Universita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra fyziologie rostlin

Transkript

1 Universita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra fyziologie rostlin Úloha karotenoidů v průběhu ontogeneze vyšších rostlin a adaptace ke stresovým podmínkám Souhrn disertační práce Daniel Haisel Praha 2009

2 Školitel: RNDr. Jana Pospíšilová, CSc. Ústav experimentální botaniky AVČR, v.v.i. Laboratoř stresové fyziologie Na Karlovce 1a, Praha 6 Školitel-konzultant: RNDr. Marie Kočová, CSc. Universita Karlova, Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie Albertov 8, Praha 2 1

3 2

4 Obsah Obsah 3 1. Úvod 5 2. Cíle práce 7 3. Metody 8 4. Výsledky Karotenoidy během ontogeneze rostlin při kultivaci in vitro a po 9 převedení do ex vitro podmínek 4.2. Karotenoidy v průběhu vodního stresu a následné rehydratace Závěry Seznam publikací v disertační práci Publikační činnost autora 17 3

5 4

6 1. Úvod Rostlinné karotenoidy jsou žluté, oranžové nebo červené pigmenty terpenoidního charakteru, které nejsou rozpustné ve vodě, ale v tucích. Z toho vyplývá jejich umístění na membránách chloroplastů a chromoplastů. Ve fotosyntetických pletivech je jejich barva často překryta chlorofylem, ale můžeme je pozorovat v pozdním stadiu vývoje listů, v květech, v plodech a také v kořenech. Z rostlinného materiálu byl poprvé izolován -karoten již počátkem 19. století a nedlouho poté byly v podzimních listech identifikovány i další fotosyntetické karotenoidy lutein, neoxanthin, violaxanthin a zeaxanthin. Kromě vyšších rostlin jsou karotenoidy přítomné též v buňkách řas a některých mikroorganizmů. Přírodní produkce karotenoidů se ročně pohybuje v řádu stovek milionů tun. Poněvadž tyto pigmenty mají široké praktické uplatnění především jako barviva a léčiva, syntetizují se v současnosti také uměle nebo se pro jejich výrobu využívá moderních metod genového inženýrství. Karotenoidy se vyskytují též v živočišné říši (např. -karoten ve vaječných žloutkách, astaxanthin v rybách způsobující oranžové až červené zbarvení nebo peří ptáků zbarvené nejčastěji ketokarotenoidy), ale jsou také nenahraditelnou součástí stravy člověka a dalších savců jako provitamin A v poslední době se jim připisuje značný význam při ochraně před některými typy nádorových onemocnění. Lutein a zaexanthin jsou používány jako účinná léčiva pro pacienty s makulární degenerativní nemocí. V tělech živočichů se však karotenoidy nesyntetizují a musí být proto přijímány ve formě rostlinné potravy. Struktura karotenoidů je odvozena z tetraterpenoidního skeletu, který je u nich tvořen dvěma iononovými kruhy spojenými 18-ti uhlíkovým řetězcem konjugovaných dvojných vazeb, který je díky absorpci ve viditelné části spektra zodpovědný za jejich barevnost (odtud jejich název chromofor). Karotenoidy rozdělujeme na karoteny a xantofyly. Karoteny jsou uhlovodíky bez dalších substituentů, z nichž je v rostlinách nejvíce zastoupen -karoten a v menší míře též -karoten, které se od sebe liší pouze polohou dvojné vazby v jednom z iononových kruhů. Xantofyly mají na svém skeletu různé substituenty, u vyšších rostlin nejčastěji hydroxy- a epoxy-skupiny a jsou většinou odvozeny od -karotenu. Výjimkou je lutein, který je odvozen z -karotenu. U řas a fototrofních bakterií mohou být na základním skeletu navázané též acetylové, aldehydové, keto-, carboxy-, carbomethoxy- a methoxyskupiny. V chromoplastech plodů a květů se karotenoidy vyskytují jako volné pigmenty nebo estericky vázané na mastné kyseliny. Rostlinné karotenoidy mají základní funkce jako světlosběrné pigmenty při fotosyntéze, ochranu proti fotoinhibici, strukturní funkci v pigment-proteinových komplexech a jako prekurzor biosyntézy kyseliny abscisové. Světlosběrná funkce karotenoidů je pro rostliny nezbytná kvůli absorpci v modré oblasti světelného záření. Absorbovaná energie je dále předávána chlorofylu. U vyšších rostlin tuto funkci plní převážně lutein a neoxanthin. 5

