Petra Sudová. STANOVENÍ POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ V PEVNÝCH MATRICÍCH HYDROSFÉRY METODOU QuEChERS POROVNÁNÍ SE STÁVAJÍCÍMI METODAMI

Transkript

1 U N I V E R Z I T A K A R L O V A V P R A Z E P ř í r o d o v ě d e c k á f a k u l t a Studijní program: Chemie Studijní obor: Analytická chemie Petra Sudová STANOVENÍ POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ V PEVNÝCH MATRICÍCH HYDROSFÉRY METODOU QuEChERS POROVNÁNÍ SE STÁVAJÍCÍMI METODAMI QuEChERS Method for Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Solid Matrices of Hydrosphere Comparison with Current Methods D i p l o m o v á p r á c e Vedoucí diplomové práce: RNDr. Karel Nesměrák, Ph.D. Konzultant diplomové práce: Ing. Alena Svobodová Praha 2012

2 2 Název práce: Anotace: Klíčová slova: Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry metodou QuEChERS porovnání se stávajícími metodami Práce se věnuje optimalizaci a validaci metody QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry, její aplikaci na stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v reálných vzorcích a porovnání naměřených výsledků, časové náročnosti a materiálových nákladů této metody s běžně používanými metodami, jimiž jsou extrakce za zvýšeného tlaku s následnou gelovou permeační chromatografií (ASE/GPC) a ultrazvukové extrakce s následnou extrakcí na pevné fázi (UZ/SPE). Z dosažených výsledků je patrné, že metoda QuEChERS je vhodná pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry, což bylo prokázáno i částečnou validací této metody. Technika QuEChERS poskytuje srovnatelné výsledky s metodami ASE/GPC a UZ/SPE. Z hlediska časové náročnosti i ceny přípravy vzorků umožňuje metoda QuEChERS, na rozdíl od metod ASE/GPC a UZ/SPE, rychlé a levné stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných vzorcích. polycyklické aromatické uhlovodíky, QuEChERS, pevné matrice hydrosféry, vysokoúčinná kapalinová chromatografie Title: Annotation: Key words: QuEChERS method for determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in solid matrices of hydrosphere comparison with current methods Thesis are aimed to the optimization and validation of the QuEChERS method for determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in solid matrices of hydrosphere. The QuEChERS method was also used for determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in real samples and for comparison of measured results, time and material costs of the method with currently employed methods: (1) accelerated solvent extraction connected with gel permeation chromatography (ASE/GPC), and (2) ultrasonic extraction connected with solid phase extraction (UZ/SPE). According to the validation criteria, the QuEChERS method is suitable for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in solid matrices of hydrosphere. The QuEChERS technique provides comparable results to ASE/GPC and UZ/SPE. In terms of price and time for sample preparation, the QuEChERS method allows (unlike the methods ASE/GPC and UZ/SPE) fast and inexpensive determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in solid samples of hydrosphere. polycyclic aromatic hydrocarbons, QuEChERS, solid matrices of hydrosphere, high performance liquid chromatography

3 3 Tato diplomová práce vznikla v souvislosti s řešením výzkumného záměru MSM Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity. V Praze dne 14. května 2012.

4 4 Poděkování Ráda bych poděkovala především mému školiteli RNDr. Karlu Nesměrákovi, Ph.D. a Ing. Aleně Svobodové z Výzkumného ústavu vodohospodářského T. G. Masaryka, za odborné vedení, které mi pomohlo při vypracování této diplomové práce. Rovněž děkuji Ing. Věře Očenáškové za umožnění provádět práci na VÚV TGM, v. v. i. Děkuji i svým rodičům za veškerou podporu a pomoc, které se mi od nich dostává.

5 5 Obsah Seznam použitých zkratek a symbolů Úvod, cíl práce Teoretický úvod Struktura polycyklických aromatických uhlovodíků Fyzikální a chemické vlastnosti polycyklických aromatických uhlovodíků Toxicita polycyklických aromatických uhlovodíků Zdroje polycyklických aromatických uhlovodíků a jejich výskyt ve vodách a v sedimentech Metody stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků Izolace polycyklických aromatických uhlovodíků ze sedimentu Čištění surového extraktu polycyklických aromatických uhlovodíků Chromatografické techniky stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků Další techniky stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků Technika QuEChERS Aplikace techniky QuEChERS na stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků Experimentální část Referenční materiály a reálné vzorky Použité chemikálie Použité pomůcky a přístroje Podmínky chromatografické analýzy pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných vzorcích vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s použitím extrakce za zvýšeného tlaku a gelové permeační chromatografie Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných vzorcích vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s použitím ultrazvukové extrakce a extrakce na pevné fázi... 39

6 6 3.7 Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných vzorcích vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s použitím metody QuEChERS Výsledky a diskuze Optimalizace metody QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry Validace metody QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry Porovnání výsledků získaných metodou QuEChERS s výsledky získanými běžně používanými metodami pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricíc hydrosféry Porovnání ceny přípravy vzorků metodou QuEChERS s běžně používanými metodami pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry Porovnání časové náročnosti metody QuEChERS s běžně používanými metodami pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry Závěr Literatura Příloha... 59

7 7 Seznam použitých zkratek a symbolů ACE acenaften ACL acenaftylen ANT anthracen AOAC Association of Official Analytical Chemists ASE zrychlená extrakce rozpouštědlem BaA benzo[a]anthracen BaP benzo[a]pyren BbF benzo[b]fluoranthen BghiP benzo[g,h,i]perylen BkF benzo[k]fluoranthen c a koncentrace jednotlivých PAU ve vzorku [mg kg 1 ] CEN European Committee for Standardisation ČSN Česká technická norma DBahA dibenzo[a,h]anthracen DNA deoxyribonukleová kyselina d-spe disperzní extrakce na pevné fázi EN Evropská norma EPA Environmental Protection Agency FID plamenový ionizační detektor FLD fluorescenční detekce FLE fluoren FLU fluoranthen GC plynová chromatografie GCB graphitized carbon black, aktivní uhlí GPC gelová permeační chromatografie h výška píku [µv]

8 8 HPLC-ED vysokoúčinná kapalinová chromatografie s elektrochemickou detekcí CHR chrysen IEC International Electrotechnical Commision IP indeno[1,2,3-c,d]pyren ISO International Standard Organisation K konstanta [µl g 1 ] K ow LC LOD LOQ m m e m 0 m 0(GPC) MAE MS n NADPH NAP PAC PAH PAU PFE PHE PLE PNH POH POM POP PSA PYR QCM 7 rozdělovací koeficient oktanol-voda kapalinová chromatografie mez detekce mez stanovitelnosti absolutní množství analytu v nástřiku na kolonu zjištěné z kalibrační křivky [ng] celková hmotnost extrakčního činidla [g] hmotnost získaného extraktu [g] hmotnost získaného extraktu [g] mikrovlnná extrakce hmotnostní detekce navážka vysušeného vzorku [g] nikotinamidadenindinukleotidfosfát naftalen Polycyclic Aromatic Compounds Polycyclic Aromatic Hydrocarbons polycyklické aromatické uhlovodíky extrakce za zvýšeného tlaku fenanthren tlaková kapalinová extrakce Polynuclear Aromatic Hydrocarbons polycyklická organická hmota Polycyclic Organic Matters perzistentní organické polutanty primární-sekundární amin pyren certifikovaný referenční materiál

9 9 QuEChERS RNA RP-HPLC SFE SPE t UZ V ASE V d V e V GPC V i V PAU VÚV TGM WHO akronym pro rychle, jednoduše, levně, efektivně, robustně, bezpečně (quick, easy, cheap, effective, rugged, safe) ribonukleová kyselina vysokoúčinná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi superkritická fluidní extrakce extrakce na pevnou fázi čas [hod] extrakce v ultrazvukové vaně objem získaný po ASE [ml] objem extraktu zakoncentrovaný v dichlormethanu [ml] objem zakoncentrovaného extraktu, z něhož se provádí nástřik na kolonu [µl] objem vnesený na GPC [ml] objem extraktu nastříknutého k analýze [µl] objem odebraný pro PAU [ml] Výzkumný ústav vodohospodářský T. G. Masaryka World Health Organisation

10 1 Úvod, cíl práce 10 1 ÚVOD, CÍL PRÁCE Ovzduší je pro člověka jednou z nejdůležitějších složek životního prostředí, bez kterého se nemůže obejít. Vdechovaný vzduch a vše, co obsahuje, se dostává do nitra lidského těla a přímo tak působí na zdraví člověka. Kvalita ovzduší je zhoršována jak průmyslovými, tak i domácími exhalacemi. Do ovzduší se tak dostává celá řada nebezpečných látek, z nichž velký problém představují polycyklické aromatické uhlovodíky, zejména benzo[a]pyren. Z ovzduší se pak tyto látky dostávají do hydrosféry a následně pak dochází k jejich sedimentaci na dně řek či rybníků. Obsah polycyklických aromatických uhlovodíků v sedimentech velmi dobře charakterizuje celkové dlouhodobější zatížení životního prostředí. Cílem této diplomové práce bylo: optimalizovat a validovat techniku QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry použít techniku QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v reálných vzorcích porovnat časové a finanční náklady metody QuEChERS s běžně používanými metodami pro stanovení těchto sloučenin v pevných matricích hydrosféry

11 2 Teoretický úvod 11 2 TEORETICKÝ ÚVOD 2.1 Polycyklické aromatické uhlovodíky Životní prostředí je kontaminované různými chemickými škodlivými látkami. Právě s rychlým rozvojem průmyslových a zemědělských technologií se zvýšil problém znečisťování životního prostředí nebezpečnými chemickými látkami, z nichž je mnoho organické povahy. Některé z organických polutantů jsou vysoce odolné proti fotolytické, chemické a biologické degradaci, a proto zůstanou v životním prostředí dlouhou dobu. Tyto polutanty se nazývají trvalé (perzistentní) organické polutanty (POP) a mohou být nalezeny ve vzduchu, vodě, půdě a potravinách. Mezi ně se řadí i polycyklické aromatické uhlovodíky [1]. Zvláště je závažná kontaminace látkami, které již při relativně nízkých koncentracích vykazují toxické, karcinogenní nebo mutagenní účinky, a proto jsou v některých zemích tyto látky nazývány jako tzv. prioritní polutanty. Mezi ně se právě řadí i polycyklické aromatické uhlovodíky [2]. Studium polycyklických aromatických sloučenin začalo v roce 1930, kdy byl identifikovaný první chemický karcinogen dibenzo[a,h]anthracen a o pár let později byl izolován benzo[a]pyren z kamenouhelného dehtu, jenž byl také prokázán jako karcinogenní. Počátkem 70. let 20. století se staly polycyklické aromatické uhlovodíky na podnět Světové zdravotnické organizace (WHO) objektem mezinárodní standardizace, která byla založena na stanovení šesti polycyklických aromatických uhlovodíků pomocí tenkovrstvé chromatografie pro kontrolu kvality pitné vody. V roce 1976 definovala americká Agentura pro ochranu životního prostředí (EPA) šestnáct polycyklických aromatických uhlovodíků jako prioritní polutanty. V 80. letech 20. století též zahrnula Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny do svého aktuálního seznamu pro hodnocení karcinogenního rizika chemických individuí vůči člověku třicet sedm polycyklických aromatických uhlovodíků [2, 4].

