Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách

Transkript

1 Odběr vzorků

2 Faktory ovlivňující růst mikroorganismů v potravinách Vnitřní : živiny, ph, redox potenciál, vodní aktivita,antimikrobiální aktivity Vnější: vlhkost, teplota, atmosféra Implicitní: specifická růstová rychlost, synergismus, antagonismus, komensalismus Technologické: krájení, mytí, balení, záření, pasteurizace

3 Podle nároků na výživu dělíme bakterie : Autotrofní - zdrojem jsou anorganické látky (zdroj uhlíku CO2, zdroj dusíku N 2, NH 4+, NO 3- ) Heterotrofní - zdrojem jsou organické látky, a to : a) prototrofní (jednoduché org.látky - ethanol, sacharidy a p.) b) auxotrofní (vyžadují složité org.látky - např. vitaminy, nukleotidy a p.)

4 Velká většina mikroorganismů je chemoorganotrofní chemoorganotrofie- Zdrojem energie je oxidace redukované organické látky. Tato látka je současně zdrojem uhlíku. Zdroj uhlíku a energie. A) komplexní B) definovaný

5 Metody stanovení mikroorganismů Kultivační: kvalitativní, kvantitativní (tuhé půdy, MPA) Mikroskopické Rychlé metody: biofyzikální biochemické imunochemické molekulárně biologické

6 kvantitativní Tuhé půdy : universální selektivní diagnostické MPA : most probably number

7 Selektivní pomnožení kvalitativní Potvrzující testy: biochemické sérologické

8 Rychlé metody stanovení Mikroskopické metody přímé epifluorescenční po filtraci Biochemické a biofyzikální Imunochemické Molekulární genetiky

9 Kultivační metody Umožňují udržení mikroorganismů (MO) v živém stavu, jejich růst a množení na živné půdě Pro detekci patogenů v potravinách využívány již déle než sto let Dodnes představují základ téměř všech metod pro zjišťování patogenů v potravinách

10 Obecná ustanovení Každé vyšetřeni, fyzikální, chemické či mikrobiologické, začíná odběrem vzorků. Na odběr vzorků bezprostředně navazuje jeho přeprava, uchovávání a zpracování v laboratoři. Vždy je třeba mít na paměti, že způsob odběru a přípravy vzorků může významně ovlivnit výsledky provedeného vyšetřeni.

11 Legislativa ČSN ISO 7218 Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení ČSN Mikrobiologické zkoušení poživatin, předmětů běžného užívání a prostředí potravinářských provozoven ČSN Způsob odběru vzorků pro mikrobiologické zkoušení Vyhláška MZČR 252/2004 Sb. (voda) ČSN ISO Jakost vod Nařízení komise (ES) č. 1441/2007 (č.2073/2005)

12 Typy rozborů Provozní Jakostní a hygienické Cílené

13 Odběr vzorků Při preventivní soustavné a namátkové kontrole hygienické a jakostní nezávadnosti, plnohodnotnosti, trvanlivosti a uchovatelnosti surovin, polotovarů a hotových výrobků Posuzování správnosti technologických postupů Posuzování úrovně hygieny a sanitace Stížnosti na jakost a uchovatelnost Vzniku onemocnění z poživatin a PBU

14 Postup mikrobiální analýzy Odběr vzorků Transport Příprava ke zkoušení - dokumentace - dekontaminace obalů - otevírání - navážky - ředění

15 Vzorek jednotka výrobku, suroviny nebo jiného zkoušeneho materiálu: originalni spotřebitelske baleni, určitý počet kusů u kusovych výrobků určitá hmotnost (objem) u nekusových výrobků a surovin. Pro mikrobiologické vyšetřeni se nejčastěji odebirají vzorky výchozich surovin, pomocných látek, fázové vzorky v průběhu výroby, dále stěry z provozní zařízení, hotové výrobky či skladované potraviny

16 Vzorkovaná jednotka 1 velkoobchodni originalni baleni (karton, bedna, balík, pytel, paleta atd.), 1 upravený celek, jde-li o kusové produkty, celá zásilka, jde-li o sypané či jiné volně ložené produkty (odebírá se 5 vzorků z různých částí zásilky), 1 nádrž, tank, konev či jiná nádoba, jde-li o produkty tekuté

17 Odběr vzorků Senzorické hodnocení (vzhled, vůně) Rozdělení do tří kategorií Nejdříve odběr vzorků pro mikrobiologické zkoušení!!!!!! Odběr jednotlivých vzorků směsné či průměrné Pozor na množství vzorku!!!!!!

18 Odběr vzorků Odběr vzorků provádí tzv. oprávněná osoba, která je: seznámena se zásadami správného vzorkování nese zodpovědnost za správnost provedení odběru

19 Odběr vzorků Kdo? oprávněná osoba Jak hodnotit? Senzorika bez?????? 1) výrobky, které nemají zjevnou mikrobiální kontaminaci 2) výrobky podezřelé vykazují známky způsobené možnou mikrobiální kontaminací- voda, plyn 3) výrobky zkažené, se zjevnými známkami mikrobiálního kažení- osliznutí, hnití, plesnivění, kysání, kvašení, změna barvy apod. (Tato skupina vzorků se běžně pro kontrolní účely mikrobiologicky nevyšetřuje).