7 Ochranná funkce karotenoidů ve vyšších rostlinách je hlavně na dvou úrovních. V reakčním centru obou fotosystémů rostlin a řas má důležitou úlohu -karoten, který chrání fotosyntetický aparát před fotooxidativním poškozením zhášením tripletového stavu chlorofylu a singletového kyslíku. Druhým ochranným mechanismem ve vyšších rostlinách je xantofylový cyklus, důležitý proces probíhající na thylakoidní membráně. Během stresových podmínek je světlosběrný karotenoid violaxanthina deepoxidován přes antheraxanthin na zeaxanthin, který má ochrannou funkci spočívající v přeměně nadbytečné energie singletového chlorofylu na teplo. Tato enzymaticky řízená reakce je vratná a po překonání stresových podmínek je zeaxanthin zpětně epoxidován na violaxanthin. Strukturní funkci v pigment-proteinových komplexech plní všechny karotenoidy přítomné ve vyšších rostlinách. Navázání pigmentů způsobuje konformační změny pigmentproteinových komplexů fotosyntetického aparátu a umožňuje tím jejich stabilizaci a plnou funkčnost. Každý z karotenoidů má svojí specifickou funkci a tomu odpovídá i jejich umístění v pigment-proteinových komplexech, např. lutein a neoxanthin jsou ve světlosběrných komplexech a -karoten v reakčním centru fotosystému. Biosyntéza kyseliny abscisové. Karotenoidy neoxanthin a violaxanthin jsou prekurzory při biosyntéze kyseliny abscisové, rostlinného hormonu, který se zapojuje do kontroly vodního režimu rostlin a mnoha dalších procesů. Navzdory velkému množství literatury věnující se karotenoidům, která vyšla od jejich objevení do současnosti, zůstává stále ještě mnoho nevyřešených otázek. V předložené disertační práci se pokusím alespoň na některé z nich odpovědět. 6

8 3. Cíle práce Cílem této disertační práce bylo zjistit, jaké úlohy mají karotenoidy v průběhu ontogeneze rostlin rostoucích v odlišných podmínkách prostředí a v odpovědi rostlin na stresové podmínky. Experimenty, které jsou součástí předložené práce, se postupně snažily zodpovědět především tyto otázky: 1) Jak se mění složení karotenoidů a jejich funkce v průběhu kultivace rostlin v in vitro podmínkách a po jejich převedení do ex vitro podmínek? 2) Je přítomnost sacharózy v mediu nezbytná pro dostatečnou tvorbu karotenoidů? 3) Jak ovlivňují podmínky kultivace in vitro (ozářenost, koncentrace sacharózy, koncentrace CO 2 ) schopnost aklimace rostlin do ex vitro podmínek? 4) Mohou karotenoidy dostatečně ochránit rostliny před fotoinhibicí při přenosu z nízké ozářenosti in vitro na podstatně vyšší ozářenost ex vitro? 5) Jaká je úloha karotenoidů v ochraně přirozeně rostoucích rostlin proti možné fotoinhibici vznikající v důsledku vodního stresu? 6) Jak tvorbu a funkci karotenoidů ovlivňují fytohormony, především kyselina abscisová nebo cytokininy? 7) Jak se s vodním stresem a následnou možnou fotoinhibicí vyrovnávají geneticky modifikované rostliny se zvýšenou produkcí cytokininů? 7

9 3. Metody Rostlinný materiál Rostlinný materiál a kultivační podmínky jsou uvedeny pro větší přehlednost u příslušných kapitol výsledků. HPLC fotosyntetických pigmentů Fotosyntetické pigmenty byly 2x extrahovány acetonem ze vzorků listů (6 cm 2 ) a po centrifugaci byly oba čiré suprnatanty spojeny. Po vysušení proudem plynného dusíku byly pigmenty rozpuštěny v 0,3 cm 3 acetonu a analyzovány pomocí HPLC, částečně na starší a částečně na nové sestavě. Starší sestava HPLC Sestava Spectra-Physics (San José, USA) tvořená absorpčním detektorem Spectra 100 s nastavenou vlnovou délkou 445 nm, pumpou s mísičem gradientu SP8800 a integrátorem ChromJet. K dělení pigmentů byla použita kolona s reverzní fází Sepharon SGX C18 (Tessek, Praha) o rozměrech mm a průměru částic 5 m. Dávkovací smyčka pro nanesení vzorků má objem 0,01 cm 3. Mobilní fází o průtokové rychlosti 1 cm 3 min -1 byl lineární gradient mezi směsí acetonitril:metanol:voda (80:12:6) a metanolem v čase 8-12 min. Celková délka chromatografie byla 30 min. Novější sestava HPLC Sestava ECOM (Praha, Česká republika) složená z absorpčního detektoru s nastavenou vlnovou délkou 445 nm, gradientové pumpy a autosampleru. K dělení pigmentů byla použita kolona s reverzní fází (Watrex Nucleosil C18, 5 m particle size, mm, ECOM, s r.o., Prague, Czech Republic). Dávkovací smyčka pro nanesení vzorků má objem 0,01 cm 3. Mobilní fází o průtokové rychlosti 1 cm 3 min -1 byl lineární gradient mezi směsmi acetonitril:metanol:voda (80:12:10) a metanolem:ethylacetát (95:5) v čase 2-6 min. Celková délka chromatografie byla 25 min. 8

