ELISA-VIDITEST anti-chlamydia pneumoniae IgM

Transkript

1 1023 ELISA-VIDITEST anti-chlamydia pneumoniae IgM OD-184 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, Jesenice, tel.: NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-chlamydia pneumoniae IgM ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgM proti antigenu Chlamydia pneumoniae v lidském séru a plazmě. 2. POUŽITÍ: Souprava je určená ke kvalitativnímu průkazu protilátek proti Chlamydia pneumoniae v lidském séru a plazmě. Při diagnostice chlamydiových infekcí se používá přímý průkaz původce (izolace bakterií, přímý průkaz antigenu nebo průkaz bakteriální DNA ve vzorcích z dolních dýchacích cest amplifikačními testy - PCR, LCR) nebo sérologické stanovení specifických IgG, IgA a IgM protilátek. V důsledku problémů při získávání vzorků a také kvůli nedostatkům při prokazování původce, je sérologie považována za metodu volby. Kromě stanovení protilátek pomocí mikroimunofluorescence (MIF) lze protilátky diagnostikovat také pomocí enzymové imunoanalýzy. Akutní infekce C. pneumoniae se vyznačuje převahou IgM protilátek do 2-4 týdnů po infekci. Teprve asi po 6-8 týdnech se začínají tvořit specifické IgG a IgA protilátky. Po akutní infekci C. pneumoniae již zpravidla po 2-6 měsících nelze protilátky IgM prokázat. Hladina protilátek IgG se snižuje velmi pomalu, zatímco hladina protilátek IgA naopak klesá rychleji. U primárních chlamydiových infekcí je průkaz protilátek IgM důležitým faktorem, avšak v případě opakovaných nebo chronických infekcí je prokazatelná hladina protilátek IgM jen velmi nízká nebo se tyto protilátky nevyskytují vůbec. Negativní nález specifických IgM protilátek v těchto případech neznamená vyloučení akutní nebo recentní infekce. Pro sérologickou diagnostiku reinfekce lze použít průkaz vzestupu specifických IgG, či IgA protilátek v krvi. V tomto případě se doporučuje vyšetření párových vzorků sér, odebraných v intervalu 2-3 týdnů. IgG i IgA protilátky proti chlamydiím mohou přetrvávat v séru několik měsíců po přeléčení infekce. Dlouhodobě přetrvávající vysoké titry těchto protilátek mohou indikovat chronickou infekci. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-chlamydia pneumoniae IgM je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán purifikovaný, homogenizovaný antigen. Jsou-li v testovaných sérech přítomny specifické protilátky, navážou se na imobilizovaný antigen. Po odstranění nenavázaného materiálu promýváním pak navázané protilátky v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgM značenými křenovou peroxidázou. Přebytek peroxidázového konjugátu je pak odstraněn promytím. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí TMB substrátu (modré zabarvení pozitivních vzorků). Reakce je zastavena přidáním stop roztoku (změna zabarvení na žlutou). Intenzita žlutého zbarvení jamek je závislá na množství protilátek ve vzorku. 1

