1. ENZYMOVÉ TECHNOLOGIE Biotechnologie a enzymové technologie

Transkript

1 1. ENZYMOVÉ TECHNOLOGIE 1.1. Biotechnologie a enzymové technologie Biotechnologie je obor spojující přírodní a inženýrské vědy za účelem využít organismy, buňky, jejich části a molekulární analogy k výrobě produktů a uspokojování služeb (Evropská federace pro biotechnologii, 1989). Enzymové technologie, podoblast biotechnologií, využívají enzymy jako biokatalyzátory za účelem průmyslové výroby čistých chemikálií, léčiv nebo potravin. Enzymy jsou dále využívány v zemědělství, živočišné výrobě, při zpracování kůže, v papírenském nebo textilním průmyslu. Enzymy se rovněž uplatňují jako aktivní komponenta různých přípravků běžného života, jako jsou prací a čisticí prostředky, přípravky osobní péče, jsou využívány při analytických a diagnostických postupech (Tabulka 1). Cílem těchto technologií je poskytování inovativních produktů a procesů, které jsou nejen konkurenceschopné, ale také splňují kritéria dlouhodobě udržitelného rozvoje Dlouhodobě udržitelný rozvoj a ochrana životního prostředí Koncept dlouhodobé udržitelnosti byl formulován Světovou komisí pro životní prostředí a rozvoj (WCED) v roce 1987 a klade si za cíl udržet a podporovat takový rozvoj ve společnosti, který uspokojuje potřeby současnosti, aniž by byla ohrožena schopnost budoucích generací uspokojovat jejich vlastní potřeby. Aby mohl být nový proces ekonomicky i ekologicky udržitelnější ve srovnání se stávajícími procesy, musí zajišťovat snížení spotřeby zdrojů (např. surovin, energie, vody), zvyšování využívání obnovitelných zdrojů (např. biomasy), snižování produkce odpadů a zvyšování podílu jejich recyklace 1. Moderní proces by měl směřovat k úsporám vstupních nákladů a současně snižovat celkový dopad na životní prostředí. Svým charakterem mohou biotechnologické procesy nalézt velmi dobré uplatnění v konceptu dlouhodobé udržitelnosti Výhody a nevýhody enzymových technologií Výhody a nevýhody použití enzymů přímo souvisí s jejich vlastnostmi (Tabulka 2). Ve srovnání s chemickými katalyzátory poskytují enzymy celou řadu výhod 1-2. Enzymy katalyzují reakce s mnohem vyšší regio- a stereo-selektivitou. Enzymatická reakce je vysoce specifická, čímž vzniká mnohem méně nežádoucích vedlejších produktů. Enzymy jsou vzájemně kompatibilní v nárocích na reakční prostředí a umožňují tak provádět vícekrokové reakce v jednom souběžném technologickém uspořádání, kde dohromady pracuje více než jeden enzym. Enzymy lze snadno imobilizovat, čímž se zvyšuje možnost opakovaného použití. Enzymy, jako přírodní bílkoviny, jsou netoxické, biologicky snadno rozložitelné a proto nepředstavují vážné riziko znečištění životního prostředí. 1

2 Tabulka 1. Enzymy používané v různých průmyslových odvětvích a způsob jejich využití 3. Odvětví Enzym Využití mycí prostředky proteasy odstraňování bílkovinných skvrn (prádlo a nádobí) amylasy odstraňování škrobových skvrn lipasy odstraňování mastných skvrn celulasy čištění, projasňování barev mannasy odstraňování mannózových skvrn škrobový průmysl amylasy zkapalňování a zcukernatění škrobu amiloglukosidasy zcukernatění glukózisomerasy konverze glukózy na fruktóza xylanasy snižování viskozity potravinářství proteasy srážení mléka, nízkoalergenní kojenecká výživa lipasy sýrová příchuť laktasy odstraňování laktózy pektin metylesterasy ztužování ovocných produktů pektinasy úprava ovocných produktů transglutaminasy modifikace viskózo-elastických vlastností pekárenství amylasy měkkost a objem chlaba, úprava mouky xylanasy úprava těsta lipasy stabilizace a úprava těsta (in situ emulgace) glukózoxidasy zpevňování těsta lipoxigenasy zpevňování těsta, bělení pečiva proteasy výroba sucharů, sušenek transglutaminasy výroba listového těsta krmiva pro zvířata fytasy uvolňování fosforu xylanasy zvyšování stravitelnosti b-glukanasy zvyšování stravitelnosti nápoje pektinasy moštování amylasy výroba nízkokalorického piva b-glukanasy rmutování acetolaktátdekarboxylasy maturace piva lakáza projasňování džusů, úprava korkových zátek textilní průmysl celulasy změkčování bavlny, výroba džínoviny amylasy úprava vláken katalasy ukončení bělení lakasy bělení peroxidasy odstranění přebytku barviv papírenský průmysl lipasy odstraňení pryskyřice a jiných znečištění proteasy odstraňení biofilmu amylasy odbarvování, odstraňování škrobových povlaků xylanasy posilování bělení celulasy odbarvování, odvodnění, úprava vláken tuky a oleje lipasy transesterifikace fosfolipasy produkce lysolecitinu organická syntéza lipasy rozlišení chirálních alkoholů a amidů acylasy syntéza semisyntetického penicilinu nitrilasy syntéza opticky čistých karboxylových kyselin koželužnictví proteasy loužení lipasy loužení osobní péče amyloglukozidasy antimikrobiální účinky glukózoxidasy bělící a antimikrobiální účinky peroxidasy antimikrobiální účinky 2