10 4. Výsledky 4.1. Karotenoidy během ontogeneze rostlin při kultivaci in vitro a po převedení do ex vitro podmínek Vliv ozářenosti a přítomnosti sacharózy v mediu Rostliny pěstované in vitro bývají poškozovány fotoinhibicí při nižších hodnotách ozářenosti než rostliny pěstované v klimatizovaných boxech, sklenících nebo volné přírodě. V následujících pokusech jsme se snažili zjistit, zda rostliny pěstované mixotrofně se lépe vyrovnávají s nadbytkem světelné energie než rostliny pěstované plně autrofně. Sledovali jsme rozdíly v ontogenezi in vitro pěstovaných rostlin Nicotiana tabacum L. cv. Samsun při dvou hodnotách ozářenosti 50 (LL) a 200 (HL) mol m -2 s -1 a bez sacharózy (0%) nebo se sacharózou (3%) v médiu. Získali jsme tím 4 varianty pěstování rostlin tabáku 0%LL (kontrola), 0%HL, 3%LL a 3%HL. Obsah -karotenu, pigmentu nacházejícího se převážně v reakčních centrech obou fotosystémů, u všech variant pěstování v období od 14. do 42. dne kultivace klesal výrazněji u rostlin pěstovaných za vyšší ozářenosti. Zde nebyl zaznamenán větší vliv sacharózy na průběh ontogeneze. U světlosběrného pigmentu luteinu docházelo u variant 3%HL a 3%LL k mírnému nárůstu jeho obsahu do 36. dne kultivace a k mírnému snížení 42. den kultivace. U varianty 0%LL a zejména 0%HL docházelo ke snižování obsah luteinu po celou dobu kultivace. Obsah neoxanthinu se u varianty 3%HL zvyšoval po celou dobu kultivace, u varianty 3%LL se prakticky neměnil a u variant 0%LL a 0%HL se snižoval podobně jako obsah luteinu. U rostlin pěstovaných za vyšší ozářenosti se tedy obsah světlosběrných pigmentů v přítomnosti sacharózy zvyšoval, zatímco u rostlin bez sacharózy v médiu jsme zaznamenali jejich pokles již od počátku sledovaného období. Obsah pigmentů xantofylového cyklu se u rostlin pěstovaných při nižší ozářenosti příliš neměnil, k poklesu došlo až mezi 36. a 42. dnem. Naproti tomu při vyšší ozářenosti byl sice jejich obsah mezi 14. a 22. den kultivace vyšší než u variant 0%LL a 3%LL, ale po celou dobu kultivace se jejich obsah snižoval (výrazněji u rostlin pěstovaných bez sacharózy) a po 42. dnech byl nejnižší u varianty 0%HL. Stupeň deepoxidace (DEPS, [(Zea+0,5*Ant)/(Zea+Ant+Vio)]) byl výrazně vyšší při vyšší ozářenosti a u všech variant se snižoval v průběhu kultivace s vyjímkou varianty 0%LL kde mírně narůstal. Stupeň deepoxidace vztažený k obsahu chlorofylu (DEPSC, [(Zea+0,5*Ant)/(Chl a+b)]), byl výrazně 9

11 vyšší u varianty 0%HL než u ostatních variant. Během ontogeneze se DEPSC snižoval s vyjímkou varianty 0%LL podobně jako DEPS. Na obsah a funkci karotenoidů v průběhu ontogeneze v in vitro podmínkách měla tedy vliv jak hladina ozářenosti, tak i přítomnost nebo nepřítomnost sacharózy v médiu. Ochranná funkce pigmentů xantofylového cyklu se projevila jejich zvýšeným obsahem při kultivaci za vyšší ozářenosti a výraznější pokles u rostlin pěstovaných bez sacharózy byl pravděpodobně způsoben vyšší mírou poškození těchto rostlin, což potvrdily i výsledky měření jiných fotosyntetických parametrů, například obsahu chlorofylu, apod. Aklimace rostlin pěstovaných in vitro k ex vitro podmínkám Pro studium vlivu in vitro podmínek na aklimaci rostlin v nových ex vitro podmínkách jsme použili pokusný model z předchozí kapitoly. Rostliny Nicotiana tabacum L. cv. Samsun byly pěstovány 35 dní in vitro za 4 různých výše uvedených podmínek 3%HL, 3%LL, 0%HL a 0%LL. Rostliny z každé z těchto variant pěstování in vitro jsme přesadili a kultivovali ex vitro při dvou různých hladinách ozářenosti 200 a 700 mol m -2 s -1. Změny v obsahu fotosyntetických pigmentů jsme sledovali 1, 2, 5 a 7 dní po přesazení. Obsah -karotenu se po přesazení ex vitro příliš neměnil u rostlin předpěstovaných na sacharózovém médiu, zatímco u rostlin pěstovaných in vitro bez sacharózy došlo k jeho nárůstu, výrazněji u 0%HL, o 35% při 200 mol m -2 s -1 a o 25% při 700 mol m -2 s -1. Světlosběrné karotenoidy lutein a neoxanthin zaznamenaly u sacharózových variant v prvních dvou dnech kultivace při ozářenosti 200 mol m -2 s -1 pokles a následně až od sedmého dne nárůst nad úroveň při přesazení. Při 700 mol m -2 s -1 byl stejný průběh pouze u 3%LL, zatímco u 3%HL se obsah luteinu téměř neměnil a obsah neoxanthinu se zvýšil o 50%. Bezsacharózové varianty 0%LL a 0%HL zaznamenaly při obou hodnotách ozářenosti postupný nárůst obsahu světlosběrných karotenoidů, který po sedmi dnech činil 30-50%, pouze u 3%HL došlo při 700 mol m -2 s -1 nejprve k poklesu obsahu těchto pigmentů o 5%. Obsah pigmentů xantofylového cyklu se po přesazení zvýšil během sedmi dnů u obou LL variant při ozářnosti ex vitro 200 mol m -2 s -1 o 15% a při 700 mol m -2 s -1 o 35-40%. Naproti tomu obě HL varianty se od sebe výrazně lišily zatímco u 3%HL se obsah pigmentů xantofylového cyklu při ozářenosti 200 mol m -2 s -1 téměř neměnil a při 700 mol m -2 s -1 se zvýšil o 10%, u 0%HL došlo během 7 dní kultivace ex vitro k nárůstu o 60-70%. Tyto výsledky ukázaly, že odlišné podmínky in vitro měly za následek i rozdílné změny ve složení karotenoidů po přesazení ex vitro. Zatímco u -karotenu a světlosběrných karotenoidů měla na rozdíly vliv hlavně přítomnost nebo nepřítomnost sacharózy v in vitro podmínkách, u pigmentů xantofylového cyklu bylo totéž pozorováno pouze u HL variant, kdežto u LL variant se vliv sacharózy neprojevil. Celkově však došlo po sedmidenní kultivaci ex vitro ke snížení rozdílu v obsahu karotenoidů mezi jednotlivými variantami pěstování in vitro. 10

