Rubella-IgM-ELA Test PKS medac. Český 135-PKS-VPCZ/010708

Transkript

1 RubellaIgMELA Test PKS medac Český PKSVPCZ/010708

2 VÝROBCE: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg MARKETING: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ DISTRIBUTOR / ADRESA PRO PŘÍJEM OBJEDNÁVEK: ASCOMED, spol. s.r.o. Pod Cihelnou Praha 6 Tel.: ++420/ 2/ , 79, 80 Fax: ++420/ 2/ PKSVPCZ/010708

3 RubellaIgMELA Test PKS medac Enzymatickoimunologický test se Systémem Kontroly Pipetování na průkaz protilátek IgM proti viru rubeoly Katalogové číslo: 135PKS POUZE PRO DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO ÚVOD Původce zarděnek, virus rubeoly, patří do rodiny Togaviridae a rodu Rubivirus. Rubeola má jednoprovazcový genom RNA a vyskytuje se pouze jako jeden sérotyp. Rubeola je onemocnění, které se objevuje převážně v dětství a obyčejně mívá jenom mírný průběh. Onemocnění se projevuje ve formě drobně skvrnité exantemy a je doprovázeno lymfadenozou. Rubeolové infekce v prvních třech měsících těhotenství mohou vyvolat infekci fétu, co může vést k závažnému embryofetálnímu poškození. Specifické protilátky IgM proti viru rubeoly jsou dokazatelné již na 4. až 30. den po vypuknutí exantemy a perzistují potom jeden až čtyři měsíce. Z toho důvodu je průkaz IgM testem RubellaIgMELA Test PKS medac vhodnou metodou pro diagnózu akutní rubeolové infekce. V jednotlivých případech může odezva IgM perzistovat do jednoho roku popřípadě vůbec nenastat. Proto je nutno každý jednotlivý nález IgM interpretovat spolu s údaji anamnézy rubeolové infekce a popřípadě s dalšími výsledky vyšetřování. 135PKSVPCZ/

4 PRINCIP TESTU Mikrotitrační destička je pokryta protihumánním IgM. Frakce IgM zo séra pacienta se váže na mikrotitrační destičku. Komplex peroxidázou značeného konjugátu monoklonální protilátky a antigenu rubeoly se váže specificky na protilátky IgM proti viru rubeoly (AG = antigen, P = peroxidáza). Inkubace se substrátem TMB. Reakce se zastaví přidáním kyseliny sírové. Následuje fotometrické odečtení. Výhody testu Žádné nespecifické reakce a žádné falešně pozitivní výsledky způsobené revmatoidními faktory. Nedochází k blokování protilátek IgM vysokým titrem IgG. Systém Kontroly Pipetování umožňuje vizuálně sledovat každý krok pipetování, při kterém dochází ke změnám barev. Lámací proužky s mikrojamkami umožňují efektivní využití testu. Test lze automatizovat pro otevřené zařízení ELISA. 135PKSVPCZ/

5 OBSAH SOURAVY Katalogové číslo: 135PKS 1. MTP Mikrotitrační destička: 12 testovacích proužků po 8 jamkách (s rámikem a desikantem v hliníkovém vakuovém balení), lámací proužky, dno tvaru písmena U, pokryta kozími protihumánními protilátkami IgM, BSA a indikátorem ph, připravená k použití. 2. CONTROL Negativní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum, připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClin TM 300 a gentamycín sulfát. 3. CONTROL + Pozitivní kontrola: 1 lahvička s obsahem 1,5 ml, lidské sérum, připravená k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClin TM 300 a gentamycín sulfát. 4. WB Promývací roztok: 1 láhev s obsahem 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, obsahuje ProClin TM VIRDIL Roztok na ředění vzorků: 1 láhev s obsahem 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, připravený k použití, obsahuje ProClin TM ANTIGENDIL Roztok na ředění antigenu: 1 lahvička s obsahem 14 ml Tris/NaCl, připravený k použití, obsahuje ProClin TM ANTIGEN Antigen: 4 lahvičky s obsahem 3,0 ml, antigen viru rubeoly/bsa, lyofilizovaný. 8. CON Konjugát: 1 lahvička s obsahem 0,3 ml, protilátky IgG proti virus rubeoly, monoklonální (myší), konjugovaný HRP, červeně zbarvený, připravený k použití, obsahuje BSA, fenol, ProClin TM 300 a gentamycín sulfát. 9. TMB Substrát TMB: 1 lahvička s obsahem 10 ml, připravený k použití. 10. STOP Roztok na zastavení reakce: 2 lahvičky s obsahem 11 ml, 0,5 M kyselina sírová (H 2 SO 4 ), připravený k použití. 135PKSVPCZ/