2 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy po 8 jamkách potažené antigenem STRIPS Ag 12 ks Negativní kontrola r.t.u. 1), 1,2 ml CONTROL - Pozitivní kontrola r.t.u., 1,2 ml CONTROL + Cut-off kontrola r.t.u., 1,2 ml CUTOFF Peroxidázový konjugát (anti-igm/px) r.t.u., 12 ml CONJ RF sorbent r.t.u., 7,5 ml RF SORB Promývací roztok 25x konc., 80 ml WASH 25x Ředicí roztok r.t.u., 100 ml DIL Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., 13 ml TMB Stop roztok r.t.u., 15 ml STOP Krycí fólie Sáček se zipem + vysoušedlo Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (připraveno k použití = v pracovní koncentraci) Promývací roztok 25x konc., stop roztok r.t.u., ředicí roztok r.t.u a chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. jsou určeny pouze pro soupravy ELISA-VIDITEST anti-chlamydia trachomatis a pneumoniae a NEJSOU VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÉ mezi ostatními soupravami ELISA-VIDITEST vyráběnými firmou VIDIA spol. s r.o. 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná nebo deionizovaná voda, promývačka na mikrotitrační destičky, zkumavky a stojánek na ředění vzorků, pipetovací zařízení (mikropipety a špičky k mikropipetám), odměrný válec pro ředění promývacího roztoku, nádoby pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/ kolorimetr/reader pro měření absorbance mikrotitrační destičky při 450 nm (referenční filtr 620/630 nm), minutka, inkubátor s teplotou +37 C s vysokou relativní vlhkostí vzduchu. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Před použitím důkladně zamíchejte jednotlivé roztoky, kontrolní séra a peroxidázový konjugát. c. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér. Testovaná séra nejprve řeďte 51x v ředicím roztoku r.t.u. (např. 10 μl séra μl ředicího roztoku). Poté přidejte RF sorbent. RF sorbent obsahuje anti-lidské IgG protilátky určené k vysycení IgG a revmatoidního faktoru (RF). Zředěný vzorek (51x) smíchejte v poměru 1:1 s RF sorbentem (např. pro použití vzorku na jednu jamku 75 μl séra + 75 μl RF sorbentu). Výsledné ředění séra je 101x. Takto připravené sérum nechte inkubovat 30 minut při laboratorní teplotě nebo přes noc při +2 C až +8 C. d. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 25x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 40 ml promývacího roztoku ml H 2 O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho ve vodní lázni +32 C až +37 C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 měsíc při teplotě +2 C až +8 C. e. Kontrolní séra, peroxidázový konjugát, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). Kontrolní séra neupravujte pomocí RF sorbentu. 2

3 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci a umístěte je do rámečku. Zatavené stripy nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k jejich orosení. Nepoužité stripy společně s desikantem důkladně uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μl kontrolních sér a ředěných testovaných sér podle následujícího schématu (viz Obr. 1 Schéma aplikace vzorků). První jamku naplňte samotným ředicím roztokem pro stanovení pozadí reakce (DIL). Další dvě jamky naplňte cut-off kontrolou (CUTOFF). Další jamky naplňte negativní kontrolou (CONTROL-) a pozitivní kontrolou (CONTROL+). Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1 ). Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku (S1, S2, S3, ). Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Stripy přelepte krycí fólií nebo překryjte víčkem. Inkubujte 60 minut (+/-5 min) v inkubátoru při teplotě +37 C (+/-1 C). Pozn.: Vzhledem k délce pipetování je doporučeno, aby se cut-off kontrola zopakovala vždy po 4 stripech (nebo po 5 minutách pipetování). Vzorky pipetované po opakované cut-off kontrole se tak mohou hodnotit s nově vypočítanou hodnotou. Obr. 1 Schéma aplikace vzorků: a DIL S4 CUTOFF b CUTOFF S... S28 c CUTOFF S29 d CONTROL- S... e f CONTROL+ S1 g S2 S... h S3 S27 c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY). Jamky poté 4x promyjte 300 μl promývacího roztoku (roztok ponechte v jamkách asi 30 sec.). Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Napipetujte do jamek po 100 μl peroxidázového konjugátu (CONJ) r.t.u.. Stripy přelepte krycí fólií nebo překryjte víčkem. Inkubujte 30 minut (+/-2 min) v inkubátoru při teplotě +37 C (+/-1 C). e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 300 μl promývacího roztoku (viz bod c.). f. Napipetujte do jamek po 100 μl chromogensubstrátového roztoku (TMB). Inkubujte 15 minut (+/- 30 sec) při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 μl stop roztoku. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Jemným poklepem na rámeček destičky zajistěte promíchání obsahu jamek. Před měřením destičky zajistěte, aby dno jamek nebylo znečištěno a aby v jamkách nebyly vzduchové bubliny. 3