3 Enzymy přirozeně fungují v mírných podmínkách, tj. nízká teplota, neutrální ph a normální atmosférický tlak, jejich reakce nevyžadují přítomnost toxických kovů nebo velkých množství toxických rozpouštědel a tak snižují energetické nároky, snižují náklady způsobené korozí zařízení a obecně mají nižší rizika pro životní prostředí. Z hlediska dlouhodobé udržitelnosti jsou enzymy vysoce perspektivní, protože jsou produkovány z biomasy, jako obnovitelného zdroje. Enzymy mají i svoje nevýhody, které jsou však v současné době často řešitelné. Jednou z nevýhod, které mohou bránit v širším využití enzymů, jsou relativně vysoké náklady na jejich přípravu a purifikaci. Některé enzymy vyžadují kofaktory, které jsou zpravidla vysoce nákladné. Další důležitou vlastností enzymů, která musí být zohledněna v praktické aplikaci, je jejich nižší stabilita vůči vysokým teplotám, extrémnímu ph nebo agresivním rozpouštědlům 1-2. Pokud se nepodaří z přírodních zdrojů izolovat dostatečně účinný nebo dostatečně stabilní enzym (např. z extremofilních organismů), je nutné jej vyvinou metodami proteinového inženýrství. Tabulka 2. Výhody a nevýhody enzymů ve srovnání s klasickými chemickými katalyzátory 1. Výhody vysoká regio- a stereo-selektivita nízká operační teplota (0-110 C) nízká energetická náročnost menší množství vedlejších produktů bez toxických účinků opakovaná využitelnost (imobilizace) snadná biologická rozložitelnost výroba z biomasy kompatibilita (multi-enzymové procesy) Nevýhody snížená teplotní stabilita snížená stabilita v extrémním ph snížená rezistence vůči rozpouštědlům inhibice některými kovy produktová nebo substrátová inhibice inaktivace proteázami vysoká cena potřeba nákladných kofaktorů potenciálně alergenní 1.4. Biotechnologie využívající halogenalkandehalogenasy Enzymové biotechnologie nacházejí široké uplatnění v ochraně a monitoringu životního prostředí. Příkladem enzymů, které mohou být využity jak pro šetrné průmyslové technologie, tak pro účely ochrany a monitoringu životního prostředí jsou halogenalkandehalogenasy (EC ). Halogenalkandehalogenasy patří do rodiny α/β-hydroláz 4-5, které katalyzují hydrolytické štěpení vazby mezi uhlíkem a halogenidovým substituentem mechanismem nukleofilní substituce. Jedná se o jednoduché globulární bílkoviny, které lze produkovat rekombinantně 6-7 a k reakci nevyžadují žádný kofaktor, čímž se tyto enzymy řadí mezi technologicky velmi atraktivní biokatalyzátory. Charakter halogenalkandehalogenas a typ 3

4 jejich reakce, předurčují směry jejich praktického využití. Mezi perspektivní aplikace patří biodegradace polutantů životního prostředí 8, biosensing toxických látek 9-10, průmyslová biokatalýza 11-14, neutralizace otravných bojových látek nebo vizualizace proteinů v buněčné biologii Biodegradace Environmentální význam halogenovaných alifatických sloučeniny a skutečnost, že halogenalkandehalogenasy katalyzují jednoduchou a účinnou detoxikační reakci, je hlavní motivací jejich uplatnění v bioremediacích a při zpracování odpadů 18. Halogenalkandehalogenasy katalyzují degradaci širokého spektra halogenovaných sloučenin 19 mezi nimiž jsou významné polutanty životního prostředí (např. 1,2-dibromethan, 1,2- dichlorethan, 1,2-dichlorpropan nebo 1,2,3-trichlorpropan). V současnosti se aktivita těchto enzymů prakticky využívá v bioreaktorech (Obrázek 1) pro dekontaminaci halogenovaných polutantů podzemních vod 8 a k odstraňování nežádoucích meziproduktů chemických syntéz 11. Nové studie rozšiřují aplikační potenciál halogenalkandehalogenas o využití k biodegradaci perzistentních polutantů, jako je β-hexachlorcyklohexan 20, nebo neutralizaci otravných bojových látek jako jsou sulfidický a dusíkatý yperit 15-16,21. Obrázek 1. Bioreaktor využívaný k odstraňování 1,2dichlorethanu z podzemních vod (Ciba- Gaigy, Luebek, Švýcarsko). Rotační biologický reaktor s povrchem kolonizovaným degradačními bakteriemi (vlevo). Písková filtrační jednotka, která je taktéž inokulována se zařízením pro absorpci na aktivní uhlí v popředí (vpravo) Biosensing Enzymy, které vykazují aktivitu při degradaci nebezpečných polutantů, mohou být využity jako biorekogniční složky v biosenzorech k monitoringu těchto látek v životním prostředí. Biosenzor je detekční zařízení sestávající z biorekogniční složky (např. enzym, protilátka) a fyzikálně-chemického převodníku, který převádí reakci biorekogniční složky s analytem na měřitelný signál fyzikálního charakteru (např. konduktivita, fluorescence). Potenciál využití biosenzorů leží především v jejich selektivitě, kontinuálnosti měření a nízké finanční náročnosti provozu. K detekci halogenovaných látek byla vyvinuta řada biosenzorů, které 4

5 využívají celé imobilizované buňky s přirozenou expresí dehalogenujících enzymů 9, Výroba biosenzorů využívajících celé buňky je snazší a levnější, nicméně tento typ biosenzorů trpí nízkou citlivostí, sníženou selektivitou i stabilitou. Tyto limitace byly překonány konstrukcí nového typu biosenzoru (Obrázek 2), který k detekci halogenovaných látek využívá čisté imobilizované halogenalkandehalogenasy 27. Popis konverze sulfidického a dusíkatého yperitu bakteriálními enzymy halogenalkandehalogenasami otevřel cestu k vývoji biosenzorů vhodných k účinné detekci této skupiny otravných látek 10. Obrázek 2. Biosenzor sloužící k detekci halogenovaných polutantů, využívající celé imobilizované buňky (vlevo) s přirozenou expresí dehalogenujícího enzymu 9 a biosenzor založený na detekci halogenovaných látek pomocí čisté halogenalkandehalogenasy Biokatalýza V posledních deseti letech prudce narůstá počet enzymů, které jsou využívány v organické syntéze a to především díky vysoké regio- a stereoselektivitě 28. Ceněná je především vysoká enantioselektivita enzymů, využívaná k výrobě opticky čistých sloučenin. Při produkci léčiv, agrochemikálií, potravinových aditiv a jejich specifických meziproduktů je požadována vysoká optická čistota, typicky s obsahem žádaného enantiomeru >98%. Vysoký potenciál využití v organické syntéze mají také halogenalkandehalogenasy 13. Produkují alkoholy, jejichž opticky čisté formy jsou atraktivní především pro farmaceutický průmysl, kosmetiku a zemědělství 29. V roce 2001 bylo provedeno první testování enantioselektivity halogenalkandehalogenas DhlA a DhaA 30. Selektivita těchto enzymů byla ve sledovaných reakcích velice nízká s maximální dosaženou E-hodnotou 9 po strukturální optimalizaci substrátu. Počátkem roku 2004, dvacet let po objevu první halogenalkandehalogenasy, byl vývoj enantioselektivních halogenalkandehalogenas pro použití v průmyslové biokatalýze vytýčen jako jeden z hlavních úkolů této výzkumné oblasti 18. Ve stejném roce byla poprvé popsána vysoká selektivita těchto enzymů (E-hodnota > 200) pro reakce směřované do chirálního centra substrátů 12. Reakce s vysokou enantioselektivitou (E-hodnota > 100) jsou průmyslově využitelné. V rozsáhlé studii věnované enantioselektivitě halogenalkandehalogenas byla vyřešena strukturní podstata enantioslektivity těchto enzymů, navrženy a ověřeny byly také možnosti jejich dalšího inženýrství směřujícího k vysokým selektivitám pro nové typy substrátů 14. 5

