Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Vliv mikrobiální aktivity půdy alpinských luk na koloběh dusíku Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Jaroslav Záhora, CSc. Vypracoval: Antonín Kintl Brno 2009

2 2

3 3 Poděkování: Děkuji vedoucímu své bakalářské práce Ing. Jaroslavu Záhorovi, CSc. a pracovníkům Ústavu mikrobiologie, půdoznalství a výživy rostlin za metodické vedení a pomoc při zpracování bakalářské práce.

4 4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma... vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis diplomanta.

5 5 ABSTRAKT Vliv mikrobiální aktivity půdy na koloběh dusíku alpínských luk Cílem bakalářské práce bylo popsat aktivity mikrobiálních společenstev alpinských luk a jejich provázanost s koloběhem dusíku. Alpské louky, jinak chudé na dusík, jsou díky antropogenní činnosti tímto prvkem nadměrně obohacovány. Vyšší dostupnost dusíku v alpinských loukách se promítá i do aktivit mikrobiálních společenstvech, které reagují na tyto změny velmi citlivě. Oxidují část nevyžitého dusíku, který může následně unikat z půdy v doprovodu cenných bazických kationtů. Aktivita mikroorganismů tak může působit akceleraci procesu acidifikace, primárně zapříčiněné kyselými atmosférickými depozicemi. Pomocí metody záchytu minerálních forem dusíku na zrnech iontoměničů in situ jsme v experimentální části zjišťovali množství disponibilního amonného a nitrátového dusíku. Takto jsme mohli nepřímo usuzovat na míru a intenzitu mikrobiálních procesů spojených s mineralizací, imobilizací, nitrifikací, denitrifikací, a jinými procesy transformací dusíkatých sloučenin. Experimentální práce probíhaly na lokalitě Salatín v Západních Tatrách na parcelkách 1,5 x 1,5 m se třemi variantami modelové zátěže dusíkem a jednou variantou dotace fosforem.. Bylo prokázáno zvyšující se množství zachyceného minerálního dusíku ve variantách se zvyšující se modelovou zátěží dusíkem. Naopak v kontrolních parcelkách a ve variantě s přídavkem fosforu bylo zjištěno nejnižší množství disponibilního dusíku. Jisté vysvětlující hypotézy jsou k dispozici. Pro uspokojivé vysvětlení jevu by bylo zapotřebí experimenty zopakovat. Klíčová slova: mikroorganismy, půdní dusík, alpinské louky

6 6 ABSTRAKT Impact of Microbial Activities of Soil on Nitrogen Cycle of Alpines Meadows The aim of this paper is to describe activities of microbial communities of alpines meadows and their connections with the nitrogen cycle. Alpines meadows, generally poor in nitrogen, are being excessively enriched by this element, thanks to the human activities. Higher content of nitrogen in alpines meadows is seen in the activities of microbial communities, which react to these changes very sensitively. They oxidize part of useless nitrogen, which is then disappearing from the soil together with basal cations. The activity of microorganisms can accelerate the process of acidification, basically caused by acid atmospheric depositions. In the experimental part, the method of capture of nitrogen mineral forms on the grains of ionmeasurer in situ was used to measure the content of disposable ammonium and nitrate nitrogen. By this method the scale and intensity of microbial processes connected with mineralization, immobilization, nitrification, denitrification and other processes of nitrogen compounds transformation could be easily presumed. The experimental works were done in the area of Salatin in West Tatra Mountains on parcels sized 1.5x1.5m with three model variant of nitrogen load and one model variant with phosphor subsidy. The increasing amount of captured mineral nitrogen was proved in the model variant of growing nitrogen load. Otherwise on the parcels in the variant with phosphor subsidy the lowest content of disposable nitrogen was demonstrated. There are several hypotheses to be discussed. For a satisfactory explanation of this effect it would be necessary to repeat these experiments. Keywords: microorganisms, soil nitrogen, alpine meadows

7 7 Obsah 1.ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Koloběh dusíku Zdroje dusíku Suchý a mokrý spad Biologická fixace molekulárního dusíku Asymbiotická fixace Symbiotická fixace Hnojiva Ztráty dusíku Volatilizace Emise plynných sloučenin dusíku Vyplavování dusíkatých látek Odnos dusíku v biomase rostlin a erozí Přeměny dusíku Obsah a formy dusíku v půdě Mineralizace organické hmoty Asimilace dusíku organismy Asimilace a disimilační redukce NO 3 - na NH Nitrifikace Respirace nitrátů Denitrifikace Nerespirační denitrifikace Fixace amoniaku Tvorba plynných sloučenin Vlivy na koloběh dusíku Půdní biota Vliv podmínek prostředí na mikroby Teplota Vlhkost Osmotický tlak Hydrostatický tlak Povrchové napětí kapalin Reakce prostředí Formy půdní reakce Půda jako prostředí mikroorganizmů Podíl mikroorganismů na tvorbě půdy Prostorové rozložení mikroorganismů v půdě Společenstva půdních mikroorganismů Stanovení biologické aktivity půdy MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ Popis lokality Iontoměničová pouzdra Instalace iontoměniče in situ Zpracování iontoměničů po expozici in situ v labolatoři Analýza iontoměničů VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE ZÁVĚR... 49

8 8 7. SEZNAM POŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKU... 52

9 9 1.ÚVOD Biogenní prvky uhlík, kyslík, vodík a zejména dusík jsou základem, umožňujícím existenci života na zemi od nejmenších prokaryotických buněk až po mnohobuněčné organismy. Dusík je jednou z hlavních živin, je naprosto nezbytný pro tvorku biomasy a životní funkce buněk všech organismů. Je složkou mnoha důležitých molekul hlavně bílkovin (je nezbytným stavebním prvkem všech aminokyselin, bílkoviny obsahují v průměru 15% hmotnosti dusíku), ribonukleových (RNA) a deoxyribonukleových (DNA) kyselin, chlorofylů, chitinu a peptidoglikanů tvořících buněčné stěny a mnoha jiných látek včetně enzymů (Šimek, 2003). Výskyt zmíněných prvků nepřevyšující metabolické potřeby organismů je vysoce žádoucí. Výskyt ve vyšších koncentracích může působit jako stresující faktor pro život druhů, které citlivě reagují na množství přístupných živin v prostředí. Změna dostupnosti živin nasměruje sukcesní vývoj zcela novým směrem. V tomto ohledu může být právě N důležitým faktorem těchto změn. Jednou z největších zátěžích ohrožující v posledních desetiletích strukturu a fungování přirozených a polopřirozených ekosystémů jsou zvláště atmosférické depozice dusíkatých látek (NH y a NO x ) (Bobbink et al. 1998). Jestliže se hladiny dusičnanů v potravinách a krmivech rostlinného původu v posledních dvou desetiletích povážlivě zvýšily, signalizuje to špatné sladění podmínek růstu, zvláště hnojení, s biologickými schopnostmi kulturních plodin (Kalač, Míka 1997). Alpské louky, jinak chudé na dusík, jsou díky antropogenní činnosti tímto prvkem nadměrně obohacovány. Vyšší dostupnost dusíku v alpinských loukách se promítá i do aktivit mikrobiálních společenstvech, které reagují na tyto změny velmi citlivě. Oxidují část nevyžitého dusíku, který může následně unikat z půdy v doprovodu cenných bazických kationtů. Aktivita mikroorganismů tak může působit akceleraci procesu acidifikace, primárně zapříčiněné kyselými atmosférickými depozicemi. Stanoviště ovlivněná zemědělskou činností vykazují změny druhového složení flóry, ve které začínají převažovat nitrofilní druhy jako jsou kopřivy a merlíky. Na těchto lokalitách se projevuje u vyšších rostlin změna množství dostupného dusíku s určitým zpožděním, proto je výhodné tyto vlivy pozorovat na mikrobiálních společenstvech, které se svou krátkou generační dobou poskytují důležité informace, napovídající jak budou reagovat ostatní organismy. Neustále se vyvíjející metody studia aktivity mikroorganismů v laboratorních podmínkách poskytují informace pouze o okamžitém stavu v odebraném vzorku

10 10 v nepřirozených podmínkách laboratoře. Naproti tomu metoda studia mikrobiální mineralizace organického půdního dusíku s využitím iontoměničů poskytuje kumulativní výsledky získané in situ za celé sledované období, přímo z ekosystému ve kterém se mikrobiální aktivita sleduje. Při použití této metody je zachováno působení přirozených faktorů na námi pozorované mikrobiální společenstva jako je ph, půdní vlhkost, teplota. Pomocí iontoměničů bylo zjištěné množství volně dostupných iontů NH + 4 a NO - 3, z čehož se následně odvozovala aktivita mikrobiálního společenstva na lokalitě Salatín v Západních Tatrách.

11 11 2.CÍL PRÁCE Cílem práce v obecné části bylo charakterizovat zvláštnosti půdních mikrobiálních společenstev alpínských luk a jejich vliv na mikrobiální transformace dusíkatých látek. Dalším cílem bylo popsat metodu aplikace intoměničových zrn in situ, pomocí které je možno zjištit mikrobiální aktivitu ovlivňující toky dusíkatých látek. Touto metodou se zjistí množství dostupného minerálního dusíku v půdě ve formě amonné a nitrátové.

12 12 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1. Koloběh dusíku Dusík je jednou z hlavních živin, je naprosto nezbytný pro tvorku biomasy a životní funkce buněk všech organismů. Je složkou mnoha důležitých molekul hlavně bílkovin (je nezbytným stavebním prvkem všech aminokyselin, bílkoviny obsahují v průměru 15% hmotnosti dusíku), ribonukleových (RNA) a deoxyribonukleových (DNA) kyselin, chlorofylů, chitinu a peptidoglikanů tvořících buněčné stěny a mnoha jiných látek včetně enzymů (Šimek, 2003). V ekosystémech se dusík pohybuje po typických cestách, prochází mnoha transformacemi a setrvává nestejně dlouhou dobu v různých zásobnících, hovoříme o charakteristickém koloběhu dusíku (Mejzlík a Záhora, 2007). Tab. 1 Hlavní zásobníky dusíku (upraveno podle: Brock a Madigan 1988) Druh zásobníku Zásobník Forma Množství Vzdušný Atmosféra N 2 Terestrický Půda Rostliny a MO Živočichové Oceánský Rozpustný N 2 Litosférický Rozpuštěný jiný Rostlina a MO Živočichové Mrtvá org. hmota Sedimenty Horniny Ložiska uhlí N 2 O NH 3, NO, NO 3 -, NH 4 +, org. slouč Organické látky, humus Anorganické sloučeniny, NO 2 -, NO 3 -, NH 4 +, Org. a anorganické slouč. v biomase Org. a anorganické slouč. v biomase N 2 NO 2 -, N 2 O, NO 3 -, NH 4 +, Org. a anorganické slouč. v biomase Org. a anorganické slouč. v biomase Různé org.látky Org. a anorganické látky Anorganické sloučeniny, minerály, N 2 Org. a anorganické látky (x kg N) , ,3 0, Globální cyklus dusíku zahrnuje přenosy dusíku mezi litosférou, pedosférou, atmosférou a hydrosférou (Šimek, 2003).

