Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Transkript

1 Investice do rozvoje vzdělávání Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

2 Investice do rozvoje vzdělávání Genomika (KBB/GENOM) Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

3 Investice do rozvoje vzdělávání Fyzické mapování Fyzické kontigové mapy Ing. Hana Šimková, CSc. Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

4 Investice do rozvoje vzdělávání Cíl přednášky - seznámení s konstrukcí fyzických kontigových map a jejich ukotvováním Klíčová slova - fyzické mapování, fingerprinting, kontig, ukotvování fyzických map, integrace genetických a fyzických map Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

5 KONSTRUKCE FYZICKÝCH KONTIGOVÝCH MAP Kontig řetězec ec po sobě jdoucích fragmentů DNA vytvářejících spojitou sekvenci Kontigová fyzická mapa se skládá z překrývajících se klonů z knihoven dlouhých inzertů Konstrukce fyzické kontigové mapy: sestavování kontigů ověřování správnosti kontigů pomocí genetických a cytogenetických markerů integrace genetických a fyzických map

6 1) Sestavování kontigů -z překrývajících se klonů z knihoven dlouhých inzertů. Překryvy je možno zjišťovat na základě - analýzy restrikčních spekter (fingerprintů) - vyhledávání společně se vyskytujících markerů (STS, genetické markery)

7 Uspořádání klonů na základě srovnání restrikčních spekter (fingerprinting) Fingerprint = unikátní spektrum restrikčních fragmentů získaných na základě štěpení 1 nebo více restriktázami a frakcionace takto vzniklých fragmentů. Klony odvozené z jednoho místa genomu sdílejí určitou část restrikčního spektra. Různé varianty fingerprintingu: a) štěpení 1 restrikční endonukleázou (RE) s 6-bp restrikčním místem (cca proužků na klon) - elektroforéza na agaróze, barvení ethidium bromidem - vizualizace téměř všech fragmentů jednoznačnější stanovení přesahů spolehlivější, je možné zjistit velikost BAC klonu, nejlevnější omezená automatizace, nižší informační hodnota Alternativní způsob vytváření fingerprintů - optickým mapováním. Gibson a Muse, 2004

8 b) štěpení více RE + koncové značení - radioaktivně - fluorescenčně Analýza na polyakrylamidovém l gelu - vertikální elektroforéza - sekvenátor Kombinace 2 enzymů Kombinace 2 enzymů, radioaktivní značení

9 Automatizovaný postup fyzického mapování BAC klonů - izolace DNA z BAC klonů ů - štěpení 1 až 4 vzácněji štěpícími RE (s 6-bp místem) zanechávajícími kohezní konce - štěpení 1 často štěpící RE (s 4-bp místem) zanechávající tupé konce 5 G G C C T C T A G A C C G G 3 3 AGATCT A T 5 CCGG C G GGCC G C XbaI + HaeIII - koncové značení fluorescenčně značenými ddntp (1 až 4 různé barvičky) jen u kohezních konců 5 3 TC * AGATC CTAGA Fragmenty bp získáme celkově až stovky fragmentů, viditelných (tj. nesoucích fluorescenční barvičku aspoň na 1 konci) do 50 pro 1 enzym. Optimum proužků pro všechny enzymy dohromady. - frakcionace sekvenátor použití vnitřního standardu v každé kapiláře - vyhodnocení program FPC (FingerPrintedContigs) - porovná fingerprinty - poskládá klony do kontigů - navrhne nejkratší cestu pro sekvenování (minimum tiling path - MTP) * CT 3 5

10 Štěpení restrikčními endonukleázami a barevné značení 5 T C T A G A 3 3 A G A T C T 5 XbaI 5 G G A T C C 3 BamHI 3 C C T A G G 5 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 EcoRI 5 C T C G A G 3 3 GAGCT G T C 5 XhoI Luo et al. (2003)

11 Využití kitu SNaPshot pro barevné značení BamHI EcoRI EcoRI HaeIII HaeIII Výstup ze sekvenátoru (adapted from Luo et al., Genomics, 2003)