4 h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru/readeru při 450 nm nejpozději do 10 minut od zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 630 (620) nm. Pozn.: Nenechte jamky během inkubací vyschnout. Nezaměňujte reagencie a neprovádějte inkubaci mimo rozmezí teplot. 8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot kontrol a testovaných sér Kvalitativní hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD cut-off kontroly (CUTOFF) ze dvou jamek. Pokud jste aplikovali CUTOFF opakovaně po 4 stripech, použijte vždy konkrétní hodnotu pro následující vzorky. 2. Stanovte cut-off hodnotu. Cut-off hodnotu stanovíte tak, že k hodnotě cut-off kontroly přičtete hodnotu negativní kontroly. cut-off hodnota = OD (CONTROL-) + OD (CUTOFF) 3. Spočítejte rozmezí cut-off hodnoty +/- 10% séra s hodnotou OD < cut-off hodnota - 10% jsou negativní séra s hodnotou OD > cut-off hodnota + 10% jsou pozitivní Výsledek je nejistý v rozmezí: cut-off hodnota -10% OD vzorku cut-off hodnota +10%. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum z nového odběru od téhož jedince. Doporučujeme zvážit a vyloučit nespecifické reakce resp. zkříženou reaktivitu, která také může být příčinou nejistého výsledku Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pozitivity pro jednotlivé vzorky sér: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (viz čl. 8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cut-off hodnotou: hodnota indexu pozitivity = OD vzorku / hodnota cut-off 3. Odečtěte v tabulce odpovídající stupeň reaktivity séra. hodnota indexu vyhodnocení < 0,9 negativní (-) 0,9 1,1 hraniční (+/-) > 1,1 pozitivní (+) Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum z nového odběru od téhož jedince. Doporučujeme zvážit a vyloučit nespecifické reakce resp. zkříženou reaktivitu, která také může být příčinou nejistého výsledku. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: Pro hodnocení serologických nálezů je doporučeno vyšetření sér ve všech třech třídách protilátek (IgG, IgM i IgA). U začínajících akutních chlamydiových infekcí může být sérologické stanovení protilátek negativní i přes klinické projevy infekce. Je-li požadavek na sérologické potvrzení, doporučujeme provést po dnech kontrolní vyšetření (test sérokonverze). 4

5 Protilátky proti C. pneumoniae IgM IgA IgG Interpretace výsledků Nelze prokázat specifické protilátky Možnost raného stádia infekce nebo solitární, přetrvávající hladiny IgA Pravděpodobná akutní nebo nedávno získaná infekce Možnost reinfekce popř. chronické infekce Možnost recentně proběhlé infekce (Pozn. k tabulce: - negativní, + pozitivní) Dříve prodělaná infekce, možná reinfekce popř. chronická infekce Doporučená doplňující vyšetření Sérologie nedokazuje infekci. Při podezření na akutní infekci se doporučuje kontrolní vyšetření po dnech. Při odůvodněném klinickém podezření by se měl provést přímý průkaz bakterií ve sputu nebo aspirátu z dolních dýchacích cest. Kontrola protilátek IgG, IgM a IgA po dnech pro určení sérokonverze. Průběžná kontrola protilátek IgG, IgM a IgA (vzorky získané v intervalu dní). Průběžná kontrola protilátek IgG, IgM a IgA pro určení sérokonverze. Při podezření na akutní infekci se doporučuje průběžná kontrola protilátek IgG a IgA (vzorky získané v intervalu dní). 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: Souprava je určená ke kvalitativnímu průkazu protilátek proti Chlamydia pneumoniae v lidském séru a plazmě. K vyšetření jsou vhodné vzorky séra a plazmy (heparin) odebrané standardním laboratorním způsobem. Vzorky inaktivované působením vysokých teplot se nesmí používat. Výsledky vyšetření vzorků moků (CSF) nejsou k dispozici Platnost testu V každém testu je nutno aplikovat všechny kontroly. Hodnota absorbance OD ředicího roztoku r.t.u. (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100. Hodnota OD negativní kontroly (CONTROL-) by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality. Průměrná hodnota OD cut-off kontroly (CUTOFF) by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality. Hodnota indexu pozitivní kontroly by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality. Pokud není předepsaných hodnot dosaženo, nejsou výsledky testu validní a test je nutné opakovat Přesnost testu Opakovatelnost (intraassay) byla stanovena testováním vzorků s různými hodnotami OD nejméně 22-krát v jednom testu. Variační koeficient byl < 10%. Reprodukovatelnost (interassay) byla stanovena testováním vzorků s různými hodnotami OD v 10 různých testech. Variační koeficient byl < 10%. 5