13 13 Obr. 1 Koloběh dusíku. Zdroj: Dusík je relativně velmi dynamický prvek a podléhá v prostředí mnoha biologickým i fyzikálně chemickým přeměnám. Většina těchto procesů probíhá v biosféře za přímé účasti mikroorganismů. Z chemického hlediska představují oxidační (ztráta elektronů) nebo redukční (příjem elektronů) reakce (Šimek, 2003). V cyklu dusíku, stejně jako v cyklu každého jiného prvku, rozlišujeme zdroje, vnitřní přeměny a ztráty. Tyto kategorie se obvykle definují na úrovni jednotlivých ekosystémů, neboť v celkovém pohledu jde o přesun dusíku mezi různými zásobníky (a o přeměny uvnitř zásobníku, jako je např. půda a oceán apod.). Pro převážnou většinu procesů přeměn dusíku je charakteristické to, že probíhají stejně v nejrůznějších typech ekosystémů a podílejí se na nich stejné nebo příbuzné mikroorganismy (Šimek, 2003). Význam koloběhu dusíku v zemědělských systémech však byl rozpoznávám mnohem dříve během historického vývoje v zemědělství. Tak již v ranných civilizacích lidé poznali výhody rozličných osevních postupů, různých systémů obdělávání půdy, zapojení úhoru,

14 14 střídání ploch pro zemědělství a využívání organických zbytků. Později pochopili i význam zařazení bobovitých plodin do osevního postupu. Při obdělávání je ovlivněna přístupnost dusíku jejím promícháváním, zvyšuje se aerace, ovlivňuje se obsah a pohyb vody, ale i půdní teplota. To vše má vliv na mikrobiální aktivitu s urychlením rozkladu organických zbytků, zrychlují se toky dusíku v ekosystému, dochází ke snižování zásob celkového dusíku, je umožněna nitrifikace a zvýšení množství oxidovaných forem minerálního dusíku a v neposlední řadě se může zvyšovat možnost vyplavování nitrátů z půdy (Úlehlová 1993). Přeměny dusíku v prostředí, tj. jeho transformace z jedněch forem na jiné formy, souvisejí zejména s metabolismem organismů. Plynný N 2 je procesem fixace molekulárního dusíku redukován na amoniak (NH 3, respektive amonium NH + 4 ). Fixace probíhá i v atmosféře účinkem elektrických výbojů a působením slunečního záření, avšak naprostá většina fixovaného N 2 připadá na mikrobiální procesy, jež jsou katalyzovány enzymem nitrogenázou. Amonné formy dusíku jsou v různých sloučeninách zabudovány do biomasy. Po jejím odumření je amoniak z organických vazeb uvolněn. Může být znovu využit jako živina, vázán (fixován) v půdě, volatilizován do atmosféry nebo nitrifikací převeden na nitrátovou formu (NO - 3 ). Nitrátový dusík může být také využit jako živina, může být redukován na amoniak, vyplaven z půdy nebo denitrifikací převeden na plynný oxid dusný (N 2 O) a na molekulární dusík (N 2 ). V těchto formách se dusík vrací do atmosféry a cyklus dusíku se uzavírá. I když jednotlivé procesy přeměn dusíku mají často velmi odlišné nároky na podmínky prostředí, mohou v půdě probíhat současně a to vzhledem k existence gradientů jednotlivých faktorů prostředí, jež jsou navíc v mnoha vzájemných vazbách a vytvářejí v půdě nepřeberné množství mikroprostředí, mnohdy s velice specifickými podmínkami (Šimek, 2003) Zdroje dusíku Z atmosféry se dusík dostává do půdy prostřednictvím fixace molekulárního dusíku mikroorganismy, s hnojivy a ve formě spadů. Zdrojem dusíku jsou dále rostlinné zbytky (Vaněk,2007) Suchý a mokrý spad V ovzduší se vyskytuje řada dusíkatých látek, a to jak organického (převážně biologického původu), tak anorganického. Jejich depozice na povrch Země se označuje jako suchý a mokrý spad. Nejvýznamnější redukovanou sloučeninou dusíku v atmosféře je

15 15 amoniak. Plynný amoniak (NH 4 + ) v ovzduší poměrně rychle reaguje s vodní parou a přechází na iontovou formu (NH 4 + ). Se sírany tvoří síran amonný, jehož vymývání srážkami představuje hlavní mechanismus odstraňování amoniaku z ovzduší. Obr. 2 Dálkový přenos (dle: Šimek, 2003) Nejvýznamnějšími oxidovanými dusíkatými sloučeninami v ovzduší jsou oxidy, zvláště N 2 O, NO, NO 2 a NO 5. Chemickými reakcemi těchto plynů s jinými sloučeninami a prvky vzniká v atmosféře kyselina dusičná. HNO 3 a dusičnany jsou hlavní složkou tzv. kyselých dešťů. Depozice oxidu dusíku, NH 3 a dalších dusíkatých látek absorbovaných na částicích představují suchý spad dusíku. Suché a mokré depozice jsou relativně velkým zdrojem dusíku v mnoha ekosystémech a činí asi 5-60 kg/rok/ha,podle stupně znečištění ovzduší. V průmyslových oblastech a poblíž velkých aglomerací mohou dosahovat až 100kg. V severní Evropě činí v současnosti kg. rok -1. Ve střední Evropě jsou průměrné depozice poněkud vyšší (Šimek, 2003).

16 16 Obr. 3 Dálkový přenos viz. Lokalita vrch Salatín (foto: autor) Biologická fixace molekulárního dusíku Fixace N 2 je proces redukce molekulárního dusíku na amoniak. Hlavní mechanismem fixace je biologická fixace N 2. V menší míře probíhá fixace N 2 v atmosféře, a to fyzikálněchemickými procesy působením elektrických výbojů a slunečním záření. Výroba dusíkatých hnojiv je založena na průmyslové fixaci N 2 ze vzduchu (Šimek, 2003). Biologickou fixaci N2 provádějí prokaryotické organismy vybavené enzymem nitrogenázou. Zjednodušená reakce: N 2 + 8H + + 6e - ( + energie, katalyzuje nitrogenáza) 2NH 3 + H 2 Fixátoři dusíku jsou bakterie (Azotobacter, Clostridium, Rhizobium aj,). Aktinomycety (Frankia) a sinice ( Nostoc, Anabaena aj.), Molekulární dusík fixují buď volně, samostatně nebo velmi často v různých asociacích a symbiózách s jinými organismy(šimek, 2003).

17 17 Biologická fixace N 2 má zásadní význam pro zásobení mnoha ekosystémů dusíkem. Většina dusíku v biomase a v organických humusových látkách byla v minulosti fixována ze vzduchu. Velikost biologické fixace N 2 je různá a závisí na mnoha okolnostech, nejvýkonnější fixační systémy mohou fixovat až asi 600 kg.ha -1. rok -1 (Šimek, 2003). Uvádí se, že biologická fixace molekulárního dusíku je po fotosyntéze druhý nejdůležitější biologický proces na Zemi. Biologická fixace N 2 je totiž jediný významnější přirozený proces, kterým je pro organizmy nedostupná forma N 2 převáděna na minerální formu dusíku metabolizovatelnou všemi rostlinami a mikroorganismy. Předpokládá se, že naprostá většina dusíku dnes vázaného v biomase organismů, v odumřelé organické hmotě, v humusových látkách i v nerostech organického původu (uhlí, rašelina, živce) byl v minulosti fixována z atmosféry procesem biologické fixace molekulárního dusíku. I v současné době je biologická fixace molekulárního dusíku hlavním zdrojem dusíku jako živiny rostlin a mikroorganismů v mnoha přirozených i polopřirozených ekosystémech a vedle syntetických hnojiv se stále významným zdrojem dusíku i v agrosystémech (Šimek, 2003). V zásadě existují 3 cesty fixace ( redukce) N 2 : Biologická fixací v buňkách mikroorganismů Cesta fixace účinkem záření a elektrických výbojů v atmosféře Průmyslová fixace, jejímž základem je Haber-Boschův (Haber Bosch)* způsob syntézy amoniaku z N 2 a H 2 za vysoké teploty ( 450 C) a tlaku (20 MPa) při použití průmyslových katalyzátorů (Fe 3 O 4 ). Z takto vyrobeného amoniaku se poté vyrábějí rozmanitá dusíkatá hnojiva (Šimek, 2003). * Haber Boschova reakce. Německý fyzikální chemik Fritz Haber získal v roce 1918 Nobelovu cenu za objev, který učinil téměř dvacet let před tím za systézu amoniaku přímo dusíku a vodíku. Tento proces rozpracoval do průmyslového měřítka jeho kolega Karl Bosch, který za něj a další vysokotlaké experimenty získal společně s Friedrichem Bergiusem Nobelovu cenu v roce Reakce je založena na proudu ohřátého a za vysokého talku smíchaného proudu vodíku a dusíku, který se pomocí katalyzátoru, obvykle oxidů železa, slučuje na amoniak, z něhož je vyráběno to nejjednodušší hnojivo dusičnan amonný (CÍLEK, 2008).

18 18 Biologickou fixaci molekulárního dusíku mohou provádět pouze organismy vybavené příslušnými enzymy. Fixátoři N 2 jsou výlučně prokaryotické mikroorganismy, a to mnohé bakterie a sinice, podle své schopnosti metabolizovat dvojatomovou molekulu dusíku se nazývají diazotrofové. Mnohé diazotrofické mikroorganismy mohou žít volně, nezávisle na jiných organismech. Jiné vytvářejí asociace nebo symbiózy s jinými mikroorganismy, s rostlinami, i s živočichy. Všichni diazotrofové však pro fixaci N 2 využívají stejný nebo velice podobný enzymatický aparát, jehož centrální složkou je enzym nitrogenáza (Šimek, 2003). Z velké energetické náročnosti redukce molekul N 2 vyplývá nutnost zajištění dostatečných zdrojů pro probíhající fixaci N 2 na fixaci 1g N 2 potřebují fixátoři průměrně 67 g C ve vhodné formě. V půdě jsou to různé organické zbytky, odumřelé tkáně a buňky rostlin a živočichů, kořenové exudáty a jiné organické sloučeniny. Kromě dostupnosti uhlíku (energie) ovlivňuje fixaci N 2 řada faktorů prostředí, např. koncentrace minerálních forem N (syntéza nitrogenázy je zastavena a aktivita již syntetizovaného enzymu potlačena v prostředí s vyšší koncentrací amoniakálního N nebo nitritů organismus dá přednost energeticky mnohem méně náročného příjmů a asimilaci NH a NO 3 před syntézou a energeticky náročným provozem fixačního systému. Nitrogenáza je extrémně citlivá na molekulární kyslík a všichni diazotrofové mají vyvinut nějaký systém ochrany nitrogenázy před O 2 (koncentrace kyslíku v prostředí také reguluje syntézu nitrogenázy u některých bakterii. Aktivita nitrogenázy a tím velikost fixace N 2 je ovlivňována i teplotou, ph a redoxpotenciálem prostředí, dostupností fosforu a jiných živin (včetně mikroprvků Mo a V) a nepřímo dalšími faktory prostředí, podobně jako jiné mikrobiální aktivity (Šimek, 2003) Asymbiotická fixace Asymbiotickou fixaci vzdušného dusíku provádějí volně žijící bakterie. Nejvýznamnější jsou rody Azotobacter a Clostridium. Asotobacter chroococcum je velmi náročný na podmínky prostředí proto je jeho podíl na celkovým množstvím půdní mikroflóry malí (uvádí se buněk v 1g půdy). Je přísně aerobní pro se vyskytuje jen v dobře provzdušněných půdách. V půdách s ph nižším než 5 se prakticky nevyskytuje. Kromě atmosférického dusíku využívá i dusík amoniakální, nitrátový, nitritový, močovinu a aminokyseliny. Když je těchto zdrojů dostatek neváže N 2. Když se Asotobacter nachází v blízkosti semínek rostlina dokáží jeho produkty stimulovat jejich růst.