12 2 Teoretický úvod 12 Pro svou toxicitu jsou polycyklické aromatické uhlovodíky zařazeny do integrovaného registru znečišťování Ministerstva životního prostředí České Republiky [5], tak i do Evropského registru úniků a přenosů znečišťujících látek [6]. Dosud bylo v životním prostředí nalezeno asi 500 polycyklických aromatických uhlovodíků a jejich souvisejících derivátů [7]. Při hodnocení výskytu polycyklických aromatických uhlovodíků v prostředí se nejčastěji hovoří o základních uhlovodících uvedených na seznamu prioritních polutantů americké Agentury pro ochranu životního prostředí (EPA), jenž klasifikuje šestnáct nejvýznamnějších polycyklických aromatických uhlovodíků, které jsou environmentálně závažné [4, 8]. Tyto prioritní polutanty jsou shrnuty v obr Obr. 2. 1: Chemická struktura šestnácti environmentálně nejzávažnějších polycyklických aromatických uhlovodíků (převzato z [1], [4])

13 2 Teoretický úvod Struktura polycyklických aromatických uhlovodíků Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU, anglicky PAH) jsou rovněž známy pod označením polykondenzované aromatické uhlovodíky nebo polycyklická organická hmota (POH, POM) [4]. V některých studiích se lze setkat s označením PNH (Polynuclear Aromatic Hydrocarbons) nebo PAC (Polycyclic Aromatic Compounds). Rozdílem mezi PAC a PAU je, že PAC zahrnují jak homocyklické, tak heterocyklické sloučeniny, zatímco PAU představují pouze homocyklické polyaromatické uhlovodíky. Jinými slovy lze říci, že PAC znamená PAU + deriváty [3, 4]. Polycyklické aromatické uhlovodíky tvoří velkou skupinu organických sloučenin, které jsou složené ze dvou nebo více aromatických (benzenových) kruhů [2] a nenesou žádné heteroatomy ani substituenty [9]. Jsou uspořádány lineárně, angulárně nebo klastrově (minimálně jedno jádro je obklopeno alespoň třemi jinými kondenzovanými jádry). Toto uspořádání má vliv na stabilitu PAU, kdy nejmenší je stabilita při lineárním uspořádání a největší je při angulárním uspořádání [4] Fyzikální a chemické vlastnosti polycyklických aromatických uhlovodíků Na fyzikálních a chemických vlastnostech individuálních PAU je velkou měrou závislý osud a pohyb polycyklických aromatických uhlovodíků uvolněných do životního prostředí [11]. Chemicky čisté polycyklické aromatické uhlovodíky jsou bílé nebo nažloutlé krystalické pevné látky, které jsou ve vodě velmi málo rozpustné [5]. Jejich rozpustnost se ve vodě snižuje se zvyšující se molekulovou hmotností a kvůli jejich hydrofobní (lipofilní) povaze (log K ow se pohybuje v rozmezí 3 8) je koncentrace rozpuštěných PAU ve vodě velmi nízká [8]. Rozpustnost PAU v povrchových a jiných přírodních vodách se může od uváděných hodnot lišit, vzhledem k různému obsahu solí a organických látek v těchto vodách. V odpadních vodách obsahujících velké množství tenzidů se může rozpustnost některých polycyklických aromatických uhlovodíků zvýšit. Pro rozpustnost je významná i teplota, například rozpustnost anthracenu se vzrůstem teploty z 5 C na 30 C zvýší až pětinásobně. Dobře se ale rozpouštějí v organických rozpouštědlech, jak nepolárních, tak i v polárnějších [2].

14 2 Teoretický úvod 14 Kvůli nízké rozpustnosti ve vodě a vysoké hydrofobicitě mají polycyklické aromatické uhlovodíky vysokou schopnost se adsorbovat na pevné sorbenty nebo částice. Také se hromadí i v tukové tkáni filtrujících organismů jako jsou například škeble, a proto byly také po dlouhou dobu užívány jako bioindikátory [12]. Schopnost sorpce na pevné částice je jeden z hlavních faktorů, které ovlivňují osud (pohyb, kumulace atd.) polycyklických aromatických uhlovodíků v životním prostředí. Absorpce je nepřímo úměrná parciálnímu tlaku par, který se u PAU snižuje s rostoucí molekulovou hmotností [2]. Tedy polycyklické aromatické uhlovodíky s nižší molekulovou hmotností jsou pohyblivější, zatímco PAU s vyšší molekulovou hmotností jsou relativně nepohyblivé vzhledem k vyšším molekulovým objemům, extrémně nízké těkavosti a rozpustnosti a proto se budou pevněji sorbovat na částice [4]. Polycyklické aromatické uhlovodíky se podle jejich molekulové hmotnosti dělí na PAU s nízkou molekulovou hmotností (dvě až tři benzenová jádra), se střední molekulovou hmotností (čtyři benzenová jádra) a s vysokou molekulovou hmotností (pět a více benzenových jader). Polycyklické aromatické uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotností jsou nacházeny v plynné fázi, s rostoucí molekulovou hmotností jsou PAU více sorbovány na jemné kapalné či pevné částice a pouze malá část je v plynné fázi [2, 11]. S růstem molekulové hmotnosti roste bod varu a tání, lipofilita resp. rozdělovací koeficient oktanol/voda a naopak klesá rozpustnost a tenze par [4]. Významnou fyzikálně-chemickou vlastností je velká rozmanitost jejich spekter v UV a VIS oblasti. Absorbují UV záření v rozsahu nm a některé (se čtyřmi a více benzenovými jádry) i viditelné světlo [10]. Znamená to, že jednotlivé polycyklické aromatické uhlovodíky mají svá typická UV/VIS spektra. Díky velkému množství π-elektronů jsou některé PAU schopné fluorescence, dokonce i fosforescence [2]. Polycyklické aromatické uhlovodíky jsou velice reaktivní. Na jejich reaktivitu v prostředí má vliv teplota, světlo, kyslík, ozon, další chemické reagenty, druh a velikost povrchu částic, na kterých mohou být PAU sorbovány [4]. Jejich významnou chemickou vlastností je tvorba derivátů. Mohou reagovat s polutanty, jako s ozonem, oxidy dusíku nebo oxidem siřičitým [13]. Při reakci s oxidy dusíku vznikají nitroderiváty a při reakci s oxidem siřičitým vznikají

15 2 Teoretický úvod 15 sulfoderiváty. Také mohou reagovat s chlorem při chloraci vody za vzniku chlorderivátů [2]. Tabulka 2. 1: Fyzikální a chemické vlastnost PAU (upraveno podle [4], [7]) sloučenina molekulová rozpustnost bod tání bod varu hmotnost ve vodě g mol 1 C C µg l 1 log K ow naftalen 128,18 80,2 217, ,0 3,30 acenaftylen 152,20 92, ,0 3,94 acenaften 154,21 93, ,0 3,92 fluoren 166,22 114, ,0 4,18 anthracen 178, ,9 43,0 4,45 fenanthren 178,24 99, ,0 4,46 fluoranthen 202,26 107, ,0 5,16 pyren 202,26 151, ,0 4,88 benzo[a]anthracen 228, ,6 9,4 5,76 chrysen 228,30 258, ,0 5,81 benzo[a]pyren 252,30 176, ,6 6,13 benzo[b]fluoranthen 252, ,5 5,78 benzo[k]fluoranthen 252, ,8 6,11 indeno[1,2,3-c,d]pyren 276,34 163, ,9 6,70 benzo[g,h,i]perylen 276, >500 0,3 6,63 dibenzo[a,h]anthracen 278,36 269, ,5 6, Toxicita polycyklických aromatických uhlovodíků Celá řada látek ze skupiny polycyklických aromatických uhlovodíků představuje závažné zdravotní riziko pro člověka [5]. Již v roce 1761 bylo poprvé pozorováno spojení mezi použitím šňupacího tabáku a nosní rakoviny [14]. Lékaři si také všímali, že u skupin obyvatelstva, které byly vystaveny uhelnému prachu, sazím a dehtu se projevilo větší riziko vzniku rakoviny. Tato pozorování byla prokázána v roce , kdy se japonským výzkumníkům podařilo uměle vyvolat rakovinu u zvířat opakovaným natíráním kůže dehtem. V roce 1932 Cook identifikoval benzo[a]pyren jako složku dehtu, která vyvolává rakovinu [2]. Obecně, čím mají PAU více benzenových jader, tím je větší jejich toxicita [14]. Benzo[a]pyren je ze všech známých polycyklických aromatických uhlovodíků nejvíce karcinogenní. Ačkoliv lehčí PAU mají slabší karcinogenní/mutagenní vlastnosti, jsou nejhojnější v atmosféře a mohou reagovat s ostatními polutanty a vytvořit tak více toxické deriváty [13]. Některé PAU jsou jak karcinogenní, tak

16 2 Teoretický úvod 16 i mutagenní. Nicméně PAH, které nejsou karcinogenní, se mohou chovat jako kokarcinogeny [9]. Polycyklické aromatické uhlovodíky také mohou pronikat přes kůži při koupání v kontaminované vodě nebo při použití pleťových krémů či šamponů obsahující tyto sloučeniny. Daleko významnější je ale příjem inhalací [4]. Tabulka 2. 2: Přehled výsledků testů na genotoxicitu a karcinogenitu polycyklických aromatických uhlovodíků (převzato z [15]). sloučenina mutagenita karcinogenita acenaften sporný* sporný acenaftylen sporný* nestudováno anthracen negativní negativní benzo[a]anthracen pozitivní pozitivní benzo[b]fluoranthen pozitivní pozitivní benzo[k]fluoranthen pozitivní pozitivní benzo[g,h,i]perylen pozitivní negativní benzo[a]pyren pozitivní pozitivní dibenzo[a,h]anthracen pozitivní pozitivní chrysen pozitivní pozitivní fenanthren sporný* sporný* fluoranthen pozitivní pozitivní* fluoren negativní negativní indeno[1,2,3-c,d]pyren pozitivní pozitivní naftalen negativní sporný* pyren sporný* sporný* * výsledek odvozený z malého souboru dat Některé polycyklické aromatické uhlovodíky jsou po vstupu do organismu nemutagenní, ale jejich metabolismus enzymy vede ke vzniku zpravidla vysoce mutagenních meziproduktů [4]. Metabolismus těchto sloučenin začíná v játrech, kde se na molekulu PAU naváže kyslík tím, že vstoupí do reakce s dvojící sousedních uhlíků některého z aromatických jader. Vzniká epoxid, který se rozloží za přítomnosti vody na dihydrodiol příslušného PAU. Na dihydrodiol se může navázat další atom kyslíku za vzniku dihydrodiolepoxidu, což je sloučenina, která je považována za bezpodmínečný karcinogen, neboť se bez dalších metabolických změn může navázat na DNA v jádru buňky. DNA adiční sloučeniny mají za následek vznik karcinogenu [14, 16]. Příklad metabolické aktivace benzo[a]pyrenu je na obr. 2.2.

17 2 Teoretický úvod 17 Obr. 2. 2: Metabolická aktivace benzo[a]pyrenu (upraveno podle [16]) Polycyklické aromatické uhlovodíky mohou způsobovat rakovinu, poruchy reprodukce a mutace i u zvířat [5]. Důvodem rozdílných hladin PAU v rybách a v ostatních vodních organismech, může být kromě odlišného metabolismu i rozdílná pohyblivost vodních živočichů a také fakt, že některé vodní organismy jsou v trvalém styku se sedimenty na dně vod, jež jsou obvykle PAU značně kontaminovány [17]. Je třeba zdůraznit, že imisní limity pro prachové částice jsou někdy překračovány a to nejen lokálně, ale i plošně [18]. Zatím jsou ale běžně se vyskytující koncentrace PAU v životním prostředí nízké a nehrozí bezprostřední akutní ohrožení lidského zdraví [5] Zdroje polycyklických aromatických uhlovodíků a jejich výskyt ve vodách a v sedimentech Polycyklické aromatické uhlovodíky se přirozeně vyskytují ve fosilních palivech, jako je uhlí a ropa [14], a proto většina polycyklických aromatických uhlovodíků pochází z neúplného spalování organických materiálů obsahující uhlík. Maximální množství PAU vzniká, když materiály hoří v teplotách mezi C [9]. Článek

18 2 Teoretický úvod 18 [17] uvádí, že PAU vznikají za nedokonalého přístupu vzduchu při teplotách v rozsahu C, zejména nad 700 C. Z antropogenních zdrojů představují největší podíl emisí PAU spalovací procesy, jako je spalování tuhých a kapalných paliv (uhlí, benzín, petrolej, motorová nafta), výroba tepelné a elektrické energie, produkce a zpracování kamenouhelného dehtu a výroba koksu. Dále se PAU uvolňují při výrobě, zpracování, použití asfaltu a hliníku, při některých průmyslových technologiích jako je krakování ropy a impregnace dřeva [17, 19]. Také mohou unikat při haváriích tankerů, lesních požárech a při spalování odpadů [19]. Závažným zdrojem expozice PAU je také cigaretový kouř. Bylo zjištěno, že vykouření tří balíčků cigaret bez filtru za den odpovídá příjmu 6-15 µg PAU [17]. Významným antropogenním zdrojem PAU jsou i automobilové výfuky [17,19] a spálené jídlo (opékání na dřevěném uhlí a pečení [9]). Na obr. 2.3 je graficky vyjádřen průměrný podíl významných sektorů na emisích polycyklických aromatických uhlovodíků Příčinnou výskytu PAU v potravinách mohou být kromě kontaminace ze vzduchu, vody a půdy, i některé technologické zásahy, prováděné během jejich výroby. Endogenní tvorba PAU při tepelné úpravě potravin je za běžných podmínek zanedbatelná. Pouze v extrémních případech např. přepálením tuku (při teplotách okolo 500 C) dochází k jejich vzniku. Mnohem významnější je exogenní znečištění, kdy potravina přichází do styku se zplodinami hoření při grilování, přímém sušení, pražení a především uzení [17]. Polycyklické aromatické uhlovodíky mohou v přírodě vznikat i přírodními biologickými procesy, biosyntézou řas, vodních rostlin a bakterií [19]. Dále jsou uvolňovány při vulkanické činnosti [14]. Nejvyšší koncentrace atmosférických PAU mohou být nalezeny v městském prostředí, kvůli rostoucí dopravě a malým rozptýlením atmosférických polutantů. [13]. Kvůli jejich schopnosti se přepravovat do značných vzdáleností ve formě plynů nebo vázané na polétavé částice, se polycyklické aromatické uhlovodíky vyskytují i v poměrně vysokých koncentracích ve venkovských a vzdálených oblastech [8]. Složení PAU emisí se významně mění v závislosti na zdroji spalování [11]. Srovnání distribuce jednotlivých uhlovodíků a jejich poměrné zastoupení umožňuje do určité míry odhalit jejich genezi. Například s klesajícím poměrem fluoranthenu k pyrenu vzrůstá pravděpodobnost původu z emisí z dopravy oproti emisím z uhlí.