6 1. SKLADOVÁNÍ A STABILITA Materiál/Reagencie Stav Skladování Stabilita Zkušební souprava neotevřená C do uplynutí exspirace Mikrotitrační destička otevřená C v sáčku 6 týdnů s desikantem Kontroly otevřené C 6 týdnů Promývací roztok zředěný C 6 týdnů Roztok na ředění otevřený C 6 týdnů vzorků Roztok na ředění antigenu Směs antigenu s konjugátem otevřený C 6 týdnů připravena k použití C 1 týden Substrát TMB otevřený C 6 týdnů Roztok na zastavení reakce otevřený C do uplynutí exspirace Reagencie nepoužívejte po uplynutí data jejich exspirace. 2. DALŠÍ POŽADOVANÉ REAGENCIE A MATERIÁLY 2.1. Aqua ad iniectabilia (bidest. H 2 O). Použití pouze deionizované vody může negativně ovlivnit výsledek testu Mikropipety s odpovídajícími objemy Čisté skleněné nádoby nebo nádoby z umělé hmoty na ředění promývacího roztoku a vzorků Vhodné zařízení na promývaní mikrotitračních destiček (např. multikanálová pipeta nebo promývačka na testy ELISA) Inkubátor na teplotu 37 C Fotometr na mikrotitrační destičky s filtry na 450 nm a nm. 3. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Před zahájením testu vytemperujte všechny komponenty testu na pokojovou teplotu. Stanovte požadovaný počet mikrotitračních jamek. 135PKSVPCZ/

7 3.1. Mikrotitrační destička Hliníkový sáček se musí po každém vyjmutí stripů spolu s desikantem dokonale uzavřít. Skladování a životnost nepoužitých mikrotitračních jamek jsou uvedeny pod bodem 1. Pokyn: Jamky mikrotitračné destičky mají slabě zelený odstín. Případně se objevující zelenohnědé skvrny v jamkách jsou způsobené zpracováním destičky a nemají negativní vliv na provedení a výsledek testu Promývací roztok Promíchejte jednu objemovou část koncentrátu promývacího roztoku (10x) s devíti částmi aqua ad iniectabilia (např. 50 ml koncentrátu roztoku (10x) se 450 ml aqua ad iniectabilia). Na 8 jamek budete potřebovat 10 ml promývacího roztoku. Případné krystaly v promývacím roztoku (10x) se musí rozpustit ohřátím (max. na 37 C) a/nebo promícháním při pokojové teplotě Směs antigenu a konjugátu Lyofilizovaný antigen se rozpustí v 3,0 ml roztoku pro ředění antigenu. Zavřené lahvičky se musí lehce potřást, aby se částice z uzávěru dostali do roztoku. 60 minut před použitím napipetuje 50 µl konjugátu ke 3,0 ml antigenu. Po rozpuštění a po přidání konjugátu je směs antigenu a konjugátu zbarvená červeně a připravena k použití. Směs antigenu s konjugátem připravenou k použití lze skladovat po dobu 1 týdne při teplotě 2 8 C (viz 1.). Poučení! Směs nezmrazujte! Reagencie specifické pro test (mikrotitrační destička, kontroly, konjugát, antigen, roztok na ředění antigenu) se nesmí míchat s reagenciemi jiných šarží. Naproti tomu jsou roztok na ředění vzorků, promývací roztok, substrát TMB a roztok na zastavení reakce pro všechny virologické testy firmy medac navzájem zaměnitelné. Reagencie jiných výrobců se v tomto testu nesmí používat. Platné a reprodukovatelné výsledky získáte pouze tehdy, pokud přesně dodržíte pracovní postup testu a použijete příslušné reagencie ze zkušební soupravy. 135PKSVPCZ/