19 19 Clostridium pasteurianum přísně anerobní bakterie mléčného kvašení. Kromě vzdušného dusíku také dobře využívá minerální a organické formy dusíku. Jsou méně citlivé na dostatek živin jako fosforu a vápníku. Rozpění ph ve kterém se normálně vyvíjí, je velmi široké (4,5 8,5). Velmi dobře snáší vysoké nasycení půdy vodou, optimum je % PVK (Merendiak, 1987) Symbiotická fixace Někteří fixátoři dusíku vstupují do asociací s jinými organizmy. Mnoho volnějších interakcí mezi fixátory a rostlinami se realizuje v rhizosféře, na povrchu kořenů i uvnitř kořenových pletiv. Bakterie zde nacházejí zdroje energie i živin a naopak poskytují rostlinám dusíkaté i jiné látky. Bakterie zde nacházejí zdroje energie i živin a naopak poskytují rostlinám dusíkaté látky. V asociaci bakterií Azotobacter paspali a kořenů tropické trávy Paspalum notatum se tak může fixovat i několik desítek kg N. ha -1. rok -1. Většinou se však v asociativních systémech bakteriích a rostlin (včetně např. našich trav, obilovin aj. běžně pěstovaných rostlin) fixují přepočtu řádově jednotky kg N. ha -1. rok -1. Takové množství dusíku nemá praktický význam pro hnojené plodiny, avšak je významné pro bilanci dusíku v mnoha přirozených a polopřirozených ekosystémech, kde fixace N 2 muže zabezpečovat většinu potřebného dusíku (Šimek, 2003). Mnohem více dusíku než v asociacích bakteriích a rostlin může být fixováno v některých symbiotických systémech. Asi nejznámější a velice rozšířeným typem symbiózy diazotrofů s rostlinami je symbióza bakterii rodu Rhizobium a rostlin čeledi Fabaceace, tzv. leguminóz. Jinou velmi efektivní symbiózou aktinomicet rodu Frankia a asi 30 rodů tzv. aktinorhizních rostlin. Bakterie i aktinomicety iniciují vznik hlízek na kořenech rostlin a jejich do jisté míry pozměněné buňky poté mohou fixovat s podporou rostliny velké množství dusíku, jehož větší část využívají hostitelské rostliny (Šimek, 2003). Kvalitní porosty jetele a vojtěšky jsou schopny fixovat 200 až 250 Kg N/ha za rok a jednoleté bobovité Kg N/ha za rok. Je však skutečností, že plochy těchto plodin jsou poměrně malé a nejsou zařazovány na pozemky pravidelně (Vaněk, 2007). A to přesto, že leguminózy jsou velmi důležité plodiny, významné zejména pro přímou výživu lidí i pro produkci krmiv hospodářských zvířat. Některé leguminózy se používají jako meliorační plodina na málo úrodných a nepříznivých stanovištích, jiné jsou významné dřeviny.

20 20 Aktinorhizní rostlin jsou typické spíše pro chladnější klimatické podmínky nebo jinak méně vhodná stanoviště pro produkci dřeva včetně produkce biomasy pro získání energie a jako rekultivační rostliny, rostlina do větrolamů, i pro okrasné účely (Šimek, 2003) Hnojiva Hnojení anorganickými i organickými hnojivy představuje často hlavní zdroj dusíku v mnoha agroekosystémech a také v některých lesních ekosystémech (Šimek, 2003). Přísun dusíku do biosféry ve formě hnojiv je v současnosti z globálního hlediska řádově stejný jako přísun biologickou fixací molekulárního dusíku, v intenzivní zemědělské oblasti dokonce vyšší (Galloway et al., 2002, 2003). Právě z tohoto důvodu srovnání je zřejmé, jak zásadním způsobem ovlivňuje lidstvo globální koloběh dusíku. Hnojením se dodává až 300 kg N. ha -1. rok -1 (Šimek,2003). V Evropě je to kolem 150 kg N. ha -1. rok -1 v České republice asi 60 kg N. ha -1. rok -1 (Šimek, 2003). Tab. 2 Hlavní tradiční dusíkatá hnojiva Sloučenina Obsah N Poznámka Bezvodý čpavek 82 Zapravuje se do půdy, dnes se omezuje Dusičnan amonný 33 + vápenec a granulace Síran amonný 20 Oblíbené hnojivo Močovina 45 Hydrolyzuje na amoniak, běžně používané Dusičnan sodný a draselný 16 Tzv: Ledky, těží se jako nerost * * Ložiska ledků jsou často organogenního původu a nacházejí se např. v Bolivii, Indie, Rusko, USA, Mexiko, Maďarsko a Německo. Nejznámější ložiska ledků se nacházejí v Chile v prohlubni mezi Přímořskými Kordillerami a vysokými Andami. Většina minerálů obsahující dusík nese předponu nitro-. Nejčastější minerály jsou nitrokalit (dusičnan amonný KNO 3, nazývá se také ledek draselný, obecně ledek) a nitronatrit (dusičnan sodný NaNO 3, také ledek sodný, chilský ledek, obsahuje kolem 16% dusíku). K dalším dusíkatým nerostům patří nitrobarit (dusičnan barnatý), nitrokalcit (vodnatý dusičnan vápenatý) a nitromagnezit (vodnatý dusičnan hořečnatý). V surovém stavu je to směs nitrátů, sodíku, draslíku a vápníku spolu se sírany těchto prvků. Mohou být surovina pro výrobu dusíkatých hnojiv je v současné době nepatrný (naprostá většina dusíkatých hnojiv se vyrábí z amoniaku vyrobeného ze vzduchu) (Šimek, 2003).

21 21 Kromě mnoha dalších dusíkatých sloučenin se jako dusíkatá hnojiva používají hlavně syntetické ledky. Z nich je nejvýznamnější ledek amonný (dusičnan amonný, NH 4 NO 3 ), který se vyrábí neutralizací amoniaku kyselinou dusičnou (Šimek, 2003). Z hlediska vodních zdrojů se nejnepříznivěji projevují průmyslová hnojiva, ve vodě dobře rozpustná, snadno se vyplavují do podzemních nebo splachují do povrchových vod. Zvláště nepříznivě se projevují dusíkatá hnojiva na bázi dusičnanů, která se neváží na sorpční komplex půdy a snadno infiltrují do podzemních vod. Příznivějších výsledků se dosahuje při využití průmyslových hnojiv s dusíkem amoniakálním (Tlapák, 1992). Je to nejen otázka zdravotní, hygienická, ale i ekonomická (náklady na hnojiva) a životní prostředí (kvalita zdrojů pitné vody, eutrofizace vodních toků atd.). Hygienici poprvé upozornily na zdravotní rizika požití většího množství dusičnanů v pitné vodě v USA v r pod názvem blednička novorozeňat (alimentární kojenecká methemoglobinémie) (Kalač, Míka, 1997) Ztráty dusíku Volatilizace Volatilizace amoniaku je vypařování (těkání) plynného NH 3 z půdy a vody do atmosféry. Plynný amoniak je v rovnováze s rozpuštěným amoniakem : NH OH - H 2 O + NH 3 (plyn) Volatilizace NH 3 začíná při hodnotách ph nad 7. Je intenzivnější v zásaditých půdách (při přebytku OH - iontů) a ve vysychajících půdách (nedostatek H 2 O). Volatilizaci podporují vyšší + teploty a nedostatek jílových minerálů a humusových látek (na nichž může být NH 4 sorbován. K volatilizaci NH 3 typicky dochází po hnojení močovinou (která se v půdě poměrně rychle rozkládá a dusík se uvolňuje ve formě NH + 4, v důsledku ustanovení rovnováhy mezi iontovou a plynnou formou vytěkává přebytečný NH 3 z půdy), nebo bezvodým čpavkem, po hnojení organickými hnojivy (hnůj, kejda, močůvka), zvláště pokud nejsou zapraveny do půdy, z uskladněných organických hnojiv a ze stájí hospodářských zvířat. Volatilizace NH 3 je také běžná z mokřadních ekosystémů, z rozkládající se biomasy rostlin a z povrchu rostlin. Může činit i několik desítek kg N. ha -1. rok -1 (Šimek, 2003).