19 2 Teoretický úvod 19 Převaha fluoranthenu a benzofluoranthenu ukazuje na původ z vysokoteplotních pyrolytických procesů. Poměrně snadno lze rozlišit PAU fosilního původu od PAU spalovacího původu [19]. veřejná energetika průmysl průmyslová energetika doprava emise z nakládání s palivy vytápění domácností Obr. 2. 3: Průměrný podíl významných sektorů na emisích polycyklických aromatických uhlovodíků (převzato z [20]) Do hydrosféry se PAU dostávají dvěma způsoby: jednak ze zdroje přes atmosféru a jednak ze zdroje přímo do hydrosféry. Ze zdroje přes atmosféru se dostanou polycyklické aromatické uhlovodíky do hydrosféry tzv. suchou depozicí, což je přímý spad z atmosféry anebo, tzv. mokrou depozicí a to znamená, že jsou strženy srážkovými vodami [2]. Atmosférická depozice je považovaná za důležitý vstup PAU do povrchových vod. Je odhadováno, že % polycyklických aromatických uhlovodíků vstupuje do hydrosféry právě z atmosférických zdrojů. Koncentrace PAU ve srážkách je někdy mnohem vyšší, než v přijímajícím vodním útvaru [8]. Druhý způsob, kdy se PAU dostávají do hydrosféry přímo ze zdroje je tehdy, když dojde k rozlití nebo průsaku ropných látek, ze vstupů z výpustí průmyslových i komunálních odpadních vod a povrchovým smyvem z ploch [4]. Významné množství polycyklických aromatických uhlovodíků, které se dostane kanály do povrchových vod, pochází právě z městského odtoku. Městský odtok obsahuje PAU z benzinu, nafty, produktů výfuku, částeček pneumatik a asfaltových povrchů. Vyšší koncentrace PAU v městském odtoku byly nalezeny během podzimu a zimy, kvůli vysokému výskytu vozidel v ulicích spojenému s použitím topných systémů. Fyzikálně-chemické vlastnosti mají vliv na chování a osud PAU. Může docházet k významným procesům jako je těkání, rozpuštění, adsorpce na pevné suspendované

20 2 Teoretický úvod 20 látky a následující sedimentace, biotická a neživá degradace, absorpce vodními organizmy a akumulace [8]. Polycyklické aromatické uhlovodíky tedy podléhají fotochemickým, chemickým a biochemickým transformacím, které na jedné straně vedou k jejich postupnému odstraňování z prostředí, avšak na druhé straně se mohou tvořit poměrně stabilní meziprodukty tohoto rozkladu, které mohou být i toxičtější než původní polycyklické aromatické uhlovodíky. Fotolýza probíhá především u těch PAU, které absorbují záření v UV oblasti. Vzhledem k jejich významné adsorpci na nerozpuštěných látkách mohou být koncentrace PAU v sedimentech řek a nádrží značně vysoké [19]. Důležitým faktorem pro adsorpci PAU je obsah organického materiálu v sedimentech. Vysokomolekulární polycyklické aromatické uhlovodíky vykazují silnou tendenci k sorpci na organický podíl. Sorpce v sedimentech roste se vzrůstem obsahu organického podílu a také přímo závisí na velikosti částic. Rozdělování PAU mezi vodu a sediment je vztaženo k obsahu organického materiálu v obou fázích. Doba setrvání PAU v různých částech prostředí je různá, závisí na vlastnostech dané sloučeniny a na vlastnostech prostředí. V sedimentech setrvávají PAU nejdéle, mohou se v nich totiž zakoncentrovat. Proto obsah PAU v sedimentech velmi dobře charakterizuje celkové dlouhodobější zatížení životního prostředí [4]. Koncentrace PAU přírodního původu se v sedimentech odhaduje na jednotky miligramů na kilogram sušiny, avšak v kontaminovaných oblastech může jít o desítky až stovky mikrogramů na kilogram sušiny [19]. 2.2 Metody stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků V podstatě se stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry skládá ze tří základních kroků. Prvním krokem je extrakce PAU ze vzorku, druhým krokem je čištění surového extraktu a třetím krokem je identifikace a stanovení obsahu PAU ve vzorku [2, 12] Izolace polycyklických aromatických uhlovodíků ze sedimentu Každá technika má své vlastní přednosti a výběr extrakční techniky je obvykle na základě extrakční účinnosti, selektivity, jednoduchosti operace, nejmenšího množství

21 2 Teoretický úvod 21 užívaného rozpouštědla, velikosti vzorku, rychlosti, výkonnosti a ceny [21]. Jednou z používaných technik k izolaci polycyklických aromatických uhlovodíků ze sedimentu je extrakce v ultrazvukové lázni. Ultrazvuková vibrace je technika, která vlivem akustické energie ultrazvukových vln s minimální frekvencí 16 khz způsobí rozkmitání molekul kapaliny [22]. Ultrazvuk zvyšuje účinnost působení rozpouštědla a současně promíchává extrakt [4]. Výhodou je vysoká extrakční účinnost, nižší přístrojové náklady, jednoduchost operace, malé či žádné úpravy vzorků a nižší extrakční teploty [23]. Další používanou moderní technikou je zrychlená extrakce rozpouštědlem (ASE = Accelerated Solvent Extraction), která je též známá pod názvem tlaková kapalinová extrakce (PLE = Pressurized Liqiud Extraction) či extrakce za zvýšeného tlaku (PFE = Pressurized fluid extraction). Tento typ extrakce je založený na tom, že vzorek je extrahován organickými rozpouštědly při teplotě v rozsahu 20 až 200 C, a za relativně vysokého tlaku od 4 do 20 MPa. Vysoký tlak udržuje rozpouštědlo ve stavu kapalném při vysoké teplotě, tedy při teplotě nad bodem varu rozpouštědla. Navíc takto vysoký tlak pomáhá rozpouštědlu se dostat mezi póry matrice a tím tedy zpřístupnit vzorek extrakčnímu rozpouštědlu. Aplikace vyšší teploty a tlaku podporuje rozpustnost vzorku, snižuje viskozitu a povrchové napětí rozpouštědel. Tyto změny zlepšují kontakt analytu s rozpouštědlem a tím je extrakce účinnější. Nevýhodou ASE extrakční techniky je relativně vysoká cena zařízení. Tato technika je spíše vhodná pro extrakci velkého množství vzorků [24]. K extrakci se u perzistentních organických polutantů, jako jsou právě PAU, používají nepolární rozpouštědla (pentan, hexan), případně kombinace středně polárních rozpouštědel (dichlormethan, aceton) [22, 24]. Výhodou superkritické fluidní extrakce (SFE = Supercritical Fluid Extraction) je, že namísto organických rozpouštědel využívá netoxický a levný oxid uhličitý, který se v superkritickém stavu chová jako nepolární rozpouštědlo. Superkritický stav znamená, že dané rozpouštědlo je zahřáté nad jeho kritickou teplotu a tlak. Kritická teplota pro oxid uhličitý je 31 C a kritický tlak je 7,4 MPa. Nad touto teplotou a tlakem má rozpouštědlo vlastnosti mezi plynem a kapalinou, například hustotu mají blízkou kapalinám a viskozitu podobnou plynům. Superkritické tekutiny mají nižší viskozitu, vyšší difuzivitu a téměř nulové povrchové napětí, usnadňující pronikání tekutiny do pórů matrice [22, 27]. Ačkoliv je oxid uhličitý vynikající rozpouštědlo

22 2 Teoretický úvod 22 pro nepolární organické látky, u některých aplikací však může být na závadu jeho nízká polarita. Se stoupající polaritou analytů totiž klesá jejich rozpustnost v oxidu uhličitém, což vede ke snížení účinnosti extrakce. To může být odstraněno tím, že se k oxidu uhličitému přidá nějaká další superkritická tekutina s přídavkem vhodné polární látky - modifikátoru (např. methanol, hexan, toluen, anilín, dichlormethan apod.). Pro zlepšení efektivity SFE extrakce je třeba vybírat takovou superkritickou tekutinu, která bude více polární a selektivní než oxid uhličitý. Modifikátory mění polaritu a solvatační sílu superkritické tekutiny nebo nahrazují molekuly analytu vázané na aktivní centra matrice a uvolňují analyt do superkritické fluidní fáze. Modifikátor může být buď přidaný ke vzorku v extrakční cele, nebo smíchaný předem s oxidem uhličitým [27]. Superkritická fluidní extrakce polycyklických aromatických uhlovodíků z environmentálních matric je provázena komplikacemi, které především vyplývají ze špatné rozpustnosti zvláště vícejaderných PAU v superkritické kapalině. A proto je třeba jejich rozpustnost zvýšit přídavkem některého z modifikátorů, které jsou uvedeny výše. K extrakci polycyklických aromatických uhlovodíků se kromě oxidu uhličitého využívá i oxid dusný, který poskytuje vyšší extrakční výtěžky. Největší výtěžnost PAU byla dosažena při použití oxidu dusného s 5 % methanolem [2, 27]. Uvádí se, že SFE poskytuje nižší výtěžnost PAU, než ASE extrakční technika [22]. Nevýhodou SFE techniky je rovněž vyšší cena zařízení. Extrakce pomocí mikrovln (MAE = Microwave Assisted Extraction) využívá mikrovlnného záření k ohřevu organického rozpouštědla, které je v kontaktu se vzorkem. Mikrovlnné zářeni je elektromagnetické záření, s frekvencí v rozsahu od 300 MHz k 300 GHz, resp. odpovídá vlnovým délkám od 1 cm do 100 cm. Teplo, které se generuje při mikrovlnném ohřívání ve vzorku, je podmíněno přítomností dielektrické sloučeniny. Čím větší dielektrická konstanta, tím větší množství tepelné energie se uvolní a tím rychlejší je ohřev při dané frekvenci záření. Rozpouštědlo musí být schopné absorpce toho typu energie a její přeměny na tepelnou energii. Běžně užívané rozpouštědla pro PAU extrakci s mikrovlnami jsou hexan, aceton, dichloromethan nebo chloroform/methanol. Pro těkavé sloučeniny se samozřejmě doporučuje uzavřená MAE extrakce, kdy je rozpouštědlo zahříváno na teplotu vyšší, než je jeho bod varu za atmosférického tlaku, což vede ke zvýšení rychlosti a účinnosti extrakce [22, 27].