8 4. VZORKY 4.1. Test je vhodný pro vzorky séra Před testem není potřebné provázet žádnou úpravu séra např. deaktivaci. Testované vzorky séra však nesmí být kontaminovány mikroorganismy ani nesmí obsahovat lidské erytrocyty Séra rozřeďte v poměre 1:100 roztokem na ředění vzorků. Pro určení titru se mohou vzorky libovolně naředit výš. 5.A. PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU 5.1. Otevřete obal mikrotitrační destičky a vyberte požadovaný počet mikrotitračních proužků (viz 3.1.). Mikrotitrační destičky jsou připraveny k použití a nemusí se promývat Jamku A1 nechte prázdnou (viz 6.A.) pro určení pozadí. Do jamek na destičce napipetujte 50 µl zředěných vzorků, negativní kontrolu a pozitivní kontrolu napipetujte dvakrát. Po napipetování se vzorky (neutrální nebo bazické kapaliny) v jamkách zbarví modře. Pokud se roztok v některé z jamek nezbarví, znamená to, že nebyl napipetován vzorek nebo kontrola. V případě potřeby se může mikrotitrační destička před dalším zpracováním ponechat ve vlhké komoře maximálně po dobu 60 minut při 2 8 C Inkubujte destičku 60 minut (± 5 minuty) při 37 o C (± 1 o C) ve vlhké komoře nebo pod krycí folií Připravte směs antigenu a konjugátu (viz 3.3) Po inkubaci promyjte každou mikrotitrační jamku třikrát 200 µl promývacího roztoku. Při promývaní dbejte na to, aby se všechny jamky pořádně naplnily. Po promytí vyklepejte mikrotitrační jamky na filtračním papíru. Jamky nesmí vyschnout! Pokračujte v práci okamžitě! 5.6. Do všech jamek (kromě A1) přidejte směs antigenu s konjugátem (zbarvený červeně). Pokud provádíte test manuálně, do každé jamky napipetujte 50 µl směsi antigenu s konjugátem. 135PKSVPCZ/

9 Poznámka: Při práci na automatických zařízeních naprogramujte pro každou jamku 60 µl směsi antigenu s konjugátem, protože v inkubačních komorách tu dochází k intenzivnímu vypařování. V rámci validace testu pro automatické zpracování se zjistilo, že tenhle test je v podstatě vhodný rovněž pro automatické zpracování. Nicméně doporučujeme verifikovat jeho kompatibilitu s přístrojem, na kterém se bude pracovat Inkubujte opět 60 minut (± 5 minuty) při teplotě 37 C (± 1 C) ve vlhké komoře nebo pod krycí folií Po inkubaci promyjte mikrotitrační jamky znovu (viz 5.5.) Do všech jamek (včetně A1) napipetujte 50 µl roztoku substrátu TMB a inkubujte 30 minut (± 2 minuty) při teplotě 37 C (± 1 C) ve vlhké komoře nebo pod krycí folií. Pozitivní vzorky se zbarví modře Reakci zastavte přidáním do každé jamky (včetně A1) 100 µl roztoku pro zastavení reakce. Dochází ke změně barev z modré na žlutou. Před fotometrickým měřením vyčistěte ze spodu mikrotitrační proužky a zkontrolujte, zda v jamkách nejsou žádné bublinky vzduchu. Měření je nutné provést během 15 minut po přidání roztoku pro zastavení reakce. 135PKSVPCZ/

10 5.B. TABULKA ZNÁZORŇUJÍCÍ PRACOVNÍ POSTUP Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky Prázdná jamka (A1) Negativní kontrola 50 µl Pozitivní kontrola 50 µl Vzorky 50 µl Inkubujte 60 minut při teplotě 37 C, 3x promyjte 200 µl promývacího roztoku Směs antigenu s konjugátem 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Inkubujte 60 minut při teplotě 37 C, 3x promyjte 200 µl promývacího roztoku Substrát TMB 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Roztok na zastavení reakce Inkubujte ve tmě 30 minut při teplotě 37 C 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Fotometrické odečtení při 450 nm (ref. vln. délka nm) *) manuální/automatické zpracování (viz 5.6.) 6.A. HODNOCENÍ TESTU (VALIDITA) Odečtěte hodnotu optické density (OD) při vlnové délce 450 nm (referenční vlnová délka nm). Od všech hodnot OD odečtěte OD pozadí (A1 jamky). Střední hodnota OD negativní kontroly musí být < 0,100. Střední hodnota OD pozitivní kontroly musí být > 0,800. Cut off = Střední hodnota OD negativní kontroly + 0,320 Šedá zóna = cut off ± 10 % Pokud kriteriá validity najsou splnena, musí se test opakovat. 135PKSVPCZ/