12 Vliv CO 2 na obsah karotenoidů V rámci studia vlivu obsahu CO 2 v in vitro podmínkách na obsah karotenoidů jsme ke kultivaci rostlin Nicotiana tabacum L. použili dva typy kultivačních nádob pečlivě utěsněné skleničky (G-rostliny) a polykarbonátové nádoby s víčkem propustným pro plyny (Magenta GA-7, M-rostliny). V pevně uzavřených skleničkách docházelo hlavně ve světelné fázi fotoperiody k poklesu obsahu CO 2 vlivem jeho spotřeby při fotosyntéze, kdežto v Magentách se CO 2 pravidelně doplňoval z okolí. Nevýhodou Magent však bylo rychlejší vysychání kultivačního média, což jsme se snažili omezit častějšími pasážemi. Po 6-ti týdenní kultivaci in vitro jsme pomocí HPLC zjistili obsah jednotlivých karotenoidů. V obsahu světlosběrného karotenoidu neoxanthinu se rostliny z obou typů pěstování téměř nelišily, naproti tomu obsah dalšího světlosběrného karotenoidu luteinu byl o 7% vyšší u M-rostlin. Obsah -karotenu byl rovněž vyšší u M-rostlin, ale daleko výrazněji, o 35%. Naproti tomu obsah pigmentů xantofylového cyklu byl vyšší u G-rostlin o 30% a zároveň byl vyšší i stupeň deepoxidace, ale pouze o 14%. Obsah pigmentů xantofylového cyklu vztažený na obsah chlorofylu byl u G-rostlin téměř dvojnásobný oproti M-rostlinám. Z uvedených výsledků vyplývá, že nedostatek CO 2 během in vitro kultivace byl pro G-rostliny větším stresem, než eventuelní úbytek vlhkosti u M-rostlin. Vliv CO 2 a kyseliny abscisové na aklimaci rostlin k ex vitro podmínkám V první sérii pokusů byl sledován pouze vliv zvýšené koncentrace CO 2 na 1200 mg m -3 (CE) v průběhu 28-denní aklimace rostlin k ex vitro podmínkám. Po převedení do ex vitro podmínek se obsah karotenoidů zvyšoval pouze u rostlin pěstovaných při normální koncentraci CO mg m -3 (CA). Proto ve srovnání s rostlinami rostoucími při (CA), rostliny aklimované při CE měly nižší obsah -karotenu, luteinu, neoxanthinu i pigmentů xantofylového cyklu, ale vyšší stupeň jejich deepoxidace. Při dalším, podrobnějším studiu vlivu obsahu CO 2 na aklimaci rostlin k ex vitro podmínkám jsme použili rostliny kultivované in vitro při nízké (G-rostliny) a normální koncentraci CO 2 (M-rostliny). Kromě vlivu CO 2 byl v těchto pokusech sledován i vliv aplikace ABA s cílem zabránit počátečnímu vadnutí rostlin. Po 6-ti týdenní kultivaci in vitro byly rostliny přesazeny do květináčků s pískem a část zalita 5 M roztokem ABA a část destilovanou vodou. Rostliny byly následně pěstovány v různých koncentracích CO 2 (CA a CE) po dobu 28 dní. Obsah fotosyntetických pigmentů byl analyzován 2, 7 a 28 dní po převedení do ex vitro podmínek. 11

