Vakcinační postup vedoucí k ochraně ovcí před infekcí klíšťovou encefalitidou

Transkript

1

2

3 Léčebný postup Vakcinační postup vedoucí k ochraně ovcí před infekcí klíšťovou encefalitidou RNDr. Jiří Salát, Ph.D. 1 MVDr. Milan Huňady 2 Mgr. Petra Formanová 1 RNDr. Luděk Eyer, Ph.D. 1 Doc. RNDr. Daniel Růžek, Ph.D. 1 1 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. 2 Bioveta, a.s. Léčebný postup byl vytvořen v rámci projektu Národní agentury zemědělského výzkumu - KEVAK QJ

4 Obsah: 1. Úvod - klíšťová encefalitida a alimentární typ přenosu 3 2. Cíl léčebného postupu 5 3. Údaje o přípravku a vakcinační postup 6 4. Legislativní požadavky 8 5. Bezpečnost a imunogenita vakcinačního postupu 9 6. Účinnost vakcinačního postupu Seznam použité literatury 19 Příloha 1: Salát, J., Růžek, D., Formanová, P., Eyer, L., Huňady, M. Vakcína proti klíšťové encefalitidě k veterinárnímu užití. Užitný vzor CZ U1. Úřad průmyslového vlastnictví Příloha 2: Salát, J., Šlosárková, S., Huňady, M., Růžek, D. Vakcinace malých přežvýkavců proti klíšťové encefalitidě. Veterinářství 2018;68: Příloha 3: Salát, J., Formanová, P., Huňady, M., Eyer, L., Růžek, D. Development and testing of a new tick-borne encephalitis virus vaccine candidate for veterinary use. Vaccine 2018; in press. DOI: /j.vaccine

5 1. Úvod - klíšťová encefalitida a alimentární typ přenosu Klíšťová encefalitida (KE) je z hlediska Evropy jedním z nejzávažnějších infekčních onemocnění lidí postihující centrální nervový systém (CNS). V ČR je každoročně zaznamenáváno přibližně 600 případů. Původce onemocnění, virus KE (VKE), je řazen mezi arboviry, tedy mezi viry, které jsou přenášeny krevsajícími členovci (Palus a Růžek, 2013). Taxonomicky je virus řazen do čeledi Flaviviridae, genom viru tvoří jednovláknová RNA kódující tři strukturní proteiny (C, M, E) a sedm nestrukturních proteinů. Nukleokapsida viru je tvořena virovou nukleovou kyselinou a kapsidovým proteinem C. Toto virové jádro je obaleno lipidovou membránou obsahující proteiny M a E. Hlavním povrchovým antigenem je právě protein E, který umožňuje vazbu na povrchové receptory hostitelské buňky a zprostředkovává tak její infekci (Heinz, 1986). K přenosu viru na člověka dochází nejčastěji během infestace (přichycení a sání krve) infikovaným klíštětem, méně častým způsobem přenosu je alimentární cesta po pozření mléka kontaminovaného VKE. Hlavním přenašečem klíšťové encefalitidy v rámci České republiky je klíště obecné (Ixodes ricinus), výskyt KE je proto úzce svázán s rozšířením tohoto parazita a obdobím jeho aktivity během roku. Nejzávažnější forma onemocnění KE se projevuje jako encefalomyelitida (zánět mozku a míchy), která bývá spojena s nejtěžšími nebo i fatálními případy infekce (Gritsun a kol., 2003). V evropských zemích umírá na KE přibližně 1,5 % pacientů. Se zvyšujícím se věkem nemocného roste pravděpodobnost vzniku závažnějšího onemocnění a následně narůstá i četnost trvalých následků po prodělaném onemocnění a počet smrtelných případů (Lindquist avapalahti, 2008). Vedle typických hostitelů VKE, zahrnujících obratlovce jako jsou hlodavci a hmyzožravci, kteří spolu s přenašečem sehrávají hlavní úlohu v udržení ohniska KE v daném prostředí, mohou být virem infikována také domestikovaná zvířata. U přežvýkavců má KE podobu asymptomatické infekce a nepředstavuje tak zdravotní problém pro samotného nakaženého hostitele. Riziko nákazy však ohrožuje člověka konzumujícího mléko nebo mléčné produkty. Alimentární cesta nákazy KE je druhým nejčastějším způsobem infekce člověka. Oproti náhodnému výskytu KE při infekcích přenesených klíšťaty mají alimentární infekce typický rodinný výskyt související s konzumací virem kontaminované potraviny. Zdrojem alimentární infekce člověka bylo identifikováno mléko koz, ovcí i krav infikovaných VKE (Grešíková, 1999). Přežvýkavci jsou obvykle infikováni VKE v období pastvy při sání nakaženého klíštěte. Experimentálně bylo potvrzeno, že u všech výše uvedených druhů přežvýkavců dochází po infekci KE k přechodné virémii trvající zpravidla několik dnů a následně je možné virus detekovat v mléce. Virus si v mléce při 4 C zachovává infekčnost až po dobu dvou týdnů bez výrazného poklesu titru. Ve fyziologickém roztoku přitom přežívá za stejných podmínek po 14 dnech sledování pouze minimální množství virových částic. Na základě těchto zjištění bylo predikováno, že mléko má 3