22 22 Při snaze omezení ztrát z aplikované kejdy na kosené louky se tato činnost provádí, nebo lépe řečeno měla by se provádět, v době nízké oblačnosti, čehož jsem byl svědkem u soukromého zemědělce v Německu, který si byl vědom důležitosti hospodaření s dusíkem Emise plynných sloučenin dusíku Zdroje plynů emitujících do atmosféry jsou jak přirozené, tak antropogenní, přičemž podíl antropogenních zdrojů na celkových emisí se velmi výrazně zvýšil s rozvojem průmyslové výroby, energetiky, zemědělství a dopravy. Většina plynných metabolitů vznikajících při procesech přeměn dusíku v půdách, sedimentech a vodách posléze emituje do atmosféry. Kromě amoniaku a molekulárního dusíku jsou to zejména oxidy dusíku: oxid dusný N 2 O, oxid dusnatý NO. Emise dusíkatých sloučenin přirozeně vyrovnávají jejich množství v atmosféře, odkud se odčerpávají biologickou fixací N 2 a spady. Tento přirozený proces významně narušuje člověk, který průmyslovou a zemědělskou činností a dopravou podstatně zvyšuje emise oxidů dusíku a amoniaku. Zvyšování koncentrace NO, N 2 O a NH 3 v ovzduší má závažné globální důsledky (globální oteplování, narušování ozonové vrstvy, tvorba smogu, vznik kyselých srážek a acidifikaci prostředí atd.). Emise dusíkatých sloučenin z půd jsou velice různé a mohou se pohybovat v řádu jednotek až desítek kg N. ha -1. rok -1 (Šimek, 2003). Na znečištěni ovzduší v zemědělské krajině se podílejí hlavně agrochemie, živočišná výroba, aplikace hnojiv, doprava, větrná eroze apod. Do ovzduší unikají emise tuhé (prach, kouř) kapalné (jemně rozptýlené kapénky nečistot) a plynné, které mohou být anorganického i organického původu (oxidy síry, dusíku) (Tlapák,1992). Oxidy dusíku i další dusíkaté látky vstupují v atmosféře do řady reakcí a procesů. Jsou to zejména: - Oxidačně redukční reakce katalýza oxidace NH + 4 v troposféře - Oxidace, tvorba silných kyselin ( HNO 3 ) Kyselé deště, acidifikace půd a vod - Kumulace, transport, emise suché a mokré depozice N, velké vstupy do přirozených ekosystémů - Vysoká perzistence N 2 O, přechod z troposféry do stratosféry Odbourávání troposférického ozonu

23 23 - Vysoká perzistence N 2 O, stálý růst koncentrace ovzduší Zvýšený skleníkový efekt (Šimek, 2003) Vyplavování dusíkatých látek Vyplavování dusíkatých látek (NO - 3, NO - 2, -NH 2, NH + 4 ) představuje významný mechanismus ztrát dusíku z půd a zároveň způsobuje eutrofizaci vod. Většina kationů je vzhledem k převaze negativních nábojů na půdních koloidech v půdách vázaná půdním sorpčním komplexem. Naproti tomu anionty jsou podstatě pohyblivější a v plné míře to platí i o nitrátech a nitritech. Z půd se vyplavují zejména nitráty, což vede nejen ke ztrátě dusíku, ale i k souběžnému vyplavování bazických kationů (K +, Ca + 2 ) a tím ochuzování horních vrstev půdy o tyto živiny, nepřímo tak dochází k acidifikaci. Vyplavováním se běžně ztrácí z půd několik desítek kg N. ha -1. rok -1 (Šimek, 2003). Pro mnoho prvků jsou hlavní cestou ztrát vodní toky. Voda, která odtéká ze suchozemských společenstev do vodního toku, obsahuje velké množství živin z části rozpuštěných a také v podobě pevných částic. Kromě železa a fosforu, které se v půdě pohybovat nemohou, se většina látek ztrácí ve formě roztoků. Ve vodních tocích se vyskytují i pevné části mrtvé organické hmoty (zejména listy stromů) i anorganické částice. Po dešti nebo tání sněhu je splachován voda, přicházející do vodních toků, mnohem zředěnější než v období sucha, kdy toky zásobuje splachován voda koncentrovanější. Přestože jsou ve vlhkých období splachové vody méně nasycené, je množství srážkových vod tak velké, že celková ztráta živin je vyšší. Celková ztráta živin je nejvyšší v letech, kdy srážky a průtok jsou vysoké (Egon, 1997). V oblastech s propustnými podložními horninami živiny neodnášejí jen povrchové vodní toky, ale také voda prosakující do hloubky do podzemních vod. Podzemní vody pak přinášejí tyto živiny do podpovrchových vodních toků nebo jezer s určitým časovým zpožděním a v určité vzdálenosti od místa průsaku. Měření množství živin odplavených podzemními vodami je velmi náročné, takže většina objevených bilancí živin vznikla v povodích s nepropustnými podložními horninami, kde se s podzemními vodami ztrácí jen zanedbatelné množství živin (Egon, 1997) Odnos dusíku v biomase rostlin a erozí Většina dusíku v biomase pěstovaných plodin je často obsažena ve sklizených produktech. Tento dusík se tak z půdy a ekosystému většinou nevratně ztrácí (kromě

24 24 pastevních systémů, kde se 85% N vrací ve formě exkrementů chovaných zvířat). Ztráty dusíku erozí půdních částic a jejich odnosem mohou dosahovat značných rozměrů, avšak o jejich velikosti nejsou dispozici kvalitativní údaje (Šimek, 2003). Na farmách a v lesích bývá významným faktorem výstupu živin sklizeň a těžba, při nichž člověk ze společenstva odstraňuje plodiny a stromy (Egon, 1997). V době propagace obnovitelných zdrojů energie ve formě spalitelné rostlinné biomasy se koloběh dusíku narušuje nadměrným a nepřirozeným přemísťováním biomasy z orné půdy do míst, kde se dusík navázaný v organické hmotě uvolní do atmosféry a je transportován do vzdálených míst viz: Suchý a mokrý spad. Takto nepřirozeně uvolněný dusík do atmosféry ohrožuje také místa, která jsou předmětem studia předložené práce, t.j. alpské louky, které nejsou na takové množství dodaného dusíku adaptovány. Ze své vlastní praxe, kdy jsem se účastnil zpracováni a odvozu rostlinné biomasy z pole, můžu říct, že žádný z oslovených agronomů s těmito postupy nesouhlasil. Všichni jsou si vědomi toho, že odvoz biomasy z pole znamená ochuzení půdy o organickou hmotu potažmo snížení zdroje energie pro mikroorganismy. Jsou si také vědomi toho, že snížení mikrobiální aktivity půdy může mít za následek degradaci půdy. Přes výše uvedené faktory, které způsobují ochuzování našich půd mají tyto praktiky zelenou. Stálo by za zjištěni zda se zisk z prodeje energetické biomasy vyrovná nákladům na dodání živin a úpravu půdního prostředí? Jestliže se do půdy dostane větší množství rostlinné biomasy, mikroorganismy jí rychle osídlí a využívají ji jako zdroj energie, uhlíku, dusíku a dalších prvků, rozkládají nejprve nejsnadněji degradovatelné organické látky, jako jsou např: sacharidy. Tato fáze rozkladu je doprovázena nárůstem počtu i biomasy mikroorganismů a indikuje jí tvorba a uvolňování značného množství oxidu uhličitého (Šimek, 2003). Půdní organismy se podílejí na tvorbě úrodnosti půd. K tomu přispívají dodívaná organická hnojiva, neboť jsou zdrojem potravy pro půdní organismy a zároveň slouží ke zvýšení jejich kvalitativního a kvantitativního zastoupení. Snižování biologické aktivity půdy neuváženým technologickým zásahem (neúměrná chemizace, poškození půdní struktury atd.) vede ke snižování její úrodnosti (Pokorný, 2004).

25 25 Výzkumy ukazují, že dusíkatá hnojiva, která jsou silně rozpustná ve vodě opouštějí půdní povrch absorbovaná na erodovatelných půdních částicích v mnohem větší míře než se předpokládalo. Obsahy celkového dusíku (převážně organického) v usazeninách jsou obvykle značně vysoké a mohou se pohybovat od 0,1 do 4 %. (Janeček, 2008). Eroze snižuje obsah organických látek v půdě dvěma způsoby: V důsledku ztráty povrchové vrstvy půdy ornice- se snižuje celkový obsah organických látek. Tzn. Čím více je snižována její mocnost, tím nižší je obsah organických látek v něm obsažených. Vzhledem ke snižování mocnosti povrchové vrstvy půdy vlivem eroze dochází při zpracování půdy k mísení podorniční a ornice a tím dochází k ředění obsahu organických látek (Janeček, 2008). Významná ztráta organické hmoty působením eroze je doprovázena ztrátou základních živin, hlavně N a P. Na každou 1 tunu ztráty organické hmoty vlivem eroze připadá přibližně 60 kg N, resp. Smyvem 1 cm půdy na 1 ha se ztratí 300 kg N (Janeček, 2008) Přeměny dusíku Obsah a formy dusíku v půdě Původním zdrojem většiny půdního dusíku je atmosféra. Prvotní atmosféra obsahovala dusík pravděpodobně ve formě NH 3, jak narůstal obsah O 2 v ovzduší, docházelo k oxidaci NH 3 na N 2, až byla naprostá většina redukovaných forem N oxidována. Dusík je tedy dnes v atmosféře obsažen hlavně jako molekulární dusík N 2 a dále ve formě oxidů (NO, N 2 O, NO x ). Fixací molekulárního dusíku je tento jinak nepřijatelný dusík zpřístupňován pro organismy (Šimek, 2003). Obsah dusíku v povrchové vrstvě půdy obvykle činí 0,1 0,15 % hmotnostních a celkově se pohybuje mezi 0,02-0,5% hmotnostních. Na ploše 1 hektaru se tedy obvykle nachází v povrchové vrstvě (ornici) několik tun N a stejné množství je v hlubších vrstvách půdy (Šimek, 2003). Velká většina (95 99%) půdního dusíku je vázána v organických látkách (zejména ve vazbě R-NH 3 ). Tento dusík je vesměs dočasně nepřístupná pro rostliny i mikroorganismy (je

26 26 tzv. imobilizovaný). Pouze malá část organického N se každoročně mineralizuje činností půdních mikroorganismů, část mineralizovaného N je dříve nebo později opět imobilizována do biomasy mikroorganismů a dalších organizmů a do humusových látek. Čistá mineralizace, tj. množství dusíku uvolněného pro potřeby rostlin, činí typicky 50 až asi 300 kg N. ha -1. rok 1. Mineralizovaný dusík se uvolňuje převážně v amonné formě a ve vegetační sezoně je + rychle mineralizace 1 20 mg NH 4 -N. kg -1 půdy. d -1. Amonná forma dusíme je půdními procesy transformována na jiné formy N. Půdy obsahují během vegetační sezony obvykle jednotky až desítky mg NH + 4 -N. kg -1 a podobná množství NO - - 3, obsah NO 2 -N je mnohem nižší. Zdrojem dusíku v půdách je z převážné části atmosféra (fixace molekulárního dusíku, spady) a částečně nerosty a hnojiva (Šimek, 2003) Mineralizace organické hmoty Mineralizace organických dusíkatých látek představuje procesy jejich rozkladu na jednoduchou minerální formu dusíku: R-NH2 + 2H2O NH + 4 +R-OH +OH- Nejběžnější minerální formou dusíku uvolněného mineralizací organických látek je amonná forma proto se tento proces často nazývá amonifikace (také amonizace). Velká většina dusíku v půdách a sedimentech je pevně vázáná v různých organických látkách. Mineralizací se tento vázaný dusík uvolňuje jako živiny pro rostliny a mikroorganismy. Mineralizace organických dusíkatých látek je klíčovým procesem zpřístupňování dusíku jako živiny ve většině ekosystémů. Opakem k procesu mineralizace je proces imobilizace asimilace minerálních forem dusíku a jejich zabudování do organických látek biomasy organismů. Procesy mineralizace a imobilizace probíhají v prostředí současně. Mineralizace dříve syntetizovaných organických látek včetně humusu je vnitřním zdrojem dusíku v ekosystému. Výjimečně činní až 400 kg N. ha -1. rok -1 (Šimek, 2003) Asimilace dusíku organismy Rostliny a mikroorganismy přijímají jako živinu obě hlavní minerální formy dusíku, amoniakální (NH + 4 ) a nitrátovou (NO - 3 ). Mnoho rostli dává přednost amoniakální formě a teprve při jejich nedostatku přijímají nitráty (NO - 3 ) nebo i nitrity (NO - 2 ). Výjimkou jsou např. rostliny adaptované na alkalické prostředí půd na vápencových přijímají přednostně nitrátovou formu. Redukovaná forma může být totiž využita při biosyntéze, zatímco