23 2 Teoretický úvod Čištění surového extraktu polycyklických aromatických uhlovodíků Po izolaci PAU ze sedimentu, je potřeba získaný extrakt přečistit, tak aby se odstranily ostatní organické koextrahované látky, které by rušily analýzu [2]. Čištění se nejčastěji provádí na vhodném sorbentu nebo gelu [8]. Používá se tedy extrakce na tuhé fázi (SPE = Solid Phase Extraction) s polárními i nepolárními sorbenty. Polárním sorbentem může být silikagel či florisil a nepolárním sorbentem modifikovaný silikagel s nepolární funkční skupinou C 18 nebo C 8 [25]. Další metodou používanou k čištění extraktu je gelová permeační chromatografie (GPC = Gel Permeation Chromatography), která je založena na separaci látek podle velikosti jejich molekul. Dochází k rozdělení látek mezi nepohyblivou stacionární fázi (póry gelu) a mezi pohyblivou mobilní fázi. Malé molekuly pronikají hlouběji do pórů náplně kolony, a proto se vymývají jako poslední [26]. Po čištění je nutno odpařit původní extrakční činidlo pod proudem dusíku a pak k získanému extraktu přidat malé množství rozpouštědla, které je vhodné pro chromatografické nebo jiné stanovení [2] Chromatografické techniky stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků K vlastnímu stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry se využívá, jak vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) s UV-fotometrickou nebo s fluorescenční detekcí (FLD), tak i plynová chromatografie (GC) s plamenovým ionizačním detektorem (FID) či s hmotnostním detektorem (MS) [8]. U kapalinové chromatografie je stacionární fáze tvořena mikročásticemi silikagelu, na kterém je navázána nepolární oktadecylová (C 18 ) skupina. Mobilní fáze je většinou tvořena směsí acetonitril/voda nebo methanol/voda. Pro separaci PAU se používá gradientová eluce, neboť při isokratické eluci by analýza trvala dlouhou dobu (až 60 minut) a navíc by nedošlo k rozlišení některých polycyklických aromatických uhlovodíků [27]. UV-fotometrický detektor poskytuje univerzální detekci a umožňuje tak stanovit všech šestnáct polycyklických aromatických

24 2 Teoretický úvod 24 uhlovodíků. Nevýhodou UV detekce je nižší selektivita, a proto se detekují kromě PAU i ostatní koextrahující látky. Což při vyhodnocování způsobuje obtížné určení polycyklických aromatických uhlovodíků. Naopak fluorescenční detektor oproti UV detektoru poskytuje daleko vyšší selektivitu i citlivost, která se pohybuje v jednotkách ppb. Fluorescenční detektor ale umožňuje stanovit jen patnáct polycyklických aromatických uhlovodíků, neboť acenaftylen nevykazuje fluorescenci. Abychom dosáhli u FLD detektoru vysoké míry přesnosti je důležité vybrat vhodnou kombinaci vlnových délek excitace a emise [8]. Detekční limit je dán použitým zařízením a kvalitou chemikálií použitých pro extrakci vzorků a vyčištění extraktů. Obecně by mělo být u HPLC/FLD dosaženo limitu 0,01 mg kg 1 (v sušině) pro každý individuální uhlovodík [28]. V tabulce 2.4 jsou zaznamenány parametry analýzy (typ sorbentu, mobilní fáze, teplota, detektor a nastavení detektoru), které byly použity pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií v pevných matricích hydrosféry. Stacionární fází u plynové chromatografie je nepolární kapalina, kterou zpravidla bývá methylpolysiloxan a mobilní fází je helium [27]. Hmotnostní detektor, který se především používá ve spojení s plynovou chromatografií, poskytuje vysokou rozlišovací schopnost s vysokou mírou selektivity. Tento detektor může být použit i ve spojení s kapalinovou chromatografií. Jen zařízení pro LC/MS je dražší než pro GC/MS. Další často využívanou, avšak méně citlivou alternativou je použití systému plynového chromatografu s plamenově ionizačním detektorem [8,27]. V tabulce 2.5 jsou zaznamenány parametry analýzy (typ sorbentu, mobilní fáze, teplotní program, detektor), které byly použity pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků plynovou chromatografií v pevných matricích hydrosféry. Srovnání výsledků stanovení získaných metodami HPLC/FLD a GC/MS prokázalo, že obě tyto techniky poskytují pro stanovení šestnácti (u FLD patnácti) PAU přesné výsledky [4, 8].

25 Tabulka 2.4: Příklady stanovení PAU v pevných matricích hydrosféry vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na C18 stacionární fází mobilní fáze acetonitril/voda 50 % 80% acetonitril za 20 min 80 % 100 % za 15 min 15 min 100 % acetonitril acetonitril/voda 2 min 47 % acetonitril 47 % 90 % za 10 min 90 % 100 % za 8 min 10 min 100 % acetonitril methanol/voda (65/35 %) acetonitril/voda 5 min 40 % acetonitril 40 % 100 % acetonitril za 30 min 5 min 100 % acetonitril acetonitril/voda 3 min 49 % acetonitril 7 min 50 % acetonitril 50 % 100 % acetonitril za 30 min 10 min 100 % acetonitril acetonitril/methanol/voda 8 min 75% acetonitril, 7 % methanol 75 % 100 % acetonitril za 25 min *v publikaci neuvedeno průtok eluentu ml min 1 1,2 0,4 0,2 1,5 * 0,8 teplota C * detektor FLD UV FLD UV FLD FLD UV nastavení detektoru 237/347 nm 0 min (NAP, ACE, FLE, PHE, ANT) 284/405 nm 8 min (FLU, PYR BaA, CHR BbF, BkF, BaP, DBahA) 365/470 nm 16,5 min (IP, BghiP) 254 nm 267/330 nm (NAP) 275/315 nm (ACE, FLE); 247/357 nm (PHE) 238/418 nm (ANT, FLU, PYR) 286/410 nm (BaA); 270/393 nm (CHR) 294/425 nm (BbF, BkF, BaP, DBahA, BghiP) 245/500 nm (IP) 250 nm 260/340 nm 0 min (NAP, ACE, FLE, PHE) 260/400 nm 15 min (ANT, FLU, PYR) 270/380 nm 22 min (BaP, CHR) 280/430 nm 28 min (BbF, BkF, BaP) 290/415 nm 33 min (DBahA, BghiP) 300/500 nm 36 min (IP) 272/335 nm 0 min (NAP) 230/325 nm 13 min (ACE, FLU) 250/360 nm 15 min (PHE) 250/430 nm 16,5 min (ANT FLE) 270/385 nm 19,5 nm (PYR) 270/385 nm 23,5 min (BaA, CHR) 300/425 nm 27 min (BbF, BkF, BaP, DBahA) 300/455 nm 32,8 min (IP, BghiP) 254 nm LOD µg kg 1 0,3 2,0 2,0 40,0 0,1 4,0 * * 80,0 210,0 * literatura [29] [30] [31] [32] [33] [34] 2 Teoretický úvod 25

26 2 Teoretický úvod 26 Tabulka 2. 3: Příklady stanovení PAU v pevných matricích hydrosféry plynovou chromatografií stacionární fáze s hmotnostní detekcí a mobilní fází tvořenou helium průtok helia teplotní program LOD literatura ml min 1 µg kg 1 DB 5* ** 1 min teplota 60 C 60 C 175 C po 6 C/min 175 C 235 C po 3 C/min 235 C 300 C po 8 C/min 5 min teplota 300 C 1 min teplota 50 C 50 C 100 C po 10 C/min ZB 5* 0,7 100 C 250 C po 6 C/min 250 C 300 C po 3 C/min 5 min teplota 300 C 1 min teplota 120 C HP 5* 120 C 220 C po 20 C/min 1,5 1 min teplota 220 C 220 C 290 C po 5 C/min 2 min teplota 290 C HP 5* 1,0 60 C 260 C po 6 C/min 15 min teplota 260 C 1,5 min teplota 50 C Rtx 5* 1,5 50 C 180 C po 30 C/min 180 C 275 C po 10 C/min 15 min teplota 275 C *5%diphenylpolysiloxan, 95% dimethylpolysiloxan **v publikaci neuvedeno 0,1 2,0 [12] 1,0 10,0 [35] 1,0 3,0 [36] 1,0 15,0 [37] ** [38] Další techniky stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků Polycyklické aromatické uhlovodíky se v environmentální analýze stanovují většinou chromatografickými metodami, které jsou uvedeny v odstavci a to vzhledem k jejich mimořádné selektivitě, citlivosti a vhodnosti pro sériové analýzy [39]. K dalším, již méně používaným, metodám pro stanovení PAU v environmentální analýze patří vysokoúčinná kapalinová chromatografie s elektrochemickou detekcí (HPLC-ED). Nirmaier a kol. [40] touto technikou stanovil osm polycyklických aromatických uhlovodíků (acenaftylen, acenaften, fluoranthen, benzo[h]fluoranthen, benzo[k]fluoranthen, benzo[a]pyren, benzo[g,h,i]perylen a indeno[1,2,3-c,d]pyren). Amperometrický detektor umožňuje stanovit polycyklické aromatické uhlovodíky nepřímou elektrooxidací za vzniku radikál kationtu. Do mobilní fáze methanol/voda byla přidána kyselina trichloroctová, která slouží jako elektrolyt. Separace byla provedena na C 18 stacionární fázi. Jako pracovní elektroda byla použita skleněná

27 2 Teoretický úvod 27 uhlíková elektroda, referenční elektroda byla argentchloridová a pomocná elektroda byla ze zlata. Amperometrická detekce je vhodná pro stanovení všech polycyklických aromatických uhlovodíků, ale vykazuje nižší citlivost než fluorescenční detekce [40]. Polycyklické aromatické uhlovodíky se mohou také stanovovat kapilární elektrochromatografií, kde je kapilára naplněna stacionární fází a mobilní fáze je unášena elektroosmotickým tokem. Separace nenabitých analytů je způsobena jejich rozdílnou distribucí mezi sorbentem a eluentem. K separaci PAU se používá C 18 navázaný na silikagelu. Mobilní fází je většinou acetonitril s tetraboritanem sodným [27,41]. U micelární elektrokinetické chromatografie se do vodného pufru přidává povrchově aktivní látka (detergent), která vytváří v pufru micely. Micely mají hydrofilní povrch a hydrofobní jádro, nesou elektrický náboj, a proto se pohybují v elektrickém poli. Analyty s rozdílnou hydrofobicitou podléhají rozdílné distribuci mezi vodnou a micelární pseudostacionární fázi. Rozdíly v rychlostech micelami rozpouštěných a unášených analytů vedou k jejich vzájemné separaci. Polycyklické aromatické uhlovodíky jsou neutrální, vysoce hydrofobní částice, které budou tedy silně spojeny s micelární fází. Jelikož mají polycyklické aromatické uhlovodíky stejné vlastnosti, budou setrvávat v micelách stejně dlouho. Proto se k vodnému pufru, kterým většinou bývá boritan sodný, kromě detergentu (běžně dodecylsíran sodný) přidá například močovina a γ-cyklodextríny. Přičemž močovina zvyšuje rozlišení polycyklických aromatických uhlovodíků, neboť způsobuje prodloužení migračního času. Přidání různých typů cyklodextrinů do tlumivého roztoku může být použito k potlačení interakcí hydrofobních látek s micelami a tím také dochází ke zvýšení selektivity pro tento typ látek [27]. 2.3 Technika QuEChERS V roce 2000 navrhli Steven J. Lehotay a Michelangelo Anastassiadese novou techniku extrakce analytu ze vzorku, nazvanou QuEChERS (výslovnost stejná jako u anglického slova catchers) [42]. Název je zkratkou šesti slov, které vystihují vlastnosti této techniky: Quick = rychlá

28 2 Teoretický úvod 28 Easy = jednoduchá Cheap = levná Effective = efektivní Rugged = robustní Safe = bezpečná. Metoda byla původně vyvinuta pro analýzu veterinárních drog v živočišných tkáních, ale následně byla s velkým úspěchem použita i pro stanovení reziduálních pesticidů v rostlinném materiálu. V roce 2003 byla navržena a publikována QuEChERS technika pro multiresiduální analýzu pesticidů v potravinách a zemědělských výrobcích. Tato technika by mohla být přizpůsobená i jiným pevným matricím environmentálních vzorků [42,43]. QuEChERS technika ve srovnání s ostatními metodami snižuje až o 95 % spotřebu rozpouštědla a nákladů, a o 90 % snižuje i čas. Počet laboratoří, které používají techniku QuEChERS roste, v roce 2009 to bylo až o 40 %, a u laboratoří, kde hrají velkou roli finanční aspekty, byl nárůst až o 70 %. Na obr. 2.4 jsou zobrazeny tři standardní postupy pro stanovení reziduálních pesticidů v potravinách a zemědělských výrobcích: originální metoda od Lehotaye a Anastassiadese, oficiální metoda asociace analytických společností (AOAC International) od Lehotaye a standardní metoda (CEN) EN od Anastassiadese [43]. Obr. 2. 4: Kroky originální verze a oficiálních verzí QuEChERS úpravy vzorků pesticidů v analýze potravin (upraveno podle [43]).