6 protektivní vliv na stabilitu VKE a pokud je kontaminováno, zachovává si infekčnost pro spotřebitele po celou dobu jeho použitelnosti. Životaschopný virus se podařilo prokázat i ve všech testovaných mléčných produktech (kyselé mléko, máslo, smetana, tvaroh a syrovátka), přičemž nejvyšší perzistence viru byla zaznamenána v másle, kde během dvou měsíců sledování nedošlo k poklesu výchozího titru. VKE je možné v mléce účinně inaktivovat pasterizací při 72 C (Grešíková a kol., 1960). Alimentární infekce VKE byly zaznamenány ve většině oblastí výskytu tohoto onemocnění. Nejrozsáhlejší epidemie KE způsobená konzumací nepasterizovaného kozího mléka propukla v Rožňavě v bývalém Československu v roce Mlékem kontaminovaným VKE bylo nakaženo přes 660 lidí a 271 z nich muselo být hospitalizováno kvůli závažnému průběhu onemocnění (Blaškovič, 1954). V současné době se v České republice objevují spíše lokální epidemie alimentární KE malého rozsahu. V letech bylo v České republice zaznamenáno 64 případů KE alimentárního původu, což odpovídalo 0,9 % všech případů diagnostikovaných KE v uvedeném období. Onemocnění se manifestovalo po požití tepelně neupraveného kozího mléka (56,3 %), ovčího sýra (32,8 %) nebo kravského mléka (10,9 %) (Kříž a kol., 2009). Popsán je také případ nákazy KE po požití jogurtu připraveného z nepasterizovaného mléka, ke kterému došlo v západních Čechách (Pazdiora a kol., 1994). První zdokumentovaná epidemie KE pocházející z ovčího sýru byla zaznamenána na Slovensku (Grešíková a kol., 1975), další opakované výskyty alimentárního typu infekce jsou v této zemi obvykle spojované s konzumací nepasterizovaného mléka ovcí a koz (Labuda a kol., 2002). Studie zjišťující séroprevalenci KE v chovech malých přežvýkavců v České republice zachytila pozitivní vzorky u 27 % testovaných zvířat (Salát a kol., 2017). Získané výsledky dokumentují, že prevalence infekcí VKE u malých přežvýkavců v ČR je značná. Konzumace syrového mléka, resp. tepelně neošetřených mléčných produktů tak může představovat riziko infekce KE, proto je pasterace nebo převaření mléka doporučováno jako standardní preventivní způsob ochrany před alimentární infekcí VKE. Mimo očkování lidí, které spolehlivě chrání i před alimentární infekcí VKE, se další potenciální možností ochrany spotřebitele jeví i vakcinace zvířat produkujících mléko. Experimentálně bylo ověřeno, že vakcinace koz humánní vakcínou proti KE zabraňuje rozvoji infekce a brání vylučování VKE do mléka (Balogh a kol. 2011). 4

7 2. Cíl léčebného postupu Cílem léčebného postupu je vakcinační postup využívající Vakcínu proti klíšťové encefalitidě k veterinárnímu užití chránící ovce před infekcí VKE a sloužící zejména ochraně spotřebitele před alimentární infekcí KE. Konkrétním cílem tohoto vakcinačního postupu je aktivní imunizace ovcí připravenou vakcínou proti VKE, vytvořené protilátky pak zabraňují virémii u infikovaných zvířat a kontaminaci mléka VKE. Vakcína proti klíšťové encefalitidě k veterinárnímu užití byla vyvinuta v rámci řešení grantového projektu Národní agentury pro zemědělský výzkum - KEVAK QJ , který je řešen na Výzkumném ústavu veterinárního lékařství, v. v. i. ve spolupráci s Biovetou a. s. Připravená vakcína je chráněna užitným vzorem CZ U1 (Salát a kol., 2018 a) a informace o její přípravě a účinnosti byly zveřejněny jak v českém odborném periodiku (Salát a kol., 2018 b) tak v mezinárodním vědeckém tisku (Salát a kol., 2018 c). Užitný vzor a publikace jsou přiloženy jako součást tohoto dokumentu. 5

8 3. Údaje o přípravku a vakcinační postup NÁZEV VETERINÁRNÍHO PŘÍPRAVKU BioOvis TBE (provizorní název) KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ SLOŽENÍ Každá dávka vakcíny (1 ml) obsahuje: Účinné látky: Purifikovaný inaktivovaný virus klíšťové encefalitidy (kmen Hypr) 10 μg Adjuvans: Hydroxid hlinitý ve formě 2 % Alhydrogelu 0,1 ml Pomocné látky: Formaldehyd 37 % max. 0,55 mg/ml Úplný seznam pomocných látek uveden v kapitole LÉKOVÁ FORMA Injekční emulze Neprůhledná bílá emulze KLINICKÉ ÚDAJE Cílové druhy zvířat Ovce Indikace s upřesněním pro cílový druh zvířat K aktivní imunizaci ovcí za účelem vytvoření protilátek zabraňující virémii u infikovaných zvířat a kontaminaci mléka VKE Kontraindikace Klinicky nemocné a z nemoci podezřelé ovce Zvláštní upozornění pro každý cílový druh Nejsou Zvláštní opatření pro použití Není Nežádoucí účinky (frekvence a závažnost) Nebyly zaznamenány žádné nežádoucí reakce Použití v průběhu březosti a laktace Vakcína nebyla testována na březích zvířatech. Vakcinace na zvířatech v laktaci je účinná. 6