13 Celkový obsah karotenoidů byl u M-rostlin vyšší než u G-rostlin pouze u rostlin zalitých roztokem ABA. Během kultivace ex vitro se rozdíly mezi G- a M-rostlinami postupně snižovaly. Obsah pigmentů xantofylového cyklu byl vyšší u G-rostlin a podobné rozdíly byly zjištěny i po ex vitro kultivaci. Jejich obsah byl vždy nižší při zvýšené koncentraci CO 2 během ex vitro kultivace a nejnižší byl u M-rostlin zalitých ABA rostoucích v podmínkách CE. Naproti tomu DEPS byl podobný u G- a M-rostlin, vyšší při pěstování v CE Karotenoidy v průběhu vodního stresu a následné rehydratace Vliv kyseliny abscisové a benzyladeninu na fotosyntetické pigmenty v průběhu vodního stresu a rehydratace V rámci studiu úlohy rostlinných hormonů v odpovědi rostlin na vodní stres jsme sledovali vliv kyseliny abscisové (ABA) a benzyladeninu (BA) na fotosyntetické pigmenty, fluorescenci chlorofylu a ultrastrukturu chloroplastů u čtyř druhů rostlin (Phaseolus vulgaris, Nicotiana tabacum, Beta vulgaris a Zea mays) během vodního stresu a následné rehydratace. 100 M ABA nebo 10 M BA byly přidány do substrátu bezprostředně před nástupem vodního stresu, kontrolní rostliny byly zality vodou. V průběhu vodního stresu jsou karotenoidy důležité zejména jako prekurzory biosyntézy ABA a pro ochranu fotosyntetického aparátu před oxidačním stresem vzniklým v důsledku nadbytku energie světelného záření. Celkový obsah karotenoidů (Car) byl nejvyšší u kukuřice a nejnižší u fazolu. U všech kontrolních rostlin docházelo ke snížení obsahu Car během vodního stresu a tento trend pokračoval i po rehydrataci. Naproti tomu u rostlin ošetřených ABA nebo BA docházelo během vodního stresu k nárůstu obsahu karotenoidů, a tento nárůst byl u fazolu a cukrové řepy výraznější po aplikaci ABA, zatímco u kukuřice a tabáku po aplikaci BA. U všech hormony ošetřených rostlin došlo ke snížení obsahu karotenoidů po rehydrataci, ale jen na úroveň před stresem, tedy jejich konečný obsah byl výrazně vyšší než u kontrolních rostlin. Obsah světlosběrných pigmentů luteinu a neoxanthinu se snižoval u kontrolních rostlin během vodního stresu a tento pokles u luteinu pokračoval i po rehydrataci, zatímco obsah neoxanthinu po rehydrataci narůstal. U rostlin ošetřených ABA a BA docházelo k nárůstu obsahu neoxanthinu s výjimkou tabáku ošetřeného BA, kde ke změně obsahu nedošlo. Naproti tomu se obsah luteinu u rostlin ošetřených hormony příliš neměnil nebo mírně snižoval. Po rehydrataci se obsah neoxanthinu a luteinu snižoval u všech rostlin. Obsah pigmentů xantofylového cyklu se výrazněji zvyšoval během vodního stresu u rostlin ošetřených ABA a BA, nejvíce u kukuřice, zatímco u kontrolních rostlin byl tento 12

14 nárůst menší, u fazolu a tabáku téměř nulový. Po následné rehydrataci došlo ke snížení obsahu pigmentů xantofylového cyklu, u fazolu dokonce pod úroveň kontrolních rostlin. Naproti tomu u kukuřice byl po rehydrataci jejich obsah na dvojnásobné úrovni oproti nestresovaným rostlinám. U všech rostlin byl po rehydrataci obsah pigmentů xantofylového cyklu vyšší u rostlin ošetřených ABA než u rostlin ošetřených BA. Dosažené výsledky potvrdily naši hypotézu, že ABA a BA mohou pozitivně ovlivnit odpověď rostlin na vodní stres. Stupeň deepoxidace pigmentů xantofylového cyklu (DEPS) se u kontrolních rostlin během vodního stresu zvýšil, nejvíce u kukuřice. Nárůst stupně deepoxidace jsme pozorovali také u rostlin fazolu, cukrové řepy a tabáku ošetřených před stresem ABA a BA. Po rehydrataci zůstal stupeň deepoxidace zvýšený u všech rostlin ošetřených vodou, ale u rostlin cukrové řepy a tabáku ošetřených ABA a BA klesal, stejně jako u rostlin fazolu ošetřených BA. Stupeň deepoxidace vztažený k obsahu chlorofylu (DEPSC) se během vodního stresu výrazně zvýšil u všech rostlin a tento nárůst pokračoval u rostlin ošetřených vodou i po rehydrataci. U rostlin fazolu, cukrové řepy a tabáku ošetřených ABA a BA došlo po rehydrataci ke snížení stupně deepoxidace vztaženého na obsah chlorofylu, výrazněji po aplikaci BA, zatímco u kukuřice byla po rehydrataci změna minimální. U všech rostlin kromě fazolu však byl po rehydrataci podstatně vyšší než před vodním stresem. Tyto výsledky ukázaly, že předpůsobení BA a zejména ABA může přispívat k ochraně fotosyntetického aparátu během následného vodního stresu. Vliv vneseného genu trans-zeatin O-glukosyltransferázy na obsah karotenoidů v průběhu vodního stresu trasgenních rostlin V rámci širšího studia interakcí mezi cytokininy a ABA jsme v následujících experimentech sledovali reakce rostlin na současné zvýšení endogenní hladiny obou těchto fytohormonů. K tomuto účelu jsme použili trasgenní rostliny tabáku s genem pro trans-zeatin O-glukosyltransferázu vneseným pod konstitutivním (35S:ZOG1) nebo senescencí indukovaným (SAG12:ZOG1) promotorem. Hladina endogenní ABA byla zvýšena působením vodního stresu. Porovnávali jsme 3 patra rostlin nejmladší, střední a nejstarší před stresem, v průběhu 7 dní vodního stresu a 7 dní následné rehydratace. Zvýšený obsah cytokininů u trasgenních rostlin ovlivnil nejen celkový obsah a složení karotenoidů ale také jejich změny v průběhu ontogeneze. Celkový obsah karotenoidů byl u WT a SAG:ZOG nejvyšší u středních listů, zatímco u 35S:ZOG byl nejvyšší u nejmladších listů. Naproti tomu nejméně karotenoidů obsahovaly nejmladší listy u WT a nejstarší listy u obou transformantů. V průběhu vodního stresu došlo k postupnému nárůstu obsahu karotenoidů u nejmladších a středních listů, u 35S:ZOG pomaleji než u zbylých dvou typů rostlin. V závěrečné fázi stresu byl největší obsah karotenoidů u SAG:ZOG v mladých listech, u ostatních rostlin byl téměř vyrovnaný. U nejstarších listů jsme na počátku stresu zaznamenali mírný nárůst obsahu karotenoidů, který byl ve střední fázi stresu následován 13

