x detekce specifických protilátek) Neutralizační test Komplement fixační test Hemaglutinin inhibiční test

48 BIOTECHNOLOGIE Využití živých organismů k řešení problémů nebo získání produktu. VIRY - NÁSTROJE BIOTECHNOLOGIE Viry obsahují specifický genetický materiál. Napadají buňky, kde se mnohonásobně zmnoží. Dopravují genetický materiál do velmi specifických buněk. Existují cesty jak cíleně rozšířit jejich genetický materiál. Virus může přenášet cizí genetický materiál. Viry obsahují specifické geny pro syntézu enzymů nezbytných v molekulární genetice. Dr. Milan Navrátil

49 INDUKOVANÁ REZISTENCE kulturních plodin vůči virům. Transformace rostlin RNA - zprostředkovaná rezistence CP - zprostředkovaná rezistence Replikázou - zprostředkovaná rezistence MP - zprostředkovaná rezistence Satelitní defektní RNA

50 VIRY - VECTORY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Klonovací a expresní vektory Bakteriofág lambda, M13, P2 klonování exprese sekvenování genomové knihovny cdna knihovny exprese heterologních proteinů

51 Virové DNA vektory - genová terapie Retrovirové vektory Adenovirové vektory HSV vektory AAV vektory Lentivirové vektory

52 VIRY - zdroje reverzních transkriptáz AMV MuMLV Avian myeloblasty virus Murine moloney leukemia virus VIRY - transformační molekuly např. PVX virus SW-40 VIRY - insekticidy např. Baculoviry