9 Interakce s dalšími léčivými přípravky a další formy interakce Nejsou dostupné informace o bezpečnosti a účinnosti této vakcíny, pokud je podávána zároveň s jiným veterinárním léčivým přípravkem. Rozhodnutí o použití této vakcíny před nebo po jakémkoliv jiném veterinárním léčivém přípravku musí být provedeno na základě zvážení jednotlivých případů Podávané množství a způsob podání Vakcinační dávka: 1 ml Vakcína je aplikována subkutánně za lopatkou. Před použitím je nutné vakcínu pomalu ohřát při pokojové teplotě a těsně před použitím důkladně protřepat. Pro aplikaci použijte sterilní injekční jehlu a stříkačku. Kompletní vakcinace zahrnuje tři dávky podané ve dvoutýdenních intervalech Ochranné lhůty bez ochranných lhůt IMUNOLOGICKÉ VLASTNOSTI Vakcína obsahuje antigeny VKE kmen Hypr. Antigeny ve vakcíně po subkutánní aplikaci do těla vakcinovaného jedince aktivují imunitní systém a tvorbu protilátek. Vakcinovaná zvířata produkují protilátky, které zabraňují virémii u infikovaných zvířat a kontaminaci mléka VKE FARMACEUTICKÉ ÚDAJE Úplný seznam pomocných látek Formaldehyd Dihydrogenfosforečnan draselný Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát Chlorid draselný Chlorid sodný Voda Inkompatibility Nejsou známy Doba použitelnosti Doba použitelnosti veterinárního léčivého přípravku v neporušeném obalu bude stanovena na základě stabilitních studií, které dosud probíhají (cílem je 24 měsíců) Zvláštní opatření pro uchování Uchovávejte při teplotách 2 8 C. Chraňte před mrazem. Chraňte před světlem. 7

10 4. Legislativní požadavky Metody testování a návrh pokusů ověření bezpečnosti a účinnosti vakcíny byly zpracovány dle požadavků následujících dokumentů: - Evropský lékopis (Ph. Eur.) - článek " Evaluation of safety of veterinary vaccines and immunosera", - Evropský lékopis (Ph. Eur.) - článek "Evaluation of efficacy of veterinary vaccines and immunosera" - COMISSION DIRECTIVE 2009/9/EC of 10 February Duration of protection achieved by veterinary vaccines (EMEA/CVMP/682/99) - Evropský lékopis (Ph. Eur.) - článek 0062 "Vaccine ad usum veterinarium" - Guideline on requirements for the production and control of immunological veterinary medicinal products (EMA/CVMP/IWP/206555/2010) - Guideline on target animal safety for veterinary live and inactivated vaccines (EMEA/CVMP/VICH/359665/2005) - Note for guidance: Field trials with veterinary vaccines ( EMEA/CVMP/852/99). - Guideline on good clinical practices (VICH Topic GL9, CVMP/VICH/595/98-Final) - Guideline on statistical principles for veterinary clinical trials (EMEA/CVMP/816/00- Final) - Requirements for tick-borne encephalitis vaccine (WHO expert committee on biological standardization, 1999) - Nařízení vlády 361/2007 Sb. 8

11 5. Bezpečnost a imunogenita vakcinačního postupu Ověření bezpečnosti a imunogenity vakcinačního postupu na modelovém organismu Metodický postup S ohledem na bezpečnostní protokol testování humánní vakcíny proti KE, který doporučuje World Health Organisation (WHO 1999), byla každá připravená šarže vakcíny nejprve testována na myším modelu. Skupina deseti laboratorních myší byla subkutánně imunizována připravenou vakcínou, dalších deset myší bylo kontrolních. Celkový objem jedné dávky aplikované vakcíny byl v tomto případě 0,15 ml, ostatní parametry vakcíny zůstaly zachovány. Imunizační proces byl proveden třemi dávkami vakcíny s časovými prodlevami 14 dnů mezi jednotlivými dávkami. Týden po poslední aplikaci vakcíny bylo stanoveno množství specifických protilátek proti VKE v séru imunizovaných myší metodou ELISA. Výsledky jsou uvedeny ve specifických jednotkách VIEU/ml (hodnocení výsledku: negativní (0 63 VIEU/ml), hraniční (63 126), pozitivní (126 a více)) Výsledky Vakcína byla bezpečná a byla zvířaty dobře snášena. Připravená vakcína vyvolala tvorbu specifických anti-vke protilátek (Obr. 1). Obr. 1.: Imunogenita vakcíny na modelovém organismu. Vynesena je průměrná hodnota všech analyzovaných vzorků ve skupině se směrodatnou odchylkou. Statistická významnost je označena hvězdičkou Ověření bezpečnosti a imunogenity vakcinačního postupu na cílovém organismu Metodický postup Bezpečnost vakcinačního postupu byla ověřena ve třech nezávislých studiích na ovci domácí (A laboratorní studie, B laboratorní studie, C klinická studie). V rámci vakcinačních experimentů byla použita pouze zvířata bez specifických protilátek proti VKE. Ovce ve všech studiích byly vakcinovány podle navrženého schématu (tři dávky vakcíny ve 14 denních intervalech). Celkový objem jedné dávky aplikované vakcíny byl 1 ml, vakcína byla aplikována subkutánně za lopatkou. V rámci ověření 9