27 27 - oxidované formy musejí být teprve redukována na amoniak (viz r- asimilační redukce NO 3 na NH + 4 ). Při nadměrném příjmu nitrátů rostlinami nebo za určitých (pro rostlinu nepříznivých) okolností není přijímaný (NO - 3 ) redukován na amoniak, ale hromadí se v biomas, která se stává toxickou pro býložravce. Typickým problémem pramenící většinou z přehnojení dusíkem v zajmu rychlého růstu rostlin je akumulace nitrátů v rychlené zelenině. V přirozených ekosystémech je roční příjem dusíku rostlinami většinou poměrně nízký. Např. v jehličnatých lesích severní Ameriky asi kg N. ha -1. rok -1, avšak v topickém pralese v Ghaně až 250 kg N. ha -1. rok -1. Pěstované plodiny mívají podstatně větší nároky ( kg. ha -1. rok -1 ), které nemohou být pokryty mineralizací organických dusíkatých látek, a proto se musejí tyto plodiny hnojit (Šimek, 2003) Asimilace a disimilační redukce NO na NH 4 - Asimilační redukce nitrátů na amonium spočívá v redukci NO 3 pomocí cytoplazmatických enzymů rostlin a mikroorganismů: amonná forma N je potom využita v biosyntéze nejrůznějších látek: NO 3 - NO 2 - (NOH) NH 2 OH NH 4 + glutamát, glutamin atd. (syntéza biomasy) Disimilační redukce nitrátů na amonium probíhá podle vztahu NO 3 - NO 2 - NH 4 + (G = - 600kJ.mol -1 NO 3 - ) Účelem disimilační redukce nitrátů na amonium je zisk energie. Je regulována parciálním tlakem O 2 a často probíhá v prostředích dlouhodobě nebo trvale oxidovaných a bohatých na organické látky. Disimilační redukce nitrátů na amoniak provádějí mnohé půdní mikroorganismy, které typicky patří do skupiny obligátně nebo fakultativně anaerobních bakterií (druhy rodů Clostridium, Desulfovibrio, Bacillus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella aj. Při asimilačních i disimilačních redukci nitrátů a nitritů na amoniak mohou vznikat jako vedlejší metabolity i plyny, NO a N 2 O (Šimek, 2003).

28 Nitrifikace Nitrifikace je oxidace amonné formy na nitrity a nitráty nebo obecněji biologická přeměna organických a anorganických sloučenin dusíku z redukovaných na oxidovanější. NH 4 + NH 2 OH (NOH) NO NO 2 - NO 3 - Proces nitrifikace lze sumárně zapsat také takto: NH O 2 NO 3 + H 2 O + 2H + Nitrifikace je v mnoha ekosystémech primárním procesem: o Transformuje relativně nepohyblivou formu (NH + 4 ) na velmi pohyblivou formu (NO - 3 ) dusíku o Při nitrifikaci dochází k okyselování (acidifikace) prostředí o Vedlejšími produkty nitrifikace jsou plynné sloučeniny dusíku- oxid dusnatý (NO) a oxid dusný (N 2 O) Nitrifikaci typicky provádějí chemolitoautotrofní bakterie (např. druhy rodů, Nitromonas, Nitrosobacter, Nitrococcus, Nitrobacter), které se vyskytují všude v přírodě: v půdách, oceánech, řekách, a jezerech, v sedimentech a v kalech odpadních vod, na povrchu stěn budov, na betonových podkladech, v tunelech apod. V prostředí, kde chybí autotrofní nitrifikátoři nebo kde je jejich aktivita potlačena např. nedostatkem O 2 nebo NH + 4, nízkým ph apod. se může uplatnit heterotrofní nitrifikace, tj. nitrifikace prováděná některými bakteriemi, aktinomycetami a mikromycetami (Šimek, 2003) Respirace nitrátů Respirace nitrátů na nitrity je reakce analogická s první krokem disimilační redukce nitrátů na amonium. Jejím smyslem je zisk energie. Respiraci nitrátů na nitrity provádějí za anaerobních podmínek mnohé bakterie (např. druhy rodů Klebsiella) (Šimek, 2003) Denitrifikace Denitrifikace je poslední etapa v koloběhu dusíku, při které se do atmosféry vrací plynné formy dusíku (Merendiak, 1987).

29 29 Denitrifikace je redukce oxidovaných forem dusíku (NO 3 -, NO 2 - ) na nestabilní NO na plynné dvojatomové dusíkaté sloučeniny, N 2 O a N 2. V půdách a sedimentech je nejvýznamnější biologická (respirační) denitrifikace probíhající podle schématu: NO 3 - NO 2 - [NO] N 2 O N 2 Při respirační denitrifikaci slouží nitráty a nitrity jako akceptory elektronů v dýchacím řetězci, a tedy zisk energie. Respirační denitrifikace je v mnoha ekosystémech klíčovým procesem, kterým se fixovaný dusík vrací do atmosféry a cyklus dusíku se také uzavírá. Protože hlavním produktem denitrifikace je bedle molekulárního dusíku i oxid dusný, je denitrifikace nežádoucí zejména ze dvou důvodů: - Denitrifikace přispívá k nárůstu koncentrace oxidů dusného v atmosféře - Denitrifikací se ochuzuje daný ekosystém o dusík, který může být využit jako živina. V jiných situacích, např. při úpravě pitné vody, je denitrifikace hodnocena pozitivně jako účinný proces odstraňování nadbytečných nitrátů. Denitrifikace typicky provádějí chemoorganoheterotrofní bakterie (např. druhy rodů Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Agrobacterium, aj.), které jí využívají za hypoxických a anodických podmínek jako alternativní disimilační proces získávání energie pro metabolismus (nitráty nebo nitrity jsou využívány místo O 2 jako akceptor elektronů v respiračním řetězci). Denitrifikace je často intenzívní v zaplavených půdách, v zemědělských půdách po hnojení dusíkatými hnojivy a v pastevních půdách (Šimek, 2003) Nerespirační denitrifikace Nerespirační denitrifikace je redukce nitrátů nebo nitritů na oxid dusný (N 2 O) za aerobních podmínek. Nerespirační denitrifikaci provádějí mnohé bakterie, houby, řasy i sinice. Patrně neslouží k zisku energie a její význam pro zúčastněné organismy je nejasný (Šimek, 2003).

30 Fixace amoniaku Fixace amoniaku je poutání amonných iontů (NH + 4 ) ve vnitřních strukturách jílových minerálů, odkud jsou jen pomalu uvolňovány. Stejně jako jiné kationty jsou ionty (NH + 4 ) poutány na negativně nabitých površích jílových minerálů a humusových látek jako tzv. výměnné kationty - jsou přístupné rostlinám a mikroorganismům, avšak zároveň jsou částečně chráněny proti vymytí. Amonné ionty mohou také být, vzhledem ke své malé velikosti poutány fixovány ve vnitřních prostorách krystalových struktur některých jílových minerálů, např. minerálů typu vermikulitu nebo montmorilonitu. Množství + fixovaného NH 4 závisí zejména na obsahu jílových minerálů v půdě a na jejich kvalitě. V silně zvětralých půdách je zanedbatelné, avšak v mnoha půdách a na jejich kvalitě. V silně zvětralých půdách je zanedbatelné, avšak v mnoha půdách může být fixováno na jílových minerálech 10-30% z celkového obsahu dusíku v půdě (Šimek, 2003) Tvorba plynných sloučenin Plynné metabolity vznikají jako vedlejší produkt při mnoha procesech přeměn dusíku, např. při Nitrifikaci zejména při snížení O 2 ( vzniká NO a N 2 O) Respiraci nitrátů (N 2 O) Nerespirační denitrifikaci nitrátů a nitritů (N 2 O) Asimilační a disimilační redukci nitrátů (a nitritů) na amonium (NO, N 2 O) Fixaci molekulárního dusíku (N 2 O) Mineralizaci organických látek (NO, N 2 O) Plynné metabolity vznikají i při chemických procesech, např. chemodenitrifikací nitrátů i nitritů (NO, N 2 O, N 2 ) (Šimek, 2003) Vlivy na koloběh dusíku Koloběh dusíku velmi výrazně ovlivňuje svou činností člověk. Vázaný dusík vzniká jako vedlejší produkt některých technologických procesů, například vnitřního spalování a výroby hnojiv. Zemědělská praxe podporuje fixaci dusíku pěstováním bobovitých druhů. Člověk opravdu produkuje řádově tolik vázaného dusíku, kolik se ho v přírodě vytvoří přirozenou fixací (Rosswall, 1983). Zvlášť citelně narušujeme koloběh dusíku používáním

31 31 dusíkatých hnojiv (více než 50 x 10 6 tun ročně), protože značná část do půdy aplikovaného hnojiva si dříve či později najde cestu do vodních toků jezer. Tím se zvýší koncentrace dusíku ve vodě, což vede k zahájení procesu kulturní eutrofizace. Člověk narušuje i atmosférickou fázi koloběhu dusíku. Hnojením zemědělských půd minerálními hnojivy zvyšuje nejen množství vyplavovaného dusíku, ale také intenzitu denitrifikace (Bremner a Mlackmer 1987). Zpracování chlévské mrvy a její využití oblastech intenzivního chovu dobytka uvolňuje značné množství čpavku (Berdén et al., 1987). Nejvíce však člověk narušuje atmosférickou fázi koloběhu dusíku uvolňováním stále většího množství oxidů dusíku (NO x ). Tyto plyny se jednak vytvářejí při spalování ropy a uhlí (v elektrárnách i při průmyslové výrobě), jednak jsou obsaženy ve výfukových plynech. Atmosférický NOx se po několika dnech změní v kyselinu dusičnou, který zvyšuje kyselost vodních srážek jak v původní průmyslové oblasti, tak i všude tam, kam vítr tuto srážku zanese (Egon, 1997). Nejvíc otázek vyvolává v současnosti osud atomů dusíku vykořeněných z původních vazeb a cest z důvodu použití dusíku pro výživový doping rostlin k nasycení cca 40 % lidské populace (Galloway et al.., 2003). Z tohoto důvodu je namístě zdůraznit, že všechny klíčové reakce v koloběhu dusíku byly původně kontrolovány mikroorganismy Půdní biota Volný dusík muže vázat jen malá skupina prokaryontních organismů, včetně několika bakterií, aktinomycet a sinic. Mnohé z nich se dostaly do těsného soužití se systémově zcela rozdílnými skupinami eukaryontních organismů. Předpokládáme že takové symbiózy se vyvinuly mnohokrát a nezávisle na sobě. Z ekologického hlediska jsou nesmírně významné, protože na mnoha stanovištích jsou zásoby dusíku velmi omezené (Šimek, 2003). Studie půdních organismů je velice důležité, neboť nám umožňují poznat jednotlivé koloběhy prvků, změny organických látek a biologické procesy v půdě, vztahy a funkce v ekosystému. Apod. Na většině půd rostě vegetace a půda bývá posuzována podle svých schopností zásobovat rostlinu vodou a živinami. Na druhé straně ale produkce primárními producenty zásobuje půdní prostředí organickými látkami, které jsou nezbytnými energetickými zdroji pro edafon. Fixovaný CO 2 v průběhu procesu fotosyntézy je pak v podobě opadu a rostlinných pletiv energetickým zdrojem pro život v půdě. Rozdíly v primární produkci vedou