12 Čtyřbarevné značení oddělení barev Luo et al BamHI EcoRI XbaI XhoI Velikostní standard (Liz)

13 HICF (high information content fingerprinting) fingerprinting s vysokým informačním obsahem Izolace DNA z BAC klonů Institut National de la Recherche Agronomique Štěpení 5 restrikčními endonukleázami Fluorescenční značení (SNaPshot kit) (Luo et al, 2003, Genomics) Kapilární elektroforéza (ABI3730) Sestavování kontigů (Genoprofiler, FPC)

14 Konstrukce fyzické mapy Výběr metody pro daný genom tak, aby byl dosažen a) optimální počet analyzovaných proužků -méně proužků nižší informační hodnota, větší relativní chyba - příliš mnoho proužků více falešně pozitivních překryvů b) dostatečná vzdálenost mezi proužky Sulston cutoff score (Sulstonova prahové hodnota) vyjadřuje pravděpodobnost, že proužky společné pro 2 fingerprintované klony jsou výsledkem náhody. Pokud je hodnota nižší než tento uživatelem nastavený práh, klony jsou prohlášeny za překrývající se. Udává se jako e -n. Větší genomy vyžadují mnohem nižší Meyers et al hodnotu Sulstonova skóre (vyšší n).

15 Závislost mezi Sulston cutoff score a rozsahem překryvu BAC klonů křivka pro BAC klon o velikosti cca 125 kb 1e -45 1e % 70-80% %překryvu klonů

16 Sestavení fyzické mapy chromozómu 3B pšenice s použitím programu FPC [e-70] [e-65] [e-60] Počet kontig gů [e-75] [e-55] [e-50] [e-45] [e-25] Počáteční sestavení (automaticky s vysokou přísností) Následné automatické sestavení s klesající přísností (merging, DQing ) Manuální upravování sestavy (merging, splitting, killing ) E. Paux (2008)

17 Vyhledávání překryvů na základě společných markerů Obvykle slouží k doplnění fingerprintingu, propojení dosud nespojených kontigů. Lze použít i samostatně, ale velmi pracné, vyžaduje vysokou hustotu markerů. STS markery (sequence-tagged site místo se sekvenční adresou) krátká sekvence, kterou lze amplifikovat pomocí PCR a kterou lze lokalizovat na jediném místě v genomu a) odvozeny z náhodných sekvencí (nemusí být polymorfní) b) odvozeny z genetických markerů ů (např. ř ISBP, mikrosatelitů, RFLP) c) odvozeny z ESTů (expressed sequence tag místo s expresní adresou)

18 2) Ověřování správnosti kontigů - integrací genetických a fyzických map markery ve vazbě by měly kolokalizovat k li na dlouhých h kontizích - sekvence z obou konců dlouhých kontigů použít k odvození genetických markerů ty by měly kosegregovat Tyto koncové sekvence (BAC end sequences = BES) také mohou posloužit ke spojení dvou kontigů: - odvození sondy z konce kontigu - skríning knihovny - vytipování BACu získání jeho koncové sekvence může být na dalším kontigu

19 Ukotvování kontigů pomocí FISH - pro kontigy, které nelze ukotvit - pro kontrolu orientace kontigů Dvoubarevná FISH - pro zjištění velikosti mezer mezi kontigy 172A K08 140C K08 VIRTUÁLNÍ Na základě SPOJENÍ dvoubarevné DVOU FISH KONTIGŮ jsou oba kontigy v těsné blízkosti nebo se překrývají PŘEKRYV? FISH 172A10 140C18 173K08 (5 kb) (8 kb) (3 kb) Podle FISH jsou oba kontigy lokalizovány na distálním konci 3B

20 Zjištění vzájemné pozice dvou BAC klonů pomocí FISH na natažených chromozómech h mitotické chromozómy natažené chromozómy mezera cca 30 kb