6 2. PROTEINOVÉ INŽENÝRSTVÍ Pro úspěšný vývoj enzymových biotechnologie je nutné, aby byl dostupný vhodný enzym s vysokou aktivitou, selektivitou a stabilitou odpovídající podmínkám vyvíjeného procesu. Většina přírodních enzymů tyto podmínky dostatečně nesplňují a je často nutné je optimalizovat metodami proteinového inženýrství 28,31. Proteinové inženýrství se zabývá modifikací existujících přírodních enzymů nebo vytvářením zcela nových biokatalyzátorů s novými nebo vylepšenými vlastnostmi. Snahy proteinových inženýrů směřují nejčastěji ke zvýšení aktivity, stability (teplota, ph, tlak, organická rozpouštědla) a selektivity, čímž jsou překonávány nejčastější příčiny technologických limitací Inženýrství halogenalkandehalogenas Inženýrství aktivity Nedostatečná katalytická aktivita je jednou z možných limitací pro využití enzymů v technologických procesech. Modifikací vazebného místa bylo dosaženo zvýšení reakční rychlosti u bakteriálních halogenalkandehalogenas DhlA z Xantobacter autotrophicus GJ10, DhaA z Rhodococcus sp. a LinB z Sphingomonas paucimobilis UT Například snížením vazebných interakcí enzymu DhlA s halogenidovým iontem se usnadnil odchod tohoto produktu, který byl rychlost-limitujícím krokem, a tak bylo dosaženo zvýšení rychlosti konverze cílového polutantu 1,2-dichloroethanu 33. Současně však tento přístup snížil i stabilizaci substrátu důležitou pro první chemický reakční krok. Protichůdné efekty vyvolané modifikací vazebných interakcí v aktivním místě neumožnily výraznější zlepšení celkového katalytického účinku těchto enzymů. Dalším příkladem zvýšení aktivity degradace cílové látky a vytvoření účinného katalyzátoru pro praktické využití je inženýrství aktivity halogenalkandehalogenasy DhaA pro degradaci 1,2,3-trichlorpropanu (TCP). TCP je průmyslový antropogenní kontaminant s vysokou perzistencí v podzemních vodách 34. Dosud se nepodařilo izolovat žádný mikroorganismus, který by uměl přirozeně degradovat TCP. Nejslibnější dehalogenasou k degradaci TCP je DhaA z bakterie Rhodococcus sp. TDTM Enzym DhaA však vykazuje s tímto substrátem nízkou aktivitu, která je pro růst bakterie nedostatečná. Tento fakt stimuloval několik pokusů o konstrukci mutantního enzymu se zvýšenou aktivitou. Gen dhaa byl podroben chybující PCR a DNA rekombinaci 36. Výsledný mutant, C176Y+Y273F, vykazoval 3,5 krát vyšší aktivitu s TCP v porovnání s přírodním enzymem. Při využití in vitro evoluce stejného genu byl získán mutant, G3D+C176F, ukazující 4 násobné zvýšení aktivity 37. Oba přístupy byly založeny na náhodném generování velkého množství variant, což nevedlo k dostatečnému zlepšení požadované vlastnosti. Využitím moderního semiracionálního přístupu kombinujícího počítačové modelování a řízenou evoluci, bylo navrženo a zkonstruováno 25 jedinečných variant DhaA enzymu. Nejlepší z variantních mutantů, který již dostatečně splňuje kritéria pro technologické využití, vykazoval 36 krát vyšší aktivitu s TCP v porovnání s přírodním enzymem 40. 6

7 Inženýrství teplotní stability Celkový výkon enzymů v biokatalytickém procesu je závislý nejen na aktivitě, ale i na jejich stabilitě. Podle Arrheniovy rovnice se rychlost enzymatické reakce zdvojnásobí každým zvýšením teploty přibližně o 10 C. Zvýšení teplotní stability je proto rovněž cílem inženýrství halogenalkandehalogenas. V designu směřujícímu ke zvýšení teplotní stability DhlA bylo využito výpočetních metod, konkrétně molekulárně dynamické simulace. Během simulací byl identifikován region ve svrchní doméně DhlA, který první podléhal teplotnímu rozkladu. Tento méně stabilní region byl inženýrstvím spojen s hlavní doménou disulfidickými můstky. Výsledná varianta vykazovala zvýšenou teplotní stabilitu, teplota tání (T m ) byla zvýšena o 8 C. Podobný trend byl pozorován také v resistenci enzymu k denaturaci močovinou 41. Odlišný přístup byl využit při inženýrství teplotní stability DhaA. Byla provedena rozsáhlá systematická analýza všech jednobodových mutací ve všech pozicích enzymu DhaA 37. Osm mutací ukazovalo pozitivní efekt na teplotní stabilitu DhaA a jejich kombinací vznikla mutantní varianta, D78G+F80S+T148L+G171Q+I209L+N227T+W240Y+P291A, která vykazovala krát delší poločas deaktivace při 55 C a s teplotou tání (T m ) zvýšenou o 8 C v porovnání s přírodním enzymem 18. Zvýšení stability DhaA bylo vysvětleno stabilizací čtvrté α-šroubovice ve svrchní doméně a vytvoření nové vodíkové vazby Inženýrství enantioselektivity Enantioselektivní halogenalkandehalogenasy, produkující opticky čisté alkoholy, mají vysoký aplikační potenciál především ve farmaceutické syntéze. Enantioselektivita vybraných halogenalkandehalogenas, DhaA, LinB a nově izolované dehalogenasy DbjA ze symbiotické bakterie Bradyrhizobium japonicum USDA byla testována s rozsáhlým počtem chirálních sloučenin 14. Všechny tři proteiny vykazovaly vysokou selektivitu (E-hodnota > 200) s β-substituovanými bromestery. Enzym DbjA navíc vykazoval vysokou enantioselektivitu se strukturně jednoduchou chirální molekulou 2-brompentanem (E-hodnota = 145). Reakce DbjA s 2-brompentanem je (R)-selektivní s konfigurační inverzí vedoucí ke vzniku (S)-2-brompentanolu. Tento opticky čistý alkohol je využíván jako stavební blok v syntéze farmaceutik, například léků na zpomalování účinků Alzheimerovy choroby 43. Ve stejné reakci s 2-brompentanem vykazovaly enzymy DhaA a LinB pouze nízkou úroveň enantioselektivity (E-hodnota = 7 a 16). Rentgenová strukturální analýza ukázala, že na rozdíl od ostatních halogenalkandehalogenas obsahuje DbjA unikátní povrchový motiv, prodloužení v α-šroubovici a smyčce spojující hlavní a svrchní doménu. Odstranění této smyčky vedlo ke vzniku mutantního enzymu DbjA s významně sníženou enantioselektivitou s 2- brompentanem (E-hodnota = 58). Enantioselektivita byla následně znovu vložena následující jednobodovou mutací DbjA +H139A (E-hodnota = 120). Tyto mutace ovlivnily anatomii hlavního tunelu vedoucího od povrchu do aktivního centra DbjA a také jeho přístupnost molekulám vody. Změny v hydrofobní interakci alkylového řetězce 2-brompentanu se stěnou tunelu spolu s jeho desolvatací byly hlavní příčinou změn v enantioselektivitě DbjA vůči 2- bromopentanu. Tyto výsledky ukázaly, že enantioselektivita halogenalkandehalogenas v rakcích s β-substituovanými bromalkany může být modulována modifikací povrchových struktur těchto proteinů 14. 7