12 bezpečnosti vakcíny byly po vakcinaci sledovány lokální a systémové reakce 2 h, 4 h a 6 h od vakcinace a denně po dobu alespoň 14 dní. Veškeré aplikace přípravků a měření byly provedeny kvalifikovanou osobou veterinárním lékařem. Zvířatům byla měřena rektální teplota pomocí kalibrovaného teploměru před vakcinací a po vakcinaci/revakcinaci během období, ve kterém se očekával vzestup teplot jako reakce na vakcinační proces (viz popis jednotlivých studií). V indikovaných časech během vakcinačního procesu a po něm byly zvířatům odebírány vzorky krve. Následně byla v připravených vzorcích sér měřena hladina specifických anti- VKE protilátek metodou ELISA (výsledky jsou uváděny ve specifických jednotkách VIEU/ml (hodnocení výsledku: negativní (0 63 VIEU/ml), hraniční (63 126), pozitivní (126 a více)) a virus neutralizačním testem. Metodický popis jednotlivých experimentálních studií: A) Laboratorní studie ovce jehňata stáří 6 měsíců Studie byla provedena v experimentálních stájích podniku Bioveta, a. s. Experimentální zvířata (ovce - jehňata, 3 jedinci, stáří 6 měsíců) byla vakcinována podle schématu uvedeného výše. Další čtyři jedinci byli využiti jako nevakcinované kontroly. Tělesná teplota byla zvířatům měřena den před vakcinací (D -1), těsně před vakcinací (D 0) a dále sedm dnů následujících po vakcinaci (D 1 až D 7). Vzorky krve pro serologické analýzy byly odebírány v časech (D 0, D 14, D 28, D 35, D 42 a D 49). Vakcinovaná a nevakcinovaná zvířata byla následně využita k ověření účinnosti vakcíny infekčním pokusem (viz část 6. Účinnost vakcinačního postupu). B) Laboratorní studie ovce laktující stáří 2 roky Studie byla provedena v experimentálních stájích podniku Bioveta, a. s. Experimentální zvířata (ovce laktující, 7 jedinců, stáří 2 roky) byla vakcinována podle schématu uvedeného výše. Tělesná teplota byla zvířatům měřena den před vakcinací (D -1), těsně před vakcinací (D 0), čtyři hodiny po aplikaci vakcíny (H 4) a dále čtyři dny následujících po vakcinaci (D 1 až D 4). Vzorky krve pro serologické analýzy byly odebírány v časech (D 0, D 14, D 28, D 42, D 56, D 70). Vakcinované ovce a příslušná nevakcinovaná zvířata byla následně využita k ověření účinnosti vakcíny infekčním pokusem (viz část 6. Účinnost vakcinačního postupu). C) Klinická studie ovce stáří 16 měsíců Studie byla provedena v chovném zařízení podniku Bioveta, a. s. Zvířata (ovce, 10 jedinců, stáří 16 měsíců) byla vakcinována podle schématu uvedeného výše. Tělesná teplota byla zvířatům měřena den před vakcinací (D -1), těsně před vakcinací (D 0), čtyři hodiny po aplikaci vakcíny (H 4) a dále čtyři dny následujících po vakcinaci (D 1 až D 4). Vzorky krve pro serologické analýzy byly odebírány v časech (D 0, D 14, D 28, D 42, D 59) Výsledky Vakcína vyhovuje testu, pokud žádné z vakcinovaných zvířat nevykazuje abnormální lokální nebo systémové reakce a neuhyne z příčin přisuzovaných vakcinaci. Průměrná teplota nesmí přesáhnout rozdíl 1,5 C od výchozí teploty pro všechna zvířata a žádnému jedinci se nezvýší teplota o 10

13 více než o 2 C od průměru naměřeného z teplot před vakcinací. Budou shrnuta abnormální klinická data. Měření místních a systémových reakcí bude zaznamenáno a předloženo. Popis výsledků jednotlivých experimentálních studií: A) Laboratorní studie ovce jehňata stáří 6 měsíců Po první aplikaci vakcíny bylo nejvyšší průměrné zvýšení teploty v čase D 1, a to o 0,2 C (Tab. 1). V dalších dnech byla zaznamenána nižší průměrná teplota než ve výchozím stavu. Nejvyšší vzestup teploty na jedince nepřekročil v celém sledovaném období 0,5 C. Po druhé aplikaci vakcíny bylo nejvyšší průměrné zvýšení teploty o 0,3 C v časových intervalech D 1, D 3, D 4 a D 5. Nejvyšší zvýšení teploty na jedince bylo o 0,6 C, a to jen u jednoho jedince v čase D 1. Po třetí aplikaci vakcíny bylo nejvyšší průměrné zvýšení teploty o 0,5 C v časovém intervalu D 2. Nejvyšší zvýšení teploty na jedince bylo o 0,8 C, v čase D 2. Nežádoucí celkové reakce a reakce v místě aplikace vakcíny nebyly pozorovány. Tab. 1: Ověření bezpečnosti vakcíny v laboratorní studii A: přehled změn teplot po aplikaci vakcíny Režim studie Laboratorní studie Aplikace vakcíny I. dávka II. dávka III. dávka Skupina Průměrná teplota před Změna teploty oproti výchozímu stavu ( C) vakcinací (D -1, D 0) ( C) D 1 D 2 D 3 D 4 D 5 D 6 D 7 vakcinovaná 39,4 0,2-0,3-0,3-0,4-0,5-0,1-0,6 kontrolní 39,4 0-0,3-0,4-0,5-0,5 0-0,5 vakcinovaná 38,9 0,3 0 0,3 0,3 0,3 0,1 0,1 kontrolní 39,3 0,1-0,1-0,1-0,2-0,2-0,1-0,1 vakcinovaná 38,9 0,3 0,5 0,2 0,3 0,4 0,4 0,3 kontrolní 39,6-0,5-0,5-0,4-0,4-0,5-0,4-0,4 Detekce specifických protilátek proti VKE v séru prokázala jejich tvorbu u vakcinovaných zvířat (Obr. 2). Dva týdny po aplikaci druhé dávky a v dalších časových intervalech vakcíny bylo množství protilátek v séru statisticky významně vyšší než v séru zvířat před vakcinací. Obr. 2: Laboratorní studie A: tvorba specifických protilátek proti VKE u vakcinovaných ovcí. Vynesena je průměrná hodnota všech analyzovaných vzorků ve skupinách se směrodatnou odchylkou. Šipka označuje termín aplikace vakcíny. Statistická významnost je označena hvězdičkou. 11