32 32 i k rozdílům v přísunu organických látek do půdy což muže ovlivnit velikost mikrobiální biomasy, která představuje živou část půdy bez kořenů rostlin a půdních živočichů větších než 5 x 10 3 mikrometrů ( Wood 1989). Počty organismů v půdě jsou ovlivněny mnoha faktory, včetně klimatu, vegetačního krytu fyzikálních a chemických vlastností půd. Je možné obecně konstatovat, že v lesních půdách nacházíme rozmanitější faunu než na loukách. Celková hmotnost biomasy organismů a jejich aktivita bude však vyšší pod trvalým travní porostem. Obdělávaná pole bývají na biomasu chudší než nenarušené přírodní oblasti. Aktivita jednotlivých skupin půdních organismů se stanovuje na základě jejich počtu, hmotnosti a objemu na plochu půdy nebo na základě jejich metabolické aktivity. Pro posouzení jednotlivých lokalit je možné využít i bioindikačních vlastností některých půdních živočichů, kdy na základě počtu jedinců na m 2 a podle přítomnosti nebo nepřítomnosti některých druhů nebo skupin je možné zjistit hodnotu půdně biologických parametrů. Na základě znalostí jednotlivých druhů je možné dále usuzovat na širší biotické a abiotické vztahy v půdě (Rusek 1992). Mikroorganismy představují neodmyslitelnou složku každého ekosystému. Mohou růst a množit se i v extrémních podmínkách, které jsou pro ostatní organismy nepřijatelné. Svou přítomností mění a modifikují méně vhodná prostředí tak, že se stávají vhodnými pro život náročnějších organismů. V přirozeném prostředí mají mikroorganismy dvě základní, vzájemně se doplňující role.jejich podstata je charakterem mikrobiálního metabolismu, kterým se mikroorganismy podílejí na: 1. IMOBILIZACE syntéze (asimilaci) nové organické hmoty z CO 2 a dalších anorganických složek za využití sluneční energie. Proces uskutečňují primární producenti. Tímto způsobem je získávána organická hmota nezbytná pro životní funkce za současného zvyšování biochemické komplexnosti ekosystému. 2. MINERALIZACE rozkladu (dekompozici) přeměn organicky vázaného prvku na jeho anorganickou formu. Proces uskutečňují dekompozitoři a je též označován jako regenerace živin, neboť prvky, které byly organicky vázány, jsou uvolněny a mohou být opět využíty v procesu asimilace. Mikroorganismy tímto způsobem snižují biochemickou komplexnost ekosystému a zvyšují entropii systému (Malachová, 2004)

33 Vliv podmínek prostředí na mikroby Teplota U bakterii, stejně jako u ostatních mikroorganismů, můžeme vyjádřit závislost aktivity na teplotě třemi tzv. kardinálními teplotními body: minimem, optimem a maximem. Minimální teplota je taková při níž ještě probíhají některé životní procesy. Generační doba je v tomto případě velmi dlouhá. Optimální teplota je nejvhodnější pro rychlý růst. Při této teplotě, která je asi o 30 C vyšší než je teplota minimální, je generační doba v logaritmické fázi nejkratší. Optimální růstová teplota však není totožná s teplotou optimálního pro všechny enzymy buňky. Produkce toxinů, tvorba bičíků, spor aj. mají obvykle svoje individuální hodnoty. Maximální teplota převyšuje pouze o 5-10 C optimální teplotu určitého mikroorganismu.to znamená, že pro zvýšení teploty nad optimální teplotu dochází k prudkému poklesu rychlosti rozmnožování, jeho zastavení či vede až k usmrcení buňky. Zvýšení teploty vede k denaturaci určitých enzymů, jenž jsou nezbytná pro růst. Tato denaturace je zprvu reverzibilní, avšak při vyšších teplotách se stává ireverzibilní (Merendiak, 1987) Vlhkost Vlhkost je pro mikroorganismy životně důležitá. Mikroby mohou žít jenom v roztocích a že chemické složení těchto roztoků a jejich fyzikální vlastnosti jsou určujícím pro rozvoj mikroorganismů. Optimální potřeba vody u mikrobů kolísá podle druhu a povahy substrátu. Podle nároků na vlhkost prostředí se mikroby mohou dělit na : - Xerofilní - Mezofilní - Hydrofilní Uveďme například ornici, která vysychá. Nejdříve jsou postiženy bakterie, teprve potom houby a streptomycety. Vysloveně hydrofilní jsou bakterie poutající vzdušný dusík, zvláště Azotobakter a Rizobia (Merendiak, 1987). Optimální vlhkost půdního prostředí vyhovující téměř všem půdním mikroorganismům se pohybuje v rozmezí % polní vodní kapacit. Nepříznivé stavy půdní vlhkosti (vysušení nebo naopak přemokření) přečkávají mikroorganismy většinou ve stavu spór nebo cyst. V sušším prostředí půdy se lépe množí aktinomicety a plísně. Většina

34 34 organismů, využívající půdní vzduch ke svým dýchacím procesům, vyžaduje vysokou vlhkost půdního vzduchu (Pokorný, 2004) Osmotický tlak Důsledkem činnosti osmotické bariery buňky, působící proti koncentračnímu spádu, je značný osmotický tlak uvnitř buňky. U bakterii průměrné hodnoty činní 0,05-0,20 MPa, tj. tlak, při němž většina nízko molekulárních nitrobuněčných sloučenin musí být volná v roztoku. Změny vnějšího osmotického tlaku mají za následek morfologické změny v mikrobiální buňce V prostředí hypotonickém (tj. při přenesení buněk z koncentrovaného roztoku do destilované vody) nastává plazmoptýza, tj. prasknutí buněčné stěny a vyhřeznutí protoplazmy. Naopak v hypertonickém prostředí mikroby ztrácejí vodu, hovoříme o plazmolýze (Merendiak, 1987) Hydrostatický tlak Běžné hydrostatické tlaky nemají podstatný vliv na mikrobiální buňku. Avšak velmi vysoký hydrostatický tlak muže omezit růst mikrobů. Většina mikroorganismů neroste při tlaku větším 6 MPa, avšak krátká expozice na 2 x 10 2 MPa nezničí některé druhy bakterii. Bakterie můžeme rozdělit na Barofilní, to jsou ty které se rozmnožují při vysokých tlacích, například: velké hloubky v oceánech). Barotolerantní jsou ty které žijí jak v nízkém tak ve vysokém tlaku (Merendiak, 1987) Povrchové napětí kapalin Četné aerobní mikroorganismy rostou na hladině pěstebních roztoků ve formě subtilní blanky či kompaktnějšího povlaku. Na příklad například Bacilus subtilis, přesto že má specifickou hmotnost o něco málo větší než roztok na kterém roste, vytváří na hladině blanku, která je zdě udržována povrchovým napětím kapaliny. Hodnoty povrchového napětí musí být zhruba 0,06 N x m -1. Přidáme li do pěstebního roztoku detergentní látku, která sníží povrchové napětí na 0,045 N x m -1, B. subtilit již blanku na hladině nevytvoří, ale rostě difúzně v celém sloupci roztoku, který zakaluje. Povrchově aktivní látky (detergenty, smáčedla). Jsou jimi například mýdla, glycerín, etanol, různé estery a saponáty. Funkcí povrchového napětí je smáčitelnost (Merendiak, 1987).

35 Reakce prostředí Půdní reakce se uplatňuje jako prvořadý faktor v životě mikrobů. Je dán koncentrací iontů vodíku v půdním roztoku a vyjadřuje se symbolem ph. Takovou reakci označujeme jako aktuální. V půdě existují i sorbované a výměnné ionty vodíku, které podmiňují tzv. výměnnou a hydrolytickou kyselost. Převážná část půdních bakterii dává přednost reakci neutrální až mírně alkalické. Výchylky na kyselou nebo alkalickou stranu oslabují jejich činnost (Ambrož, 1986) Úpravou půdní reakce vápněním můžeme výrazně ovlivňovat důležité fyziologické funkce mnohých mikroorganismů (poutání vzdušného dusíku Azotobacter prakticky ustává při poklesu ph pod 6, výrazně je také snížena činnosti nitrifikačních bakterii (Pokorný, 2004). Půdní ph v suchozemském (terestrickém) prostředí může mít silný vliv na výskyt a počet organismů. Půdní ph má vliv na dostupnost živin a koncentraci toxických látek. Pod hodnotou ph 4,0 až 4,5 obsahují minerální půdy tak vysokou koncentraci hliníkových iontů (Al 3+ ), že jsou pro většinu rostlin silně toxické. Navíc při nízkém ph mohou být mangan (Mn 2+ ) a železo (Fe 3+ ) přítomny v toxické koncentraci, ačkoliv jinak jde o základní rostlinné živiny. Na opačném konci stupnice ph může být značným problémem nedostatek živin. V alkalických půdách jsou železo, mangan, fosfáty (PO 3+ 4 ) a některé stopové prvky pěvně vázány v relativně nerozpustných sloučeninách, takže rostliny jsou jimi nedostatečně zásobovány. Od průmyslové revoluce způsobilo spalování fosilních paliv a následní emise nejrůznějších polutantů, hlavně oxidů siřičitého, do ovzduší spad suchých kyselých částeček a deště, který je vlastně zředěnou kyselinou sírovou (Egon, 1997). Podobně jako je tomu o teploty, má i ph pro každého mikroba své minimální, optimální a maximální hodnoty, dovolující růst a množení. Tyto hodnoty těsně souvisejí s hodnotami pro aktivitu životně důležitých enzymů. Poněvadž ph je logaritmická funkce, rozdíl hodnot o 1 znamená 10 krát větší kyselost nebo zásaditost. Podle schopnosti růstu při různém ph rozdělujeme mikroorganismy takto: - Acidofilní ph Neutrofilní ph Alkalofilní ph 7-11 (Merendiak, 1987).