8 Proteinové inženýrství studuje vztahy mezi strukturou, dynamikou a funkcí proteinů. Toto studium významně přispívá k chápání fyzikálních a chemických vlastností proteinů a jejich evoluce 32. Vyžaduje mezioborovou expertízu a spolupráci odborníků z chemie, biochemie, biofyziky, molekulární biologie, mikrobiologie, počítačového modelování a bioinformatiky. Racionální přístup v proteinovém inženýrství zvyšuje pravděpodobnost získání funkčních proteinů a současně snižuje množství konstruovaných proteinových variant, se kterými je nutné pracovat. Racionální přístup však vyžaduje detailní znalost struktury a funkčních charakteristik studovaného enzymu. V této oblasti zažilo proteinové inženýrství významný pokrok s rozvojem výpočetních algoritmů, které umožňují in silico studium vztahu mezi strukturou a funkcí enzymů na molekulární úrovni 44, podporované dynamickým rozvojem experimentálních technik studia proteinové struktury (NMR a rentgenová krystalografie) a metod analýzy kinetiky a mechanismu enzymové reakce Kinetika a mechanismus enzymové reakce v proteinovém inženýrství Analýza nových vlastností modifikovaných enzymů vyžaduje detailní studium katalytických charakteristik s využitím metod enzymové kinetiky. Hlubší pochopení mechanismu studovaných efektů a jejich závislosti na struktuře významně zvyšuje úspěšnost navrhovaných změn. Proteinové inženýrství proto stále častěji vedle metod kinetiky v ustáleném stavu využívá i sofistikované metody rychlých transitních kinetik 32. Tranzitní enzymová kinetika poskytuje základní informace o jednotlivých krocích reakční dráhy, identifikuje jednotlivé intermediáty a specifikuje krok, který je limitující pro celkový katalytický účinek Kinetika v ustáleném stavu Kinetická analýza a analýza mechanismu enzymové reakce nejčastěji začíná měřením kinetiky v ustáleném stavu. Obecně jde o stav, kdy jednotlivé kvantity jsou konstantní a rychlost vzniku je v rovnováze s rychlostí rozkladu 46. Analýza kinetiky v ustáleném stavu podává první informace o enzymatické reakci, o rychlosti a faktorech, které ji ovlivňují (koncentrace ligandu, teplota, ph a iontová síla). Kinetika v ustáleném stavu poskytuje praktické informace o pořadí, ve kterém substráty vstupují do aktivního místa enzymu a pořadí, ve kterém se uvolňují jednotlivé produkty. Studium vlivu ph nebo teploty může poskytnout důležité informace o charakteru aminokyselin, které se reakce přímo účastní 47. Analýzy izotopových efektů poskytují informaci o limitacích v chemických krocích katalytického cyklu 45. Kinetika v ustáleném stavu poskytuje zjednodušené nepřímé informace o reakčním mechanismu, které popisují minimální kinetické schéma (Schéma 1). Poskytuje pouze dvě základní kinetické veličiny, k cat a K m, které mohou být kombinací rychlostních konstant (Rovnice 1 a 2) několika individuálních reakčních kroků reálného vícekrokového kinetického mechanismu (Schéma 2). 8

9 Tuto limitaci lze řešit analýzami reakce v transitním stavu. Kinetika v ustáleném i transitním stavu se vzájemně doplňují a poskytují tak ucelený obraz o studované reakci 45. Výsledky z kinetiky v ustáleném stavu umožňují dobře navrhnout a následně i interpretovat výsledky experimentů studujících reakci v transitních fázích. Schéma 1. Minimální schéma popisující enzymem katalyzovanou reakci, kde E je enzym, S je substrát, E.S je Michaelisův komplex enzymu se substrátem a P je produkt. Schéma 2. Komplexní schéma enzymového katalytického cyklu zahrnující čtyři kroky, vazbu substrátu, první chemický reakční krok spojený s tvorbou meziproduktu, druhý chemický reakční krok přeměny meziproduktu na finální produkt a uvolnění produktu, kde E.X je komplex enzymu s reakčním meziproduktem, E.P je komplex enzymu s produktem a k n a k -n jsou rychlostní konstanty individuálních reakčních kroků. Rovnice 1 Rovnice Kinetika v tranzitním stavu Pro hodnocení rychlostních konstant jednotlivých kroků a detekci reakčních meziproduktů je nutné měřit rychlost pře tím, než je dosaženo ustáleného stavu 46. Tato fáze, kdy se rychlosti vzniku a rozpadu reakčních intermediátů ustavují a je možné sledovat rychlosti jednotlivých kroků, se nazývá transitní fáze reakce. Tranzitní fáze enzymové reakce nastává od chvíle, kdy je enzym smíchán se substrátem, t=0, až do chvíle, kdy je dosaženo rovnováhy nebo ustáleného stavu 48. Vzhledem k tomu, že hodnoty k cat leží mezi 1 a 10 7 s -1, musí být provedeno měření v časovém rozmezí od 1 do 10-7 s a vyžaduje speciální techniky popsané v následujícím textu

10 Metoda zastaveného toku Metoda zastaveného toku, angl. stopped-flow, je užitečná pro reakce poskytující optický signál (např. absorbance, cirkulární dichroismus, fluorescence, fluorescenční anizotropie). Tyto experimenty jsou v principu velmi jednoduché. Přístroj umožňuje rychlé smícháním dvou nebo více roztoků s reaktanty za vzniku reakční směsi, která pak proudí do měřící kyvety, zatímco předchozí obsah je vytlačován čerstvou reakční směsí. Stříkačka nebo ventil na výstupu slouží k omezení objemu roztoku potřebného pro jednotlivá měření a také slouží k rychlému zastavení toku reakční směsi (Obrázek 3a). Průběh reakce je sledován v čase po zastavení toku. Časové rozlišení této metody je závislé na době potřebné k tomu, aby se reakční směs dostala z bodu mísení do bodu měření (tzv. mrtvý čas). Mrtvý čas se obvykle pohybuje v řádu 1 až 4 ms, v závislosti na technickém uspořádání přístroje. Moderní zařízení vybavené mikrokyvetami dosahují mrtvých časů až 0,2 ms. Přesnost měření reakcí pomocí zastaveného proudu je závislá na poměru signálu k šumu a především na rychlosti mísení a z toho vyplívajícím mrtvém čase Měření s mikrokyvetou umožňuje spolehlivý sběr dat pro reakce s rychlostní konstantou do s -1. Obrázek 3. Schéma standardního zařízení pro měření tranzitních kinetik metodou zastaveného toku (a) a rychlého zhášení (b). M je krokový motor, S je reakční stříkačka, V je ventil a Mix je mísící komůrka. 10

