Detekce mikroorganismů v kravském mléce metodou qpcr a jejich korelace s počtem somatických buněk Diplomová práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Detekce mikroorganismů v kravském mléce metodou qpcr a jejich korelace s počtem somatických buněk Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Libor Stehlík, Ph.D. Vypracovala: Bc. Vladimíra Lichevníková Brno 2013

2

3

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Detekce mikroorganismů v kravském mléce metodou qpcr a jejich korelace s počtem somatických buněk vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne.. podpis diplomanta

5 PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucímu diplomové práce Ing. Liboru Stehlíkovi, Ph.D. za pedagogickou a odbornou pomoc a další cenné rady při zpracování mé diplomové práce, Ing. Jakubovi Surýnkovi za pomoc v laboratoři a doc. Ing. Tomášovi Urbanovi, Ph.D. za pomoc se zpracováním výsledků. Dále bych chtěla poděkovat svým rodičům za umožnění studia na VŠ a jejich podporu při studiu a zpracování diplomové práce.

6 ABSTRAKT Cílem práce bylo detekovat patogeny způsobující mastitidu z kravského mléka metodou real-time PCR a zjistit jestli existují vztahy mezi množstvím detekovaných patogenů a počty somatických buněk. Pro stanovení patogenů byl použit komerční kit PathoProof Mastitis PCR Assay. Pomocí kitu byla zjišťována přítomnost 11 běžných patogenů mléčné žlázy a gen BlaZ způsobující rezistenci stafylokoků vůči penicilinu. Bylo odebráno 80 individuálních vzorků mléka v rámci odběrů pro kontrolu užitkovosti. Pouze 2 vzorky byly negativní na všechny detekované patogeny. Téměř 95% frekvence výskytu byla zjištěna pro koaguláza negativní stafylokoky. Bylo zjištěno, že všechny vzorky pozitivní na Staphylococcus aureus měly přítomný gen BlaZ. Vztah mezi Ct hodnotami a počtem somatických buněk byl zjištěn u Streptococcus dysgalactiae, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis a Staphylococcus agalactiae. Metoda qpcr představuje užitečný nástroj pro bakteriologickou diagnostiku, vyznačující se vysokou rychlostí analýzy, specifitou a citlivostí. Klíčová slova: mastitida, patogen, real-time PCR, počet somatických buněk ABSTRACT The aim of this study was to detect mastitis causing pathogens in cows' milk by realtime PCR to determine whether relationships exist between the number of detected pathogens and somatic cell counts. For determination of pathogens a commercial PathoProof Mastitis PCR Assay was used. A presence of 11 pathogens common in mammary gland and BlaZ gene causing staphylococcal resistance to penicillin were detected using this kit. Eighty individual milk samples were collected from performance monitoring sampling. Only two samples were negative for all detected pathogens. Almost 95% incidence rate was found for coagulase-negative staphylococci. It was found that all samples tested positive for Staphylococcus aureus were also positive for BlaZ gene. The relationship between Ct values and the number of somatic cells was found in Streptococcus dysgalactiae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae and Staphylococcus uberis. The qpcr method is a useful tool for bacteriological diagnostics characterized by high speed analysis, specificity and sensitivity. Key words: mastitis, pathogen, real-time PCR, somatic cells counts

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Mastitidy Kategorizace zdraví mléčné žlázy Definice mastitidy Klinická vs. subklinická mastitida Genetická prevence mastitid Somatické buňky Somatické buňky buňky bílé krevní řady Počet somatických buněk Původci mastitid Rod Streptococcus Rod Staphylococcus Rod Mycoplasma Rod Corynebacterium Rod Enterococcus Čeleď Enterobacteriaceae Detekce patogenů Mikrobiologické metody Molekulární metody PathoProof Mastits PCR Assay Výhody proti konvenčním metodám bakteriální kultivace Princip kvantifikace PathoProof Mastitida Complete - 12 Kit Vztahy mezi mastitidními patogeny a PSB Bazénové vzorky mléka Individuální vzorky mléka Čtvrťové vzorky mléka MATERIÁL A METODIKA Charakteristika testovaných zvířat... 34

8 4.2 Odběr a uchování vzorků Stanovení počtu somatických buněk PathoProof Mastitis PCR Assay Extrakce bakteriální DNA Real-time PCR Analýza a vyhodnocení dat Matematické zpracování výsledků, statistické vyhodnocení Test normality Popisná statistika Statistická analýza VÝSLEDKY A DISKUSE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM TABULEK SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM ZKRATEK... 63

9 1 ÚVOD Mastitidy jsou celosvětově nejběžnější, nejfrekventovanější a nejdražší nemocí dojnic. I přes pokročilý výzkum a pokrok v preventivních programech mastitida stále představuje pro mlékařský průmysl ekonomicky nejzávažnější onemocnění skotu a je zároveň chorobou s nejčastější indikací pro použití antibiotických preparátů. Významně snižuje produkci mléka (dojnice při mastitidě ztrácí na produkci asi o 10 15% za rok, což v našich podmínkách představuje průměrně 350 litrů mléka na dojnici), snižuje rovněž nutriční hodnotu a technologickou zpracovatelnost syrového mléka na mléčné produkty. Ekonomiku chovu zatěžují vícenáklady na preventivní opatření, léčení a manipulaci s mastitidními krávami. Dochází také k předčasnému vyřazování krav z chovu a v některých případech jsou vykazovány nižší výsledky v plodnosti. Spolehlivá identifikace mastitidních patogenů je velmi důležitá pro tvorbu preventivních opatření, kontrolu mastitid ve stádě. Je také důležitá pro cílenou antimikrobiální léčbu, která je pro mastitidy doporučována. Přesným stanovením druhu původce se můžeme vyhnout aplikaci širokospektrálních antibiotik. V případě klinické mastitidy potřebujeme diagnózu určit co nejdříve, abychom mohli co nejrychleji zahájit léčbu, protože její zpoždění prodlužuje celkovou dobu léčby. Pro odhalení subklinické mastitidy je detekce přítomnosti patogenů nezbytná. Tradiční mikrobiologické metody s biochemickými testy jsou zlatým standardem pro identifikaci mastitidních patogenů. Doba analýzy je ale příliš dlouhá, trvá běžně 48 hodin. V poslední době se pro detekci mastitidních patogenů začínají vyvíjet metody založené na detekci specifických genomových sekvencí spíše než na fenotypovou expresi produktů, které tyto sekvence kódují. Základem těchto metod je polymerázová řetězová reakce. Proti tradičním mikrobiálním metodám detekce jsou rychlejší, citlivější a mají možnost automatizace. Revoluci v detekci mastitidních patogenů představuje produkt firmy Thermo Fischer Scientific Patho Proof Mastitis PCR Assay, který umožňuje během 4 hodin identifikovat až 16 původců mastitidního onemocnění. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je: - charakterizovat zánět mléčné žlázy mastitidu - popsat etiologii mastitidy se zaměřením na popis mikroorganismů - vybrat skupinu krav a odebrat jim individuální vzorky mléka pro izolaci - detekovat mikroorganismy metodou qpcr - vyhodnotit vztah mezi množstvím mikroorganismů a počtem somatických buněk 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Mastitidy Kategorizace zdraví mléčné žlázy Nezbytným předpokladem pro hodnocení zdravotního stavu mléčné žlázy je jednotná kategorizace zánětů mléčné žlázy. Toto bylo již před lety diskutováno a řešeno skupinou expertů z iniciativy Mezinárodní mlékařské federace (IDF), kdy byly definovány kategorie zdraví a nemoci mléčné žlázy na základě buněčných elementů, přítomnosti mikrobiálních původců mastitid a biochemických změn ve složení mléka. Kategorizace se jeví ze současného hlediska překonána, ale její principy zůstávají v platnosti (Hofírek, 2003). Tabulka 1 Kategorizace zánětů mléčné žlázy (Hamann, Fehlings, 2002) PSB/ml mléka patogenní mikroorganismy v mléce ano ne latentní infekce normální sekrece mastitis nespecifická mastitis Definice mastitidy Jako mastitis je označována každá zánětlivá změna mléčné žlázy, která je charakterizována zvýšeným počtem somatických buněk, obzvláště leukocytů v mléce, změnou fyzikálně-chemických a mikrobiologických vlastností sekretu mléčné žlázy a patologickými změnami v tkáni mléčné žlázy (Kováč a kol., 2001). Změny nejsou vždy patognomické, jelikož různí původci mohou vyvolat stejné nebo velmi podobné klinické příznaky a patologicko-morfologické změny. Navíc průkaz agens v mléku nemusí vždy znamenat zánět mléčné žlázy (Hejlíček a kol., 1987). IDF zvolila následující diagnostickou kategorizaci mastitid: Zdravá mléčná žláza - normální sekrece. Počet somatických buněk leží pod kritickou hodnotou. Sekret má normální chemické složení a normální fyzikální vlastnosti. V sekretu nebyl diagnostikován mikrobiální patogen mléčné žlázy. 11

