Kultivace bun k in vitro

Transkript

1 Kultivace bun k in vitro

2 Výhody a nevýhody p i použití bun ných kultur

3 Zdroje bun k pro kultvivaci Získání bun né kultury Primokultura Sekundární kultura Zestárnutí kultury Rozdíl mezi nádorovými a normálními bu kami

4 Kultury Orgánové Tká ové Bun né Oba termíny se asto zam ují. Bu ky opoušt jí p vodní tká a v médiu se samostatn d lí tak vzniká bun ná kultura.

5 Alexis Carrel ( )

6 Kultliva ní podmínky Adheze Médium jeho složení (viz dále) a barva Teplota CO 2 Relativní vlhkost Médium Fetální bovinní sérum

7 Složení média základní anorganické živiny stopové prvky stabilizátory ph (CO 2-3 /HCO 3-, HPO 2-4 /H 2 PO 4- ) ph = 7,2 7,4 glukóza aminokyseliny vitaminy a jiné složky r zných enzym mastné kyseliny a lipidy specifické proteiny a peptidy podporující bun né d lení sérum (zpravidla fetální bovinní sérum) antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi)

8 Kultiva ní podmínky Používáme sklen né nebo um lohmotné nádobky, které plníme médiem s rozptýlenými bu kami. P echováváme v termostatu p i 37 ºC. Bu ky brzy ulpí na st nách nádobky a za nou se d lit. V n kterých p ípadech p idáváme do kultiva ní atmosféry oxid uhli itý.

9 Práce ve sterilním boxu

10 Pasážování bun k Po ur ité dob se živiny z média vy erpají a po etnost bun k stoupne na neúnosnou míru. Proto je nutné ást bun k odebrat, smísit s novým médiem a tuto suspenzi p enést do další kultiva ní nádobky

11 Bun né kultury živo išných bun k sav ích bun k (v etn lidských) kultura makrofág rostlinných bun k explantátové kultury význam ve šlechtitelství a genetickém inženýrství produkce transgenních plodin explantátová kultura tzv. kalus

12 Z hlediska životnosti d líme bun né kultury do 3 skupin: Primokultury (též primární kultury) obsahují bu ky erstv izolované z organismu Po p evedení do kultiva ního média p ežívají pouze ty bu ky, které jsou lépe izp sobeny daným podmínkám. existují zpravidla jen n kolik dní, pak je nutné bu ky, které se rozmnožily, evést do nového média. Bun né kmeny vycházejí z primárních kultur kultury normálních diploidních bun k, které byly již alespo jednou pasážovány vznikají z bun k, které se v podmínkách in vitro za aly rozmnožovat zhruba po d leních zanikají. Bun né linie (též permanentní bun né linie) mají charakter nádorových bun k jsou pln adaptovány na podmínky in vitro neomezen se d lí a lze je p echovávat libovoln dlouho vznikají transformací bun ných kmen anebo jde o bu ky p vodn izolované z nádor

13 stová k ivka bun né kultury vyjad uje zm ny po etnosti bun k v závislosti na ase R st bun né kultury prochází n kolika fázemi: Lag-fáze po áte ní fáze, po et bun k nejprve mírn klesne a pak pom rn rychle vzr stá. Bu ky se adaptují na kultiva ní prost edí a p ipravují se k bun nému d lení. Log-fáze (též logaritmická nebo exponenciální fáze) po et bun k exponenciáln roste. V této fázi zachytíme nejvíce bun k v mitóze, což lze využít pro chromozomové vyšet ení. Stacionární fáze rychlost r stu bun né populace postupn klesá, projevují se inhibi ní mechanismy (nap. kontaktní inhibice, produkce r stových inhibitor ) a postupné vy erpávání živin z média. Fáze úbytku bun k dochází k postupnému odumírání bun k zp sobenému nedostatkem živin, snížením ph (následkem zvýšení koncentrace CO 2 a dalších kyselinotvorných látek v médiu) a hromad ním toxických produkt bun ného metabolismu.

14 stová k ivka bun né kultury log N stacionární fáze log úbytek lag as

15 Pozorování bun né kultury inverzním mikroskopem Seznamte se s použitím inverzního mikroskopu. Prohlédn te pod inverzním mikroskopem kultiva ní nádobku s bun nou kulturou. Povšimn te si tvar bun k a posu te jejich denzitu.

16 Práce s inverzním mikroskopem

17 Bu ky HeLa Epiteliální bu ky HeLa jsou stabilizovanou bun nou linií. Primární kultura byla získána z bun k karcinomu d ložního kr ku pacientky Henrietty Lacksové v po átku 50.let 20.století. Dosud se v laborato ích používají jako typický model zachovávající všechny vlastnosti nádorových bun k. Henrietta Lacks

18 Význam bun ných kultur studium regulace bun ného cyklu a diferenciace bun k studium proces vedoucích ke vzniku a progresi nádorových chorob. produkce monoklonálních protilátek, které jsou nezbytné i diagnostice mnoha onemocn ní. testování ú ink lé iv a jiných chemických látek, které by mohly ohrozit zdraví lov ka, stanovení genotoxicity nahrazení pokus s laboratorními zví aty? klinická genetika prenatální vyšet ení (amniocyty z plodové vody, bu ky choriových klk ) postnatální vyšet ení (kultury lymfocyt periferní krve) chromozomové vyšet ení nádorových bun k mapování lidského genomu klonování savc virologie kultivace a izolace vir