14 Virus neutralizačním testem bylo dále ověřeno, že tyto specifické protilátky mají virus neutralizační účinek. U nevakcinovaných zvířat nebyly specifické protilátky detekovány. Dva týdny po aplikaci druhé dávky a v dalších časových intervalech vakcíny bylo množství neutralizačních protilátek v séru statisticky významně vyšší než v séru zvířat před vakcinací (Obr. 3). Obr. 3: Laboratorní studie A: tvorba neutralizačních protilátek proti VKE u vakcinovaných ovcí. Vynesena je průměrná hodnota všech analyzovaných vzorků ve skupině se směrodatnou odchylkou. Statistická významnost je označena hvězdičkou. B) Laboratorní studie ovce laktující stáří 2 roky V případě vakcinace laktujících ovcí bylo po první aplikaci vakcíny zjištěno nejvyšší průměrné zvýšení teploty v čase D 3, a to o 0,2 C (Tab. 2). Nejvyšší vzestup teploty u jedince byl 1,1 C v čase D 1. Po druhé aplikaci vakcíny nebyl pozorován vzestup průměrných teplot. Nejvyšší zvýšení teploty na jedince bylo o 0,3 C, a to jen u jednoho jedince v čase D 1. Po třetí aplikaci vakcíny nebylo pozorováno průměrné zvýšení teploty. Nejvyšší zvýšení teploty na jedince bylo o 0,1 C, v čase D 1. Nežádoucí celkové reakce a reakce v místě aplikace vakcíny nebyly pozorovány. Tab. 2: Ověření bezpečnosti vakcíny v laboratorní studii B: přehled změn teplot po aplikaci vakcíny Režim studie Aplikace vakcíny Průměrná teplota před vakcinací (D-1, D 0) ( C) Změna teploty oproti výchozímu stavu ( C) 4 H 1 D 2 D 3 D 4 D I. dávka 39,7-0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 Laboratorní studie II. dávka 39,9-0,1-0,1-0,1-0,1-0,3 III. dávka 39,8-0, ,1-0,2 Vakcinace vyvolala tvorbu specifických protilátek proti VKE. Dva týdny po aplikaci druhé dávky a v dalších časových intervalech vakcíny bylo množství protilátek v séru statisticky významně 12

15 vyšší než v séru zvířat před vakcinací (Tab. 3). Virus neutralizačním testem bylo dále ověřeno, že tyto specifické protilátky mají virus neutralizační účinek (počínaje časem 28 dnů po první dávce vakcíny). Tab. 3: Laboratorní studie B: produkce protilátek po vakcinaci u laktujících ovcí Koncentrace anti-vke specifických protilátek (VIEU/ml) Čas (dny) 0 (I. dávka) 14 (II. dávka) 28 (III. dávka) Průměr 7,7 71,8 130,7 * 212,4 * 170,9 * 123,2 * S. O. 1,0 42,8 48,4 72,7 70,8 53,6 V tabulce je uvedena průměrná hodnota koncentrace anti-vke specifických protilátek IgG v séru všech vakcinovaných zvířat spolu se směrodatnou odchylkou výběru (S. O.). Statistická významnost je označena hvězdičkou. C) Klinická studie ovce stáří 16 měsíců V případě vakcinace ovcí v rámci klinické studie nebylo po první aplikaci vakcíny zjištěno zvýšení průměrné zvýšení teploty (Tab. 4). Nejvyšší vzestup teploty u jedince byl změřen u tří jedinců, a to o 0,2 C v čase D 1. Po druhé aplikaci vakcíny bylo nejvyšší zvýšení průměrné teploty o 0,4 C detekováno v čase D 1 a D 3. Nejvyšší zvýšení teploty u jedince bylo o 0,8 C (v čase D 1) a 0,6 C (v čase D 3). Po třetí aplikaci vakcíny bylo pozorováno průměrné zvýšení teploty o 0,1 C v časech D 1 až D 4. Nejvyšší zvýšení teploty na jedince bylo o 0,8 C, v čase D 1. Nežádoucí celkové reakce a reakce v místě aplikace vakcíny nebyly pozorovány. Tab. 4: Ověření bezpečnosti vakcíny v klinické studii C: přehled změn teplot po aplikaci vakcíny Režim studie Aplikace vakcíny Průměrná teplota před vakcinací (D-1, D 0) ( C) Změna teploty oproti výchozímu stavu ( C) H 4 D 1 D 2 D 3 D 4 I. dávka 39, ,1 0 0 Klinická studie II. dávka 38,9 0,4 0,3 0,3 0,4 0 III. dávka 38,8-0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Aplikace vakcíny vyvolala tvorbu specifických protilátek proti VKE. Čtrnáct dnů po aplikaci druhé dávky a v dalších časových intervalech vakcíny bylo množství protilátek v séru statisticky významně vyšší než v séru zvířat před imunizací (Tab. 5). Virus neutralizačním testem bylo dále ověřeno, že tyto specifické protilátky mají virus neutralizační účinek (viz kapitola ). Tab. 5: Klinická studie C: produkce protilátek u ovcí Koncentrace anti-vke specifických protilátek (VIEU/ml) Čas (dny) 0 (I. dávka) 14 (II. dávka) 28 (III. dávka) Průměr 15,2 96,6 312,9 * 486,9 * 475,8 * S. O. 8,1 92,1 54,5 38,7 30,7 V tabulce je uvedena průměrná hodnota koncentrace anti-vke specifických protilátek IgG v séru všech vakcinovaných zvířat spolu se směrodatnou odchylkou výběru (S. O.). Statistická významnost je označena hvězdičkou. 13