29 2 Teoretický úvod 29 Technika QuEChERS tedy zahrnuje extrakci rozpouštědlem, kterým může být acetonitril, ethylacetát nebo aceton, dále rozdělení organické a vodné fáze použitím bezvodého síranu hořečnatého v kombinaci s různými solemi (např. chlorid sodný, octan sodný) efekt vysolování, čištění surového extraktu disperzní extrakcí na pevné fázi (d-spe) a analýzu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie či plynové chromatografie [43, 44]. Tato metoda je velmi flexibilní, neboť ji lze různě modifikovat v závislosti na stanovovaném analytu, použité matrici či instrumentaci. Faktory, které lze měnit jsou: typ vzorku, extrakční rozpouštědlo (acetonitril, ethylacetát, aceton) typ a množství přidané soli (chlorid sodný, octan sodný) ph vodné fáze obsah vody třepáni či míchání doba extrakce V článku [43] se uvádí, že je vždy zapotřebí k homogennímu vzorku s malou vlhkostí přidat vodu, aby se otevřely póry matrice a zlepšil se tak přístup rozpouštědla. Důležité je také zmínit, že po přidání bezvodého síranu hořečnatého k navlhčenému vzorku s rozpouštědlem dojde k velmi silné exotermické reakci. Bezvodý síran hořečnatý je totiž velmi silné sušidlo, a při jeho hydrataci se uvolňuje velké množství tepla, takže teplota vzorku se zvýší až na 40 C. Toto zvýšení teploty zlepšuje účinnost extrakce. Rozdíl mezi čištěním disperzní extrakcí oproti čištění klasickou extrakcí na pevné fázi je v tom, že se sorbent nasype přímo do čištěného extraktu [45]. Techniku d-spe lze modifikovat podle konkrétních požadavků na čištění. Například pro odstranění barev, sterolů, nepolárních sloučenin a jiných polárních sloučenin se používá grafitický uhlík (GCB) nebo pro odstranění lipidů a mastných kyselin s dlouhými řetězci se přidává C 18 sorbent. Sacharidy, mastné a organické kyseliny, lipidy a některé pigmenty lze odstranit přídavkem sorbentu na bázi primárních a sekundárních aminů (PSA). Pro odstranění chlorofylu se používá chlorofiltr [43, 44].

30 2 Teoretický úvod Aplikace techniky QuEChERS na stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků Ramalhosa a kol. [46] použil techniku QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků ve vzorcích ryb. Výzkum byl nejprve proveden na spikovaném (uměle kontaminovaném) vzorku ryb. K 5 g homogenizovaného vzorku byly přidány 2 ml standardního roztoku obsahujícího šestnáct vybraných PAU o různých koncentracích. Následovalo převedení do 50 ml teflonové centrifugační zkumavky, kde bylo naváženo 6 g bezvodého síranu hořečnatého a 1,5 g octanu sodného. Ke směsi ve zkumavce bylo dále přidáno 8 ml acetonitrilu. Extrakce byla provedena jednak mícháním na vortexu po dobu 1, 2, 3 a 5 minut a jednak pomocí ultrazvuku (frekvence 30 khz) po dobu 3, 10 a 20 minut. Surový extrakt byl čištěn v teflonové centrifugační zkumavce o objemu 15 ml, která obsahovala 900 mg bezvodého síranu hořečnatého, 300 mg PSA a 150 mg C 18. K analýze byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie s fluorescenční detekcí. Vlnové délky excitačního a emisního záření pro jednotlivé PAU jsou zaznamenány v tabulce 2.5. Na počátku byla mobilní fáze tvořena z 50 % acetonitrilu a 50 % vody, průtok mobilní fáze činil 0,8 ml min 1 a jako stacionární fáze byl použit C 18 sorbent. Tabulka 2. 4: Vlnové délky excitačního a emisního záření pro stanovované PAU (převzato ze [46]) sloučenina excitace emise nm nm naftalen acenaften fluoren fenanthren anthracen fluoranthen pyren benzo[a]anthracen chrysen benzo[b]fluoranthen benzo[k]fluoranthen benzo[a]pyren dibenzo[a,l]pyren dibenzo[a,h]anthracen benzo[g,h,i]perylen indeno[1,2,3-c,d]pyren

31 2 Teoretický úvod 31 Bylo zjištěno, že výtěžnost se zvyšovala při prodlužování doby víření na vortexu. K výraznému zvýšení výtěžnosti došlo především u fenanthrenu, anthracenu, benzo[a]anthracenu, dibenzo[a,l]pyrenu, benzo[b]fluoranthenu, dibenzo[a,h] anthracenu a indeno[1,2,3-c,d]pyrenu. Při extrakci v ultrazvukové lázni se výtěžnost také zvyšovala s časem extrakce, ale vždy byly výtěžnosti nižší než při použití vortexu. Vortex tedy umožňuje účinnou extrakci všech stanovovaných PAU [46]. Detekční limity se pohybovaly v rozmezí 0,04 0,56 µg kg 1. V literatuře byly spíše nacházeny odkazy na aplikaci metody QuEChERS na stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků ve vzorcích ryb a mořských plodů. Co se ale týče aplikace této metody na stanovení PAU v sedimentech, tak doposud nebyly nalezeny žádné publikace. Jen firma Agilent Technologies uvádí v aplikačních listech [47, 48] použití metody QuEChERS na stanovení PAU v půdách.

32 3 Experimentální část 32 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Referenční materiály a reálné vzorky K optimalizaci podmínek postupu a validaci metody QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích, byl používán referenční materiál od firmy Analytika, tzv. čistírenský kal QCM 7. Deklarované koncentrace jednotlivých PAU v referenčním materiálu QCM 7 včetně jejich nejistoty stanovení uvádí tabulka 3.1. Jako vztažné hodnoty pro naftalen, acenaften a fluoren byly použity dlouhodobé průměrné hodnoty vypočtené z regulačních diagramů vedených pro tyto látky. Tabulka 3. 1: Deklarované koncentrace jednotlivých PAU v referenčním materiálu QCM 7 sloučenina vztažná hodnota nejistota mg kg 1 mg kg 1 naftalen 0,268 acenaften 0,349 fluoren 0,107 fenanthren 1,000 0,348 anthracen 0,091 0,044 fluoranthen 1,615 0,548 pyren 1,542 0,480 benzo[a]anthracen 0,716 0,196 chrysen 0,815 0,134 benzo[b]fluoranthen 0,747 0,234 benzo[k]fluoranthen 0,351 0,088 benzo[a]pyren 0,588 0,160 dibenzo[a,h]anthracen 0,627 0,176 benzo[g,h,i]perylen 0,083 0,021 indeno[1,2,3-c,d]pyren 0,582 0,212 Jako reálné vzorky, pro srovnání metody QuEChERS s běžně používanými metodami, byly vybrány sedimenty a plaveniny odebrané v roce 2009, uložené ve sbírkách VÚV TGM v. v. i. Popis vzorků je uveden v tabulce 3.2. Vzorky byly po odebrání zmrazeny, sušením vymrazeny v lyofilizeru a rozemlety na kulovém mlýnu.

33 3 Experimentální část 33 Do zpracování byly uchovávány v zábrusových skleněných prachovnicích za laboratorní teploty. Mezi reálné vzorky byly zařazeny, jak materiály s relativně nízkými nálezy PAU řádově do 0,5 mg kg 1, tak i vzorky, u kterých se koncentrace PAU pohybovaly kolem hodnot 5 7 mg kg 1. Tabulka 3. 2: Seznam použitých reálných vzorků číslo vzorku místo odběru okres řeka matrice 6669 Troubky Přerov Bečva plavenina 6671 Otrokovice Zlín Dřevnice plavenina 6693 Hrádek nad Nisou Liberec Lužická Nisa sediment 6701 Dolní Olešnice Vestřev Trutnov Labe sediment 6812 Otrokovice Zlín Dřevnice sediment 6857 Zelčín Hořín Mělník Vltava sediment 6959 Dolní Olešnice Vestřev Trutnov Labe plavenina 6992 Hrádek nad Nisou Liberec Lužická Nisa plavenina 7009 Zelčín Hořín Mělník Vltava plavenina 7709 Bohumín Karviná Odra plavenina 3.2 Použité chemikálie Pro jednotlivé metody byly použity tyto chemikálie: aceton, SupraSolv, for gas chromatography (Merck); acetonitril, ChromaSolv, for liquid chromatography, gradient grade (Sigma-Aldrich); bezvodý síran hořečnatý, p. a. (Merck); bezvodý síran sodný, p.a., žíhaný 4 hodiny při 550 C, (Lach-Ner); dichlormethan, LichroSolv, for liquid chromatography, (Merck); dusík v čistotě 4.8 filtrovaný přes aktivní uhlí; ethylacetát, LichroSolv, for liquid chromatography (Merck); florisil 60/100 PR, mesh, aktivovaný 4 hodiny při 550 C (Supelco); hydromatrix; chlorid sodný p. a (Lach-Ner); isopropanol, for liquid chromatography, gradient grade (Merck); kolonky pro extrakci na pevné fázi Strata, náplň florisil, množství 0,5 g, délka 65 mm, průměr 15 mm (Phenomenex); methanol, for liquid chromatography, gradient grade (J. T. Baker); n-hexan, SupraSolv, for gas chromatography (Merck); octan sodný bezvodý p. a. (ChEMOSCz); oktadecyl, C18-T (55 µm, 140 A), z komerční SPE kolonky (Strata Phenomenex); 1,2-propandiol, p. a. (Fluka); PSA, typ U (Supelco); silikagel 60, ( µm), zahřívá se 14 h při teplotě 500 C (Merck); směsný standard šestnácti PAU, PAU MIX 9 (Dr. Ehrenstorfer); standard pro GPC připravený VÚV TGM v. v. i., který obsahuje bis(2-ethylhexyl)ftalát (Fluka), jedlý olivový olej, methoxychlor (Sigma-Aldrich), síra (Lachema) a perylen

34 3 Experimentální část 34 (Aldrich-Chemie); referenční materiál QCM 7, Metrochem, matrice čistírenský kal (Analytika). 3.3 Použité pomůcky a přístroje Pomůcky a přístroje pro přípravu a extrakci vzorků analytické váhy Sartorius a laboratorní váhy s přesností 0,01 g OHAUS (typ Adventura Pro) ASE 300 Dionex (USA) včetně zařízení k míchání výsledné extrakční směsi ze čtyř lahví (tzv. Solvent Controller) a řídícího počítače se softwarem AutoASE, extrakční cely o objemu 34 ml, sběrné nádoby na extrakty o objemu 250 ml, teflonová septa do sběrných nádob celulózový filtr Dionex P/N , 30 mm kolona pro GPC ENVIROGEL mm, velikost 10 µm, ochranná předkolonka pro GPC ENVIROGEL 4,6 30 mm, velikost částic 10 µm, podavač vzorků Waters 717 plus Autosampler, Waters 486 Tunable Absorbance Detector, Waters Fraction Colector III, řídící počítač se softwarem Milennium Waters kolonky pro extrakci na pevné fázi Strata Phenomenex (náplň florisil, množství 0,5 g, délka 65 mm, vnitřní průměr 15 mm) laboratorní odstředivka Hetlich Lentrifugen mikrostříkačka Hamilton stříkačkový filtr fy Membrane Solution (materiál PTFE, průměr 13 mm, velikost pórů 0,45 µm) TurboVap II včetně koncentračních nádobek třepačka IKA HS501digital ultrazvuková vana Sonorex zařízení pro extrakci na pevné fázi Machery-Nagel zařízení pro odpařování v proudu dusíku Ecom

35 3 Experimentální část Zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii vysokoúčinný kapalinový chromatograf Waters separační modul Aliance 2695 (vysokotlaké gradientové čerpadlo, vakuový odplyňovač mobilní fáze, autosampler, termostat kolon) Guard cartridge systém Phenomenex (dva kusy předkolonek, sorbent C 18, rozměry 4 2 mm) kolona Waters PAU (sorbent C 18, velikost částic 5 µm, rozměry mm) programovatelný fluorescenční detektor Waters 2475, PC s chromatografickým softwarem Empower Waters 3.4 Podmínky chromatografické analýzy pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry K separaci patnácti polycyklických aromatických uhlovodíků byla použita chromatografická kolona Waters PAU se stacionární fází C 18, mobilní fáze byla tvořena směsí methanol/voda v gradientovém programu (tab. 3.3), průtok mobilní fáze byl 0,64 ml min 1, teplota termostatu byla nastavena na 30 C, objem nástřiku vzorku na kolonu byl 10 µl. K detekci byl použit fluorescenční detektor, podmínky jeho nastavení jsou uvedeny v tab 3.4. Tabulka 3.5 uvádí rovnice kalibračních přímek pro jednotlivé polycyklické aromatické uhlovodíky. Chromatografické podmínky i rovnice kalibračních přímek byly převzaty ze standardního operačního postupu VÚV TGM v. v. i. Tabulka 3. 3:Gradientový program mobilní fáze v závislosti na čase čas min methanol % voda %