12 Latentní infekce - počet somatických bun k leží pod kritickou hodnotou. Sekret má normální chemické složení a normální fyzikální vlastnosti. V sekretu byl diagnostikován mikrobiální patogen mléčné žlázy. Aseptická (nespecifická) mastitida - Počet somatických buněk dosáhl, nebo leží nad kritickou hodnotou. Sekret má změněné chemické složení a fyzikální vlastnosti. V sekretu nebyl diagnostikován mikrobiální patogen mléčné žlázy. Subklinická mastitida - Počet somatických buněk dosáhl, nebo leží nad kritickou hodnotou. Sekret má změněné chemické složení a fyzikální vlastnosti. V sekretu byl diagnostikován mikrobiální patogen mléčné žlázy. Klinická mastitida - Mléčná žláza vykazuje klinické příznaky zánětu (dolor, calor, rubor, oedema, functio laesa) nebo jen některý z nich. Sekret je vždy smyslově změněný. Podle pozitivity mikrobiologického nálezu se rozlišuje klinická mastitida nespecifická (negativní nález) a klinická mastitida infekční (pozitivní nález). Obrázek 1 Zanícené a oteklé vemeno; charakteristické znaky onemocnění mastitida (Pazdera, 2005) Klinická vs. subklinická mastitida V případě klinické mastitidy bývá mléko vyřazeno, jelikož jsou patrné příznaky zánětu a je aplikována antibiotická léčba. Méně kvalitní mléko se tak nedostane do směsné nádrže a nepřispívá tak ke snížení kvality tankového mléka. (Forsback a kol., 2009). 12

13 Subklinická mastitida je problematičtější, jelikož nevykazuje žádné viditelné příznaky, jako je otok a zčervenání vemene a nejsou ani pozorovatelné abnormality v mléce (Gianneechini a kol., 2002). Hlavní ztráty (70 80%) připadají právě na subklinickou verzi mastitidy (Nauriyal, Pachauri, 2003). Subklinické záněty způsobují především kontagiózní (nakažliví) původci mastitid. Subklinicky nemocnou čtvrť je třeba brát jako velmi nebezpečnou, jelikož představuje riziko infekce dalších čtvrtí nebo jiných dojnic (Jelínková, 2012). Klinické záněty představují jen špičku ledovce. Ambade a kol., 2012 uvádí výskyt klinické mastitidy 24,4% a subklinické 75,6%. Včasné odhalení zánětu může ochránit mléčnou žlázu před atrofií a trvalou dysfunkcí Genetická prevence mastitid Nárůst mléčné užitkovosti je provázen rostoucím výskytem zdravotních problémů, které jsou představovány zejména nárůstem výskytu mastitid. Genetická korelace mezi mléčnou produkcí a výskytem mastitid činí v průměru 0,20. Je třeba očekávat pomalý avšak trvalý nárůst výskytu mastitid provázející geneticky podmíněný nárůst mléčné užitkovosti. Na odolnost nebo vnímavost krav k infekci mléčné žlázy a k následnému výskytu mastitid má vliv celá řada morfologických, fyziologických a imunologických činitelů. Existuje velký počet dosud neznámých genů, kódujících znaky rezistence. Jsou však známy polymorfní lokusy, jejichž produkty jsou bovinní leukocytární antigeny (BoLA), které jsou v asociaci s mastitidami skotu. Dědivost výskytu klinických mastitid vyjádřená koeficientem heritability činí v průměru 0,12, dědivost výskytu bakteriální infekce má průměrnou hodnotu 0,11 (Ryšánek, ). V selekčních programech se používá počet somatických buněk (PSB) v individuálních vzorcích mléka. PSB bývají k tomuto účelu vyjadřovány v logaritmické transformaci. Tento parametr se označuje jako skóre počtu somatických buněk (SCS). Heritabilita PSB činí 0,06 pro SCS je dvojnásobná, 0,12. Postupy zlepšování geneticky podmíněných vlastností krav jsou založeny na selekčních indexech, které umožňují zahrnout několik znaků. Selekční indexy zahrnují PSB a tvarové vlastnosti vemene, plemenní býci jsou pro plemenitbu vybíráni na jejich základě. Genetická prevence je jen jedním z prostředků prevence mastitid ale nemůže nahradit celkovou chovatelskou péči (Ryšánek, ). 13

14 3.2 Somatické buňky Mléko v období laktace, sekrety mléčné žlázy v období kolostrogeneze v období aktivní involuce, jakož i tekutina obsažená v dutinovém systému juvenilní mléčné žlázy obsahují buňky. Paape se svými spolupracovníky v roce 1963 pro ně zavedl označení somatické buňky (Ryšánek, ) Somatické buňky buňky bílé krevní řady Somatické buňky jsou především obránci mléčné žlázy (tj. bílé krvinky), jsou signálem, že mléčná žláza byla zasažena, a to buď infektem, nebo neinfekčními vlivy. Cílem organismu je pomocí bílých krvinek eliminovat přítomný infekt, poškozené buňky mléčné žlázy a zajistit tak její rychlé uzdravení (Zelinková, 2002). V mléce zdravé mléčné žlázy jsou převládajícím typem somatických buněk makrofágy (mononukleární fagocyty, kolostrální tělíska, pěnové buňky), které představují 35 79% SB, následují lymfocyty 16 28%, neutrofilní granulocyty (polymorfonukleární fagocyty, polymorfonukleární neutrofily) 3 26%. V menším zastoupení jsou to i epiteliální buňky 2 15%, eozinofily, bazofily, erytrocyty, histiocyty, plazmatické a žírné buňky. Při mikrobiální infekci mléčné žlázy dochází k nárůstu počtu somatických buněk a neutrofily představují až 95% buněčné populace. Chronický zánět je provázen vyšším zastoupením makrofágů a lymfocytů, avšak neutrofily zůstávají dominantní (Lindmark Mansson a kol., 2006; Ryšánek, ). Reaktivita krávy ve smyslu spouštění somatických buněk do mléka je ovlivněna částečně i genetickým založením dojnice (Zelinková, 2002) Počet somatických buněk PSB ve čtvrťovém vzorku z prvních střiků je spolu s nálezem bakteriologického vyšetření prostředkem diagnostické klasifikace mastitid. PSB v individuálním vzorku krav je prostředkem operativního řízení chovatelských a veterinárních činností v jednotlivých stádech a také prostředkem šlechtitelské prevence mastitid. PSB v bazénovém vzorku je významným jakostním znakem syrového mléka (Ryšánek, ). Dobrý zdravotní stav mléčné žlázy je zásadní pro produkci kvalitního mléka. Počet somatických buněk (PSB) je ukazatelem zdravotního stavu mléčné žlázy. Je také jedním z hlavních ukazatelů hygieny (kvality) syrového kravského mléka a může být 14

15 spojena s buněčnu imunitní odpovědí na zánětlivé podněty (Paape a kol., 2003; Ryšánek a kol., 2007; Erdem a kol., 2010; Ambade a kol., 2012). Posuzování zdraví vemene na základě hodnot SB jen z jediného měření nemá samo o sobě dostatečnou vypovídající schopnost a může vést k mylným závěrům. Vysoký PSB může být způsoben například v důsledku stresu a jakmile tento stres pomine, plesnou SB sami od sebe. Tak se mohou tyto hodnoty během několika hodin znatelně zvýšit nebo naopak poklesnout (Jelínková, 2012). Nejvýznamnějším činitelem ovlivňujícím celkový i diferenciální PSB je zánětlivý proces, při kterém vzrůstá PSB o několik řádů (z 10 4 na 10 7 ) (Ryšánek, ). Tabulka 2 Limitní hodnoty PSB podle Hillerton, 1999 (Ryšánek, ) vzorek PSB (x 10 3 /ml) čtvrťový zdravá pravděpodobná infekce individuální přijatelný stav má být < 10 % krav exudativní proces nepřijatelný stav V současnosti lze za zdravou čtvrť mléčné žlázy považovat takovou, která vykazuje PSB v mléce 100 tisíc/ml (Lindmark Marrsson a kol., 2006; Vyletělová, Hanuš, 2012). Shaldrake a kol. (1983) stanovili v neinfikované mléčné žláze PSB od 83 tisíc až po 160 tisíc, vyšší hodnoty už signalizují možnou infekci mléčné žlázy. Při zvýšených PSB se vždy kromě snižování produkce mléka mění více či méně jeho složení a vlastnosti. Proto jsou u směsného mléka stanoveny hraniční hodnoty PSB, kdy se ještě předpokládá bezriziková zpracovatelnost mléka. Stanovení PSB ve směsném mléce má význam pro posuzování kvality a technologické zpracovatelnosti. Pro bazénové vzorky syrového dodavatelského kravského mléka je stanovena u PSB povolená limitní hodnota 400 tisíc v ml (Vyletělová, Hanuš, 2012). S poklesem mléčné užitkovosti se musí počítat již při průměru stáda 200 tisíc v ml až o 5%. Při 400 tisíc SB dochází ke ztrátě až 10% a při 1 milionu je to až 18% ztráta mléčné produkce. Je proto důležité z hlediska ekonomických ztrát pravidelně kontrolovat vývoj SB ve stádě, na základě měsíčních zpráv z KU (Jelínková, 2012). 15

16 PSB byl navržen a potvrzen jako indikátor pro včasnou diagnostiku subklinické mastitidy. Tyto výsledky (Ambade a kol., 2012) souhlasí se zjištěním Tuteja a kol., (2000). PSB 283 tisíc jako limitní hodnotu pro detekci výskytu subklinických mastitid uvádí ve své práci Renau (1986). 3.3 Původci mastitid Mastitidy nejsou jednotnou nozologickou jednotkou. Jsou to polyfaktorová onemocnění, na kterých se podílí celá řada činitelů z vnějšího prostředí na jedné straně, úroveň obranných mechanismů dojnice na straně druhé. Řada činitelů vnějšího prostředí má pouze dispoziční charakter (Ryšánek, ). Obrázek 2 Interakce tří biosystémů uplatňujících se při vzniku mastitid (Hejlíček a kol., 1987) Příčinou naprosté většiny mastitid je infekce mléčné žlázy mikrobiálními patogeny. K infekci mléčné žlázy dochází téměř vždy strukovým kanálkem. Důležité je rozlišovat kdy k infekci dochází, jestli v průběhu dojení nebo mezi jednotlivými dojeními (Ryšánek, ). Zpravidla každá interakce patogena s makroorganismem se projevuje specifickými symptomy, patogenezí a vyžaduje odlišnou terapii a specifické formy prevence (Hejlíček a kol., 1987). Mikrobiální původci a jejich patogenita také ovlivňují PSB (Ryšánek, ) 16

