Objednací číslo Určení Ig-třída Substrát Formát EI M CMV (Cytomegalovirus)

Transkript

1 Protilátky proti CMV (IgM) Návod na použití ELISA testu Objednací číslo Určení Ig-třída Substrát Formát EI M CMV (Cytomegalovirus) IgM Ag-potažené mikrotitrační jamky 96 x 01 (96) Princip testu: Kit ELISA test nabízí semikvantitativní in-vitro test na lidské IgM protilátky proti CMV. Testovací kit obsahuje osm mikrotitračních proužků, každý s 8 odlomitelnými reagenčními jamkami potaženými antigeny CMV. V prvním reakčním kroku jsou naředěná séra pacientů inkubována v jamkách. V případě pozitivních vzorků, se specifické IgM (rovněž IgG a IgA) protilátky naváží na antigen. V druhém kroku jsou použity enzymově značené protilátky proti lidským IgM protilátkám, které následně katalyzují barevnou reakci. Intenzita zabarvení je úměrná koncentraci protilátek proti CMV. Obsah kitu: - Mikrotitrační jamky potažené antigeny: 12 oddělených proužků mikrotitrační desky, každý obsahuje 8 jednotlivých oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití) - Kalibrační sérum (lidské IgM): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno tmavě červeně. - Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgM): 1 x 1,3 ml, připravené k použití. Značeno modře. - Negativní sérum (lidské IgM): 1x 1,3 ml, připravené k použití. Značeno zeleně. - Enzymový konjugát: peroxidasou značené králičí protilátky proti lidským IgM: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Značeno červeně. - Vzorkový pufr: obsahující IgG/RF-absorbent.(anti-lidské IgG, kozí)1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno zeleně. - Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný) - Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen: tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku. - Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití. 1 N kyselina fosforečná. - Návod k provedení testů - Protokol s hodnotami. Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 o C až +8 o C, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do vyznačeného data expirace. Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HbsAG, anti-hcv, anti- HIV-1 a anti-hiv-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody. Příprava a stabilita reagencií Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu.

2 Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a trhnutím otevřete lepící ochranný obal. Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska vytemperovaná na pokojovou teplotu, tím zabráníte zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 o C až +8 o C, lze je použít po dobu nejméně dvou měsíců. Kalibrační a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně promíchat. Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat. Vzorkový pufr: Připraven k použití Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou. Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě +2 o C až +8 o C. Poznámka: Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 o C a před ředěním promíchejte. Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Zastavovací roztok. Připravený pro užití Ředění séra a vzorků plasmy Úvod: Před tím, než je pacientovo sérum testováno na specifické IgM protilátky, je nutné odstranit IgG protilátky a to buď ultracentrifugací, chromatograficky nebo amunoabsorbcí. Tento postup musí být proveden proto, aby se z reakce odstranili jakékoli revmatoidní faktory reagující specifickou vazbou s IgG, které by mohly způsobit falešnou positivitu testu na IgM a aby specifické IgG protilátky nevytěsnili IgM protilátky z antigenu, což by vedlo k falešně nagativním výsledkům. Princip: Vzorkový pufr (zelené barvy) obsahuje anti-human protilátky. IgG protilátky ze séra nebo plasmy jsou specificky vázány těmito protilátkami a vysráženy. Jestliže vzorek obsahuje také revmatoidní faktory, budou absorbovány na komplex IgG/anti-human IgG. Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 101 vzorkovým pufrem. Například, přidejte 10 µl séra k 1 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. Inkubujte směs alespoň deset minut při pokojové teplotě. Potom může být rozpipetována do jednotlivých jamek podle pipetovacího protokolu. Poznámka: V analyzované směsi nesmí být protilátky třídy IgG. Ověření efektivní absorpce IgG je ověřeno tak, že se paralelně s testem na IgM provádí i test na IgG výsledky jsou správné pouze tehdy, je-li test na IgG negativní. Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je znovu.