36 36 Rostliny přijímají dusík ve formě iontů, a to kationu amonného (NH + 4 ), nebo anionu nitrátového dusičnanového (NO - 3 ). O příjmů iontů rozhodují hlavně vnější podmínky, ale i - sama rostlina. Výrazný vliv vykazuje ph prostředí. V kyselejší oblasti převažuje příjem (NO 3 ) a v neutrální až alkalické oblasti ph se příjem obou iontů vyrovnává, nebo je vyšší příjem (NH - 4 ) (Vaněk, 2007). Zvláště nepříznivý vliv na znečištění krajiny má energetika a ostatní průmyslový znečišťovatelé zplodinami okyselující deště (Tlapák, 1992) Formy půdní reakce V půdě se vodíkové ionty nacházejí buď v půdním roztoku a pak udávají aktivní reakci (ph/h 2 O) a nebo jsou výměně sorbovány půdními koloidy a tvoří potenciální reakci. Potenciální reakce se dělí na reakci výměnnou (ph/kcl) a hydrolytickou (mmolh + /0.1 kg půdy). Aktivní kyselost je způsobena volnými H + ionty, které jsou v půdním roztoku. Zdrojem vodíkových iontů jsou disociované minerální a organické kyseliny, kyseliny solí a acidoidy. Aktivní kyselost zjišťujeme potenciometrickým měřením koncentrace H + v půdním roztoku, půdní pastě nebo ve vodním roztoku. Tato forma kyselosti se nejvíce vyskytuje v půdách odvápněných, sorpčně nenasycených a s vysokým podílem absorbovaných iontů H + a Al 3+. Výměnná kyselost je způsobena adsorbovanými ionty H + a Al 3+.(Fe 3+ ), které předcházejí do roztoku nebo extraktu výměnnou za bazické kationty neurálních solí z roztoku. Výměnnou kyselost zjišťujeme měřením koncentrace H + iontů ve výluhu půdy 1N roztokem KCl. Výměnná reakce se zpravidla vyznačuje nižšími hodnotami ph než aktivní rekce, určovaná ve vodním výluhu ph/h 2 O je značně proměnlivá během roku vlivem povětrnosti, obdělávání, hnojeni atd. Protože ph/kcl neprodělává během roku tak velké změny je daleko důležitější a tím používanějším ukazatelem, zejména pro stanovení charakteristik sorpčníhokomplexu a stavu jeho nasycenosti. Aktivní reakce má bezprostřední význam fyziologický. Hydrolytická kyselost zjistíme působením na půdu 1N roztokem hydrolyticky zásadité soli (CH 3 COONa, /CH 3 COO/ 2 Ca. Její hodnotu vyjádříme V mmol H + /0,1 kg půdy. Je nemírnější formou půdní kyselosti, která se může v půdním roztoku projevit teprve při nevhodných chemických zákrocích (hnojením, chemickou meliorací atd.) (Pokorný, 2004).

37 Půda jako prostředí mikroorganizmů Mikroorganismy, tak jako rostliny a živočichové, potřebují ve svém ontogenetickém vývoji okolí sebe prostor pro svůj metabolismus růst. Tento prostor označujeme jak životní prostředí nebo biotop. Mikroorganismy a prostředí vytváří funkčně vzájemně propojený dialektický dynamický celek. Prostředí poskytuje mikroorganismům živiny, energie, vodu, mikroorganismy zase zpětně působí na prostředí a spolu s ostatními organismy formulují jeho biologické, fyzikální a chemické vlastnosti. Životní prostředí mikroorganismů může být velmi rozmanité (půda, voda, vzduch, organismus ), ale primární je půda (Merendiak, 1987) Podíl mikroorganismů na tvorbě půdy Půda je oživená zvětralá vrstva zemské kůry, v které se uskutečňují přeměny látek důležité pro život rostlin, živočichů a mikroorganismů. Půda má pět hlavních složek: minerální látky, vodu, vzduch, organické látky a organismy. Vzduch a voda zabírají přibližně polovičku půdního objemu, minerální látky v dobrých strukturních půdách přibližně druhou polovičku v nestrukturních víc. Organická hmota představuje zpravidla 1-3 (6)% a žijící složka 1 nebo míň jak jedno procento. Množství a kvalita jednotlivých složek podléhá neustálím změnám, v důsledku čeho se půda stává dynamicky biologickým útvarem přírody. Půdní organizmy (edafon) svou činností podmiňuje: Zvětrávání minerálů a důsledku biochemických procesů. Rozklad a syntézu organických látek. Promíchávání minerálních a organických složek. Tvorbu strukturních agregátů podmiňující půdní úrodnost, přičemž produkty činnosti edafonu působí jako tmel spojující nejmenší půdní částice do větších shluků, agregátů. Tmelový účinek mají mikrobiální polysacharidy uvolněné lýzou buněk po jejich odumření. Jsou odolnější vůči rozkladu jako rostlinné polysacharidy. Odolné se stávají po spojení s jinými minerály půd, např. Na bentonit, Na kaolin a nebo oxidy železa. Také komplexy kovů a polysacharidů podmiňují tvorbu vodo stálých agregátů. Aktivní činitel tvorby agregátů se tvoří i při rozkladu mycelia hub, přičemž se uvolňuje slizovitá hmota plazmy. Kromě

38 38 mikrobiálních metabolitů s účinkem tmelu mají i produkty rozkladu a systézy půdní organické hmoty humusové látky. Tvorbou půdní struktury si mikroorganismy vytvářejí svoje vlastní životní prostředí, ve kterém se formují mikrobní společenstva, realizuje se v nich mnohostranná činnost a tvorba vztahů k ostatním biotickým a abiotickým složkám ekosystému (Merendiak, 1987) Prostorové rozložení mikroorganismů v půdě Půda má heterogenní strukturu. Obsahuje množství drobných agregátů s mnoha póry, které jsou vyplněné půdním vzduchem a půdním roztokem. Agregáty jsou většinou složené z minerálních a organických částí. Jejich komplexy s se vzduchem a vodou představují mikrostanoviště půdních mikroorganismů. Minerální složka se skládá z drobných částic primárních a sekundárních minerálů, které mají obrovský povrch dosahující v jednom gramu až několik stovek čtverečních metrů. Na tomto povrchu jsou soustředěné zásoby živin jako humus, orgnanominerální koloidy, kationty K +,Ca 2+, Mg 2+. Hovoříme taky o tom, že minerální podíl agregátů je nosičem organických substrátů, které však nejsou na něm rovnoměrně rozložené. Organická složka agregátů představuje zdroj živin a energie pro mikroorganismy, které postupně agregáty osídlují.v našich kulturních půdách tvoří organická hmota 1-3% její hmotnosti a představuje velký povrch pro kolonizaci. Přímé mikroskopické pozorování z co nejméně porušeného stavu půdy ukázali, že naproti velkým počtům mikroorganismů v půdě jsou ještě velké povrchy agregátů neosídlené. Kolonizovány jsou jen desetiny, resp. setiny procent těchto povrchů, na kterých jsou buňky mikroorganismů absorbovány. Absorpce mikroorganizmů na pevnou fázi půdy má velký význam pro jejich životní činnost. Absorbované buňky vylučující exoenzymy lehčí využívají substrát, na kterém jsou fixované, přičemž vázací síly zároveň zabraňují jejich vyplavení. Adsorpce zvyšuje odolnost mikroorganismů vůči působení nepříznivých faktorů a chrání stabilitu procesů koloběhu látek v půdě. Adsorpce buněk na pevnou část půdy je přitom omezená výlučně na její organický podíl (humusové látky, odumřelé zbytky rostlin a živočichů). Minerální podíl se jeví pod mikroskopem, kromě výjimečných případů, jako chudě osídlené mikroorganismy, podobně jako tekutá fáze půdy. Počet mikroorganismů se v půdní vodě zvyšuje po přidání lehko rozložitelného organického materiálu. Tomuto prostředí se dobře přizpůsobuji mikroorganismy s aktivním pohybem.

39 39 Přímím mikroskopickým pozorováním agregátů se zjistilo, že mikroorganismy žijí na nich nebo v nich organizovaně. Bakterie se vyskytují jako jednotlivé buňky, nebo v převážné většině tvoří mikrokolonie skládající se z různého počtu individui, nejčastěji z 3-20, ale může být seskupených až 200 buněk. Kolonizace nových mikrostanovišť závisí ve velké míře od způsobu růstu, aktivního o pasivního pohybu mikroorganismů a vlastnosti prostředí. Aktivní pohyb pomocí bičíků umožňuje mikroorganismům vodní fáze půdy nebo po povrchu kořenů rostlin, přes kompaktní vrstvu půdy je pohyb omezený. Intenzivní přemísťování mikroorganismů se uskutečňuje pasivním způsobem, a to prouděním půdní vody, roznášení zárodků na povrchu těla půdní fauny nebo prostřednictvím jejich zažívacího traktu. Základní jednotkou celého mikrobiálního osídlení je životaschopný jedinec, jeho rozmnožováním vzniká populace jednoho druhu. Jednotlivé populace osídlují mikrostanoviště vedle sebe, takže obyvatelé jednoho agregátu patří k různým populacím. Mezi populacemi na jedné a na druhé straně se formulují velmi složité vztahy určující skladbu a činnost mikrobiálního společenstva - mikrobiocenózy. Každé mikrostanoviště představuje mikrozónu rozdílných vyživovacích a osídlovacích poměrů. Probíhá v nich diferenciovaná látková přeměna podmiňující změny fyzikálního, chemického a biologického stavu mikrostanoviště. Také samotné produkty látkového metabolismu stimulují nebo brzdí seskupování stejných nebo různých druhů populací mikroorganismů. Tak vznikají malé objemové jednotky půdy mikrostanovišť s rozličným zastoupením mikroorganismů. Podle velikosti a složenosti organického podílu probíhá v mikrostanovištích bouřlivá, nepřetržitá činnost mikrobiálních společenstev zahrnující houby, sporulující a nesporulujících bakterii a aktinomycet. Tuto mikroflóru, náročnou na dostatek energetického materiálu, nazýváme společenstvo eutrofních mikroorganismů. Po vyčerpání zdrojů potravy a energie činnost tohoto společenstva ustupuje, mikroorganismy přecházejí do stavu latentního až do nového přísunu substrátu a bouřlivé vzplanutí jejich aktivity. Tato činnost vede k vytváření zóny, která obsahuje malé množství lehko přístupných zdrojů energie. V této sféře se rozvíjí mikroflóra rostoucí při malém obsahu potravy v prostředí. Tyto organismy představují druhé společenstvo heterotrofních mikrobů, které roste a vyvíjí se při minimálních koncentracích organických látek v půdě a velmi ekonomicky je využívá. Nazýváme je společenstva oligotrofních mikroorganismů. Oligotrofní mikroflóra, představovaná především rodem Arthrobacter, tvoří základ bakteriálního společenstva půdy. Má velkou schopnost přežívat nepříznivé podmínky (sucho, nedostatek potravy) sníženou endogenní respiraci, často i vlastním kanibalismem. Představují 50-90% celkové