15 poklesem jejich obsahu. Při silném stresu docházelo k úplné degradaci karotenoidů doprovázené částečným odumřením starých listů. Po rehydrataci docházelo k rychlejšímu úbytku karotenoidů u středních listů než u nejmladších listů, nejvýrazněji u WT. Obsah světlosběrných karotenoidů luteinu a neoxanthinu v nejmladších listech narůstal postupně, zatímco u středních listů až při silnějším stresu a u nejstarších listů po počátečním nárůstu (neoxanthin) nebo stagnaci (lutein) jejich obsah klesal. Po rehydrataci se obsah luteinu u mladých listů výrazněji neměnil, zatímco u středních listů klesal, nejvýrazněji u WT. Obsah neoxanthinu po rehydrataci mírně klesal v mladých i středních listech u obou transformantů a výrazněji u WT. U WT rostlin docházelo k postupnému nárůstu obsahu pigmentů xantofylového cyklu po celou dobu stresu, naproti tomu u 35S:ZOG až v konečné fázi stresu a u SAG:ZOG docházelo jen k nepatrným změnám. Z detailního porovnání změn měřených parametrů v průběhu vodního stresu jsme dospěli k závěru, že oba typy transgenních rostlin reagují na vodní stres lépe než netransgenní rostliny. 14

16 4. Závěry Na základě výsledků, jichž jsme dosáhli během experimentů uvedených v této disertační práci, jsme dospěli k následujícím odpovědím na otázky položené v cílech této práce: 1. V průběhu ontogeneze rostlin v in vitro podmínkách se složení i obsah karotenoidů měnil v závislosti na podmínkách kultivace (obsahu sacharózy v mediu, hladiny ozářenosti, koncetrace CO 2 ). Podobně tomu bylo i po převedení rostlin do ex vitro podmínek 2. Sacharóza v mediu ovlivnila ochrannou funkci karotenoidů u rostlin pěstovaných při vyšší ozářenosti, při nízké ozářenosti na ni měla jen nepatrný vliv. 3. Vyšší ozářenost v kombinaci se sacharózou v kultivačním mediu in vitro měla pozitivní vliv na obsah karotenoidů v prvních dnech aklimace k ex vitro podmínkám, postupně se rozdíly vzniklé odlišnou kultivací in vitro zmenšovaly. 4. Změny ve složení a obsahu karotenoidů po převádění rostlin z in vitro do ex vitro byly velmi závislé na předchozí in vitro kultivaci a na podmínkách během následné aklimace. K nárůstu obsahu -karotenu a pigmentů xantofylového cyklu docházelo u rostlin rostoucích ex vitro při normální koncentraci CO 2. Naproti tomu, u rostlin rostoucích při zvýšené koncentraci CO 2 nedocházelo ke zvyšování obsahu karotenoidů, ale u těchto rostlin byl zvýšen stupeň deepoxidace pigmentů xantofylového cyklu. 5. V důsledku vodního stresu docházelo ke zvyšování obsahu pigmentů xantofylového cyklu i jejich stupně deepoxidace, což rostlinám napomáhalo vyrovnat se s těmito nepříznivými podmínkami a zabránit poškození rostlin fotoinhibicí. 6. Aplikace ABA a benzyladeninu (BA) při vodním stresu stimulovala syntézu karotenoidů včetně pigmentů xantofylového cyklu a tím i napomáhala k ochraně rostlin před oxidativním poškozením. 7. Zvýšený obsah cytokininů u transgenních rostlin ovlivnil nejen celkový obsah a složení karotenoidů ale také jejich změny v průběhu ontogeneze. 15