21 3) Integrace genetických a fyzických map Xb d907 Xcfa2191 Xcfa2226 Xcfd143 Xgwm493 Genetická mapa Xgwm493 Xbarc87 Xbarc147 Xcfa2191 Xcfa2226 X fd143 Deleční mapa Fyzická mapa Xbcd907 Xcdo460 Xtam61 Xgwm493 Xbarc147 Xbarc133 Xbarc75 Xbarc102 Xgwm389 Xgwm533-1 Xgwm533-2 XksuH7 Xgwm389 Xgwm533 Xbarc68 Xbarc156 Xbarc147 Xbarc102 Xbarc75 Xcfd143 Xbarc133 Xwmc43 Xk H7 3BS-8 3BS-9 Xbarc73 Xabg471 Xbcd1418 Xgwm566 Xgwm72 Xcfd4 Xgwm285 Xgwm77 Xgwm533 2 Xwmc43 Xgwm264 Xcnl3 Xgwm131 XksuH7 Xpsr689 Xcfd79 Xgwm566 Xgwm72 Xgwm285 Xgwm77 Xcfd4 XksuH7 Xpsr689 3BS-1 Xbarc73 Xgwm264 Xgwm144 Xfbb378 Xbcd131 g Xgpw1146 Xgwm376 Xgwm284 g Xgwm108 Xgwm112 Xbarc164 Xgpw1146 Xgwm376 Xgwm131 Xgwm108 Xbarc77 Xbarc1077 Xgwm77 Xbarc139 Xgwm284 Xbarc164 Xcnl3 C 3BL-2 Xfba360 Xbg131 Xcfa2170 Xgwm114 Xgwm299 Xbarc77 Xbarc84 Xbarc1077 Xgwm112 Xgwm114 Xpsp3081 3BL-2 3BL-10 Xbarc203 Xbarc1044 Xbg131 Xtam63 Xmwg11 g Xpsp2151 Xgwm547 Xgwm247 Xgwm181 Xgwm340 Xcfa2170 Xgwm547 Xgwm299 Xpsp2151 Xgwm247 Xpsr170 XksuG62 3BL-7 Xbarc164? g Xgwm181 Xbarc84 Xgwm247 Xgwm340 Xfwm4 XksuG62

22 A) Přímé ukotvování (forward contig anchoring) Přímé ukotvování: - z genetických map do kontigů pomocí geneticky zamapovaných markerů (SSR, EST, RFLP, DArT, SNP ) Provádí se skríning knihovny genetickými markery - je možné i s větším počtem sond poolovací strategie (strategie směsných vzorků): a) PCR skríning pooly z knihovny miskové+řádkové+sloupcové (=3D), ale i 5D, 6D pooly. b) skríning hybridizací na membránách o vysoké hustotě E. Paux (Science, 2008)

23 a) Vytváření třídimenzionálních směsných vzorků (poolů) 48 PCR reakcí umožní proskrínovat 8 misek po 384 jamkách, tedy najít 1 pozitivní klon mezi CNRGV Toulouse

24 b) Hybridizace na membránách o vysoké hustotě Nylonová membrána s nanesenými klony Nanášecí schéma 5x5, každý klon 2x CNRGV Toulouse Detail Po hybridizaci s radioaktivně značnou sondou

25 Skríning hybridizací na membránách o vysoké hustotě - sonda z 1 markeru (např. EST) - směsné sondy z několika typů markerů - sondy z překrývajících se oligonukleotidů (overgos) odvozeny z kusu známé unikátní sekvence 2 částečně se překrývající oligonukleotidy bp konce doplněny radioaktivně značenými oligonukleotidy 8bp bp vysoká specificita it hybridizace (odvozeno z jednokopiových sekvencí), silné signály, lze snadno odmýt hybridizační membránu je možno použít víckrát poměrně vysoké náklady na syntézu overgos

26 B) Reverzní ukotvování (reverse contig anchoring) Reverzní ukotvování (chromosome landing): - ukotvování kontigů BAC klonů na genetickou mapu (přes genetický marker obsažený v kontigu) využívá markerů odvozených ze sekvencí BAC klonů ů nebo konců ů BAC klonů ů (BES) SSR, ISBP, SNP,, které se geneticky zamapují za použití mapovací populace E. Paux (Science, 2008)