11 Metoda rychlého zhášení Metoda rychlého zhášení, angl. rapid-quench, umožňuje mísení reaktantů, které je následováno inkubací reakční směsi po přesně daný časový interval v reakční smyčce a následné smíchání se zhášecím roztokem (obvykle kyselina nebo báze). Zhášecí roztok zastaví reakci denaturací enzymu, při které dojde k uvolnění substrátů, meziproduktů a produktů vázaných v enzymu (Obrázek 3b). Vzniklé vzorky jsou sbírány pro následnou analýzu standardními analytickými technikami (např. GC, MS, HPLC, IC) Metodu rychlého zhášení lze použít pro téměř všechny reakce včetně těch, které neposkytují žádný spektrofotometrický signál limitující metodu zastaveného toku. Doba reakce je dána rychlostí toku a objemem reakční smyčky mezi místem míchání reaktantů a místem míchání reakční směsi se zhášecím roztokem. V praxi se doba reakce pohybuje od 2 ms do několika sekund Blesková fotolýza Předchozí dvě techniky rychlého mísení jsou limitovány časem nutným ke smíchání reaktantů. Jediným způsobem, jak zvýšit časové rozlišení, je oddělit start reakce od míchání reaktantů a zajistit rychlý start reakce v již promíchané reakční směsi. To umožňuje metoda bleskové fotolýzy, angl. flash photolysis, ve které dochází k rozštěpení specifické vazby na molekule reaktantu pulsem světla vedoucí ke vzniku reaktivních forem. Na rozdíl od metod rychlého mísení nemůže být metoda bleskové fotolýzy aplikována obecně. Pro metodu bleskové fotolýzy je nutné vyvinout substrát, který lze aktivovat světelným zábleskem se specifickou vlnovou délkou a intenzitou Relaxační techniky Relaxační metody představují další alternativní způsob, jak překonat limitaci mrtvého času metod rychlého mísení. Reakční směs je uvedena do rovnováhy, která je pak následně narušena vnějším impulsem. Měřena je pak změna rovnováhy a rychlost s jakou k takové relaxaci dochází. Nejběžnější relaxační technikou je teplotní skok, angl. temperature jump. Teplota reakční směsi v rovnováze je prudce zvýšena o 5 až 10 C za méně než mikrosekundu s pomocí infračerveného laseru. Pokud rovnováha zahrnuje změny v entalpii, pak bude takovou teplotní změnou posunuta. Systém bude směřovat do nové rovnovážné polohy přes sérii relaxačních časů. Tato metoda nemůže být použita pro systémy, ve kterých jsou některé kroky nevratné. Metoda je vhodná pro vazbu ligandů a inhibitorů, nebo konformační změny proteinu. Další použitelnou technikou je NMR, která neovlivňuje chemizmus systému, ale může měřit rychlostní konstanty rovnovážné směsi. NMR lze využít k měření disociačních konstant komplexu enzymů s inhibitory 46. Reakce proteinů jsou často spojeny s velkými změnami v objemu, které umožňují rozrušovat rovnovážné polohy změnami tlaku. Tato moderní metoda se nazývá teplotní skok, angl. pressure jump. Rychlé změny tlaku (± 20 MPa) tak mohou být využity k vyvolávání relaxace rovnovážných stavů 49. Tento přístup zatím není široce využívaný, protože instrumentace potřebná k metodám tlakového skoku je technicky složitá a v současné době není komerčně dostupná. 11

12 2.3. Kinetika a mechanismuss halogenalkandehalogenas Racionální přístup v proteinovém inženýrství vyžaduje detailní informace o cílovém proteinu, jako jsou experimentálně vyřešená struktura, reakční a kinetický mechanismus. Vyřešení první rentgenové krystalové struktury halogenalkandehalogenasy DhlA z Xanthobacter autotrophicus GJ10 50 umožnilo i následné pochopení obecného reakčního mechanismu těchto enzymů Katalytický účinek těchto enzymů je zajištěn třemi reaktivními rezidui, tzv. katalytickou triádou (Asp-His-Asp/Glu), které byly identifikovány v krystalových strukturách se substráty a halogenidy naměřených při různých hodnotách ph. Z výsledků těchto experimentů byl navržen obecný reakční (Schéma 3) a kinetický (Schéma 4) mechanismus halogenalkandehalogenas. Schéma 3. Obecný reakční mechanismus haloalkandehalogenasy odvozený z krystalových struktur enzymu DhlA z bakterie Xanthobacter autotrophicus GJ Schéma 4. Katalytický cyklus halogenakalandehalogenas odvozený z kinetických měření. E je enzym, RX je halogenovaný substrát, X - je halogenidový produkt, ROH je alkoholový produkt, E.RX je komplex enzymu se substrátem, E-R.X je alkyl-enzymový meziprodukt, E.X.ROH komplex enzymu s produkty a k n a k -n jsou rychlostní konstanty individuálních reakčních kroků. Vazba substrátu je následována chemickým krokem, kdy nukleofilní aspartát napadá atom uhlíku, na kterém je vázaný halogenidový substituent a mechanismem nukleofilní substituce dochází k tvorbě kovalentněě vázaného alkyl-enzymového meziproduktu za současného odštěpení halogenidového iontu. Alkyl-enzymový meziprodukt je následně hydrolyzován molekulou vody, která je aktivována bazickým histidinem. Druhá katalytická kyselina, aspartát nebo glutamát, stabilizuje náboj na imidazolovém kruhu histidinu. Posledním krokem kinetického mechanismu je uvolnění produktů. Halogenalkandehalogenasy pocházející z různých mikroorganismů byly purifikovány a biochemicky charakterizovány. Pro tři různé enzymy, halogenalkandehalogenasu DhlA z bakterie Xanthobacter autotrophicus GJ10 56, halogenalkandehalogenasu DhaA z bakterie Rhodococcus rhodochrous NCIMB a halogenalkandehalogenasu LinB z bakterie 12