40 40 mikrobiálního osídlení půdy. Oligotrofní mikroflóra žije výlučně na pevné fázi půdy (Merendiak, 1987) Společenstva půdních mikroorganismů Půdní organismy tvoří biologicky aktivní část organické složky stanoviště. Jejich životní prostor z ekologického hlediska označujeme jako biotop a jejich životní společenstvo jako biocenózu. K půdním organismům patří rozdílní zástupci rostlinné, živočišné a mikrobiální říše, které označujeme společným názvem Edafon. Největší význam v biologickém koloběhu látek mají mikroorganismy, a to vzhledem k jejich: Velkému aktivnímu povrchu ke objemu biomasy. Vysokému stupni rozmnožování. Velkému počtu fyziologických skupin mikroorganismů s diferencovanou schopností rozkladu, přeměny a syntézy hmoty v půdním systému. Bakteriocenózi Patří mezi základní mikrobiální společenstva půdy. Jsou nejpočetnějším, nejdynamičtějším a biochemicky velmi významným prvkem komplexu mikrocenozi. Autotrofní bakterie Jsou v půdách zastoupeny poměrně malým počtem druhů. Jako zdroj energie využívají CO 2, čím se řadí do skupiny primárních producentů. Heterotrofní bakterie Tvoří podstatnou část bakteroicenozy. Plní úlohu reducentů, rozkládají odumřelou organický materiál, čímž vrací jeho jednotlivé prvky do biologického koloběhu. Mykocenózy Tvoří mikroskopické houby, mikromicety. Jsou relativně stabilnějšími společenstvy než bakteriocenozy. Spolu s heterotrofními bakteriemi vykonávají funkci reducentů. Houby tvoří mycelium, které rychle roste a vyznačuje se aktivním metabolizmem což jim umožňuje rychlou kolonizaci substrátu. Po využití substrátu se metabolizmus zpomaluje, probíhají

41 41 morfologické změny, tvoří se odpočinkové orgány a velké množství spor. Spory umožňují přežít nepříznivé podmínky a osídlení nového substrátu (Merendiak, 1987) Stanovení biologické aktivity půdy Konvenční metody založené na izolaci mikroorganismů z prostředí, jejich kultivaci na živných mediích, identifikace klasifikace podle zavedených taxonomických kriterii vycházejících z morfologických, fyziologických a biochemických vlastností se dnes jeví jako omezené. Takový přístup neumožňuje charakterizovat mikrobiální společenstvo jako celek ani charakterizovat jeho vnitřní a vnější vztahy a vazby. Odhaduje se, že informace získané konzervativními metodami se týkají jen asi 1-10% mikroorganismů daného společenstva. Už jen skutečnost, že laboratorní kultivace na bohatých mediích jsou pro oligotrofní mikroorganismy přírodního prostředí nevhodné, ukazuje, jak potřebná je aplikace metod dovolující studium v reálných in-situ podmínkách (Malachova, 2004). Nejčastěji se požívá orientační metoda stanovení tzv. dýchací mohutnosti půdy, která vyjadřuje množství uvolněného (vyprodukovaného) CO 2 z určitého množství půdního vzorku za časovou jednotku. Charakterizuje hlavně intenzitu činnosti heterotrofních půdních organismů (Pokorný, 2004). Díky technickému zdokonalení zažívají dnes ve studium diverzity mikrobiocenóz renesanci mikroskopických metod. Nové techniky umožňují vizualizaci a kvantifikaci buněk přímo ve vzorcích z prostředí. Jde zvláště o fluorescenční mikroskopii. Analýza mastných kyselin (fatty acid analysis). Tato metoda se používá ke studiu biomasy mikroorganismů. Dovoluje determinovat výskyt určitých skupin mikroorganismů pomocí specifických biomarkerů. Imunologické metody, se používají pokud je k dispozici specifické protilátky pro skupinu či serotyp mikrobů. Genetické metody, v dnešní době jsou považovány za velmi perspektivní. Jsou velice citlivé a specifické, jsou založeny na hybridizaci s fluorochromem označenou sondou (Malachova, 2004).

42 42 Metoda pomocí aplikace iontoměničových zrn in situ, která je detailně popsaná v kapitole Materiál a metody zpracování. K hodnocení mikrobiální aktivity lze efektivně vyžít také autoradiografických metod. Obvykle hodnotíme vznik radioisotopem označených metabolitů, např. u fotoautotrofních mikroorganismů tvorbu 14 CO 2, u desulfurikačních H 35 2 S, u metanových 14 CH 4, apod. Užití radioisotopů muže být zkombinováno s mikroautoradiografickými metodami, které dovolují sledovat jednotlivé buňky. V nárostech a sedimentech, kde je větší biomasa mikroorganismů, lze použít ke zhodnocení přítomnosti některých produktů látkového metabolismu tzv. chemotaxonomie, která využívá plynové chromatografie nebo hmotnostní spektrofotometre. K hodnocení aktivity mikroorganismů v mikrostanovištích* jsou také využívány mikroelektrody, kterými lze měřit ph, O 2, N 2 O, sulfidy a další látky v prostředí. * Půda je specifická tím, že mikroorganismy v ní obývají mikrostanoviště, tvořená agregáty vzniklými slepením minerálních částic a organických molekul. Volně žijících mikroorganismů je v půdním roztoku málo. Agregáty jsou tvořeny minerálními složkami, organickou hmotou a společenstvím mikroorganismů tvořeným různými populacemi žijícími na povrchu nebo uvnitř agregátů. Agregáty dosahují velikosti kolem 3 mm. Měřením pomocí mikroelektrod bylo zjištěno, že koncentrace kyslíku na povrchu a uvnitř agregátů je značně rozdílná. V mnoha případech to pak vede k tomu, že povrch o osídlen aerobními druhy, zatím uvnitř se nacházejí druhy anaerobní. Změny v podmínkách mikrostanovišť (živiny, voda, vzduch) se projevují rychlými dynamickými změnami ve složení jeho mikrospolečenstva. Agregáty, na než jsou reversibilně adsorbovány mikroorganismy, tvoří v půdě tzv. bioorganominerální komplexy, které se podílejí na dynamice živin v půdě. Různé typy půd se liší ve schopnostech vytvářet tyto komplexy. Mezi počtem mikroorganismů a specifickým sorpčním povrchem existuje přímá úměra (Malachova, 2004).

43 43 4. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1.Popis lokality Obr. 4 Pokusná parcelka + označení (foto: autor) Tyto pokusné plochy jsou umístěny blízko vrcholu Salatín (2047 m) v Západních Tatrách, (TANAP), na Slovensku. Porost který se nachází na těchto plochách paří do svazu Juncion trifidi. Zde bylo vytyčeno pět bloků (variant) a v každé variantě pět opakování. Dohromady tak bylo vytvořeno 25 pokusných ploch o rozměrech 1,5 x 1,5m, na kterých byly aplikovány třikrát během vegetačního období (29.května - 9.října 2007) různé experimentální dávky hnojiv. Jednalo se otyto varianty: 2N: 2g N m -2. rok -1 6N: 6g N m -2. rok -1 15N: 15g N m -2. rok -1 P: 6g P m -2. rok -1 aplikován KH 2 PO 4 v roztoku (s dodatkem 6,3g K.m -2. rok -1 ) C: kontrola (byla aplikována pouze voda ve stejném množství)

44 Iontoměničová pouzdra Disky, ve kterých je iontoměničové medium aplikováno do půdy, jsou vyrobeny z novoduru. V nitřní průměr disků je 70 mm a výška 5 mm. Zbylý prostor je uzavřen se shora a zespodu polyamidovou síťovinou Uhelon (Silk & Progres, typ 130 T, velikost oka 42µm). Iontoměničové medium dodává firma Purolite (katex purolite C100E, anex Purolite A520E). Před plněním iontoměničových disků se smíchá katex s anexem, při dodržení poměru 1:1. Tuto směs je třeba před plněním zkondiciovat. Kondiciování probíhá dle návodu výrobce opakovaným propíráním 10% roztokem NaCl a destilovanou vodou. Obr. 5 Iontoměničové disky (zprava prázdný, naplněný ionexi) (foto: autor) 4.3. Instalace iontoměniče in situ Tyto disky byly zapraveny do půdního profilu vodorovně ve hloubce 8-10 cm (hlubší zapravení není možné pro mělké půdní poměry) na výše zmíněné lokalitě v Tatrách a exponovány po dobu vegetačního období (29.května - 9.října 2007). Při zapravování disků do půdy je třeba dbát na co nejmenší porušení půdního profilu. Po ukončení vegetačního období byly disky vyjmuty a přepraveny do laboratoře k analýze. Při nadměrném množství dostupného dusíku dochází k jeho uvolňování až po naplnění všech přirozených možností sorpce, jak rostlinami tak mikroorganismy a právě tento dusík, který již nejsou organizmy schopny využít sorbujeme do intomeničových zrn. Pro získání objektivnějších výsledků byly disky aplikovány také do porostu kleče na západní přístupové cestě na vrch Salatín,

45 45. dále jsme disky aplikovaly do smrkového porostu kde již výškový rozdíl od hlavních pokusných parcelek představuje m. Obr. 6 Zapravený disk (foto: autor) Obr. 7 Vyjmutí disku (foto: autor)

46 Zpracování iontoměničů po expozici in situ v labolatoři V laboratoři byly ponechány disky k vysušení cca: 7 dní. Po vysušení byla zjištěna hmotnost anexkatexové směsi. Obsah disků byl nasypán do předem připravených polyetylenových lahviček. Podle hmotnosti ionexů bylo ke směsi přidáno 8-10ml destilované vody. Po přidání destilované vody došlo k nabobtnání ionexů. Následně se obsah lahviček doplnil na obsah 100 ml 10% roztokem NaCl. Přidaný roztok NaCl způsobil vytěsnění nasorbovaných amonných a nitrátových iontů z nitra ionexů. Uzavřené lahvičky se nechaly třepat, a po uplynutí doby 45 minut byly tyto vzorky připraveny k analýze Analýza iontoměničů - Roztok 10 % NaCl byl použit k resorbci zachycených iontů NH 4 a NO - 3. Amonné ionty byly v extrakčním roztoku stanoveny destilačně titrační metodou v alkalickém prostředí s MgO (Peoples et al., 1989). Pomocí indikátoru s HBO 2 byl amonný dusík jímán a následnou titrací HCl bylo zjištěno množství NH NO 3 ionty jsou stanoveny stejným způsobem s použitím Devardovy slitiny. Obr. 8 Destilační přístroj a titrační zařízení ( foto: autor)