6 10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti a specifity testu bylo provedeno testováním souboru 135 vzorků sér. Ověření bylo provedeno srovnávacími metodami (ELISA / MIF). Z výsledků byla vypočtena citlivost 96,8% a specifita 81,8%. Pro výpočet citlivosti a specifity ELISA testu byly neurčité výsledky interpretovány jako pozitivní. Výsledky byly vyhodnoceny podle skupin vzorků Interakce V důsledku vzájemné příbuznosti antigenů různých chlamydií může docházet ke zkříženým reakcím mezi protilátkami proti Chlamydia pneumoniae s protilátkami proti Chlamydia trachomatis a Chlamydia psitacci. V případě pozitivních výsledků, které neodpovídají klinickému obrazu, nebo limitních výsledků se proto doporučuje potvrdit nález pomocí vhodných konfirmačních testů (MIF, Western blott). Zkříženou reaktivitu s antinukleárními, heterofilními, či jinými autoprotilátkami nelze v individuálních případech vyloučit. Lipemické, hemolytické nebo ikterické vzorky lze testovat pouze s výhradami, ačkoliv při našich testech nebyl zjištěn žádný negativní vliv. Mikrobiálně kontaminované vzorky mohou vést k nespolehlivým výsledkům testů. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely (pro diagnostiku in vitro). Testy musí provádět kvalifikovaní a proškolení pracovníci. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. Lidská séra použitá v soupravě pro přípravu kontrolních sér byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-hiv-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem. Předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Mikrotitrační destičky jsou potaženy inaktivovaným antigenem. Nicméně je běžné s nimi v laboratoři nakládat jako s potenciálně infekčními. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, Chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Roztoky obsahující azid sodný (kontroly a RF sorbent) likvidujte naředěním v dostatečném množství vody. Azid sodný může tvořit při dlouhodobém styku s kovy explozivní sloučeniny. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Pokud se při použití modifikuje testovací postup popsaný v tomto návodu k použití, musí uživatel tuto metodu validovat a je za ni zodpovědný. b. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. 6