20 Vzorkování v rámci výkonu státního zdravotního dozoru Náhodný výběr jednoho vzorku ze vzorkovaného celku (určitý pokrm) Cílený odběr se provádí v případech EPI souvislosti Odděleně se vzorkují: součástí pokrmu suroviny rozpracované pokrmy a polotovary

21 Vzorkování v rámci výkonu státního zdravotního dozoru Vzorek je: Podávaná porce Kusový výrobek (při odběru vzorků na průkaz bakteriálních toxinů se odebere větší množství vzorku) U vícesložkových pokrmů lze odebrat všechny součásti v poměru, v jakém jsou zastoupeny nebo odděleně jako několik vzorků

22 Odběr vzorků Při úřední kontrole tj. hodnocení, zda daná šarže (dávka) odpovídá stanoveným mikrobiologickým požadavkům, se odebírá zpravidla 5 vzorků. U vybraných skupin výrobků může byt tento počet ještě vyšší (upravuje platná evropská legislativa týkající se mikrobiologických kritérií pro potraviny).

23 Odběr nekusových vzorků Pokud není odebíráno celé spotřebitelské balení, musí být ke vzorkování použito výhradně: sterilní náčiní z korozivzdorné oceli (sondy, nebozezy, naběračky, lžíce, nože, pinzety, atd.) skla (pipety), které se předem balí do hliníkové fólie a sterilizují v horkovzdušném sterilizátoru či autoklávu. kovové nástroje lze při odběru průběžně sterilizovat 70% etanolem a opálením v plameni.

24 Odběr nekusových vzorků Vzorky se odebírají do sterilních, dostatečně velkých nádob či obalů prachovnic se zabroušenou zátkou zavařovacích sklenic s uzávěrem twist off fólií (alobal) polyetylénových sáčků sterilního nepropustného papíru.

25 Hmotnost odebíraných vzorků Odebraný počet vzorků musí vystihovat celou vyšetřovanou partii tak, aby bylo možno posoudit povahu, stupeň a rozsah mikrobiálního znečištění. Při odběru vzorků pro mikrobiologické vyšetření se neodebírají vzorky průměrné (tj.směsné).

26 Hmotnost odebraného vzorku musí být dostatečná pro provedení všech předepsaných vyšetření Odebíráme-li vzorek výrobku ve spotřebitelském balení, potom: a) odebereme 1 spotřebitelské balení, pokud jeho hmotnost (objem) dosahuje požadované hmotnosti; b) pokud hmotnost (objem) spotřebitelského balení výrazně převyšuje potřebné množství, stačí odebrat jako vzorek poměrnou část spotřebitelského balení, nesmí tím však být ohroženo dosažení účelu vyšetření; c) pokud hmotnost (objem) spotřebitelského balení je nižší než požadované množství, odebereme potřebný počet spotřebitelských balení

27 Potřebná množství vzorků pro mikrobiologické vyšetření. Druh vzorku tekuté koncentráty kašovité vejce pevné drůbež sušené pitná voda Množství 300 ml 150 g 250 g 3 ks 300 g 1 ks 150 g 500 ml

28 Odběr vzorků závisí na balení a konsistenci vzorku nejméně 1 kus u výrobků ve spotřebitelském balení nejméně však podle charakteru vzorku g (ml); až 500 g(ml) u tekutých, kašovitých, sypkých a malých kusových výrobků g(ml) výrobků ve velkých kusech nebo velkých baleních jednotkách.

29 Způsob odběru tekuté a kašovité promíchat, u vyšších objemů odběr ze tří vrstev sypké promíchat, velké objemy z různých míst střední a velké kusové výrobky: odkrojení odřezání z hloubky použití vzorkovače ASEPTICKÁ PRÁCE!!!!!!!!

30 Označování vzorků O odběru musí být vyhotoven protokol o odběru vzorků. Současně se vyplní žádanka o laboratorní vyšetření, ve které je nutno specifikovat, jaká konkrétní vyšetření mají být u vzorku provedena.

31 Protokol o odběru vzorků Číslo protokolu o odběru vzorků Účel mikrobiologického rozboru Místo, datum, hodina odběru Přesný název vzorkovaných výrobků (druh, typ obalu, hmotnost) Název výrobce, datum (hodina) výroby Název dodavatele, datum dodávky Posouzení vnějšího vzhledu, obalů, závady Způsob, počet, hmotnost odebraných vzorků Adresa institucí, kterým budou sděleny výsledky Způsob úchovy vzorků do doby mikrobiologického rozboru Jména a příjmení, funkce a podpisy osob, které odběr prováděly a které byly odběru přítomny