16 5. 3. Závěr - ověření bezpečnosti a imunogenity vakcinačního postupu Na základě výsledků výše uvedených studií je zřejmé, že vakcína vyhovuje požadavkům na bezpečnost. Vakcína byla bezpečná jak při testování na modelovém tak i na cílovém organismu. Nežádoucí celkové reakce a reakce v místě aplikace vakcíny nebyly pozorovány. Vakcína vyhověla i kritériím v ověřování bezpečnosti na základě změn tělesné teploty. Vakcína je imunogenní, její aplikace vyvolává u ovcí tvorbu specifických protilátek proti VKE s prokázaným virus neutralizačním účinkem. 14

17 6. Účinnost vakcinačního postupu Ověření účinnosti vakcinačního postupu na modelovém organismu Metodický postup Účinnost každé připravené šarže vakcíny byla nejprve testována na modelovém organismu podle bezpečnostního protokolu testování humánní vakcíny proti KE, který doporučuje World Health Organisation (WHO 1999). Skupina deseti laboratorních myší byla po vakcinaci (viz Ověření bezpečnosti a imunogenity vakcinačního postupu na modelovém organismu) experimentálně infikována VKE. Pět myší bylo infikováno kmenem KE Hypr (kmen využívaný pro přípravu vakcíny), zbývajících pět myší bylo infikováno kmenem KE 9001 (terénní izolát z klíštěte). Dalších deset nevakcinovaných myší bylo použito jako kontroly: pět myší bylo infikováno KE Hypr a pět KE Následně byla po dobu 28 dnů sledována morbidita, v případě rozvoje příznaků KE byly myši utraceny. Byla porovnána střední doba přežívání vakcinovaných a kontrolních myší Výsledky Imunizace navodila ochranu před rozvojem letální infekce KE u všech imunizovaných myší (Obr. 4). Naproti tomu u všech experimentálně infikovaných nevakcinovaných myší došlo k rozvoji fatální formy klíšťové encefalitidy. Rozdíl byl statisticky významný pro oba použité kmeny VKE. Obr. 4: Přežívání vakcinovaných a kontrolních myší v infekčním experimentu. Myši byly infikovány VKE Hypr (A) nebo 9001 (B) Ověření účinnosti vakcinačního postupu na cílovém organismu Metodický postup VKE je řazen do skupiny biologických činitelů skupiny 3 (Nařízení vlády 361/2007 Sb.) Pracoviště používající biologické činitele této kategorie musí splňovat příslušné nároky na biologickou ochranu, proto není možné provádět infekční pokusy s VKE v podmínkách běžného komerčního chovu. Z tohoto důvodu byla účinnost vakcinace u ovcí (prováděná infekčními pokusy) testována v podmínkách experimentálních stájí v podniku Bioveta, a.s. splňující tyto vysoké bezpečnostní nároky. Klinické testování spočívalo v monitoringu postvakcinačních protilátek imunizovaných ovcí a v průkazu jejich virus neutralizačního účinku v chovném zařízení podniku Bioveta, a.s. 15

18 Metodický popis jednotlivých experimentálních studií: A) Laboratorní studie ovce jehňata stáří 6 měsíců Studie byla provedena v experimentálních stájích podniku Bioveta, a. s. V experimentu byla využita skupina vakcinovaných (3 ks) a nevakcinovaných (4 ks) ovcí (viz Ověření bezpečnosti a imunogenity vakcinačního postupu na cílovém organismu - Metodický popis jednotlivých experimentálních studií - A) Laboratorní studie ovce jehňata stáří 6 měsíců). Obě skupiny zvířat byly infikovány terénním kmenem VKE (KE 9001). Následně jim byla ve vybraných časových intervalech (každý den během prvního týdne a poté v časech 8, 10, 12, 14, 21 a 28 DPI) odebírána krev za účelem sledování hladiny virémie s využitím metody plakové titrace a na molekulární úrovni pomocí metody kvantitativní reverzně transkripční PCR (qrt-pcr) detekující virovou RNA. B) Laboratorní studie ovce laktující stáří 2 roky Studie byla provedena v experimentálních stájích podniku Bioveta, a. s. V experimentu byla využita skupina vakcinovaných (4 ks) a nevakcinovaných (4 ks) laktujících ovcí (viz Ověření bezpečnosti a imunogenity vakcinačního postupu na cílovém organismu - Metodický popis jednotlivých experimentálních studií - B) Laboratorní studie ovce laktující stáří 2 roky). Všechna zvířata byla infikovány kmenem VKE (KE 9001). Poté jim byla ve vybraných časových intervalech (každý den během prvního týdne a poté v časech 8, 10, 12, 14, 21 a 28 DPI) odebírána krev za účelem sledování hladiny virémie s využitím metody plakové titrace a qrt-pcr. V identických časových intervalech byly odebírány i vzorky mléka za účelem detekce RNA VKE metodou qrt-pcr. C) Klinická studie ovce stáří 16 měsíců Studie byla provedena v chovném zařízení podniku Bioveta, a. s. Ve studii byla využita skupina vakcinovaných zvířat (10 ks) (viz Ověření bezpečnosti a imunogenity vakcinačního postupu na cílovém organismu - Metodický popis jednotlivých experimentálních studií - C) Klinická studie ovce stáří 16 měsíců). Klinické testování spočívalo v monitoringu postvakcinačních protilátek imunizovaných ovcí metodou ELISA a v průkazu jejich virus neutralizačního účinku Výsledky Popis výsledků jednotlivých experimentálních studií: A) Laboratorní studie ovce jehňata stáří 6 měsíců V případě ověřování účinnosti vakcinace na ovcích (stáří 6 měsíců) byly získány následující výsledky. Imunizace ovcí připravenou vakcínou zabránila virémii, VKE nebyl zachycen u žádného ze tří vakcinovaných zvířat. Naproti tomu u tří zvířat z nevakcinované skupiny (4 jedinci) byla metodou plakové titrace prokázána přítomnost VKE v krvi, virus byl zachycen u tří zvířat v čase 2 DPI a u jednoho zvířete v čase 3 DPI (průměrný titr: PFU/ml). VKE v krvi zvířat byl potvrzen i metodou qrt-pcr, kdy byla prokázána přítomnost virové RNA u tří nevakcinovaných zvířat v čase 3 DPI (průměrná hodnota: 3,1±0, TBEV kopií/ml). Ochranný efekt vakcinace ve vztahu k přítomnosti viremie u vakcinovaných a kontrolních zvířat byl statisticky významný. 16