17 6. Seznam publikací v disertační práci Poster 1 Haisel, D., Tichá, I.: Ontogenetic changes in contents of photosynthetic pigments in tobacco plantlets grown in vitro. - Acta Physiol. Plant. 25(Suppl.): Publikace 1 Tichá, I., Čáp, F., Pacovská, P., Hofman, P., Haisel, D., Čapková, V., Schäffer, C.: Culture on sugar medium enhances photosynthetic capacity and high light resistance of plantlets grown in vitro. - Physiol. Plant. 102: , Publikace 2 Haisel, D., Hofman, P., Vágner, M., Lipavská, H., Tichá, I., Schäfer, C., Čapková, V.: Ex vitro phenotype stability is affected by in vitro cultivation. - Biol. Plant. 44: , Publikace 3 Hofman, P., Haisel, D., Komenda, J., Vágner, M., Tichá, I., Schäfer, C., Čapková, V.: Impact of in vitro cultivation conditions on stress responses and on changes in thylakoid membrane proteins and pigments of tobacco during ex vitro acclimation. - Biol. Plant. 45: , Publikace 4 Haisel, D., Pospíšilová, J., Synková, H., Čatský, J., Wilhelmová, N., Plzáková, Š.: Photosynthetic pigments and gas exchange of in vitro grown tobacco plants as affected by CO 2 supply. - Biol. Plant. 42: , Publikace 5 Pospíšilová, J., Synková, H., Haisel, D., Čatský, J., Wilhelmová, N., Šrámek, F.: Effect of elevated CO2 concentration on acclimation of tobacco plantlets to ex vitro conditions. - J. exp. Bot. 50: , Publikace 6 Pospíšilová, J., Haisel, D., Synková, H., Čatský, J., Wilhelmová, N., Plzáková, Š., Procházková, D., Šrámek, F.: Photosynthetic pigments and gas exchange of in vitro grown tobacco plants during ex vitro acclimation. - Plant Cell Tissue Organ Cult. 61: , 2000 Publikace 7 Haisel, D., Pospíšilová, J., Synková, H., Schnáblová, R., Baťková, P.: Effects of abscisic acid or benzyladenine on pigment contents, chlorophyll fluorescence, and chloroplast ultrastructure during water stress and after rehydration. - Photosynthetica 44: , Publikace 8 Haisel, D., Vaňková, R., Synková, H., Pospíšilová, J.: The impact of trans-zeatin O-glucosyltransferase gene over-expression in tobacco on pigment content and gas exchange. - Biol. Plant. 51: 49-58,

18 7. Publikační činnost autora Pospíšilová, J., Synková, H., Haisel, D., Baťková, P.: Effect of abscisic acid on photosynthetic parameters during ex vitro transfer of micropropagated tobacco plantlets. - Biol. Plant. 53: 11-20, Procházková, D., Haisel, D., Wilhelmová, N.: Antioxidant protection during ageing and senescence in chloroplasts of tobacco with modulated life span. - Cell Biochem. Funct. 26: , Haisel, D., Vaňková, R., Synková, H., Pospíšilová, J.: The impact of trans-zeatin O-glucosyltransferase gene over-expression in tobacco on pigment content and gas exchange. - Biol. Plant. 51: 49-58, Pospíšilová, J., Synková, H., Haisel, D., Semorádová, Š.: Acclimation of plantlets to ex vitro conditions: effects of air humidity, irradiance, CO2 concentration and abscisic acid. - Acta Hort. 748: 29-38, Mýtinová, Z., Haisel, D., Wilhelmová, N.: Photosynthesis and protective mechanisms during ageing in transgenic tobacco leaves with over-expressed cytokinin oxidase/dehydrogenase and thus lowered cytokinin content. - Photosynthetica 44: , Haisel, D., Pospíšilová, J., Synková, H., Schnáblová, R., Baťková, P.: Effects of abscisic acid or benzyladenine on pigment contents, chlorophyll fluorescence, and chloroplast ultrastructure during water stress and after rehydration. - Photosynthetica 44: , Kosová, K., Haisel, D., Tichá, I.: Photosynthetic performance of two maize genotypes as affected by chilling stress. - Plant Soil Environ. 51: , Kutík, J., Holá, D., Kočová, M. Rothová, O., Haisel, D., Wilhelmová, N., Tichá, I.: The ultrastructure and dimensions of chloroplasts in leaves of three maize (Zea mays L.) inbred lines and their F1 hybrids grown under moderate chilling stress - Photosynthetica 42: , Pechová, R., Kutík, J., Holá, D., Kočová, M., Haisel, D., Vičánková, A.: The ultrastructure of chloroplasts, content of photosynthetic pigments, and photochemical activity of maize (Zea mays L.) as influenced by different concentrations of the herbicide amitrole. - Photosynthetica 41: , Hofman, P., Haisel, D., Komenda, J., Vágner, M., Tichá, I., Schäfer, C., Čapková, V.: Impact of in vitro cultivation conditions on stress responses and on changes in thylakoid membrane proteins and pigments of tobacco during ex vitro acclimation. - Biol. Plant. 45: , Haisel, D., Hofman, P., Vágner, M., Lipavská, H., Tichá, I., Schäfer, C., Čapková, V.: Ex vitro phenotype stability is affected by in vitro cultivation. - Biol. Plant. 44: , Kadleček, P., Tichá, I., Haisel, D., Čapková, V., Schäfer, Ch.: Importance of in vitro pretreatment for ex vitro acclimation and growth. - Plant. Sci. 161: , Pospíšilová, J., Haisel, D., Synková, H., Čatský, J., Wilhelmová, N., Plzáková, Š., Procházková, D., Šrámek, F.: Photosynthetic pigments and gas exchange of in vitro grown tobacco plants during ex vitro acclimation. - Plant Cell Tissue Organ Cult. 61: , Haisel, D., Pospíšilová, J., Synková, H., Čatský, J., Wilhelmová, N., Plzáková, Š.: Photosynthetic pigments and gas exchange of in vitro grown tobacco plants as affected by CO 2 supply. - Biol. Plant. 42: , Pospíšilová, J., Synková, H., Haisel, D., Čatský, J., Wilhelmová, N., Šrámek, F.: Effect of elevated CO2 concentration on acclimation of tobacco plantlets to ex vitro conditions. - J. exp. Bot. 50: ,