13 Sphingobium japonicum (dříve Sphingomonas paucimobilis) UT26 6, byl vyřešen kinetický mechanismus s využitím tranzitní kinetiky. Srovnání kinetického mechanismu DhlA 58, DhaA 59 a LinB 60 ukazuje obecně shodné charakteristiky těchto reakcí. Pro všechny tři enzymy jsou vazba substrátu a štěpení vazby mezi halogenidem a uhlíkem rychlé kroky, což způsobuje akumulaci alkyl-enzymového meziproduktu (Tabulka 3). Tabulka 3. Kinetické konstanty halogenalkandehalogenas DhlA, DhaA a LinB. Enzym Substrát K s k 2 k -2 k 3 k 4 K m k cat k cat /K m (µm) (s -1 ) (s -1 ) (s -1 ) (s -1 ) (µm) (s -1 ) (µm -1.s -1 ) DhlA divoký typ 1,2-dibrometan a > 27 > ± 2 4 ± DhlA Val226Ala 1,2-dibrometan b ± ± 3 43 ± DhlA Phe172Trp 1,2-dibrometan c ± 5-9 ± ± DhlA divoký typ 1,2-dichloretan a ± ± 3 8 ± DhlA Val226Ala 1,2-dichloretan b ± 1-9 ± 2 50 ± DhlA Phe172Trp 1,2-dichloretan c ± ± 1 > DhaA divoký typ 1,3-dibrompropan d ± ± ± LinB divoký typ 1-chlorhexan e 240 ± ± ± ± LinB divoký typ bromcyklohexan e > 450 > ± ± LinB divoký typ chlorcyklohexan e > 500 > ± a měřeno při ph 8.2 a 30 C 58 b měřeno při ph 8.2 a 30 C 64 c měřeno při ph 8.2 a 30 C 58 d měřeno při ph 8.2 a 30 C 59 e měřeno při ph 8.2 a 30 C 60 Z hlediska interpretace kinetických dat je nutné mít na zřeteli, že tímto efektem je Michaelisova konstanta (K m ) výrazně nižší, než skutečná disociační konstanta enzymsubstrátového komplexu (K s ). Hlavní a nejdůležitější odlišností je rozdíl v rychlostlimitujícím kroku. V reakci katalyzované DhlA je nejpomalejším krokem uvolňování halogenidového produktu 55,61, v reakci DhaA je rychlost-limitující uvolňování alkoholového produktu 59, v reakci katalyzované enzymem LinB je rychlost-limitujícím krokem hydrolýza alkyl-enzymového meziproduktu 60. V katalytickém cyklu haloalkandehalogenasy LinB se neprojevuje žádná významná limitace související s transportem ligandů, uvolňováním produktů nebo vazbou substrátu. Tento závěr je v souladu s architekturou aktivního místa, které je ve srovnání s DhlA a DhaA více otevřené okolnímu solventu 18,60,62. Další strukturní odlišnost, odpovědná za rozdíly v exportu halogenidového produktu z aktivního místa je složení halogenid-stabilizujících aminokyselin 63. Jedna ze dvou halogenid-stabilizujících aminokyselin je tryptofan (Trp125 v DhlA, Trp107 v DhaA a Trp109 v LinB), který je plně konzervovaný ve všech halogenalkandehalogenasách. Druhá halogenid-stabilizující aminokyselina se mění jak z hlediska fyzikálně-chemických vlastností, tak polohy v proteinové struktuře (Trp175 v DhlA, Asn41 v DhaA a Asn38 v LinB). Stupeň stabilizace, 13

14 zajišťovaný dvěma tryptofany je významně vyšší než v případě kombinace jednoho tryptofanu a jednoho asparaginu 60. Tato pozorování ukazují, že obecné extrapolace tak důležitého parametru, jakým je rychlost-limitující krok, může být zavádějící i pro evolučně příbuzné enzymy. Kinetika rychlost-limitujícího kroku se může měnit i mezi jednotlivými mutanty. Příkladem je inženýrství haloalkandehalogenasy pro technologii degradace TCP (kapitola ), kde transitní kinetika významně přispěla k plnému pochopení mechanismu a změnám, které vedly k 36-ti násobnému navýšení aktivity výsledné mutantní varianty DhaA 40. Mutace významně zvyšující aktivitu DhaA k TCP se překvapivě objevovaly ve vstupních tunelech, spíše než v aktivním místě. Vstupní tunely spojují aktivní místo, které je ukryto uvnitř proteinu, s okolním prostředím. Zvýšená aktivita k TCP souvisela s částečným uzavíráním těchto tunelů a snížením množství molekul vod proudících do aktivního místa. Tyto vody bránily tvorbě produktivního komplexu mezi enzymem a substrátem. Tranzitní kinetika a molekulové modelování objasnily mechanistické aspekty katalytického účinku přírodní DhaA a jejích mutantních varianty se zvýšenou aktivitou. Tranzitní kinetika dále umožnila identifikaci katalytického kroku ovlivněného mutagenezí (Obrázek 4). Obrázek 4. Strukturní podstata zvýšené aktivity mutantní DhaA s TCP. Srovnání přírodního enzymu DhaA (vlevo) s mutantní variantou DhaA31 (vpravo). (a) Dostupnost aktivního místa pro solvent vyhodnoceno z MD simulace; dutina aktivního místa přírodní DhaA je plně dostupná solventu (červeně), dutina mutantní varianty je uzavřena, kdy jsou vodou zaplněny pouze některá oddělená vnitřní místa (modře); kuličky představující vodu mají velikost 0.5 Å. (b) Efekt molekul vody na stabilizaci substrátu v reaktivní pozici hodnocené z MD simulace; čas odpovídající snímkům v části (c) je označen ( ). (c) Vyobrazení z MD simulace; v přírodní DhaA (vlevo) molekuly vody kompetují s TCP o nukleofil a TCP se tak dostává do nereaktivní konfigurace; reaktivní orientace TCP v mutantní variantě (vpravo). (d) identifikace rychlost-limitujícího kroku z tranzitních kinetik; Reakční schéma ukazuje polohu rychlostní limitace v přírodní DhaA (červeně) a mutantní variantě (modře); vložený graf ukazuje izotopový efekt solventu na reakci s TCP; sledována byla změna rychlosti reakce v různých poměrech H 2 O a D 2 O. 14