19 B) Laboratorní studie ovce laktující stáří 2 roky Experiment provedený na laktujících ovcích (stáří 2 roky) potvrdil účinnost vakcíny. Imunizace v navrženém schématu vakcinačního postupu zabraňuje virémii a následnému přestupu VKE do mléka. VKE nebyl zachycen v séru ani mléku žádného ze čtyř vakcinovaných zvířat. Naproti tomu u tří zvířat z nevakcinované skupiny (4 jedinci) byla metodou plakové titrace prokázána přítomnost VKE v krvi, virus byl zachycen u dvou zvířat v čase 1 DPI, u tří zvířat v čase 2 DPI a u jednoho zvířete v čase 4 DPI. Stěžejním výsledkem této studie byl rozdíl v záchytu VKE v mléku u vakcinovaných a nevakcinovaných zvířat. Pouze u kontrolních zvířat byla metodou qrt-pcr zachycena virová RNA v mléku, a to u dvou ovcí (ze čtyř) v čase 6 DPI (průměrná hodnota: 3,1±0, TBEV kopií/ml). C) Klinická studie ovce stáří 16 měsíců V rámci klinické studie byla sledována produkce anti-vke protilátek. Výsledky jsou uvedeny ve specifických jednotkách VIEU/ml (hodnocení výsledku: negativní (0 63 VIEU/ml), hraniční (63 126), pozitivní (126 a více)) pro každé vakcinované zvíře a sledovaný časový interval (Tab. 6). Tab. 6: Klinická studie C: produkce protilátek u ovcí hodnoty pro jednotlivá zvířata Koncentrace anti-vke specifických protilátek (VIEU/ml) Čas (dny) 0 (I. dávka) 14 (II. dávka) 28 (III. dávka) ,1 242,7 316,3 512,4 504, ,8 163,8 361,2 535,8 484, ,0 15,1 229,6 524,1 487, ,8 4,5 214,1 433,1 439,2 ovce ,5 78,9 371,2 431,9 410,0 (číslo) ,3 8,3 305,2 463,9 469, ,9 54,3 295,8 494,4 467, ,2 200,5 350,1 457,5 505, ,4 13,8 324,1 488,0 496, ,6 184,5 362,0 528,3 495,6 Průměr 15,2 96,6 312,9 * 486,9 * 475,8 * S. O. 8,1 92,1 54,5 38,7 30,7 V tabulce je uvedena koncentrace anti-vke specifických protilátek IgG v séru všech vakcinovaných zvířat. Dále je uvedena průměrná hodnota spolu se směrodatnou odchylkou výběru (S. O.) pro celou skupinu zvířat. Statisticky zvýšené koncentrace oproti stavu před vakcinací (čas 0) jsou označeny hvězdičkou. Protektivní efekt VKE specifických protilátek byl vyhodnocen virus neutralizačním testem. Byl zjišťován titr neutralizačních protilátek v séru pro každé vakcinované zvíře a sledovaný časový interval po dokončené vakcinaci v časech 42 a 59 po podání první dávky vakcíny. Bylo zjištěno, že specifické protilátky proti VKE primárně detekované metodou ELISA (viz výše) mají virus neutralizační účinek. Neutralizace VKE séry imunizovaných ovcí byla prokázána v obou testovaných intervalech (Tab. 7). Koncentrace virus neutralizačních protilátek v séru vakcinovaných zvířat byla ve srovnání s koncentracemi protilátek před vakcinací statisticky významně vyšší. 17

20 Tab. 7: Klinická studie C: produkce neutralizačních protilátek u ovcí hodnoty pro jednotlivá zvířata ovce (číslo) Čas (dny) Průměr S. O. Titr anti-vke neutralizačních protilátek ,0 80, ,0 80, ,0 160, ,0 80, ,0 160, ,0 160, ,0 160, ,0 80, ,0 160, ,0 160,0 0,0 109,23 * 121,7 * 0,0 47,9 41,3 V tabulce je uvedena koncentrace anti-vke neutralizačních protilátek v séru všech vakcinovaných zvířat. Za pozitivní výsledek je považován titr 20 a vyšší. Dále je uvedena průměrná hodnota spolu se směrodatnou odchylkou výběru (S. O.) pro celou skupinu zvířat. Statisticky zvýšené koncentrace oproti stavu před vakcinací (čas 0) jsou označeny hvězdičkou Závěr V rámci testování účinnosti vakcinačního postupu se podařilo prokázat, že imunizace připravenou vakcínou navozuje ochranu před rozvojem infekce VKE jak v modelovém tak v cílovém organismu. Postvakcinační anti-vke protilátky mají virus neutralizační účinek. Bylo prokázáno, že vakcinace zabraňuje virémii a přestupu VKE do mléka vakcinovaných ovcí. 18