17 Tabulka 3 Patogenní původci a PSB (Ryšánek, ) patogen aritmetický průměr ( 10 3 /ml) geometrický průměr ( 10 3 /ml) S. aureus S. agalactiae S. dysgalactiae S. uberis Enterococcus spp negativní Tabulka 4 Kategorizaze mastitidních patogenů (upraveno dle Bouška a kol., 2006; Ryšánek ; Brzdil, 2012) kontagiózní původci závislí na environmentální původci patogeny organismu dojnice nezávislí na organismu dojnice zdroj infikovaná mléčná žláza prostředí přenos při dojení mezi dojením hlavní (major) vedlejší (minor) Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae (Streptococcus dysgalactiae) Mycoplazma bovis koaguláza-negativní stafylokoky Corynebacterium bovis environmentální streptokoky: Streptococcus uberis Streptococcus equinus ( bovis ) (Streptococcus dysgalactiae) Enterococcus spp.: Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus durans koliformní: Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Enterobacter aerogenes nekoliformní: Proteus spp. Serratia spp. Yersinia spp. jiné: Pseudomonas aeroginosa Arcanobacterium pyogenes plísně houby typ mastitidy klinická a subklinická v průběhu laktace klinická zejména po otelení a v létě 17

18 3.3.1 Rod Streptococcus Streptokoky patří mezi hlavní původce mastitid dojnic. Jsou to gram pozitivní mikroorganismy, které mají oválný nebo kulatý tvar. Jsou nepohyblivé a většinou fakultativně anaerobní (Hejlíček a kol., 1987). Streptococcus agalactiae Patří do skupiny vysoce kontagiózních patogenů mléčné žlázy dojnic. Je nejčastěji prokazovaným původcem infekčních mastitid. K infekci dochází průnikem přes strukový kanálek. Pomnožuje se v mléku a na povrchu mléčných tkání, ke kterým velice dobře adheruje (Hejlíček a kol., 1987). Formy onemocnění, které může vyvolávat, jsou latentní infekce, subklinický zánět, galactophoritis, akutní nebo chronická katarální mastitida a parenchymatózní mastitida. Klinické příznaky se objevují za 1 2 dny po infekci (Hofírek a kol., 2003). Zánět způsobuje zástavu sekrece v postižené čtvrti mléčné žlázy. Zdrojem šíření infekce je mléčná žláza a mléko postižených krav. Dlouhodobě přežívá v prostředí mléčné žlázy, včetně období zaprahnutí. Mimo mléčnou žlázu může přežívat v zaschlé formě na kůži zvířat. Ve stájovém prostředí přežívá jen krátce (Hejlíček a kol., 1987). Streptococcus uberis Patří do skupiny environmentálních streptokoků. (Hofírek a kol., 2003). Jde o saprofyta a epifyta kůže, tonzil, rekta a vaginy skotu. Vyskytuje se i v podestýlce. Primárním zdrojem mikroorganismu je střevní obsah skotu. Není považován za obligátního patogena mléčné žlázy skotu. Vzniklý zánět mívá akutní, chronický nebo nejčastěji subklinický průběh. Infekce, které způsobuje, nejsou infekční. Dlouhodobě přežívá ve stájovém prostředí včetně výkalů, tím se podobá enterokokům (Hejlíček a kol., 1987). Streptococcus dysgalactiae Mastitidy vyvolané S. dysgalactiae mají převážně kontagiózní charakter. Jde o oportunistického původce mastitid. Je to saprofyt a epifyt, vyskytuje se na sliznici nosu, hltanu a vaginy krav a také v mléčné žláze. Zdrojem infekce je většinou mléčná žláza a mléko infikovaných dojnic. Původce onemocnění se po zavlečení do stáda šíří především chybami v hygieně a poraněním konců struků dojnic. Nejčastěji vyvolává akutní katarální mastitidu a přechází do chronického stádia (Kováč a kol., 2001). 18

19 3.3.2 Rod Staphylococcus Jsou to grampozitivní mikroorganismy kuličkovitého tvaru, fakultativně anaerobní. Ve vnějším prostředí přežívají velmi dlouho (Hejlíček a kol., 1987). Stávají se poměrně často rezistentními proti antimikrobiálním látkám (Hofírek a kol., 2009). Staphylococcus aureus V našich podmínkách je druhým nejčastějším původcem infekčních mastitid krav (Hofírek a kol., 2009). Uplatňuje se především v poškozené a traumatizované tkáni (Hejlíček a kol., 1987). S. aureus není obligátním patogenem mléčné žlázy. Sekret infikovaných čtvrtí představuje nejčastější zdroj infekce, ke kontaminaci zdravých čtvrtí tak dochází prostřednictvím dojícího stroje. Jde o běžného obyvatele kůže, proto by měla být nastavena preventivní opatření, aby nedocházelo ke kontaminaci mléčné žlázy rukama dojičů. Častý je přenos i mouchami a vzájemným vysáváním krav (Kováč a kol., 2001). Má schopnost se rychle šířit a výrazně snižuje dojivost. Formy onemocnění mléčné žlázy jsou latentní infekce, subklinický zánět, akutní zánět, parenchymatózní mastitida (hemoragicko - nekrotizující mastitida). Nástup klinických příznaků může být za 2 hodiny po infekci ale také až za 2 dny. (Hofírek a kol., 2003). Vyznačuje se dobrou odolností vůči nepříznivým vlivům vnějšího prostředí. V zaschlém hnisu, na povrchu kůže, srsti a v organických zbytcích zůstává životaschopný po několik měsíců. Jednotlivé kmeny produkují toxiny, které pronikají do hloubky mléčné žlázy, kde se vytváří fibrózní tkáň, která chrání původce před přímým stykem s léčivem (Hejlíček a kol., 1987). Koaguláza-negativní stafylokoky (KNS) Mastitidy vyvolané KNS jsou poměrně časté. Jsou to epifyté kůže vemene, struků a strukového kanálku. Snadno kolonizují ruce dojičů. Nejčastěji se projevují chronickou formu onemocnění. Běžní původci jsou: Staphylococcus hyicus, xylosus, simulans, intermedius, epidermidis (Kováč a kol., 2001) Rod Mycoplasma Mastitidy mykoplazmového původu jsou typické akutním průběhem a lokálním výskytem. Jsou provázeny snížením produkce mléka až agalakcií (Kováč a kol., 2001). Nejčastějším druhem vyvolávající mastitidy dojnic s těžkým průběhem je Mycoplasma bovis (Hejlíček a kol., 1987). 19

20 3.3.4 Rod Corynebacterium Zahrnuje grampozitivní tyčinky, které jsou rovné, často kyjovitě rozšířené. Infekce, které způsobují, se vyznačují společným rysem a tím je vznik hnisavých procesů v mléčné žláze (Hejlíček a kol., 1987). Corynebacterium pyogenes Záněty vemene vyvolané tímto původcem se většinou vyskytují jako tzv. letní mastitidy. Průběh onemocnění může být od latentních až po akutní abscedující formy s charakteristickým odporným zápachem sekretu. Abscedující mastitidy jsou typické u zaprahnutých dojnic. V našich podmínkách jsou pyogenní mastitidy ojedinělé (Kováč a kol., 2001). Z postižené mléčné žlázy se zpravidla původce izoluje s několika dalšími původci mastitid skotu, jako jsou streptokoky a anaerobní grampozitivní koky. Má schopnost přežívat v prostředí mléčné žlázy a hnisu i několik týdnů (Hejlíček a kol., 1987) Corynebacterium bovis Příležitostně může způsobovat zánět mléčné žlázy dojnic (Hejlíček a kol., 1987) Rod Enterococcus Mastitidu skotu způsobují zejména druhy Enterococcus faecalis a Enterocuccus faecinum. Běžně se vyskytují v trávícím traktu odkud kontaminují vnější prostředí, jejich přítomnost v mléce bývá spojována s fekálním znečištěním. Převážně vyvolávají subklinické mastitidy, ale taky klinické katarální formy. V mléčné žláze jsou schopny přežívat dlouho dobu. Jsou značně termostabilní, pasterace je neničí ani nepoškozuje (Hofírek a kol., 2009) Čeleď Enterobacteriaceae Mastitidy způsobené koliformními bakteriemi (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens a Enterobacter aerogenes) nemají nakažlivý charakter (Kováč a kol., 2001). Nejčastěji se vyskytují ve formě těžkého akutního zánětu. Jsou to bakterie, které se ve stáji běžně vyskytují. Jejich přítomnost v mléce bývá spojována s nízkou hygienickou úrovní stáje a s fekální kontaminací. Za příznivých podmínek se v mléčné žláze pomnoží a vylučují endotoxin, který vyvolává lokální i celkové příznaky onemocnění. Ke vzniku dochází náhle, většinou mezi dvěma dojeními. Sekret bývá typicky změněn, má vzhled hemolytického krevního séra a obsahuje vločky fibrinu (Jagoš a kol., 1985). Koliformní bakterie jsou odolné vůči 20