15 Molekulová dynamika předpověděla, že mutace zužující vstupní tunel zabraňují pronikání molekul vody do uzavřeného aktivního místa. Jedna voda slouží jako kosubstrát hydrolytické reakce, ale ostatní molekuly vody stericky brání nukleofilní substituční reakci Metoda rychlého zhášení experimentálně potvrdila předpoklady z molekulové dynamiky, že štěpení vazby mezi uhlíkem a halogenidem je rychlost-limitující krok v konverzi TCP přírodním enzymem DhaA. U mutantní varianty byla rychlost tohoto kroku významně zvýšena a limitace reakce se přesunula z chemického kroku na poslední krok, což je uvolňování produktů. Změnu v rychlost-limitujícím kroku potvrzuje i výsledek izotopového efektu solventu. Detailní pochopení strukturní podstaty a mechanismu změn v modifikovaných enzymech umožňuje přesnější racionální inženýrství jejich katalytických vlastností. 3. Závěr Moderní enzymové technologie poskytují inovativní produkty a procesy, které jsou nejen konkurenceschopné, ale také splňují kritéria dlouhodobě-udržitelného rozvoje. Pro úspěšný vývoj moderních enzymových biotechnologií je nutné, aby byl dostupný vhodný enzym s aktivitou, selektivitou nebo stabilitou odpovídající podmínkám daného procesu. Většina přírodních enzymů tyto podmínky nesplňuje, a proto je vhodné provést jejich optimalizaci metodami proteinového inženýrství. Moderní proteinové inženýrství směřuje k racionálním přístupům, které významně zvyšují úspěšnost navrhovaných změn. Racionální přístup však vyžaduje detailní znalost struktury a funkčních charakteristik studovaného enzymu. V proteinovém inženýrství se proto stále častěji využívají vedle relativně jednoduchých metod kinetiky v ustáleném stavu i náročnější metody rychlých transitních kinetik. K dispozici je řada sofistikovaných technik, jako jsou metody rychlého mísení nebo relaxační techniky, které poskytují detailní obraz mechanismu a limitaci reakce. Velmi slibné jsou současné trendy rozvoje mikro-fluidních technologií, které nabízejí miniaturizaci a urychlení biochemických charakterizací velkého množství konstruovaných mutantních variant vyvíjených proteinů i vysoce přesné analýzy reakcí v tranzitních stavech. 15

16 Reference 1 Buchholz, K., Kasche, V. & Bornscheuer, U. T. Biocatalysts and enzyme technology. (Wiley-VCH, 2005). 2 Chaplin, M. F. & Bucke, C. Enzyme technology. (Cambridge University Press, 1990). 3 Kirk, O., Borchert, T. V. & Fuglsang, C. C. Industrial enzyme applications. Curr Opin Biotechnol 13, , (2002). 4 Ollis, D. L. et al. The α/β hydrolase fold. Protein Engineering 5, (1992). 5 Nardini, M. & Dijkstra, B. W. α/β Hydrolase fold enzymes: the family keeps growing. Current Opinion in Structural Biology 9, (1999). 6 Nagata, Y. et al. Purification and characterization of haloalkane dehalogenase of a new substrate class from a gamma hexachlorocyclohexane-degrading bacterium, Sphingomonas paucimobilis UT26. Applied and Environmental Microbiology 63, (1997). 7 Nakamura, T. et al. Expression of glycosylated haloalkane dehalogenase LinB in Pichia pastoris. Protein Expression and Purification 46, (2006). 8 Stucki, G. & Thuer, M. Experiences of a large-scale application of 1,2-dichloroethane degrading microorganisms for groundwater treatment. Environmental Science and Technology 29, (1995). 9 Campbell, D. W., Muller, C. & Reardon, K. F. Development of a fiber optic enzymatic biosensor for 1,2-dichloroethane. Biotechnology Letters 28, (2006). 10 Bidmanova, S., Pohanka, M., Cabal, J., Prokop, Z. & Damborsky, J. Early Warning Biosensors for Detection of Chemical Warfare Agents. Chemické listy 104, (2010). 11 Swanson, P. E. Dehalogenases applied to industrial-scale biocatalysis. Current Opinion in Biotechnology 10, (1999). 12 Prokop, Z., Damborsky, J., Nagata, Y. & Janssen, D. B. Method of production of optically active halohydrocarbons and alcohols using hydrolytic dehalogenation catalysed by haloalkane dehalogenases. (2004); CZ ; US 7,632,666; WO (A3). 13 Janssen, D. B. Biocatalysis by dehalogenating enzymes. Advances in Applied Microbiology 61, (2007). 16

17 14 Prokop, Z. et al. Enantioselectivity of haloalkane dehalogenases and its modulation by surface loop engineering. Angew Chem Int Ed Engl 49, , (2010). 15 Prokop, Z., Damborsky, J., Oplustil, F., Jesenska, A. & Nagata, Y. Method of detoxification of yperite by using haloalkane dehalogenases. (2005); CZ ; EA ; AU B2, NZ , EP ; WO (A1); US (A1). 16 Prokop, Z., Oplustil, F., DeFrank, J. & Damborsky, J. Enzymes fight chemical weapons. Biotechnology Journal 1, (2006). 17 Los, G. V. & Wood, K. The HaloTag: a novel technology for cell imaging and protein analysis. Methods in Molecular Biology 356, (2007). 18 Janssen, D. B. Evolving haloalkane dehalogenases. Current Opinion in Chemical Biology 8, (2004). 19 Damborsky, J. et al. Structure-specificity relationships for haloalkane dehalogenases. Environmental Toxicology and Chemistry 20, (2001). 20 Ito, M. et al. Degradation of beta-hexachlorocyclohexane by haloalkane dehalogenase LinB from gamma-hexachlorocyclohexane-utilizing bacterium Sphingobium sp. MI1205. Archives in Microbiology 188, (2007). 21 Huggett, B. Mustard gas enzyme. Nature Biotechnology 25, 1197 (2007). 22 Henrysson, T. & Mattiasson, B. A microbial biosensor system for dihalomethanes. Biodegradation. Biodegradation 4, (1993). 23 Hutter, W. et al. Development of a microbial bioassay for chlorinated and brominated hydrocarbons. Analitica Chimica Acta 306, (1995). 24 Peter, J., Hutter, W., Stollnberger, W. & Hampel, W. Detection of chlorinated and brominated hydrocarbons by an ion sensitive whole cell biosensor. Biosensors & Bioelectronics 11, (1996). 25 Han, T.-S. et al. Development of a Reactor Type Bio-sensor for Trichloroethylene. Analytical Letters 36, (2003). 26 Maliszewska I, W. K. Detection of some chloroorganic compounds by a microbial sensor system. Materials Science-Poland 26, (2008). 27 Bidmanova, S., Chaloupkova, R., Damborsky, J. & Prokop, Z. Development of an enzymatic fiber-optic biosensor for detection of halogenated hydrocarbons. Anal Bioanal Chem 398, , (2010). 28 Bornscheuer, U. T. & Pohl, M. Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design. Current Opinion in Chemical Biology 5, (2001). 17