36 3 Experimentální část 36 Tabulka 3. 4: Vlnové délky excitačního a emisního záření pro stanovované PAU včetně změn citlivosti fluorescenčního detektoru v průběhu měření sloučenina čas excitace emise citlivost FLD detektoru min nm nm naftalen acenaften fluoren fenanthren antracen fluoranthen pyren benzo[a]anthracen chrysen benzo[b]fluoranthen benzo[k]fluoranthen benzo[a]pyren dibenzo[a,h]anthracen benzo[g,h,i]perylen indeno[1,2,3-c,d]pyren Tabulka 3. 5: Rovnice kalibračních přímek pro jednotlivé PAU sloučenina rovnice kalibrační přímky naftalen h (µv) = 4, c (ng µl 1 ) acenaften h (µv) = 1, c (ng µl 1 ) fluoren h (µv) = 3, c (ng µl 1 ) fenanthren h (µv) = 3, c (ng µl 1 ) anthracen h (µv) = 3, c (ng µl 1 ) fluoranthen h (µv) = 1, c (ng µl 1 ) pyren h (µv) = 1, c (ng µl 1 ) benzo[a]anthracen h (µv) = 2, c (ng µl 1 ) chrysen h (µv) = 2, c (ng µl 1 ) benzo[b]fluoranthen h (µv) = 2, c (ng µl 1 ) benzo[k]fluoranthen h (µv) = 6, c (ng µl 1 ) benzo[a]pyren h (µv) = 4, c (ng µl 1 ) dibenzo[a,h]anthracen h (µv) = 1, c (ng µl 1 ) benzo[g,h,i]perylen h (µv) = 1, c (ng µl 1 ) indeno[1,2,3-c,d]pyren h (µv) = 2, c (ng µl 1 ) h = výška píku 3.5 Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných vzorcích vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s použitím extrakce za zvýšeného tlaku a gelové permeační chromatografie Do extrakční cely objemu 34 ml byl vložen celulosový filtr, byly přidány 3 g florisilu a směs, složena z 3 g florisilu, 3 g hydromatrixu a 2 g vzorku. Podle potřeby byl ještě dosypán hydromatrix a opět byl vložen celulosový filtr. Cela byla uzavřena víčkem,

37 3 Experimentální část 37 a byla vložena do horního automatického podávače přístroje ASE 300. Do spodního karuselu byly umístěny sběrné láhve. Pomocí řídícího počítače byly nastaveny podmínky pro extrakci. Jako extrakční činidlo byla použita směs hexan/aceton v poměru 9:1, teplota extrakce byla 120 C, objem proplachu činil 70 % objemu cely a tlak v cele je automaticky udržován v oblasti 103,4 bar (1500 psi). Po ukončení extrakce byl celý extrakt pomocí tlakového dusíku vytlačen do sběrné nádoby. Cela byla ještě automaticky promyta hexanem a vše bylo spojeno do sběrné nádoby. Uvedené extrakční podmínky vedou k celkovému objemu 100 ml extraktu zachyceného do sběrné nádoby. Ze sběrné nádoby byl extrakt převeden do koncentrační nádobky, která byla vložena do zařízení TurboVap. V TurboVapu byl získaný extrakt pod proudem dusíku postupně převeden do dichlormethanu a pak byl extrakt zakoncentrován na objem 1 ml. Tento objem byl převeden do odměrné baňky na 5 ml, a baňka byla doplněna po rysku dichlormethanem. Pomocí stříkačkových filtrů byl extrakt z odměrné baňky přefiltrován do vialek používaných k nástřiku na GPC kolonu. Před nástřikem vzorků na kolonu bylo nutné zkontrolovat stabilitu retenčních časů pro odběr požadované frakce. To bylo provedeno nadávkováním 200 µl interního laboratorního standardu (složeného z olivového oleje, bis(2-ethylhexyl)ftalátu, methoxychloru, perylenu a síry) na GPC kolonu. Poté byl nastříknut na GPC kolonu vzorek a přečištěný extrakt byl jímán do koncentrační nádobky mezi 8,5 a 13,5 minutou. Mobilní fází byl dichlormethan, průtok mobilní fáze činil 5 ml min 1, objem nástřiku byl 2 ml, na UV detektoru byla nastavena vlnová délka na 254 nm a objem získané frakce byl 25 ml. Přečištěný extrakt byl v TurboVapu pod proudem dusíku postupně převeden do hexanu a pak byl zakoncentrován na objem 1 ml. Tento objem byl převeden do 5 ml odměrné baňky a baňka byla doplněna hexanem po rysku. Poté byly z odměrné baňky odebrány 2 ml extraktu do předem zvážené zkumavky a zkumavka byla znova zvážena. Do zvážené zkumavky se 2 ml extraktu bylo přidáno 1000 l směsi 1,2-propandiolu s isopropanolem (4:1), aby se zabránilo ztrátám těkavějších PAU, neboť 1,2-propandiol se za těchto podmínek neodpařuje. Následně byl extrakt odpařován přibližně na objem 0,4 ml a zkumavka s extraktem byla zvážena. Při odpaření dusíkem došlo k odpaření hexanu a isopropanolu. Pak bylo přidáno

38 3 Experimentální část l methanolu, a vše bylo ze zkumavky převedeno do vialky. Pokud vypadly sraženiny, bylo nutné extrakt odstředit v odstředivce při 2500 rpm po dobu 10 minut. Čirá vrstva pak byla převedena do čisté vialky, K analýze PAU byla použita vysokoučinná kapalinová chromatografie, podmínky měření jsou uvedeny v kapitole 3.4. Identifikace PAU byla provedena porovnáním retenčních časů s retenčními časy externího směsného standardu. S každým měřením byl také zpracován slepý pokus, kterým se testuje vliv kvality použitých chemikálií a materiálů na výsledky analýzy. Pro získání koncentrace jednotlivých PAU v reálném vzorku bylo nutné si vypočítat tzv. konstantu K K = V V PAU V V GPC m V ASE d e e (3.1) m 0(GPC) n kde K je konstanta [µl g 1 ], V ASE objem získaný po ASE [ml], V PAU objem odebraný pro PAU [ml], V d objem extraktu zakoncentrovaný v dichlormethanu [ml], V GPC objem vnesený na GPC [ml], m e hmotnost extrakčního činidla [g], m 0(GPC) hmotnost extraktu získaného po GPC [g], V e objem zakoncentrovaného extraktu, z něhož se provádí nástřik na kolonu [µl], n navážka vysušeného vzorku [g]. Tato konstanta byla použita v chromatografickém softwaru Empower Waters, kde byla automaticky vypočtena koncentrace jednotlivých PAU ve vzorku [mg kg 1 ] podle následujícího vzorce m K 3 c a = 10 V i (3.2) kde c a je koncentrace jednotlivých PAU ve vzorku [mg kg 1 ], m absolutní množství analytu v nástřiku na kolonu zjištěné z kalibrační křivky [ng], K konstanta [µl g 1 ], V i objem extraktu nastříknutého k analýze [µl], 10 3 z důvodu převodu jednotek z ng g 1 na mg kg 1.

39 3 Experimentální část Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných vzorcích vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s použitím ultrazvukové extrakce a extrakce na pevné fázi Do skleněných vialek o objemu 25 ml bylo na analytických vahách naváženo 0,5 g vzorku a 0,5 g bezvodého síranu sodného, a k navážce bylo přidáno 15 ml směsi hexan/aceton (1:1). Vialka byla uzavřena víčkem se septem. Následně byla provedena extrakce v ultrazvukové lázni vytemperované na 40 C po dobu 40 minut. Během extrakce byla vialka dvakrát (po 13 a 26 minutách) intenzivně protřepána. Vialka se nechala zchladnout a poté byl extrakt odstředěn v odstředivce při 2500 rpm po dobu 10 minut. Po centrifugaci byl extrakt převeden do předem zvážené skleněné zkumavky a zkumavka s extraktem byla opět zvážena. Následovalo odpaření extraktu dusíkem, aby se extrakt zakoncentroval na menší objem. Extrakt byl odpařen ke 2 ml a stěny byly spláchnuty hexanem a opět byl extrakt odpařován až na objem 1 ml. Poté byl extrakt vyčištěn pomocí SPE kolonek s florisilem. Nejprve byla provedena kondicionace kolonky promytím 4 ml hexanu. Do stojánku ve spodní části zařízení pro SPE byly umístěny předem zvážené 10 ml skleněné zkumavky. Na kolonku byl nanesen extrakt, který kolonkou protékal, rychlostí jedna kapka za sekundu. Zkumavka od extraktu byla propláchnuta 4 ml hexanu, následně použitými pro eluci analytů. V dalším kroku byly analyty eluovány 4 ml směsi hexan/dichlormethan (2:1). Poté byla krátce zapnuta vakuová vývěva, aby na florisilu nezůstalo žádné rozpouštědlo. Opět následovalo odpaření vyčištěného extraktu v proudu dusíku. Extrakt byl tedy odpařen na 1 ml a automatickou pipetou bylo přidáno 1000 l směsi isopropanol/ 1,2-propandiol (4:1), aby se zabránilo ztrátám těkavějších PAU. Následně byl extrakt zakoncentrován až k objemu 0,4 ml a zkumavka s odparkem byla zvážena. Při odpaření dusíkem došlo k odpaření hexanu, dichlormethanu a isopropanolu. K odparku bylo přidáno 1000 l methanolu, a vše bylo ze zkumavky převedeno do vialky. Pokud vypadly sraženiny, bylo nutné extrakt odstředit v odstředivce při 2500 rpm po dobu 10 minut. Čirá vrstva pak byla převedena do čisté vialky. K analýze PAU byla použita vysokoučinná kapalinová chromatografie, podmínky měření jsou uvedeny v kapitole 3.4. Identifikace PAU byla provedena porovnáním retenčních

40 3 Experimentální část 40 časů s retenčními časy externího směsného standardu. S každým měřením byl také zpracován slepý pokus. Pro získání koncentrace jednotlivých PAU v reálném vzorku bylo nutné si vypočítat tzv. konstantu K K = me Ve (3.3) m n 0 kde K je konstanta [µl g 1 ], m e celková hmotnost extrakčního činidla [g], V e objem zakoncentrovaného extraktu, z něhož se provádí nástřik na kolonu [µl], m 0 hmotnost získaného extraktu [g], n navážka vysušeného vzorku [g]. Tato konstanta byla použita v chromatografickém softwaru Empower Waters, kde byla automaticky vypočtena koncentrace jednotlivých PAU ve vzorku [mg kg 1 ] podle vzorce (3.2). 3.7 Stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných vzorcích vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s použitím metody QuEChERS Do 40 ml skleněné vialky byly na analytických vahách naváženy 2,0 g vzorku, bylo přidáno 5 ml destilované vody a vialka byla protřepána. Na 10 minut byla vialka vložena do lednice, aby se voda vsákla do vzorku. Bylo přidáno 10 ml ethylacetátu, a vialka byla opět protřepána. Pak byla přidávána směs 6 g bezvodého síranu hořečnatého a 1,5 g chloridu sodného. Jelikož přidání směsi způsobí velmi silnou exotermickou reakci, je potřeba směs přidávat pomalu. Vialka byla položena na třepačku, a byla třepána na horizontální třepačce 10 minut při rychlosti 300 rpm. Poté byla odstředěna v odstředivce při 2500 rpm po dobu 10 minut. Byl získán surový extrakt, který byl odpipetován do zkumavky s naváženou směsí na čištění pomocí d-spe (1,2 g bezvodého síranu hořečnatého a 400 mg florisilu). Po odstředění při 2500 rpm po dobu 10 minut, byl získán přečištěný extrakt, který byl přepipetován do předem zvážené skleněné zkumavky a zkumavka s extraktem byla zvážena. U velmi znečištěných vzorků není účinnost popsané d-spe dostačující, a proto je zapotřebí, aby byly extrakty dočištěny. Po centrifugaci byla do zkumavky s první

41 3 Experimentální část 41 směsí na čištění přidána ještě druhá směs na čištění (1,2 g bezvodého síranu hořečnatého a 400 mg PSA). Poté bylo zopakováno odstředění a získaný dočištěný extrakt byl odpipetován do předem zvážené skleněné zkumavky a zkumavka s extraktem byla zvážena. Pak následovalo odpaření vyčištěného extraktu v proudu dusíku. Extrakt byl tedy odpařen na 1 ml a automatickou pipetou bylo přidáno 1000 l směsi isopropanol/ 1,2-propandiol (4:1), aby se zabránilo ztrátám těkavějších PAU, neboť 1,2-propandiol se za těchto podmínek neodpařuje. Následně byl extrakt zakoncentrován až k objemu 0,4 ml a zkumavka s odparkem byla zvážena. Při odpaření dusíkem došlo k odpaření ethylacetátu a isopropanolu. K odparku bylo přidáno 1000 l methanolu, a vše bylo ze zkumavky převedeno do vialky. Pokud vypadly sraženiny, bylo nutné extrakt odstředit v odstředivce při 2500 rpm po dobu 10 minut. Čirá vrstva pak byla převedena do čisté vialky. K analýze PAU byla použita vysokoučinná kapalinová chromatografie, podmínky měření jsou uvedeny v kapitole 3.4. Identifikace PAU byla provedena porovnáním retenčních časů s retenčními časy externího směsného standardu. S každým měřením byl také zpracován slepý pokus. Pro získání koncentrace jednotlivých PAU v reálném vzorku bylo nutné si vypočítat tzv. konstantu K podle vzorce (3.3) a použit ji v chromatografickém softwaru Empower Waters k výpočtu koncentrace jednotlivých PAU ve vzorku podle vzorce (3.2).