21 vlivům vnějšího prostředí. Ve vlhkém prostředí výkalů a odpadních vod jsou přítomny trvale (Hejlíček a kol., 1987). Klebsiella sp., Serratia sp., Enterobacter sp. spolu s E.coli způsobují záněty označované jako enterobakteriální mastitidy. Vyznačují se perakutním nebo akutním projevem s velmi vážnými klinickými projevy (Hofírek a kol., 2009). Escherichia coli Způsobuje infekce, které se vyskytují většinou jako sporadická onemocnění. Můžeme se také setkat s případy jejich hromadného výskytu. Kolimastitidy se většinou vyskytují ve stádech s příznivou hodnotou PSB. Vznik je umožněn zvýšeným mikrobiálním tlakem původce v zoohygienicky nevyhovujícím vnějším prostředí (Hofírek a kol., 2009). 3.4 Detekce patogenů Spolehlivá a rychlá identifikace patogenů je základem pro kontrolu mastitid a cílenou antibiotickou léčbu, která je obecně doporučována (Bradley a kol., 2007). V případě klinické mastitidy potřebujeme diagnózu určit co nejdříve, abychom mohli co nejrychleji zahájit léčbu, protože její zpoždění prodlužuje celkovou dobu léčby. Pro odhalení subklinické mastitidy je detekce přítomnosti patogenů nezbytná. Můžeme se také vyhnout aplikaci širokospektrálních antibiotik. Rychlá identifikace patogenů vede ke snížení nákladů zkrácenou dobou léčby, menší spotřebou antibiotik a sníženým množstvím mléka, které je nevhodné k lidské spotřebě (Pyörälä, 2002; Barkema, 2006) Mikrobiologické metody Mezinárodní mlékařská federace (IDF, 1981) doporučila metody mikrobiologické pro diagnostiku mastitid (Ryšánek, ). Konvenční kultivační metody jsou zlatým standardem pro identifikaci bakterií z mléka. Ve většině laboratoří se v současné době používá identifikace bakterií na základě fenotypových charakteristik, biochemických testů, sérotypizace a enzymatických profilů (Gillepsie, Oliver, 2005; Phuektes a kol., 2001). Existuje několik nevýhod spojených s těmito metodami. Jednou z hlavních nevýhod je časová náročnost těchto metod. Identifikace většiny bakterií standardními metodami vyžaduje hodin, někdy až 72 hodin (Koskinen a kol., 2010; Gillespie a Oliver, 2005). Identifikace bakterií založená na kultivaci vyžaduje rozsáhlé zkušenosti a dochází tak ke vzniku rozdílů v spolehlivosti výsledků mezi různými diagnostickými 21

22 laboratořemi (Koskinen a kol., 2010). Ve studii Pitkälä a kol. (2005) v rámci Evropského programu zkoušení odborné způsobilosti zahrnující 40 finských laboratoří bylo zjištěno, že celková míra chybně identifikovaných bakterií se pohybovala v rozmezí od 9 37 %. Další významný problém je, že značný počet všech vzorků mléka nevykazuje žádný bakteriální růst i po 48 hodinách. Takové vzorky jsou nákladné a představují problém pro laboratoře, veterináře a producenty mléka. V různých studiích uvádějí autoři množství vzorků mléka z klinických mastitid bez bakteriálního růstu pohybující se od %. U subklinických mastitd se vzorky mléka bez bakteriálního růstu pohybují od % (Koivula a kol., 2007; Bradley a kol., 2007; Olde Riekerink a kol., 2008). Makovec a Ruegg (2003) uvádí téměř 50 % vzorků bez bakteriálního růstu bez rozlišování klinické a subklinické mastitidy. Důvody, proč vzorky nevykazují bakteriální růst, jsou nízký počet bakterií ve vzorku (Sears a kol., 1990; Phuektes a kol., 2001), přítomnost bakterií, které nerostou na běžných kultivačních médiích jako je Mycoplazma (Taponen a kol., 2009). Špatná životaschopnost nebo mrtvé bakterie v důsledku antibakteriálních faktorů mléka mohou být také důvod, proč vzorky nevykazují růst bakterií. Mléko obsahuje mnoho antimikrobiálních látek jako lysozym peroxidázu, imunoglobuliny a laktoferin. Jejich koncentrace se zvyšuje během mastitidy. Přítomnost reziduí léčiv po antibiotické léčbě nebo zbytky desinfekčních prostředků také snižují životaschopnost bakterií, přítomnost leukocytů v mléce u případů klinické mastitid může také způsobit negativní výsledek kultivace (Taponen a kol., Phuektes a kol., 2001). Výhoda konvenčních metod kultivace spočívá v možnosti stanovení antimikrobiální citlivosti u životaschopných bakterií (Phuektes a kol., 2001). Mikrobiální kultury produkují cenné epidemiologické údaje, odhalují nové nebo atypické mikroorganismy. Je možné takto získat živé mikroorganismy pro další studium (Mackay, 2004) Molekulární metody Kvůli problémům, které souvisí s diagnostikou mastitidních patogenů tradičními mikrobiologickými metodami, se pro tyto účely začaly navrhovat molekulární metody založené na použití nukleových kyselin. Tyto postupy se zaměřují na specifické sekvence bakteriálního genomu spíše než na fenotypovou expresi produktů, které tyto sekvence kódují (Gillepsie, Oliver 2005; Koskinen a kol., 2010). Metody na bázi testů 22

23 nukleových kyselin mají potenciál být vysoce specifické, citlivé a diferencovat i vysoce příbuzné bakterie. Tyto technologie umožňující rychlou amplifikaci a detekci nukleových kyselin rychle vytlačují tradiční metody založené na fenotypu patogenů (Mackay, 2004). Molekulární metody, založené na detekci jednotlivých genetických markerů bakteriálních původců mastitid se začínají stále více uplatňovat (Ryšánek, ). Molekulární metody by měly vést ke zlepšení diagnostiky mastitid z následujících důvodů: 1. Výrazně zkrácený čas detekce 2. Objektivita výsledků a jejich automatizace vysoká přesnost ve všech diagnostických laboratořích 3. Řešení problému s vzorky, které nevykazují bakteriální růst při kultivaci (Taponen a kol., 2009) Polymerázová řetězová reakce (PCR; polymerase chain reaction) je základní molekulární metoda. PCR byla poprvé provedena v roce O tento vynález se zasloužil americký vědec Kary B. Mullis a získal Nobelovu cenu za chemii (Mullis, 1990). Tato metoda umožňuje namnožit požadovanou sekvenci DNA bez předchozího klonování, její princip je založen na replikaci DNA (Šmarda, 2005). Bylo prokázáno, že vzorky mléka, by mohly být použity pro amplifikaci specifických sekvencí DNA pomocí PCR (Lipkin a kol., 1993). Velkou výhodou PCR je její rychlost, umožňuje detekovat bakterie během několika hodin (Gillepsie, Oliver 2005), v praxi to znamená, že výsledek diagnostiky je znám v týž den odběru vzorku (Pyörälä, 2002; Barkema a kol., 2006). Dalšími výhodami jsou rychlost a snadná analýza. PCR je vysoce přesná metoda s vysokým detekčním limitem a je vhodná pro identifikaci mastitidních patogenů (Riffon a kol., 2001). S testováním mastitidních patogenů pomocí PCR je spojeny také nějaké problémy. Až 140 různých druhů mikroorganismů může způsobit mastitidu a molekulární metody lze použít jen na ty, na které byly navrženy, zatímco kultivační metody mají potenciál identifikovat většinu druhů (Phuektes a kol., 2001). Schopnost navrhnout oligonukleotidové primery se vztahuje na naše znalosti o genomu mikroorganismu a veřejně dostupných databází sekvencí. Mikrobiální genom může také obsahovat nečekané mutace, které snižují nebo ruší funkci PCR (Mackay, 2004). 23

24 PCR na základě 16S nebo 23S ribosomální DNA oblasti sekvence byly úspěšně použity pro identifikaci mnoha bakterií (Forsman a kol., 1997; Straub a kol., 1999; Riffon a kol., 2001; Phuektes a kol., 2001; Goli a kol., 2012). Amplifikace DNA oblastí kódující RNA byla vybrána z důvodu přítomnosti hypervariabilních oblastí, což umožňuje konstrukci vysoce specifických oligonukleotidivých primerů a sond (Giovannoni a kol., 1988). Kromě genu 16S rrna, který je dobře znám jako standardní cíl pro identifikaci bakteriálních druhů se ukazuje, že 16S a 23S rrna intergenová mezerníková oblast je také užitečná pro druhovou identifikaci bakterií (Jensen a kol., 1993). Byly nalezeny značné rozdíly v sekvenci a délce 16S a 23S rrna intergenové mezerníkové oblasti byly nalezeny mezi mnoha druhy bakterií. Evoluční rychlost této mezerníkové oblasti je 10 krát větší oproti genu 16S rrna, což ho dělá vhodným pro diferenciaci blízce příbuzných druhů bakterií (Gurtler a Stanisich, 1996). Dmitriev a kol. (2006) použili ve své studii polymorfismy v cpn60 genu pro identifikaci různých druhů streptokoků DNA fingerprinting Od roku 1990 se začaly používat testy založené na PCR a DNA fingerprintingu pro detekci mastitidních patogenů (Jayaro a kol., ; Jayaro a Oliver a 1994; Gillepsie a kol., 1997; Oliver a kol., 1998). Jayaro, Oliver (1994) ve své studii amplifikované fragmenty rozdělili podle optické hustoty denzitometrickým měřením na primární (pozorované u všech druhů), sekundární a variabilní (vzácně se vyskytující). Bylo zjištěno, že každý z hodnocených druhů měl specifický profil a vznikl tak identifikační systém na základě vzniku primárních a sekundárních fragmentů. Jayaro a kol. (1992-2) použili amplifikaci 16S rdna a restrikční endonukleázy HhaI, RsaI a MspI. Bylo zjištěno, že všechny zkoumané druhy bakterií mohou být identifikovány na základě specifických profilů 16S rdna. DNA fingerprinting byl také použit pro odlišení nové a perzistující bakteriální infekce na základě identifikace různých subtypů bakterií ve vzorcích. (Oliver, kol., 1998). 24

