Sekvenování nové generace. Radka Reifová

Transkript

1 Sekvenování nové generace Radka Reifová

2 Prezentace ke stažení v záložce Přednášky

3 1. Přehled sekvenačních metod nové generace 2. Využití sekvenačních metod nové generace

4 Vývoj sekvenačních metod za posledních 30 let Stratton et al Nature 458:

5 Sangerova metoda využívá ddntp zpočátku detekce fragmentů na gelech (radioaktivní značení) později automatické sekvenátory (fluorescenční značení; až 96 kapilár)

6 Kapilární sekvenování (Sangerova metoda) Nutná PCR amplifikace či klonování jednotlivých DNA fragmetnů Sekvenace jednotlivých DNA fragmentů. V jednom sekvenačním běhu lze sekvenovat max. 96 vzorků (96 kapilárové sekvenátory). Délka získané sekvence cca 650 bp. Max. sekvenační výtěžek jednoho sekvenačního běhu cca 60 kb. Sekvenování nové generace (massivelly parallel sequencing) PCR se provádí paralelně pro všechny fragmenty DNA nebo není třeba. Paralelní sekvenování několika miliónů sekvencí. Délka získaných sekvencí cca bp. Sekvenační výtěžek jednoho běhu až několik tisíc Gb.

7 emulzní PCR pyrosekvenování

8 454 Genome Sequencers FLX System 1 million of reads/run bp/read 3 přístroje v ČR GS Junior 0.1 millions of reads/run 400 bp/read

9 můstková bridge PCR sekvenování pomocí DNA syntézy Solexa (Illumina)

10

11

12

13 Illumina sequencers Illumina MiSeq 4 millions reads/run 150 bp/read Illumina GAIIx 300 millions reads/run 150 bp/read Illumina HighSeq millions reads/run 100 bp/read Genomics Core Facility EMBL Heidelberg Head: Vladimir Benes

14 SOLiD (2008) emulzní PCR, sekvenování pomocí ligace SOLiD 5500xl 1500 millions reads/run 75 bp/read 1 přístroj v ČR

15 Další sekvenační metody nové generace Ion Torrent (2010) Sekvenování na polovodičovém čipu. Pacific Biosciences (2010) Single-molecule real-time sequencing. Není třeba PCR. Sekvence čtena přímo při procesu replikace DNA pomocí DNA polymerázy používající fluorescenčně značené nukleotidy. Dlouhé sekvence ( bp). Oxford Nanopore (2012) Single-molecule sequencing. Není třeba PCR. Báse DNA jsou určeny na základě jejich elektrické vodivosti při průchodu nonopórem.

16 Přehled současných metod sekvenování nové generace Modified from T. C. Glenn Field guide to next-generation DNA sequencers. Molecular Ecology Resources 11:

17 2012. NGS Field Guide (

18 Chybovost jednotlivých sekvenačních metod NGS Field Guide (

19 Mnohonásobné prosekvenování jednoho úseku DNA (tj. vysoká coverage ) kompenzuje vyšší chybovost sekvenačních metod nové generace Sekvenujeme-li DNA z diploidního organismu, je třeba coverage > 10x, abychom rozlišili sekvenační chybu od heterozygota.

20 Fastaq GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT +!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65 Řádek 1: Začíná a obsahuje informaci o sekvenci. Řádek 2: Samotná sekvence. Řádek 3: Začíná symbolem + a může obsahovat další informace o sekvenci. Rádek 4: Quality scores. V tomto případě Phred Quality Scores.

21 Fastaq GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT +!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65 Phred Quality Scores (Q) Q P Správnost báze 10 0,1 90% 20 0,001 99% 30 0, % 40 0, % Pravděpodobnost, že je daná báze určena nesprávně.

22 Multiplex Identifier Sequences (MIDs). Umožňují individuálně značit sekvenované vzorky DNA. Lze např. označit vzorky DNA pocházející z různých jedinců, které se sekvenují v jednom sekvenačním běhu.

23 Pair-end sequencing Významně usnadňuje assembly sekvencí

24 1. Přehled sekvenačních metod nové generace 2. Využití sekvenačních metod nové generace

25 Sekvenování celých genomů de novo assembly (A) Overlapping short reads (blue) are merged to form contigs (red). (B) Read pairs (i.e., short reads from the ends of a genomic fragment) that map to two different contigs act as anchors to join the contigs into (C) scaffolds (green). (D) Assigning scaffolds to chromosomes (easier when linkage map is known). Pokud k dispozici genom příbuzného druhu, lze využít refference guided assembly. Ellegren, TREE, 2013

26 Ellegren, TREE, 2013

27 Ensembl Genome Browser

28 Sekvenování celých genomů Resekvenování Read mapping = mapování krátkých sekvencí (readů) na referenční sekvenci.

29 Populační a evoluční genomika Genomová sekvence několika jedinců dvou druhů lejsků odhalila oblasti genomu pravděpodobně odpovědné za vznik reprodukční izolace. Ellegren et al Nature

30 Komparativní genomika a fylogenomika 2x pomalejší substituční rychlost protein kódujících sekvencí ve srovnání s ostatními tetrapody. Latimérie podivná

31 Sekvenování transkriptomu (RNA sequencing) Sekvenování cdna bez nutnosti klonování. Hluboké sekvenování umožňuje identifikovat i dosud neznámé transkripty. Možnost získat informaci i o míře transkripce jednotlivých genů (přesnější než microarrays). RNA lze normalizovat vyrovnání početnosti jednotlivých traskriptů.

32 Populační a evoluční genomika Libor Mořkovský slavík tmavý slavík obecný Normalizovaná cdna z jater z 8 jedinců slavíka obecného a 7 jedinců slavíka tmavého. Sekvenace pomocí 454. Získali jsme 5 mil. sekvencí, v průměru 300 bp dlouhých. De novo assemby vytvořilo 47 tis. kontigů delších než 500 bp. Identifikováno 301 druhově specifických SNP. Navrženy PCR a genotypovací primery pro 248 z nich.

33 Cílené (targeted) sekvenování = sekvenování jen určité části genomu či vybrané skupiny genů ddrad sequencing (double digest Restriction site associated DNA sequencing) Štěpení genomové DNA pomocí jednoho či více restrikčních enzymů. Výběr restrikčních fragmentů jen určité velikosti Sekvenování krátkých úseků vybraných fagmentů. Umožňuje získat stejné sekvence z mnoha jedinců.

34 Využití ddrad sekvenování

35 Hybridization-based capture Na základě hybridizace k cca 100 bp dlouhým próbám se vyselektují fragmenty DNA, které sekvenujeme. Nutná referenční sekvence (alespoň z příbuzného druhu), kterou použijeme na přípravu prób. Sekvenování určité skupiny genů vybraného chromosomu exomu (Exome sequencing)

36 PCR Amplicon Sequencing Sekvenování mnoha (až několik stovek) různých PCR produktů. Možnost individuálního značení vzorků. Odpadá nutnost klonování PCR produků!

37 Využití NGS metod Populační genetika Fylogenetika Komparativní genomika Metagenomika Funkční genetika. a mnoho dalších

38 Doporučené čtení Elaine R. Mardis. Next-generation sequencing platforms. Annual Review of Analytical Chemistry Hans Ellegren. Genome sequencing and population genomics in nonmodel organisms Trends in Ecology and Evolution