42 4 Výsledky a diskuze 42 4 VÝSLEDKY A DISKUZE 4.1 Optimalizace metody QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry Optimalizace metody QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry byla provedena na certifikovaném referenčním materiálu QCM 7. Originální metodika QuEChERS [44] byla modifikována v těchto parametrech: typ extrakčního činidla (acetonitril, ethylacetát) složení směsi solí (MgSO 4 + NaCl, MgSO 4 + CH 3 COONa) způsob provedení extrakce (třepání, ultrazvuk) typ čistící složky (C 18, PSA, aktivní uhlí, silikagel, florisil) Další postup zpracování vzorku byl shodný s originální metodou QuEChERS [44], s vyjímkou posledního kroku zakoncentrování a převodu do rozpouštědla kompatibilního s mobilní fází, který je uveden ve standardním operačním postupu VÚV TGM v. v. i. pro stanovení PAU metodou HPLC v pevných vzorcích. Jako extrakční činidla byla testována středně polární rozpouštědla acetonitril a ethylacetát. Z hlediska toxicity mají obě rozpouštědla podobné vlastnosti. Ale odlišná je jejich cena, acetonitril je dražší než ethylacetát. K navážce vzorku byl vždy přidáván bezvodý síran hořečnatý, sloužící k odstranění vody, spolu s další solí (chlorid sodný nebo octan sodný) pro zlepšení oddělení vodné a organické fáze. Byly odzkoušeny dva způsoby extrakce, třepání na horizontální třepačce a extrakce v ultrazvukové lázni s dobou expozice 10, 20 a 40 minut. V čistícím kroku byl vždy přidáván bezvodý síran hořečnatý z důvodu odstranění přebytečné vody. Jako další přídavné složky byly z hlediska účinnosti čištění a vlivu na celkovou výtěžnost, testovány C 18, florisil, silikagel, PSA, aktivní uhlí.

43 4 Výsledky a diskuze 43 Výsledky stanovení PAU v referenčním materiálu QCM 7 metodou QuEChERS za různě modifikovaných podmínek postupu, přepočtené na výtěžnost, uvádí tabulka 4.1. Z tabulky je patrné, že při použití aktivního uhlí došlo ke ztrátám, tj. výraznému snížení výtěžnosti PAU s pěti benzenovými jádry (15 31 %), což lze vysvětlit silnějšími sorpčními vlastnostmi těchto analytů oproti 2 4 jaderným PAU (50 99 %). U ostatních způsobů čištění extraktů jsou dosažené výsledky srovnatelné a pohybují se u 2 4 jaderných PAU v rozmezí %. U pěti jaderných PAU jsou celkově dosažené hodnoty nižší a leží v intervalu %. Na výtěžnosti se neprojevilo ani prodloužení doby expozice v ultrazvukové lázni, protože všechny získané výsledky dosahují % výtěžnosti bez ohledu na dobu extrakce. V tabulce 4.1 nejsou mezi výtěžnostmi 2 4 jaderných PAU zahrnuty výsledky pro naftalen, protože jeho výtěžnosti (38 70 %) mohou být ovlivněny ztrátami během přípravy vzorků, zejména při zakoncentrování extraktů. Výtěžnosti PAU v certifikovaném referenčním materiálu QCM 7 stanovené metodou ASE/GPC se pohybují v rozmezí % a metodou SPE/UZ v rozmezí %. Rovněž není nezahrnuta výtěžnost pro naftalen. Pro výběr optimálních podmínek metody QuEChERS bylo proto zvoleno ekonomické hledisko. Jako nejlevnější se jeví varianta: organické rozpouštědlo ethylacetát sůl přidávaná k síranu hořečnatému chlorid sodný extrakce třepání po dobu 10 minut čistící složka florisil Při následných analýzách reálných vzorků, za použití optimalizované metody s florisilem v prvním čistícím kroku, bylo zjištěno, že u silně znečištěných extraktů nebylo čištění pomocí d-spe účinné, neboť extrakty zůstávaly zbarvené. K dočištění byl na základě srovnání chromatografických záznamů vybrán PSA, protože u vzorků čištěných PSA byl patrný úbytek polárních látek, eluujících na začátku analýzy. Při rozhodování o dodatečném čistícím kroku je nutné si uvědomit, že přídavek relativně drahého PSA zvyšuje cenu stanovení.

44 Tabulka 4. 1: Výtěžnosti získané při modifikaci podmínek postupu metody QuEChERS čištění čistící složka bez čištění 2 4 benzenová jádra výtěžnost, % 5 benzenových jader Výsledky a diskuze 44 MgSO4 MgSO4 MgSO4 MgSO4 C18 C18 + PSA C18 C18 C18 + PSA rozpouštědlo acetonitril ethylacetát extrakce soli NaCl CH3COONa NaCl (UZ 10 min) NaCl (UZ 20 min) NaCl (UZ 40 min) NaCl sůl PSA aktivní uhlí silikagel florisil bez čištění PSA C18 + PSA florisil bez čištění PSA silikagel florisil

45 4 Výsledky a diskuze Validace metody QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry Validace metody QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků byla provedena dle normy ČSN EN ISO/IEC 17025:2005. Pro účely validace bylo provedeno deset nezávislých stanovení materiálu QCM 7 celým postupem. K výpočtům validačních parametrů byl použit program EffiValidation 3.0 od firmy EffiChem. Byly testovány tyto validační parametry: opakovatelnost, správnost, citlivost, linearita, mez detekce a mez stanovitelnosti. Všechny tyto validační parametry a jejich získané výsledky jsou zaznamenány v tabulce 4.2. V příloze je uveden validační protokol fluoranthenu pro správnost, přesnost, linearitu a citlivost. Na obr. 4.1 je chromatografický záznam standardního referenčního materiálu QCM 7. K ověření přesnosti resp. opakovatelnosti byla zvolena opakovatelnost po úrovních z vícenásobného měření a odlehlost výsledků byla testována pomocí Grubbsova párového testu, jednoduchého Grubbsova testu a také Dixonova testu. Opakovatelnost byla vyjádřena jako relativní směrodatná odchylka v procentech z deseti měření. Též byla ověřena i normalita. K ověření správnosti byl zvolen způsob výpočtu pomocí omezeného koncentračního rozsahu s referenčním materiálem k dispozici a byla vyjádřena jako výtěžnost v procentech z deseti měření. Linearita byla prokázána na základě hodnot korelačního a QC koeficientu. Požadavky na výsledné hodnoty jsou: korelační koeficient minimálně 0,9900, QC koeficient maximálně 5 %. Citlivost metody vyjadřující nejmenší rozdíl koncentrace, jenž lze ještě detegovat, byla dána směrnicí kalibrační křivky. Limit detekce i limit kvantifikace byly zjištěny z poměru signál/šum. Limit detekce (LOD), který představuje koncentraci, kdy lze ještě s definovanou pravděpodobností tvrdit, že je analyt přítomen, ovšem nelze určit jeho koncentraci je vyjádřen jako trojnásobek šumu základní linie. Limit kvantifikace (LOQ), který představuje koncentraci, kdy lze s definovanou pravděpodobností již tvrdit, že je analyt přítomen v dané koncentraci, je vyjádřen jako desetinásobek šumu základní linie.

46 4 Výsledky a diskuze 46 Byla provedena částečná validace, která prokázala, že metoda QuEChERS je vhodná pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry. sloučenina Tabulka 4. 2: Validační parametry a jejich získané výsledky pro jednotlivé PAU relativní opakovatelnost správnost linearita citlivost LOD LOQ % % µv µl ng 1 µg kg 1 µg kg 1 naftalen 9,60 48,8 1,0000 4, ,1 0,4 acenaften 5,03 81,2 1,0000 1, ,9 2,9 fluoren 5,03 78,3 1,0000 3, ,4 1,4 fenanthren 3,95 79,3 0,9999 3, ,4 1,3 anthracen 6,36 81,2 0,9997 3, ,4 1,2 fluoranthen 4,28 90,7 0,9999 1, ,2 0,8 pyren 4,38 94,5 0,9999 1, ,3 1,1 benzo[a]anthracen 4,37 92,6 0,9999 2, ,3 0,9 chrysen 4,57 88,6 0,9998 2, ,3 0,9 benzo[b]fluoranthen 4,18 85,9 0,9999 2, ,4 1,3 benzo[k]fluoranthen 4,08 92,0 0,9999 6, ,2 0,6 benzo[a]pyren 3,94 64,1 0,9999 4, ,2 0,8 dibenzo[a,h]anthracen 12,79 77,8 0,9999 1, ,4 1,3 benzo[g,h,i]perylen 4,24 83,2 0,9999 1, ,3 1,0 indeno[1,2,3-c,d]pyren 5,83 76,8 0,9999 2, ,2 0,8

47 4 Výsledky a diskuze 47 Obr. 4. 1: Chromatogram certifikovaného referenčního materiálu QCM 7 upraveného optimalizovanou metodou QuEChERS, separace 15 PAU na C18 stacionární fázi; mobilní fáze: methanol/voda, 2 min 70 % MeOH, % MeOH za 7 min, 15 min 100 % MeOH, % MeOH za 1 min; průtok eluentu 0,64 ml min 1 ; nástřik 10 µl vzorku; fluorescenční detekce: 273/323 nm (NAP), 245/340 nm (ACE, FLE, PHE), 248/375 nm (ANT), 232/430 nm (FLU, PYR), 270/385 nm (CHR, BaA), 294/440 nm (BbF), 294/400 nm (BkF, BaP), 293/410 nm (DBahA, BghiP), 300/500 nm (IP)

48 4 Výsledky a diskuze Porovnání výsledků získaných metodou QuEChERS s výsledky získanými běžně používanými metodami pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry Jako vztažné hodnoty pro vzájemné porovnávání všech testovaných metod byly vybrány koncentrace získané metodou ASE/GPC. V tabulce 4.3 a 4.4 jsou zaznamenány koncentrace PAU v reálných vzorcích naměřené pomocí uvedených metod. Rozdíly koncentrací PAU získaných metodami QuEChERS a UZ/SPE se od vztažných hodnot získaných metodou ASE/GPC u většiny analýz pohybují v rozmezí 0 20 %. Nejistota stanovení kolem hodnoty 20 % se v oblasti chromatografických analýz organických látek považuje za přijatelnou. Lze tedy říci, že obě metody, jak QuEChERS, tak i UZ/SPE, poskytují až na několik výjimek, srovnatelné výsledky s metodou ASE/GPC. Rovněž i meze detekce a stanovitelnosti všech tří metod se shodují. Na obr. 4.2 je chromatografický záznam reálného vzorku 6669.