25 Obrázek 3 Různé subtypy S. uberis (Oliver a kol., 1998) DNA fingerprinting je snadno proveditelný, spolehlivý a reprodukovatelný a má potenciál, aby se vyvíjel jako rutinní metoda pro identifikaci bakteriálních druhů. Založení této metody na sekvenci nukleové kyseliny umožňuje diferenciaci blízce příbuzných bakterií (Jayaro, Oliver, 1994, Oliver a kol., 1998) Multiplex PCR Někteří autoři ve svých studiích použíli PCR pro detekci pouze jedné bakterie (Kim a kol., 2001; Meiri-Bendek a kol., 2002). Postupně docházelo k rozvoji multiplexů pro simultánní detekci několika patogenů (Phuektes a kol., 2001; Dmitriev a kol., 2006; Amin a kol., 2011; Goli a kol., 2012). Pro diagnostiku mastitid představuje multiplex PCR velký význam, protože umožňuje současný screening několika mastitidních patogenů v jedné reakci. Součástí multiplexu jsou páry primerů, které jsou specifické pro detekované bakteriální cíle (Phuektes a kol., 2001). Výhodou multiplexu v porovnání s konvenční PCR je efektivita nákladů. Snižuje množství použitých reagencií, které se používají pro každou diagnózu. Kromě toho zkracuje čas potřebný na analýzu. V porovnání s konvenčními kulturami se ukazuje, že vyšší citlivost má PCR multiplex při detekci S. aureus a S. uberis. Z těchto důvodů je více použitelný pro rutinní diagnostiku (Phuektes a kol., 2001). Jedním z problémů multiplexu je snížení jeho citlivosti. V této studii měl krát nižší citlivost v porovnání s PCR pro jeden bakteriální cíl. Také bývá uváděno, že 25

26 nízká koncentrace jedné bakterie nebude multiplexem zachycena v případě, že je vysoká koncentrace jiné bakterie. Dalším problémem bylo, že produkty amplifikovány z S. agalactie a S. dysgalactiae se lišily pouze o 6 bp což je nerozeznatelné v agarózovém gelu. To může být vyřešeno použitím polyakrylamidového gelu. (Phuektes a kol., 2001). Studie ukazují, že multiplex PCR lze použít jako rychlý a citlivý diagnostický nástroj k detekci přítomnosti různých druhů mastitidních patogenů (Phuektes a kol., Dmitriev a kol., 2006, Amin a kol., 2011) Obrázek 4 Produkty multiplex PCR (Amin a kol., 2011) Pozn.: 1 marker (100bp), 2 S. aureus, 3 S. agalactiae, 4 E. coli, 5 S. aureus a E. coli, 6 S. aureus a S. agalactiae, 7 S. agalactiae a E. coli, 8 negativní kontrola Real-time PCR Real-time PCR (qpcr) je založena na sledování průběhu reakce pomocí fluorescenčních barviv nebo sond, které detekují množství PCR produktu během reakce zvýšením své fluorescenční aktivity (Anonym 1). Tato metoda poskytuje velmi přesnou kvantifikaci genových kopií. Na rozdíl od jiných metod nevyžaduje post-pcr manipulace se vzorkem (gelovou elektroforézu), což představuje prevenci potenciální kontaminace (Haid a kol., 1996). Koncepční a praktická jednoduchost v kombinaci s vysokou rychlostí, citlivostí a specifitou je real-time PCR ideální pro kvantifikaci nukleových kyselin. Kromě použití ve výzkumu bylo vyvinuto mnoho diagnostických aplikací včetně mikrobiální kvantifikace s využitím této metody (Bustin a kol., 2009). Gillespie, Oliver (2005) vyvinuli multiplex real-time PCR s použitím specifických primerů a dvojitě značených sond. Byla provedena také identifikace bakterií konvenčními mikrobiologickými metodami a její výsledky byly použity pro stanovení 26

27 citlivosti a specifity multiplexu real-time PCR. Byla stanovena 95% citlivost a 99,6% specifita. To dokazuje, že tato metoda má velký potenciál pro simultánní detekci mastitidních patogenů. Společnost Thermo Fisher Scientific nabízí komerční kit pro real-time PCR analýzu ve čtyřech variantách. K dispozici jsou reagenční sady pro detekci 3, 4, 12 nebo 16 bakterií způsobujících mastitidu (Anonym 4). 3.5 PathoProof Mastits PCR Assay PathoProof Mastits PCR Assay (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland) je komerční kit pro real-time PCR analýzu. Jde o revoluční zkoušku identifikace všech hlavních bakterií z kravského mléka, které způsobují mastitidu. Jsou k dispozici 4 reagenční sady: PathoProof Mastitis Complete 16 Kit PathoProof, Mastitis Complete - 12 Kit pro identifikace hlavních mastitidu způsobujících bakterií, PathoProof Mastitis Major - 3 Kit, PathoProof Mastitis Major - 4 Kit pro identifikaci vysoce nakažlivých bakterií (Anonym 2). Kit je určen pro přesnou identifikaci bakterií z kravského mléka, které způsobují mastitidu pomocí kvantitativní real-time PCR. Sada obsahuje všechny potřebné reagencie pro extrakci bakteriální DNA a PCR (Anonym 2) Výhody proti konvenčním metodám bakteriální kultivace - podstatně rychlejší získání výsledků - riziko kontaminace v laboratoři je minimalizovaná, protože testy jsou prováděny v uzavřených systémech - identifikuje a kvantifikuje se veškerá bakteriální DNA detekuje životaschopné, mrtvé i růstově inhibované bakterie - použití i pro vzorky mléka konzervované použitím monopolu (Anonym 2) Princip kvantifikace Ke kvantifikaci dochází na základě Ct (cyklus threshold) hodnot, získaných pro každý bakteriální cíl. Hodnota Ct představuje počet cyklů potřebných, aby amplifikační křivka dosáhla nastavené fluorescenční úrovně signálu situované do exponenciální fáze reakce. Čím méně cyklů je potřeba k získání prahové hodnoty, tím větší množství bakteriální DNA je ve vzorku (Katholm., 2012). 27

28 Obrázek 5 A. ideální amplifikační křivka, která má exponenciální charakter B. abnormální amplifikační křivka, která nepředstavuje skutečnou amplifikaci (Anonym 2) PathoProof Mastitida Complete - 12 Kit PathoProof Mastitida Complete - 12 Kit identifikuje 11 mastitidu způsobujích bakteriálních druhů nebo skupiny druhů a ß-laktamázový gen BlaZ zodpovědný za rezistenci stafylokoků na penicilin. Je určen pro použití syrového, mrazeného nebo konzervovaného mléka bronopolem. Kit obsahuje potřebné reagencie pro extrakci bakteriální DNA a real-time PCR (Anonym 2). Pro každý vzorek jsou prováděny 4 samostatné PCR reakce. Každá reakce identifikuje 3 bakteriální cíle a obsahuje vnitřní amplifikační kontrolu (IAC) pro ověření přijatelných podmínek reakce. Součástí kitu jsou 4 primermixy, z nichž každý obsahuje oligonukleotidy pro identifikaci 3 bakteriálních cílů. Také zahrnuje vnitřní amplifikační kontolu DNA (IAC). Primer mix 1 identifikuje C. bovis, S. aureus a enterokoky. Primer mix 2 identifikuje S. dygalactiae, stafylokokový gen BlaZ a E coli. Primer mix 3 identifikuje S. uberis, stafylokoky a S. agalactiae. Primer mix 4 identifikuje A. pyogenes a/nebo P. indolicus, Klebsiella sp. a S. marcescens (Anonym 2). 28

29 Obrázek 6 Ukázky správného tvaru a rozložení amplifikačních křivek IAC (Anonym 2) Obrázek 7 Ukázka správného rozpětí Ct hodnot pro IAC (Taponen a kol., 2009) 29

30 Nedílná součást postupu pro detekci bakteriálních původců mastitid je analýza získaných dat, ke které se používá softwarové aplikace Norden Lab Mastitis Studio General Edition v1.5.1 (Norden Logic Oy, Helsinky, Finland) (Anonym 3). Obrázek 8. Ukázka z vyhodnocovacího programu Norden Lab Mastitis Studio (Anonym 3) Obrázek 9 Legenda k vyhodnocovacímu programu Norden Lab Mastitis Studio (Anonym 3) Pozn.: Podle legendy lze interpretovat výsledky. S vyšší intenzitou zbarvení stoupá množství detekovaného bakteriálního cílu. 30