3 Inkubace Inkubace vzorku: 1. Krok. Přeneste 100 µl kalibračního séra, pozitivní a negativní kontroly nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých mikrotitračních jamek a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě. Promývání: Vyprázdněte jamky a následně promyjte každou jamku třikrát pomocí 300 µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechte pufr v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu, teprve potom jamku vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů (provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte, vyklepejte promývací pufr poklepem desky dnem vzhůru na filtrační papír. Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou značené anti-lidské IgM) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Promývaní: Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě. Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační desky a to v tom samém pořadí, jako byl kapán chromogen/substrátový roztok. Měření: Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce mezi 620 a 650 nm za 30 minut od přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku. Pipetovací protokol A C P6 P14 P22 B pos P7 P15 P23 C neg P8 P16 P24 D P1 P9 P17 E P2 P10 P18 F P3 P11 P19 G P4 P12 P20 H P5 P13 P21 Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem semikvantitativní analýzy protilátek v sérech od 24 pacientů (P1 až P24). Kalibrátor (C), pozitivní (pos) a negativní (neg) kontrolní séra a všechny vzorky sér pacientů byly inkubovány každý v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu se dá zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužku. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií.

4 Výpočet Semikvantitativní vyhodnocení: Jako horní hranice referenční oblasti (cut-off value) pro lidi neinfikované je definována kalibrátorem (C). Hodnoty nad touto indikovanou hranicí se pokládají za pozitivní, pod touto hraniční hodnotou za negativní. Jak pozitivní, tak negativní kontrolní sérum slouží jako vnitřní kontroly pro určení spolehlivosti testovaného postupu. Musí být proto vždy do každého testu zařazeny. Poměry > 1,0 se považují jako pozitivní, poměry < 1,0 jako negativní. Poměry se vypočítají z následujícího vztahu: Extinkce vzorku séra Extinkce kalibračního séra 2 = Poměr Jestliže hodnoty extinkce vzorku leží nad hodnotami standardní křivky, doporučujeme, aby byl vzorek znovu otestován při ředění 1:400. Výsledek v IU/ml získaný ze standardní křivky pro tento vzorek se potom musí vynásobit faktorem 4. Charakteristiky testu Kalibrace: Kalibrace se vyjadřuje v mezinárodních jednotkách (IU) s využitím materiálu třetího mezinárodního jednání o přípravě standardů Světové zdravotnické organizace (WHO). Pro všechny skupiny prováděných testů musí hodnoty extinkce pro kalibrační séra a mezinárodní jednotky určené pro pozitivní a negativní kontrolu ležet v hranicích určených pro tyto důležité hodnoty. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se nedosáhne hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a proto se musí opakovat. Vazebná afinita protilátek, stejně tak aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud nepoužijete termostat. Čím vyšší je pokojová teplota během inkubace substrátu, tím vyšší jsou hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví také vzhledem k času inkubace. Kalibrační séra se vystaví stejnému vlivu, a to proto, že tyto změny jsou povětšinou zakalkulovány ve výpočtu výsledků. Tyto změny se berou následovně do úvahy a přizpůsobují se časy inkubace substrátu vzhledem k pokojové teplotě: Pokojová teplota 14 o C - 18 o C Pokojová teplota 19 o C - 23 o C Pokojová teplota 24 o C - 30 o C doba inkubace substrátu 18 min doba inkubace substrátu 15 min doba inkubace substrátu 12 min Antigen: Antigen je získáván z buněčného lyzátu MRC-5 buněk infikovaných kmenem cytomegaloviru AD169. Klinický význam: Většina infekcí CMV probíhá skrytě. Onemocnění se může projevit téměř ve všech orgánech, především pak v játrech a plicích, kdy je onemocnění spojeno s vytrvalými horečkami. Závažná je vrozená cytomegalovirová infekce, jejíž následkem dochází k poškození jater, sleziny a centrálního nervového systému. Okolo 1% vážných případů jsou infekce v děloze

5 spojené s objevením se IgM protilátek. Po propuknutí onemocnění mohou být detekovány téměř u všech sér pacientů protilátky proti cytomegaloviru. Obvykle se vytváří dlouhodobá imunita. Z 80% onemocnění postihuje dospělou populaci. Dřívější infekce mohou být reaktivovány při celkovém oslabení imunitního systému. Pacientům s rakovinou, pacientům po transplantacích a kojencům nesmí být dávány krevní produkty z CMV-infikovaných (protilátky na CMV jsou pozitivní) dárců.