32 Přeprava vzorků Zvláštní pozornost musí být věnována zachování doporučených teplot úchovy v průběhu přepravy jednotlivých druhů vzorků: stabilní výrobky - okolní teplota čerstvé a chlazené výrobky - rozmezí teplot 0-4 o C zmrazené a hlubokozmrazené výrobky - teploty pod -18 o C pasterované a podobné výrobky - rozmezí teplot 0-4 o C zkažené jednotky stabilních výrobků - rozmezí teplot 0-4 o C rychle se kazící potraviny - např. vnitřnosti, čerstvé ryby musí být při přepravě uchovávány při teplotě v rozmezí 0-2 o C

33 Transport mrazené výrobky v isotermických obalech Konzervy - nemrazit obsah - pokojová teplota ostatní vzorky při 5 o C maximální doba přepravy 6 hodin

34 Příjem a uchovávání vzorků v laboratoři Při příjmu vzorků v laboratoři se: posoudí jejich stav zkontroluje se, zda souhlasí údaje uvedené v průvodní dokumentaci provede se záznam o příjmu vzorků do laboratorního deníku. Obecně musí být o vzorcích přijatých do laboratoře vedena dokumentace tak, aby byl monitorován jejich postup od okamžiku přijetí až do doby zpracování protokolu o výsledku zkoušení.

35 Typy vzorkování Základem vzorkování je vytvoření vzorkovacího plánu, podle kterého bude sledovaný soubor potravinářských výrobků sledován. Komplexní plán musí obsahovat následující prvky: a) Jaký mikrob nebo skupina mikrobů bude sledovaná; b) Počet testovaných vzorků (n); c) Testovací metoda (metody); d) Mikrobiální limit (y); m & M - přijatelný (< m) - mezní hodnota (>m a > _ M) - nepřijatelná hodnota (>M) e) Počet vzorků spadajících do shora uvedených kategorií Pro vzorkování užívané v mikrobiologii se užívá dvouparametrický a tříparametrický plán. Podle těchto schemat se ze zkoumaného souboru odebírá dané množství vzorků.

36 Zápis do laboratorního deníku musí obsahovat pořadové číslo záznamu datum a hodinu příjmu vzorků druh, množství a charakteristiku vzorků údaje o vzorkování (datum, způsob vzorkování, konzervace, atd.) jméno a adresu majitele vzorků datum a hodinu zahájení rozboru požadovaný rozsah vyšetření vzorků způsob přípravy vzorků k rozboru (hmotnost navážek a stupeň ředění, zjištěné mikrobiologické ukazatele) jméno osoby, která vyšetření provedla případně další nezbytné údaje.

37 Příprava vzorku k rozboru - dokumentace - dekontaminace - příprava navážek - zřeďování vzorků

38 Dokumentace Protokol o odběru Laboratorní deník: - datum a hodina příjmu - datum event. hodina zahájení rozboru - testované ukazatele - počet vzorků - způsob přípravy vzorku (množství, ředění)

39 Protokol o odběru číslo místo datum hodina způsob údaje o výrobku konrétní osoba podpisy

40 Protokol o rozboru - senzorické hodnocení - živné půdy - způsob očkování - teplota a doba inkubace - vyhodnocení výsledků - závěr

41 Dekontaminace obalů Hermetické obaly (sklo, kov, plast) -odstranění -omytí detergentem -oplach čistou vodou -osušení Nehermetické obaly - otření sterilním tamponem s ethanolem

42 Kontrola hermetičnosti plechovka se ponoří do vody cca 85 o C na 5-7 min plechovka se ponoří do převařené, schlazené vody (var. 15 min) v exikátoru skleněné obaly: filtrační papír kolem uzávěru

43 Zmrazené výrobky 18 hodin při teplotě 2-5 o C 15 minut při teplotě 35 o C

44 Zpracování vzorku Do 3 hodin Do 24 hodin Do 48 hodin Skladování!!!!

45 Zřeďování vzorků fysiologický roztok s peptonem (0,85%NaCl + 0,1%peptonu, ph 7) Pozor Chladový šok Teplota zřeďovacího = teplota navážky tuky 37 o C psychrofilní, o C ostatní Hypertonické roztoky bez NaCl Halofilni, osmofilní zvýšený obsah NaCl

46 Zřeďování vzorků Výchozí ředění Tekuté, tuhé-nerozpustné 1:9 Tuhé rozpustné 1:10 Botnající 1:9, sterilní olej a poté ředící roztok Ojedinělé mikroorganismy - bez ředění Tekuté, filtrovatelné membránová filtrace DOBA MANIPULACE SE VZORKEM: 30 minut!!!!!

47 Deskové metody a) Zalévání do pevných půd 2 misky, 1 ml vzorku, vytemperovaná půda, 4-5mm vrstva rozmíchat!!!!!! b) Roztěr na povrch půd 2 misky, předsoušení půd, 0,1-0,2 ml vzorku

48 Membránová filtrace Vzorky s malým množstvím resuspendovaných částic se filtrují nejdříve přes filtr o průměru porů 4µm Podle zjišťované skupiny mikroorganismů přes filtr : bakterie 0,3 µm