7 c. Promývací roztok 25x konc., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u lze zaměnit u všech souprav ELISA-VIDITEST anti-chlamydia trachomatis a pneumoniae IgG, IgM a IgA. Roztok TMB r.t.u. lze zaměnit pouze v případě stejné šarže uvedené na štítku lahvičky. Tyto roztoky nejsou zaměnitelné mezi ostatními soupravami vyráběnými firmou VIDIA s.r.o. d. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií, reagencie po použití pečlivě uzavírejte. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Peroxidázový konjugát a ředicí roztok jsou konzervovány 0,049% Thiomersalem. f. Kontrolní séra a RF sorbent jsou konzervovány 0,095% azidem sodným. g. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. h. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu, pracujte pozorně a pečlivě. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným vytemperováním a promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů Chyba Bez barevné reakce po přidání substrátu Obecně velmi silná reakce Obecně velmi slabá reakce Reakce blanku velmi vysoká Falešně pozitivní / negativní vzorky Nevysvětlitelné výkyvy Vysoká variabilita (v jednom testu) Vysoká variabilita (mezi jednotlivými testy) Možné příčiny Nebyl nepipetován Px-konjugát. Došlo k inaktivaci Px-konjugátu např. jeho kontaminací kontrolním sérem během pipetování. Nesprávný Px-konjugát (není z originální soupravy). Inkubační doba příliš dlouhá. Inkubační teplota příliš vysoká. Nedostatečná kvalita vody pro ředění promývacího roztoku (nízký stupeň deionizace). Nesprávný Px-konjugát (není z originální soupravy). Inkubační doba příliš krátká. Inkubační teplota příliš nízká. Nesprávné pipetování ředicího roztoku. Kontaminované reagencie. Reagencie po expiraci. Překročení inkubační doby a teploty. Vnější znečištění dna mikrotitrační destičky (pečlivě očistěte!). Nesprávné ředění vzorků. Lipemické, hemolytické nebo ikterické vzorky. Bakteriální kontaminace vzorků. Kontaminace pipet, špiček nebo použitých nádob. Přítomnost kovů (železo, měď atd.). Nedostatečné promývání. Reagencie nebo stripy nebyly vytemperovány na laboratorní teplotu. Promývačka nepracuje správně. Inkubační podmínky nejsou konstantní (čas, teplota). Kontroly a vzorky nejsou zpracovány současně (ve stejném intervalu) - prověřte postup pipetování. Lidský faktor. Vysušení stripů během promývání. 7

8 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte při teplotě +2 C až +8 C. Složky nezmrazujte, chraňte je před přímým slunečním zářením. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Používejte pouze stripy neporušeně vakuově zatavené. Načaté nespotřebované stripy dobře uzavřete do plastikového sáčku společně s desikantem (vysoušedlem). Takto uložené stripy jsou stabilní po dobu 4 týdnů. c. Po použití pečlivě uzavřete lahvičky reagencií víčky a dále je uchovávejte při +2 C až +8 C. d. Nespotřebovaný naředěný promývací roztok je stabilní po dobu 4 týdnů, pokud je uchován při teplotě +2 C až +8 C. e. Vzorky séra nebo plazmy (heparin) odebrané standardním laboratorním způsobem jsou vhodné k vyšetření. Vzorky inaktivované působením vysokých teplot se nesmí používat. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 C až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 C až +8 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. f. Vzorky naředěné v ředícím roztoku nelze skladovat a je potřeba je použít tentýž den. g. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. 8

9 14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Aplikujte 100 μl/ jamku kontrol a testovaných sér Inkubujte 60 minut v inkubátoru při teplotě +37 C 4x promyjte (300 μl/ jamku, 30 sec. nechte roztok v jamkách), vyklepněte Aplikujte 100 μl/ jamku peroxidázového konjugátu Inkubujte 30 minut v inkubátoru při teplotě +37 C 4x promyjte (300 μl/ jamku, 30 sec. nechte roztok v jamkách), vyklepněte Aplikujte 100 μl/ jamku chromogensubstrátového roztoku TMB Inkubujte 15 minut při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte 100 μl/ jamku stop roztoku Změřte absorbanci při 450 nm do 10 minut Doporučená literatura: Roubalová K., Hrubá D., Janechková L.: Možnosti diagnostiky infekcí vyvolaných Chlamydia pneumoniae. Naše zkušenosti s diagnostikou Chlamydia pneumoniae u chronicky nemocných pacientů.; Antibiotiká a rezistencia 2, 5, 2006; P. Hejnar, D. Koukalová: Serodiagnostics of Chlamydial Infections-Significance of Positivity in IgA and/or IgM Antibody Classes only.; Biomed. Papers 146(2), (2002). Diagnostik von Chlamydien-Infektionen; J. Lab Med 2004; 28 (2): Kazár, J.: Chlamýdiové pneumónie; Antibiotiká a rezistencia 2, 5, 2006; Datum poslední verze tohoto návodu: 07/2014 9

10 10