31 Analytická specifita a senzitivita Analytická přesnost testu byla studována pomocí sbírky 643 kultivačních izolátů, což představuje 83 různých bakteriálních druhů nebo skupin druhů. Pocházely z 6 zemí Evropy a Severní Ameriky. Specifita i senzitivita byla stanovena 100% v rámci všech izolovaných kmenů z mastitid skotu (Koskinen a kol., 2009). Tyto informace jsou velmi důležité. Potvrzují, že pozitivní výsledky jsou skutečně pozitivní, že nejde o falešnou pozitivitu. To znamená, že pozitivní vzorky skutečně obsahují DNA z příslušného druhu bakterie (Taponen a kol., 2009) Analýza vzorků bez bakteriálního růstu Vzorky, které nevykazovaly bakteriální růst, pocházely od krav s klinickou mastitidou. Po real-time PCR analýze se ukazuje, že téměř polovina (43 %) klinických případů mastitidy, ve kterých konvenční bakteriální kultivace neodhalila bakterie, je pozitivní na mastitidní patogeny a často dokonce ve značném množství. U 57 % vzorků nebyla bakteriální DNA detekována ani real-time PCR testem. Je možné, že tyto vzorky obsahovaly jiné původce mastitid, nebo může jít o trauma mléčné žlázy. V každém případě představuje real-time PCR užitečný nástroj pro bakteriologickou diagnostiku těchto vzorků (Taponen a kol., 2009) Srovnání real-time PCR a bakteriální kultivace Real-time PCR detekovala více bakterií ve větším počtu vzorků ve srovnání s kultivací. Například real-time PCR test detekoval S. aureus v 53 a S. uberis v 137 vzorcích s klinickou mastitidou. Tyto vzorky byly stanoveny jako negativní pro tyto bakterie po kultivaci. Podobně vysoký počet (96 % po kultivaci a 92 % po real-time PCR analýze) negativních výsledků byt zjištěn u vzorků pocházejících z klinicky zdravých čtvrtí s nízkým PSB. Vyskytlo se několik případů, kdy kultivací identifikovaný druh nebyl jedním z cílů real-time PCR. Bylo by výhodné zvýšit počet druhů detekovaných tímto kitem. Real-time PCR kit poskytl několik výhod v porovnání s konvenční kultivací rychlost (4 hodiny v porovnání s 48 hodinami), automatizovanou interpretaci výsledků, vysokou citlivost detekce. Real-time PCR je vhodný nástroj pro doplnění tradičních metod v diagnostice mastitid. Účinně identifikuje i mrtvé bakterie, takové čtvrtě sice nevyžadují antibiotickou léčbu, ale poskytnou informace o bakteriologické etiologii (Koskinen a kol., 2010). 31

32 3.6 Vztahy mezi mastitidními patogeny a PSB Bazénové vzorky mléka Eberhart a kol. (1982) zaznamenal lineární vztah mezi PSB bazénových vzorků a procentem čtvrtí infikovaných patogeny. Podle toho se procento infikovaných čtvrtí pohybuje na úrovních PSB 200, 400, 750 a 1000 tisíc v ml na 6,2 %, 12,8 %, 24,3 % a 32,6%. Benda a kol. (1997) v případě bazénových vzorků mléka odhadují 1,7% výskyt mastitidy způsobené S. aureus při PSB 160 tisíc v ml a 43,5% výskyt při PSB 410 tisíc v ml. V případě mastitidy způsobené S. agalactiae odhadují 1% výskyt při PSB také 160 tisíc v ml a 24,6% výskyt při PSB 400 tisíc v ml. Ryšánek a kol. (2007) nalezli vysoce významný vztah mezi počtem kontaminací hromadných vzorků mastitidními patogeny a PSB. Pomocí tohoto vztahu stanovili pravděpodobnost nalezení mastitidních patogenů v mléce s různými úrovněmi PSB. 20% pravděpodobnost definovali při PSB 100 tisíc v ml a 63% při PSB 400 tisíc v ml. Zjistili také, že přítomnost S. uberis a P. aeruginosa nebyl doprovázen zvýšeným PSB a přítomnost S. aureus vyvolávala zvýšení PSB. Studie tak objasnila, že mohou být odhaleny potenciální zdroje kontaminace patogeny. Je-li nízký PSB spolu s přítomností vysokých hladin kontaminace, pravděpodobným zdrojem kontaminace patogeny je prostředí. S použitím výsledků komerčního kitu pro identifikaci 11 patogenů způsobující mastitidu dojnic byla zjištěna nízká Ct hodnota pro hlavní infekční patogeny (S. agalactiae, S. dysgalactiae a S. aureus) ve srovnání se středními až vysokými Ct hodnotami u environmentálních původců (E. coli, enterokoky, Klebsiella sp.), která může být důsledek výskytu subklinických mastitid. V případech s vysokou Ct hodnotou pro E. coli nebyl PSB ovlivněn. To není překvapivé, protože při infekcích způsobených E.coli bývá mléko zřetelně změněné, dojde k jeho vyřazení a nedostává se tak do bazénových nádrží. Z ostatních hlavních patogenů mléčné žlázy korelovaly nízké Ct hodnoty s vysokým PSB u S. aureus, S. uberis, S. agalactiae a S. dysgalactiae. Nejvýznamněji PSB zvyšovali S. aureus a S. uberis (Katholm a kol., 2012) 32

33 Obrázek 10 Korelace mezi Ct hodnotami a PSB bazénového mléka (Katholm a kol., 2012) Individuální vzorky mléka Vyletělová, Hanuš (2012) zjistili u individuálních vzorků mléka, že při nízkých PSB (52 tis.) byly přítomny bakterie rodu Staphylococcus, následovaly rody Enterococcus (75 tis.), Enterobacter (123 tis.) a teprve při vyšších PSB (330 tis.) rod Streptococcus. Geometrické průměry SB při enterokokové a stafylokokové infekci jsou téměř totožné, pohybují se kolem 500 tisíc v ml. Infekce způsobené streptokoky se vyskytly až při geometrickém průměru SB 1500 tisíc v ml. 30 % vzorků s výsledky PSB vyšší jak 283 tisíc byly negativní na patogeny a při PSB vyšším jak 400 tisíc jich bylo negativních celkem 27%. Vyšší PSB zároveň s absencí mastitidních patogenů může být důsledkem výskytu jiných než sledovaných patogenů (jiné bakteriální druhy, plísně, kvasinky) nebo jiné zátěže mléčné žlázy jako je stres, špatná výživa, nevhodná technika dojení, závady nebo špatně seřízené dojící zařízení (kolísání podtlaku, nedostatečné rezervy vakua vývěvy atd.) Čtvrťové vzorky mléka Goli a kol. (2012) stanovovali mastitidní patogeny v jednotlivých čtvrtích pomocí multiplexu-pcr. Při porovnání s PSB nejmenší změny nastaly u E.coli. Kontagiózní patogeny byly častější ve srovnání s environmentálními a vytvářely větší kvantitativní 33

34 i kvalitativní změny detekovaných patogenů. PSB. Také zjistili, že PSB narůstal s rostoucím počtem 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Charakteristika testovaných zvířat Pro testování byl náhodně vybrán soubor krav plemene české strakaté. Dojnice pocházejí ze dvou chovů z Vysočiny, z nichž každý má kolem 300 dojnic. V rámci prvního chovu byly dojnice vybrány z jedné stáje a v rámci druhého chovu ze dvou stájí. Celkový počet dojnic, kterým byly odebrány vzorky pro testování, byl 80. Jedná se o krávy, u kterých pravidelně probíhá kontrola užitkovosti. 4.2 Odběr a uchování vzorků Náhodně vybraným 80 dojnicím byly v rámci kontroly užitkovosti odebrány individuální vzorky mléka. Mléko bylo odebráno do sterilních zkumavek. V prvním chovu byly odběry prováděny v říjnu a v druhém v listopadu Vzorky mléka byly zchlazeny a převezeny do laboratoře v přenosném chladicím boxu. Při převozu vzorků došlo k vylití jedné špatně uzavřené zkumavky. Pro analýzy bylo použito 79 vzorků. Dále byly vzorky v laboratoři uchovány před následnou analýzou v mrazáku při 20 C. 4.3 Stanovení počtu somatických buněk PSB z individuálních vzorků mléka byl stanoven v akreditované Laboratoři pro rozbor mléka Brno Tuřany v rámci rozborů kontroly užitkovosti (podle ČSN EN ISO :2007). Byl použit přístroj Somacount 500 (Bentley Instrument, Inc., Chaska, Minesota, USA), který pracuje na principu průtokové cytometrie a používá fluoro-optoelektronickou metodu. 4.4 PathoProof Mastitis PCR Assay PathoProof Mastitis PCR Assay (Thermo Fischer Scientific, Vantaa, Finland) identifikuje bakterie způsobující mastitidy z kravského mléka. V práci byla použita reagenční sada PathoProof Mastitis Complete-12 Kit detekuje 11 bakteriálních druhů nebo skupin způsobujících mastitidu a ß-laktamázový (BlaZ) gen, který je zodpovědný 34

35 za rezistenci stafylokoků na penicilin. Bakterie a BlaZ gen jsou detekovány ve čtyřech různých PCR reakcích. Pomocí tohoto kitu lze detekovat: Staphylococcus aureus Enterococcus sp. (E. faecalis a E. faecium) Corynebacterium bovis Staphylococcal ß-laktamázový gen Escherichia coli Streptococcus dysgalactiae Staphylococcus sp. (Staphylococcus aureus a koaguláza-negativní stafylokoky) Streptococcus agalactiae Streptococcus uberis Klebsiella sp. (K. oxytoca a K. pneumoniae) Serratia marcescens Arcanobacterium pyogenes a Peptoniphilus indolicus Kit obsahuje potřebné reagencie pro extrakci bakteriální DNA a real-time PCR. Byla použita souprava reagencií F-870S, která obsahuje jeden QIAGEN a jeden Finnzymes box. Kromě reagencií, které jsou součástí kitu, byl použit etanol a PCR H voda bez nukleázové aktivity (Top-Bio s.r.o., Praha, Czech Republic). 35