49 4 Výsledky a diskuze 49 Tabulka 4. 3: Koncentrace polycyklických aromatických uhlovodíků v reálných vzorcích naměřené uvedenými metodami

50 4 Výsledky a diskuze 50 Tabulka 4. 4: Koncentrace polycyklických aromatických uhlovodíků v reálných vzorcích naměřené uvedenými metodami

51 4 Výsledky a diskuze 51 Obr. 4. 2: Chromatogram vzorku 6669 upraveného optimalizovanou metodou QuEChERS, separace 15 PAU na C18 stacionární fázi; mobilní fáze: methanol/voda, 2 min 70 % MeOH, % MeOH za 7 min, 15 min 100 % MeOH, % MeOH za 1 min; průtok eluentu 0,64 ml min 1 ; nástřik 10 µl vzorku; fluorescenční detekce: 273/323 nm (NAP), 245/340 nm (ACE, FLE, PHE), 248/375 nm (ANT), 232/430 nm (FLU, PYR), 270/385 nm (CHR, BaA), 294/440 nm (BbF), 294/400 nm (BkF, BaP), 293/410 nm (DBahA, BghiP), 300/500 nm (IP)

52 4 Výsledky a diskuze Porovnání ceny přípravy vzorků metodou QuEChERS s běžně používanými metodami pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry Ke zjištění ceny přípravy vzorků byly vzaty ceny chemikálií od firmy Sigma Aldrich, které firma uvádí na svých internetových stránkách [49]. Ceny chemikálií za dané množství uvedené v ceníku, byly přepočteny na množství, které bylo použito, a následným součtem těchto vypočtených cen byla zjištěná celková cena pro přípravu jednoho vzorku testovanou metodou. Tato cena pak byla vyjádřena pro sérii deseti vzorků. V ceně jsou zahrnuty pouze materiálové náklady na extrakci a čištění vzorků. Přehled cen přípravy vzorků pro sérii deseti vzorků testovanými metodami uvádí tabulka 4.5. Jak je vidět v tabulce 4.5, nejnižší náklady pro přípravu série deseti vzorků pro stanovení PAU poskytuje metoda QuEChERS, ale jen za předpokladu, že surové extrakty těchto deseti vzorků budou málo znečištěné a budou se čistit pouze jednokrokově. Jinak pro každý vzorek, který bude třeba dočistit přidáním PSA, cena analýzy vzroste přibližně o 65 Kč. Celková cena pro sérii deseti silně znečištěných vzorků by tedy vystoupala až na 1200 Kč. Je nutné se ještě zmínit, že pořizovací cena přístroje pro ASE extrakci je finančně velmi nákladná, a rovněž je i nákladný provoz přístroje při zpracování vzorků. U metody QuEChERS, kde se k extrakci vzorků používá jen horizontální třepačka, jsou finanční náklady, oproti ASE minimální. Tabulka 4. 5: Ceny přípravy vzorků pro sérii deseti vzorků technika cena přípravy vzorků Kč ASE/GPC UZ/SPE 930 QuEChERS 520* *cena s jednokrokovým čištěním

53 4 Výsledky a diskuze Porovnání časové náročnosti metody QuEChERS s běžně používanými metodami pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry Doba nutná pro provedení extrakce a čištění série deseti vzorků technikami ASE/GPC, UZ/SPE a QuEChERS je graficky porovnána na obrázku 4.3. Také je rovněž zobrazeno, jak dlouho trvá analýza deseti vzorků pomocí HPLC/FLD. Jak je vidět z grafu, extrakce i čištění pro sérii deseti vzorků probíhá nejrychlejší u metody QuEChERS. Pokud by bylo třeba extrakty dočišťovat s PSA, doba čištění by se oproti základnímu čištění prodloužila přibližně o minut. Z grafu rovněž vyplývá, že časově nejnáročnější je metoda ASE/GPC. K tomu je však nutné poznamenat, že tato metoda je plně automatizovaná a po spuštění přístrojů neklade časové nároky na obsluhu. Naopak u metod UZ/SPE a QuEChERS je vyžadován značný podíl manuální práce. Obr. 4. 3: Doba trvání extrakce, čištěni a analýzy pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry

54 5 Závěr 54 5 ZÁVĚR Cílem této diplomové práce bylo: optimalizovat a validovat techniku QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry použít techniku QuEChERS pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v reálných vzorcích porovnat časové a finanční náklady metody QuEChERS s běžně používanými metodami pro stanovení těchto sloučenin v pevných matricích hydrosféry Na základě dosažených výsledků lze konstatovat, že metoda QuEChERS je vhodná pro stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných matricích hydrosféry, což bylo prokázáno i validací této metody. Technika QuEChERS poskytuje i srovnatelné výsledky s metodou ASE/GPC a UZ/SPE. Z hlediska časové náročnosti i ceny přípravy vzorků umožňuje metoda QuEChERS, narozdíl od metod ASE/GPC a UZ/SPE, rychlé a levné stanovení polycyklických aromatických uhlovodíků v pevných vzorcích.

55 6 Literatura 55 Literatura [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] Pandit G. G., Srivastava K. P., Sharma S., Sahu K. S.: Monitoring of persistent organic pollutants (POPs) in aerosols using HPLC. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 25:8, (2002). Kužílek V.: Polycyklické aromatické uhlovodíky v hydrosféře. Praha, Výzkumný ústav vodohospodářský Tomáše Garrigua Masaryka Hafkenscheid, T. L.: Standard atmospheres and reference materials for PAH monitoring. Fresenius Environmental Bulletin 8:9/10, (1999). CA 131: Holoubek I.: Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAHs) v prostředí. Praha, Český ekologický ústav a Odbor ekologických rizik a monitoringu MŽP ČR Integrovaný registr znečisťování. Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU). Dostupné na WWW: < [cit ]. The European Pollutant Release and Transfer Register (E PRTR). Dostupné na WWW: < [cit ]. Watson D. H.: Pesticide, Veterinary and other Residues in Food. Cambridge, Woodhead Publishing Manoli E., Samara C.: Polycyclic aromatic hydrocarbons in natural waters: sources, occurrence and analysis. Trends in Analytical Chemistry 18:6, (1999). Wenzl T., Simon R., Kleiner J., Anklam E.: Analytical methods for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAUs) in food and the environment needed for new food legislation in the European Union. Trends in Analytical Chemistry 25:7, (2006). Wang S., Sheng Y., Feng M., Leszczynski J., Wang L., Tachikawa H., Yu H.: Light-induced cytotoxicity of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons on the US EPA priority pollutant list in human skin HaCaT keratinocytes: Relationship between phototoxicity and excited state properties. Environmental Toxicology 22:3, (2007). Simon A. J., Sobieraj A. J.: Contributions of common sources of polycyclic aromatic hydrocarbons to soil contamination. Remediation Journal 16:3, (2006). Martinez E., Gros M., Lacorte S., Barceló D.: Simplified procedures for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in water, sediments and mussels. Journal of Chromatography A 1047:2, (2004). Srogi K.: Monitoring of environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons: a review. Environmental Chemistry Letters 5:4, (2007).

56 6 Literatura 56 [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] 28] Bamforth M. S., Singleton I.: Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons: current knowledge and future directions. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 80:7, (2005). World Health Organization. Health risks of persistent organic pollutants from long-range transboundary air pollution. Dostupné na WWW: < data/assets/ pdf_ file/0009/78660/e78963.pdf> [cit ]. Hönera A.: Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAU) metabolites. Handbook of Analytical Separations 3, (2001). Tomaniová M., Kocourek V., Hajšlová J.: Polycyklické aromatické uhlovodíky v potravinách. Chemické listy. 91, (1997). Ministerstvo životního prostředí. Znečištěné ovzduší nemá hranice. Dostupné na WWW: < [cit ]. Pitter P.: Hydrochemie. 4. aktual. vyd., Praha, VŠCHT Ministerstvo životního prostředí. Znečištěné ovzduší nemá hranice. Dostupné na WWW: < 4graf_emise_polyaromatickych_uhlovodiku-2007.gif> [cit ]. Wang W. D., Huang Y. M., Shu W. Q., Cao J.: Multiwalled carbon nanotubes as adsorbents of solid-phase extraction for determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in environmental waters coupled with high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1173:1 2, (2007). Lau E. V., Gan S., Ng H. K.: Extraction techniques for polycyclic aromatic hydrocarbons in soils. International Journal of Analytical Chemistry 2010 (2010). Banjoo R. D., Nelson K. P.: Improved ultrasonic extraction procedure for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediments. Journal of Chromatography A 1066:1 2, 9 18 (2005). Ramos L., Kristenson E. M., Brinkman U. A. Th.: Current use of pressurised liquid extraction and subcritical water extraction in environmental analysis. Journal of Chromatography A 975:1, 3 29 (2002). Baran S., Oleszczuk P.: Chromatographic determination of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAU) in sewage, sludge, soil and sewage sludge amended soils. Polish Journal of Environmental Studies 11: 6, (2002). Mermet J.M., Otto M., Valcárcel M., Kellner R., Widmer H. M.: Analytical chemistry. 2nd Ed., Wiley-VCH Hian L.: Modern techniques for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons. Handbook of Analytical Separations 3, (2001). Integrovaný registr znečisťování. Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) metody měření znečišťujících látek v únících do půdy. Dostupné na WWW: < 178#puda > [cit ].

57 6 Literatura 57 [29] Criado A., Cárdenas S., Gallego M., Valcárcel M.: Direct automatic screening of soils for polycyclic aromatic hydrocarbons based on microwave-assisted extraction/fluorescence detection and on-line liquid chromatographic confirmation. Journal of Chromatography A 1050, (2004). [30] Pena T. M., Pensado L., Casais C. M., Mejuto C. M., Cela R.: Sample preparation of sewage sludge and soil samples for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons based on one-pot microwave-assisted saponification and extraction. Analytical and Bioanalytical Chemistry 387, (2007). [31] Gorshkov G. A., Marinaite I. I., Baram I. G., Sokov A. I.: Application of high-performance liquid chromatography on short narrow-bore columns to the determination of priority polycyclic aromatic hydrocarbons in environmental samples. Journal of Analytical Chemistry 58:8, (2003). [32] Oluseyi T., Olayinka K., Alo B., Smith M. R.: Comparison of extraction and clean-up techniques for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in contaminated soil samples. African Journal of Environmental Science and Technology 5:7, (2011). [33] Chen W. Ch., Wang Y. Y., Wu C. J. G.: Interfacing ASE and HPLC for the determination of PAU in soil. Journal of the Chinese Chemical Society 46, (1999). [34] Sun L., Lee K. H.: Microwave-assisted extraction behavior of nonpolar and polar pollutants in soil with analysis by high-performance liquid chromatography. Journal of Separation Science 25, (2002). [35] Cam D., Gagni S., Lombardi N., Punin M. O.: Solid-phase microextraction and gas chromatography mass spectrometry for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in environmental solid matrices. Journal of Chromatographic Science 42, (2004). [36] Ene A., Bogdevich O., Sion A., Spanos T.: Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons by gas chromatography mass spectrometry in soils from Southeastern Romani. Microchemical Journal 100, (2012). [37] Cao Z., Liu J., Luan Y., Li Y., Ma M., Xu J., Han S.: Distribution and ecosystem risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons in the Luan River, China. Ecotoxicology 19, (2010). [38] Dabrowski L., Giergielewicz Mozajska H., Górski L., Biziuk M., Namiesnik J., Janicki B.: Determination of environmental pollutants in soil and sediments - some aspects of sample clean-up and GC analysis. Journal of Separation Science 25, (2002). [39] Yosypchuk O., Pecková K., Barek J.: Voltametrické stanovení 1-nitropyrenu a 1-amino pyrenu na borem dopované diamantové filmové elektrodě. Chemické listy 104, (2010). [40] Nirmaier P. H., Fischer E., Meyer A., Henze G.: Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples using high-performance liquid chromatography with amperometric detection. Journal of Chromatography A (1996).

58 6 Literatura 58 [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] Kvasničková L., Glatz Z., Kahle V.: Kapilární elektrochromatografie. Chemické listy 97, (2003). QuEChERS. History. Dostupné na WWW: < nav1o=2&nav2o=1&nav3o=0> [cit ]. Lehotay J. S., Anastassiades M., Majors E. R.: The QuEChERS revolution. LC-GC Europe 23:8, (2010). Majors E. R.: QuEChERS A new technique for multiresidue analysis of pesticides in foods and agricultural samples. LC-GC Europe 20:11, (2007). Díez, C., Traag, W. A., Zommer, P., Marinero, P., Atienza, J., Comparison of an acetonitrile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction method with classical multiresidue methods for the extraction of herbicide residues in barley samples. Journal of Chromatography A 1131, (2006). Ramalhosa J. M., Paíga P., Morais S., Delerue-Matos C., Oliveira B. P. P. M.: Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in fish: evaluation of a quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe extraction method. Journal of Separation Science 32:20, (2009). Agilent Technologies. Analysis of polycyclic aroamatic hydrocrabons in soil with Agilent QuEChERS AOAC kit and HPLC-FLD. Dostupné na WWW: < agilent.com/en-us/search/library/_layouts/agilent/publicationsummary.aspx?whid=62220 &liid=2726> [cit ]. Agilent Technologies. Screening PAHs in soil using RTL database with bond elut QuEChERS extraction kits and AGgilent 5975T LTM GC/MS. Dostupné na WWW: < whid=62220&liid=2726> [cit ]. Sigma-Aldrich. Dostupné na WWW: < [cit ].

59 7 Příloha 59 Příloha

60 7 Příloha 60

61 7 Příloha 61

62 7 Příloha 62