19 Pospíšilová, J., Tichá, I., Kadleček, P., Haisel, D., Plzáková, Š.: Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. - Biol. Plant. 42: , Tichá, I., Čáp, F., Pacovská, D., Haisel, D., Čapková, V., Schäffer, C.: Photosynthesis and photoinhibition in tobacco plantlets grown in vitro: an ontogenetic approach. - In: Garab, G. (ed.): Photosynthesis: Mechanisms and Effects. Pp Kluwer Academic Publishers, Dorrecht Tichá, I., Čáp, F., Pacovská, P., Hofman, P., Haisel, D., Čapková, V., Schäffer, C.: Culture on sugar medium enhances photosynthetic capacity and high light resistance of plantlets grown in vitro. - Physiol. Plant. 102: , Wilhelmová N., Wilhelm J., Kutík J., Haisel D.: Changes in French bean cotyledon composition associated with modulated life-span. - Photosynthetica 34: , Synková H., Wilhelmová N., Holá D., Haisel D., Šesták Z.: Comparison of chlorophyll fluorescence kinetics and photochemical activities of isolated chloroplasts in genetic analysis of Lycopersicon esculentum Mill. hybrids. - Photosynthetica 34: , Kutík, J., Holá, D., Kočová, M. Rothová, O., Haisel, D., Wilhelmová, N., Tichá, I.: The ultrastructure and dimensions of chloroplasts in leaves of three maize (Zea mays L.) inbred lines and their F1 hybrids grown under moderate chilling stress. -Photosynthetica 42: , Pechová, R., Kutík, J., Holá, D., Kočová, M., Haisel, D., Vičánková, A.: The ultrastructure of chloroplasts, content of photosynthetic pigments, and photochemical activity of maize (Zea mays L.) as influenced by different concentrations of the herbicide amitrole. - Photosynthetica 41: , Hofman, P., Haisel, D., Komenda, J., Vágner, M., Tichá, I., Schäfer, C., Čapková, V.: Impact of in vitro cultivation conditions on stress responses and on changes in thylakoid membrane proteins and pigments of tobacco during ex vitro acclimation. - Biol. Plant. 45: , Haisel, D., Hofman, P., Vágner, M., Lipavská, H., Tichá, I., Schäfer, C., Čapková, V.: Ex vitro phenotype stability is affected by in vitro cultivation. - Biol. Plant. 44: , Kadleček, P., Tichá, I., Haisel, D., Čapková, V., Schäfer, Ch.: Importance of in vitro pretreatment for ex vitro acclimation and growth. - Plant. Sci. 161: , Pospíšilová, J., Haisel, D., Synková, H., Čatský, J., Wilhelmová, N., Plzáková, Š., Procházková, D., Šrámek, F.: Photosynthetic pigments and gas exchange of in vitro grown tobacco plants during ex vitro acclimation. - Plant Cell Tissue Organ Cult. 61: , Haisel, D., Pospíšilová, J., Synková, H., Čatský, J., Wilhelmová, N., Plzáková, Š.: Photosynthetic pigments and gas exchange of in vitro grown tobacco plants as affected by CO2 supply. - Biol. Plant. 42: , Pospíšilová, J., Synková, H., Haisel, D., Čatský, J., Wilhelmová, N., Šrámek, F.: Effect of elevated CO2 concentration on acclimation of tobacco plantlets to ex vitro conditions. - J. exp. Bot. 50: , Pospíšilová, J., Tichá, I., Kadleček, P., Haisel, D., Plzáková, Š.: Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. - Biol. Plant. 42: , Tichá, I., Čáp, F., Pacovská, P., Hofman, P., Haisel, D., Čapková, V., Schäffer, C.: Culture on sugar medium enhances photosynthetic capacity and high light resistance of plantlets grown in vitro. - Physiol. Plant. 102: ,