36 Tabulka 5 Seznam použitých reagencií reagencie pufr AW1 pufr AW2 pufr AL pufr AE lyzační roztok 1 lyzační roztok 2 proteináza K master mix primer mix 1 primer mix 2 primer mix 3 primer mix 3 amplifikační standard box QIAGEN QIAGEN QIAGEN QIAGEN QIAGEN Finnzymes Finnzymes Finnzymes Finnzymes Finnzymes Finnzymes Finnzymes Finnzymes reagencie neobsažené v kitu PCR H 2 O 96% etanol Extrakce bakteriální DNA Pro izolaci bylo použito syrové kravské mléko, které bylo zmraženo. Izolace byla prováděna po deseti vzorcích a předcházelo jí rozmrazení vybraných vzorků. Zkumavky se zmrazeným mlékem byly umístěny v termostatu nastaveném na teplotu 55 C a po rozmrazení krátce zvortexovány. DNA z mléka byla izolována kolonkovou metodou, za použití reagencií z QIAGEN boxu, proteinázy K a etanolu. Izolace byla prováděna dle protokolu přiloženém ke kitu za použití 350 µl mléka jako výchozího materiálu pro izolaci. Extrakce DNA zahrnuje tyto kroky: enzymatické rozrušení buněčné stěny G + a G - bakterií, centrifugaci, purifikaci a eluci DNA. Získaná DNA byla uchována v mrazáku při 20 C. 36

37 4.4.2 Real-time PCR DNA extrahovaná z mléka byla použita pro detekci bakteriálních původců mastitid. Detekce byla prováděna po 20 vzorcích. Reakční směsi byly namíchány podle protokolu přiloženém ke kitu, za použití reagencií z Finnzymes boxu. Výsledné reakční objemy byly 20 µl. PCR H 2 0 byla použita jako negativní kontrola pro potvrzení, že nedošlo ke kontaminaci. Umístění vzorků na real-time PCR destičku bylo dodrženo podle manuálu, což je nezbytně důležité pro správnou analýzu dat. Obrázek 11 Schéma 96-jamkové real-time PCR destičky s požadovaným rozložením vzorků Pozn.: Postup plnění jamek: jamky A1 A4 přidělit vzorku č. 1, takto naplnit jamky ve směru A H tzn., že na jamky H1 H4 vychází vzorek č. 8, další vzorek naplnit do jamek A5 A8 atd. PCR roztok 1 bude vždy umístěn v sloupcích 1,6,9, PCR roztok 2 v sloupcích 2,6,10, PCR roztok 3 ve sloupcích 3,7,11 a PCR roztok 4 ve sloupcích 4,8,12. Červeně znázorněná je negativní kontrola, která se umísťuje vždy jako poslední. Pro každý vzorek jsou prováděny 4 samostatné PCR reakce. Každá reakce identifikuje 3 bakteriální cíle a obsahuje vnitřní amplifikační kontrolu (IAC) pro ověření přijatelných podmínek reakce. 37

38 Tabulka 6 Primer mixy a fluorescenční barviva primer mix 1 primer mix 2 primer mix 3 primer mix 4 CY5 C.bovis S.dysgalactiae S. uberis FAM S. aureus blaz gen VIC Enterococcus sp. Staphylococcus sp. A.pyogenes /P.indolicus Klebsiella sp. E. coli S. agalactiae S. marcescens TXR IAC 1 IAC 2 IAC 3 IAC 4 Reakce probíhaly na přístroji Chromo 4 Real-Time PCR Detection Systém (Bio- Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) s použitím programu Opticon Monitor 3.00 (Bio- Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Tabulka 7 PCR protokol Teplota ( C) Délka trvání (s) 1. fáze fáze opakování fáze Analýza a vyhodnocení dat Analýza získaných dat probíhala použitím softwarové aplikace Norden Lab Mastitis Studio General Edition v1.5.1 (Norden Logic Oy, Helsinky, Finland), která je určena pro zpracování výsledků jako nedílná součást postupu pro detekci bakteriálních původců mastitid. 38

39 Tabulka 8 Kategorie výsledků - Bakteriální DNA nebyla detekována +/- Bakteriální DNA detekována pod detekčním limitem + Bakteriální DNA detekována v malém množství ++ Bakteriální DNA detekována ve středním množství +++ Bakteriální DNA detekována ve velkém množství Pozn.: Kategorie +/- odpovídá Ct hodnotám 37,1 až 40; detekční limit = 37 Ct Při vyhodnocování jednotlivých reakcí byl zkontrolován každý vzorek. Kontrolovalo se, zda Ct hodnoty a amplifikační křivky IAC jsou přijatelné. Také se ověřoval exponenciální tvar amplifikačních křivek jednotlivých bakteriálních cílů a Ct hodnoty abnormálních amplifikačních křivek byly odstraněny. 4.6 Matematické zpracování výsledků, statistické vyhodnocení Hodnocení vzorků pro jednotlivé bakteriální cíle jako pozitivní nebo negativní je založeno na hodnotě Ct. Jako limitní byla určena hodnota Ct 37. Tato hodnota byla vybrána, protože rozdíl 3 cyklů ve srovnání s negativní kontrolní Ct je obecně přijímanou normou pro spolehlivé oddělení pravého pozitivního signálu od nečistot (Koskinen a kol., 2009). Celkově je v PCR prováděno 40 cyklů, to znamená, že hodnota Ct 37 získaná pro bakteriální cíl, je pozitivní. Všechny ostatní výsledky (Ct 37,1 - také znázornění +/-) byly brány jako negativní pro příslušný bakteriální cíl. Pro všechny statistické výpočty byl použit program SAS v8.2 pro Windows (SAS Institute Inc., Cary, USA). Byl použit zobecněný lineární model s pevným efektem stáda a regresemi den laktace a Ct hodnota s použitím rovnice: kde: = sledovaný znak = odhadovaný průměr sledovaného znaku stáj i b jk = pevný efekt = regrese = náhodná chyba každého pozorování 39

40 4.6.1 Test normality Test normality dat byl proveden u PSB a následná logaritmická transformace těchto dat Popisná statistika Distribuce Ct hodnot byly spočítány pro každý bakteriální cíl, frekvence pozitivních vzorků, střední hodnoty a směrodatné odchylky Statistická analýza Síla statistické závislosti korelace byla vyjádřena Pearsonovými korelačními koeficienty ρ vypočtenými dle rovnice: r = s xy s s x y s x = směrodatná odchylka proměnné X (logpsb) s y = směrodatná odchylka proměnné Y (Ct hodnoty) s xy = kovariance proměnných X a Y Regresní koeficienty pro Ct hodnoty a logpsb byly vypočteny metodou nejmenších čtverců. Záporné koeficienty znamenají, že zvýší-li se Ct příslušných patogenů, klesne PSB (tzn., že se snižujícím se množstvím patogenu se bude snižovat PSB). Vztah těchto patogenů s PSB byl znázorněn graficky pomocí programu Microsoft Office Excel. Koeficienty nebyly počítány pro gen BlaZ, jelikož se jeho přítomnost vždy vztahuje k S. aureus nebo koaguláza-negativním stafylokokům. 40

41 5 VÝSLEDKY A DISKUSE Pomocí metody real-time PCR, PathoProof Mastitis Complete 12 kit (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland), počítačového programu Opticon Monitor 3.00 (Bio- Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) a vyhodnocovacího programu Norden Lab Mastitis Studio General Edition v1.5.1 (Norden Logic Oy, Helsinky, Finland) byly u vybraných 79 vzorků detekovány a kvantifikovány patogeny, které způsobují mastitidu. Obrázek 12 Průběh real-time PCR v programu Opticon Monitor 3.00 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) 41

42 Obrázek 13 Protokol s výsledky vytvořený pomocí Norden Lab Mastitis Studio General Edition v1.5.1 (Norden Logic Oy, Helsinky, Finland) Obrázek 14 Grafické znázornění testu normality dat PSB před a po logaritmické transformaci Grafy zobrazující distribuci četnosti PSB, jsou pravostranně vychýlené, nemají normální Gaussovo rozložení. To přináší komplikace při statistickém zpracování těchto dat i při zpracování těchto dat k operativnímu řízení. Z tohoto důvodu doporučuje Mezinárodní mlékařská federace (IDF, 1997) logaritmickou transformaci těchto dat, neboť ta vykazuje normální rozložení. Byl proveden test normality dat pro PSB a graf 42

43 Pozitivní na počet patogenů byl skutečně pravostranně vychýlený, bylo tedy provedeno jejich logaritmování a takto transformovaná data byla použita. Tabulka 9 Rozdělení vzorků podle počtu detekovaných patogenů nález patogenů počet vzorků % průměr PSB ( 10 3 /ml) logpsb negativní 2 2,53 34,00 1, , ,00 3, ,66 175,90 2, ,72 748,07 2, ,39 276,33 2, ,66 355,10 2, ,85 150,00 2, ,66 659,90 2,82 celkem ,00 411,35 2,61 Z celkového počtu vzorků (79) byly pouze 2 negativní na všech 11 detekovaných mastitidu způsobujících patogenů. Jelikož jde o vzorky odebírané v rámci KU, dojnice nemohly mít klinické příznaky zánětu. Je tedy možné, že jde o problém se subklinickými mastitidami v těchto chovech. Také je možné, že před dojením nedošlo k řádnému oddojení prvních střiků mléka (jsou typické vysokými počty mikroorganismů a somatických buněk) spolu s nedostatečným provedením toalety vemene případně použitím kontaminovaných utěrek k omytí vemene. Největší počet vzorků byl pozitivní na 6 patogenů, průměrný PSB těchto vzorků je nízký. Nejvyšší průměrný PSB je u vzorků, u kterých byl detekován jen jeden patogen. Jde pouze o 2 vzorky, kdy jeden z nich měl vysoký PSB ( /ml). Celkový průměr PSB z KU těchto vzorků silně přesahuje /ml což ukazuje podle Jelínkové (2012) na problém mastitid ve stádě. Uvádí také, že při průměru stáda /ml SB dochází k poklesu mléčné užitkovosti až o 10%. Goli a kol. (2012) ve své studii (288 čtvrťových vzorků mléka) zjistili nárůst logpsb se stoupajícím počtem detekovaných patogenů. Z tabulky 9 vyplývá, že tento vztah se v práci neprokázal, což mohlo být způsobeno malým počtem vzorků, nebo také vzorky s vysokými PSB, které byly způsobeny jinými důvody jako je stres, špatná výživa, závada na dojícím zařízení, nebo výskyt jiných než sledovaných patogenů. 43