18 29 Mozga, T., Prokop, Z., Chaloupkova, R., Damborsky, J.,. Chiral Aliphatic Hydroxy Compounds in Nature: a Review of Biological Functions and Practical Applications. Collection of Czech Chemical Communication 74, (2009). 30 Pieters, R. J., Spelberg, J. H. L., Kellogg, R. M. & Janssen, D. B. The enantioselectivity of haloalkane dehalogenase. Tetrahedron Letters 42, (2001). 31 Panke, S. & Wubbolts, M. G. Enzyme technology and bioprocess engineering. Curr Opin Biotechnol 13, , (2002). 32 Lutz, S. & Bornscheuer, U. T. Protein Engineering Hanbook (WILEY-VCH, Weinheim, 2009). 33 Schanstra, J. P. et al. Kinetic characterization and X-ray structure of a mutant of haloalkane dehalogenase with higher catalytic activity and modified substrate range. Biochemistry 35, (1996). 34 Yujing, M. & Mellouki, A. Rate constants for the reactions of OH with chlorinated propanes. Physical Chemistry Chemical Physics 3, (2001). 35 Newman, J. et al. Haloalkane dehalogenase: structure of a Rhodococcus enzyme. Biochemistry 38, (1999). 36 Bosma, T., Damborsky, J., Stucki, G. & Janssen, D. B. Biodegradation of 1,2,3- trichloropropane through directed evolution and heterologous expression of a haloalkane dehalogenase gene. Applied and Environmental Microbiology 68, (2002). 37 Gray, K. A. et al. Rapid evolution of reversible denaturation and elevated melting temperature in a microbial haloalkane dehalogenase. Advances in Synthesis and Catalysis 343, (2001). 38 Damborsky, J. & Brezovsky, J. Computational tools for designing and engineering biocatalysts. Current Opinion in Chemical Biology 13, 26-34, (2009). 39 Klvana, M. et al. Pathways and Mechanisms for Product Release in the Engineered Haloalkane Dehalogenases Explored Using Classical and Random Acceleration Molecular Dynamics Simulations. Journal of Molecular Biology 392, , (2009). 40 Pavlova, M. et al. Redesigning Dehalogenase Access Tunnels as a Strategy for Degrading an Anthropogenic Substrate. Nature Chemical Biology 5: (2008). 18

19 41 Pikkemaat, M. G., Linssen, A. B. M., Berendsen, H. J. C. & Janssen, D. B. Molecular dynamics simulations as a tool for improving protein stability. Protein Engineering 15, (2002). 42 Sato, Y. et al. Two rhizobial strains, Mesorhizobium loti MAFF and Bradyrhizobium japonicum USDA110, encode haloalkane dehalogenases with novel structures and substrate specificities. Applied and Environmental Microbiology 71, (2005). 43 Patel, R. N. Biocatalysis: synthesis of chiral intermediates for drugs. Current Opinion in Drug Discovery and Development 9, (2006). 44 Damborsky, J. & Brezovsky, J. Computational Tools for Designing and Engineering Biocatalysts. Current Opinion in Chemical Biology 13, (2009). 45 Johnson, K. A. Transient-State Kinetic Analysis of Enzyme Reaction Pathways The Enzymes 20, 1-61 (1992). 46 Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: A guide to enzyme catalysis and protein folding. (W.H. Freeman and Company, 1999). 47 Segel, I. H. Enzyme kinetics: Behavior and analysis of rapid equilibrium and steadystate enzyme systems. (John Wiley and Sons, 1993). 48 Gutfreund, H. Kinetics for life sciences. (Cambridge University Press, 1995). 49 Pearson, D. S., Holtermann, G., Ellison, P., Cremo, C. & Geeves, M. A. A novel pressure-jump apparatus for the microvolume analysis of protein-ligand and proteinprotein interactions: its application to nucleotide binding to skeletal-muscle and smooth-muscle myosin subfragment-1. Biochemical Journal 366, , (2002). 50 Verschueren, K. H. G., Franken, S. M., Rozeboom, H. J., Kalk, K. H. & Dijkstra, B. W. Refined X-ray structures of haloalkane dehalogenase at ph 6.2 and ph 8.2 and implications for the reaction mechanism. Journal of Molecular Biology 232, (1993). 51 Verschueren, K. H. G., Seljee, F., Rozeboom, H. J., Kalk, K. H. & Dijkstra, B. W. Crystallographic analysis of the catalytic mechanism of haloalkane dehalogenase. Nature 363, (1993). 52 Verschueren, K. H. G. et al. Crystallographic and fluorescence studies of the interaction of haloalkane dehalogenase with halide ions. Studies with halide compounds reveal a halide binding site in the active site. Biochemistry 32, (1993). 19

20 53 Pries, F. et al. Site-directed mutagenesis and oxygen isotope incorporation studies of the nucleophilic aspartate of haloalkane dehalogenase. Biochemistry 33, (1994). 54 Pries, F. et al. Histidine 289 is essential for hydrolysis of the alkyl-enzyme intermediate of haloalkane dehalogenase. Journal of Biological Chemistry 270, (1995). 55 Krooshof, G. H. et al. Kinetic analysis and X-ray structure of haloalkane dehalogenase with a modified halide-binding site. Biochemistry 37, (1998). 56 Janssen, D. B. et al. Purification and characterization of a bacterial dehalogenase with activity toward halogenated alkanes, alcohols and ethers. European Journal of Biochemistry 171, (1988). 57 Kulakova, A. N., Larkin, M. J. & Kulakov, L. A. The plasmid-located haloalkane dehalogenase gene from Rhodococcus rhodochrous NCIMB Microbiology 143, (1997). 58 Schanstra, J. P., Kingma, J. & Janssen, D. B. Specificity and kinetics of haloalkane dehalogenase. Journal of Biological Chemistry 271, (1996). 59 Bosma, T., Pikkemaat, M. G., Kingma, J., Dijk, J. & Janssen, D. B. Steady-state and pre-steady-state kinetic analysis of halopropane conversion by a Rhodococcus haloalkane dehalogenase. Biochemistry 42, (2003). 60 Prokop, Z. et al. Catalytic mechamism of the haloalkane dehalogenase LinB from Sphingomonas paucimobilis UT26. Journal of Biological Chemistry 278, (2003). 61 Schanstra, J. P. & Janssen, D. B. Kinetics of halide release of haloalkane dehalogenase: evidence for a slow conformational change. Biochemistry 35, (1996). 62 Marek, J. et al. Crystal structure of the haloalkane dehalogenase from Sphingomonas paucimobilis UT26. Biochemistry 39, (2000). 63 Bohac, M. et al. Halide-stabilizing residues of haloalkane dehalogenases studied by quantum mechanic calculations and site-directed mutagenesis. Biochemistry 41, (2002). 64 Schanstra, J. P., Ridder, A., Kingma, J. & Janssen, D. B. Influence of mutations of Val226 on the catalytic rate of haloalkane dehalogenase. Protein Engineering 10, (1997). 20

21 65 Hur, S., Kahn, K. & Bruice, T. C. Comparison of formation of reactive conformers for the SN2 displacements by CH3CO2- in water and by Asp124-CO2- in a haloalkane dehalogenase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 100, (2003). 66 Devi-Kesavan, L. S. & Gao, J. Combined QM/MM study of the mechanism and kinetic isotope effect of the nucleophilic substitution reaction in haloalkane dehalogenase. Journal of American Chemical Society 125, (2003). 67 Olsson, M. H. & Warshel, A. Solute solvent dynamics and energetics in enzyme catalysis: the S(N)2 reaction of dehalogenase as a general benchmark. Journal of American Chemical Society 126, (2004). 21