11 6.B. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Vzorky s hodnotami OD pod dolní hranicou šedé zóny se hodnotí jako NEGATIVNÍ. Vzorky s hodnotami OD v oblasti šedé zóny se hodnotí jako HRANIČNÍ. Tyto séra se musí znovu zkontrolovat po 14 dnech společně s nově odebranými vzorky, aby se zjistil pohyb titru IgM. Vzorky s hodnotami OD nad horní hranicí šedé zóny se hodnotí jako POZITIVNÍ. Výsledky testu se musí interpretovat vždy společně s klinickým obrazem pacienta a dalšími diagnostickými parametry. Velmi zřídka mohou séra obsahující ANA zapříčinit falešnou pozitivitu. Velmi vysoké hodnoty lipidů mohou vést k falešně pozitivním výsledkům. Vysoké hodnoty hemoglobinu a bilirubinu neovlivňují výsledky testu. 7. CHARAKTERISTICKÉ VLASTNOSTI TESTU V rámkách diagnostické evaluace jsme obdrželi následující charakteristické vlastnosti testu. 7.A. CITLIVOST A SPECIFITA Celkově 466 sér od zdravých dárců krve, od pacientů s podezřením na akutní rubeolovou infekci a s protilátkami IgM proti jiným virům (CMV, HSV, VZV, EBV, Parvo B19) a séra obsahujíci ANA nebo RF bylo testováno testem CMVIgMELA Test PKS medac. Paralelně s tím byli tyto vzorky testovány jiným vysoko specifickým referenčním testem ELISA, který se rutinně používá v laboratořích. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Referenční test negativní pozitivní RubellaIgMELA negativní Test PKS medac pozitivní PKSVPCZ/

12 Citlivost = 99,03 % Specifita = 99,17 % Pozitivní prediktivní hodnota: 97,14 % Negativní prediktivní hodnota: 99,72 % 7.B. PŘESNOST Vzorek Variace intraassay Vzorek Variace interassay OD SP CV (%) n OD SP CV (%) n NK 0,025 0, NK 0,024 0, PK 1,235 0, PK 0,962 0, Č. 1 1,400 0, Č. 4 0,922 0, Č. 2 0,930 0, Č. 5 0,230 0, Č. 3 0,488 0, Č. 6 1,159 0, Č. 7 0,426 0, NK = negativní kontrola, PK = pozitivní kontrola VŠEOBECNÉ RADY TÝKAJÍCI SE MANIPULACIE Aby jste předešli vzájemné kontaminaci jednotlivých reagencií, nezaměňujte lahvičky ani jejich šroubové uzávěry. Reagencie je potřebné ihned po použití uzavřít, aby nedošlo k jejich vypařování a mikrobiální kontaminaci. Po skončení testu se musí reagencie uložit tak, jak je uvedeno v pokynech, aby se zachovala jejich garantovaná životnost. Aby nedošlo k záměně s reagenciemi jiných testovacích systémů nebo šarží, musí se všechny komponenty jednoho testu po použití skladovat spolu v původním balení (viz také 3.). 135PKSVPCZ/

13 INFORMACE TÝKAJÍCI SE BEZPEČNOSTI A OCHRANY ZDRAVÍ Je nevyhnutné dodržovat místní předpisy týkající se bezpečnosti práce. Reagencie lidského původu byli testovány na HBsAg, na protilátky proti HIV 1/2 a protilátky proti HCV a bylo zjištěno, že nejsou reaktivní. Přesto se musí s těmito reagenciemi a také s těmi, které obsahují součásti zvířecího původu, (viz obsah soupravy), pracovat jako s potencielně nákažlivými, aby se předešlo riziku nákazy. RADY TÝKAJÍCÍ SE LIKVIDACIE Chemikálie a přípravky patřící k tomuto produktu jako i jejich zbytky, vznikající při použití tohoto produktu, se považují zpravidla za odpady, které se musí odstraňovat podle předpisů. Odstraňování těchto odpadů se řídí podle národních zákonů týkajících se odpadů. Informace o možnostech odstraňování odpadů Vám podají zodpovídající úřady nebo společnosti zabývající se odstraňováním odpadů. Datum výdání: PKSVPCZ/

14 LITERATURA Enders, G.: Röteln. Fortschr. Klin. Virol. München, (1986). Hermann, K.L.: Available Rubella serological tests. Rev. Infect. Dis. 7, (1985). Pustowoit, B., Hofmann, J. a Trauer, H.: Rötelnvirus (Virus rubeola), in: Diagnostische Bibliothek, Bd. 1, Virusdiagnostik, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell WissenschaftsVerlag, (1996). Selb, B.: Rötelnvirus, in: Medizinische Virusdiagnostik, Selb, B. (Hrsg.), Umschau Verlag, (1992). Thomas, H.I., MorganCapner, P., Roberts, A., Hesketh, L.: Persistent rubellaspecific IgM reactivity in the absence of recent primary rubella and rubella reinfection. J. Med. Virol. 36, (1992). Wolinsky, J.: Rubella (Rubeola), in: Virology, 2. Edition, B. N. Field, B. M., Kipe, D. M. et al. (Eds.), Raven Press, Ltd., New York (1990). 135PKSVPCZ/