44 44 Tabulka 10 Výsledky real-time PCR analýzy celková distribuce Ct hodnot Distribuce Ct hodnot ve vzorcích s Ct 37 Patogen N Průměr SE Minimum Maximum Kvantil 10 Kvantil 25 Median Kvantil 75 Kvantil 90 APYPIN 7 35,26 1,94 31,10 36,90 31,10 35,20 35,70 36,50 36,90 BLAKT 27 34,79 1,69 30,00 36,50 32,60 34,30 36,00 36,00 36,30 CBO 2 33,00 0,28 32,80 33,20 32,80 32,80 33,00 33,20 33,20 ECO 52 23,64 6,62 10,30 35,00 14,00 18,00 24,60 28,25 32,50 ENT 60 21,65 6,01 11,10 35,80 14,90 17,10 19,85 27,00 30,55 KLEB 50 29,15 6,61 9,60 37,00 20,20 25,20 31,20 33,80 36,35 SMAR 37 22,66 5,62 12,10 34,80 15,10 17,70 23,10 26,10 31,60 SA 7 33,06 2,18 30,00 36,20 30,00 31,20 32,90 35,30 36,20 STAPH 75 28,69 3,73 16,40 36,50 23,80 25,90 28,70 31,50 33,00 SAG 44 26,72 4,99 11,80 33,20 21,90 24,70 27,25 30,10 31,60 SDG 9 35,02 1,56 32,40 37,00 32,40 34,30 35,20 36,30 37,00 SU 14 31,87 3,47 25,90 35,90 26,60 28,70 32,35 35,20 35,70 Poz.: N = počet, SE = standardní odchylka, APIPYN = Arcanobacterium pyogenes/peptococcus indolicus, BLAKT = BlaZ gen, CBO = Corynebacterium bovis, ECO = Escherichia coli, ENT = enterokoky, KLEB = Klebsiella sp., SMAR = Serratia marcescens, SA = Staphylococcus aureus, STAPH = koaguláza-negativní stafylokoky, SAG = Streptococcus agalactiae, SDG = Streptococcus dysgalactiae, SU = Streptococcus uberis

45 Tabulka 11 Distribuce Ct hodnot v 1. stáji Patogen N Průměr SE Minimum Maximum APYPIN 1 35,20-35,20 35,20 BLAKT 8 33,44 2,47 30,00 36,50 CBO 2 33,00 0,28 32,80 33,20 ECO 4 22,58 10,09 10,30 35,00 ENT 4 26,10 2,88 22,20 28,60 KLEB 8 34,71 1,83 32,50 37,00 SMAR 5 23,08 5,60 17,70 32,40 SA 6 32,53 1,84 30,00 35,30 STAPH 11 32,53 1,45 30,80 35,40 SAG 3 29,20 1,40 27,60 30,20 SDG 6 35,18 1,42 33,00 37,00 SU 6 31,83 3,80 25,90 35,30 Tabulka 12 Distribuce Ct hodnot v 2. stáji Patogen N Průměr SE Minimum Maximum APYPIN 6 35,27 2,13 31,10 36,90 BLAKT 17 35,32 0,80 34,10 36,50 CBO ECO 31 22,77 7,25 11,00 35,00 ENT 33 22,71 7,37 11,10 35,80 KLEB 23 31,32 4,29 23,50 36,60 SMAR 15 24,45 5,96 15,00 34,80 SA 1 36,20-36,20 36,20 STAPH 38 29,33 3,56 22,00 36,50 SAG 25 25,84 5,26 11,80 33,20 SDG 2 34,45 2,90 32,40 36,50 SU 6 32,15 2,88 28,00 35,90 Pozn.: N = počet, SE = standardní odchylka, vysvětlivky zkratek patogenů viz Tabulka 10 a seznam zkratek 45

46 Tabulka 13 Distribuce Ct hodnot v 3. stáji Patogen N Průměr SE Minimum Maximum APYPIN BLAKT 2 35,65 0,35 35,40 35,90 CBO ECO 17 25,47 4,09 18,00 34,00 ENT 23 19,36 2,45 13,90 23,90 KLEB 19 24,17 7,03 9,60 34,70 SMAR 17 20,95 5,10 12,10 30,60 SA STAPH 26 26,13 2,79 16,40 31,30 SAG 16 27,63 4,84 13,80 31,90 SDG 1 35,20-35,20 35,20 SU 2 31,15 6,43 26,60 35,70 Pozn.: N = počet, SE = standardní odchylka, vysvětlivky zkratek patogenů viz Tabulka 10 a seznam zkratek Pomineme-li Ct hodnoty BlaZ genu, který se vztahuje vždy jen k S. aureus nebo koaguláza-negativním stafylokokům jsou vysoké medián Ct hodnoty u A. pyogenes/p. indolicus, S. dysgalactiae, C. bovis a S. aureus a nízké u enterokoků, S. marcescens, Klebsiella sp. a E. coli. Katholm a kol. (2012) zjistili opak - environmentální patogeny jako jsou enterokoky a E. coli s vysokými medián Ct hodnotami a nízkými u infekčních patogenů (S. agalactiae, S. dygalactiae a S. aureus). Nízké množství infekčních patogenů (vysoké Ct hodnoty), by mohlo být signálem výskytu subklinické mastitidy. V nejvyšších množstvích jsou přítomné zejména patogeny indikující fekální znečištění mléka. Vysoké množství environmentálních patogenů (nízké Ct hodnoty) jsou spojovány s kontaminací mléka těmito patogeny způsobenou nedostatečnou hygienickou úrovní při dojení, jelikož záněty způsobené těmito patogeny mívají vážné klinické projevy. Ve všech stájích jsou nejvíce detekovanými patogeny koaguláza-negativní stafylokoky. V 1. Stáji jsou celkově nízké počty detekovaných patogenů. Jsou zde ale přítomni kontagiózní patogeny C. bovis a S. aureus, kteří se v dalších dvou stájích téměř nevyskytují. Je tedy pravděpodobné, že při dojení krav z 1. stáje dochází k přenosu těchto infekčních patogenů, projevujících se zřejmě subklinicky. 46

47 47 Tabulka 14 Výskyt jednotlivých patogenů v různém množství APYPIN BLAKT CBO ECO ENT KLEB SMAR SA STAPH SAG SDG SU N % N % N % N celkem % 8,86 34,18 2,53 65,82 75,94 63,29 46,84 8,86 94,94 43,04 11,39 17,72 Pozn.: N = počet, APIPYN = Arcanobacterium pyogenes/peptococcus indolicus, BLAKT = BlaZ gen, CBO = Corynebacterium bovis, ECO = Escherichia coli, ENT = enterokoky, KLEB = Klebsiella sp., SMAR = Serratia marcescens, SA = Staphylococcus aureus, STAPH = koaguláza-negativní stafylokoky, SAG = Streptococcus agalactiae, SDG = Streptococcus dysgalactiae, SU = Streptococcus uberis

48 100 94, ,94 65,82 63, ,18 46,84 43, ,86 2,53 8,86 11,39 17,72 0 APYPIN BLAKT CBO ECO ENT KLEB SMAR SA STAPH SAG SDG SU Obrázek 15 Celkový výskyt mastitidních patogenů Pozn.: vysvětlivky zkratek patogenů viz Tabulka 14 a seznam zkratek V analyzovaných chovech jsou nejčastěji detekovanými patogeny způsobující mastitidu koaguláza-negativní stafylokoky. Dále byly často detekovány enterokoky, Escherichia coli, Klebsiella sp., Serratia marcescens a Streptococcus agalactiae v tomto pořadí. Jak je vidět v Tabulce 14 S. aureus byl detekován v 8,86 %, což představuje 7 vzorků, ve kterých byl zároveň detekován gen BlaZ. Většina koaguláza-negativních stafylokoků obsažených v nízkém množství také obsahovala BlaZ gen. Garmo a kol. (2010) ve své studii uvádí, že až 50 % koaguláza-negativních stafylokoků a téměř 9 % S. aureus bylo rezistentních na penicilin. Bylo by tedy výhodné, abychom se vyhnuli nákladné, ale neúčinné léčbě stafylokokových zánětů, používat jiná než penicilinová antibiotika. Přesto že je S. aureus považován za jednoho z nejvýznamnějších patogenů mléčné žlázy, jsou jeho prevalence uváděné ve studiích velmi různorodé. Tenhagen a kol. (2006) uvádí prevalence S. aureus v Německu 5,7%. Brzdil (2012) v ČR 16,41%, Waage a kol. (1999) v Norsku 44,3% a Gianneechini a kol. (2002) v Uruguay 62,8%. Ryšánek a kol. (2007) uvádí, že jde o hlavního mastitidního patogena mléčné žlázy. Jeho významnost spočívá především v jeho schopnosti rychle se šířit a vznikající rezistenci vůči některým antibiotickým přípravkům. 48