21 7. Seznam použité literatury Balogh, Z., Egyed, L., Ferenczi, E., Bán, E., Szomor, K.N., Takács, M., Berencsi, G. Experimental infection of goats with tick-borne encephalitis virus and the possibilities to prevent virus transmission by raw goat milk. Intervirology 2011;55: Blaškovič, D., Epidémia encefalitídy v Rožňavskom prírodnom ohnisku nákaz. SAV, Bratislava Grešíková, M., Havárnek, I., Gorner, F. Vplyv pasterizácie na infektivitu vírusu kliestovej encefalitídy. Vet Cas 1960;9: Grešíková, M., Sekeyova, M., Stupalova, S., Necas, S. Sheep milk-borne epidemic of tick-borne encephalitis in Slovakia. Intervirology 1975;5: Grešíková, M. Kliešťova encefalitída trvalý verejno-zdravotnícky problém. Veda, SAV, Bratislava Gritsun, T.S., Lashkevich, V.A., Gould, E.A. Tick-borne encephalitis. Antiviral Res 2003;57: Heinz, F.X. Epitope mapping of flavivirus glycoproteins. Adv Virus Res 1986;31: Kříž, B., Beneš, Č., Daniel, M. Alimentary transmission of tick-borne encephalitis in the Czech Republic ( ). Epidemiol Mikrobiol Imunol 2009;58: Labuda, M., Elecková, E., Licková, M., Sabó, A. Tick-borne encephalitis virus foci in Slovakia. Int J Med Microbiol 2002;291, Suppl 33:43-7. Lindquist, L., Vapalahti, O. Tick-borne encephalitis. Lancet 2008;371: Palus, M., Růžek, D. Klíšťová encefalitida stále více otazníků než jasných odpovědí. Vakcinologie 2013;7: Pazdiora, P., Morávková, I., Bruj, J. Alimentární přenos u rodinného výskytu klíšťové encefalitidy. Prak Lék 1994;74: Salát, J., Šlosárková, S., Růžek, D. Klíšťová encefalitida u malých přežvýkavců. Veterinářství 2017;67: Salát, J., Růžek, D., Formanová, P., Eyer, L., Huňady, M. Vakcína proti klíšťové encefalitidě k veterinárnímu užití. Užitný vzor CZ U1. Úřad průmyslového vlastnictví 2018 a. Salát, J., Šlosárková, S., Huňady, M., Růžek, D. Vakcinace malých přežvýkavců proti klíšťové encefalitidě. Veterinářství 2018 b;68: Salát, J., Formanová, P., Huňady, M., Eyer, L., Růžek, D. Development and testing of a new tickborne encephalitis virus vaccine candidate for veterinary use. Vaccine 2018 c; in press. DOI: /j.vaccine WHO expert committee on biological standardization Requirements for tick-borne encephalitis vaccine (inactivated). In: WHO Technical Report Series, 889. World Health Organization, Geneva, pp

22

23 Příloha 1 Salát, J., Růžek, D., Formanová, P., Eyer, L., Huňady, M. Vakcína proti klíšťové encefalitidě k veterinárnímu užití Užitný vzor CZ U1 Úřad průmyslového vlastnictví 2018

24

25 Document number: 31355; Page: 0

26 Document number: 31355; Page: 1

27 Document number: 31355; Page: 2

28 Document number: 31355; Page: 3

29 Document number: 31355; Page: 4

30 Document number: 31355; Page: 5

31 Document number: 31355; Page: 6

32

33 Příloha 2 Salát, J., Šlosárková, S., Huňady, M., Růžek, D. Vakcinace malých přežvýkavců proti klíšťové encefalitidě Veterinářství 2018; 68:

34

35 Hospodářská zvířata Vakcinace malých přežvýkavců proti klíšťové encefalitidě RNDr. Jiří Salát, Ph.D., vědecký pracovník MVDr. Soňa Šlosárková, Ph.D., vědecký pracovník J. SALÁT, 1 S. ŠLOSÁRKOVÁ, 1 M. HUŇADY, 2 D. RŮŽEK 1,3 1 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i. 2 Bioveta, a. s. 3 Parazitologický ústav, Biologické centrum Akademie věd České republiky, v. v. i. SOUHRN Salát J., Šlosárková S., Huňady M., Růžek D. Vakcinace malých přežvýkavců proti klíšťové encefalitidě. Veterinářství 2018;68(8): Klíšťová encefalitida (KE) je závažné infekční onemocnění postihující centrální nervový systém člověka. Původcem infekce je virus klíšťové encefalitidy (VKE). Člověk je obvykle nakažen během infestace infikovaným klíštětem, méně častým způsobem přenosu je alimentární infekce po požití mléka nebo mléčných produktů pocházejících od infikovaných koz, ovcí či krav. V letech 2015 až 2018 jsme provedli epidemiologickou studii analyzující séroprevalenci KE v chovech malých přežvýkavců v České republice. Vyšetřením 571 vzorků z 56 hospodářství bylo zjištěno, že výskyt KE je poměrně častý. U koz byla séroprevalence 24 %, u ovcí 39 % a pozitivní vzorky byly zaznamenány v 79 % chovů koz a v 97 % chovů ovcí. Následně byly provedeny experimenty za účelem zavedení infekčních modelů a ověření produkce a stability postinfekčních protilátek. Vedle pasterizace mléka a vakcinace lidí je další potenciální ochranou konzumenta před alimentární infekcí VKE imunizace přežvýkavců. Byla vyvinuta experimentální vakcína proti KE pro veterinární použití. Sérií experimentů na modelových a cílových organismech bylo prokázáno, že vakcína je bezpečná, indukuje produkci specifických protilátek proti VKE a chrání imunizovaná zvířata před rozvojem infekce. MVDr. Milan Huňady, pracovník biologického vývoje SUMMARY Salát J., Šlosárková S., Huňady M., Růžek D. Vaccination of small ruminants against tick-borne encephalitis. Veterinářství 2018;68(8): Tick-borne encephalitis (TBE) is a serious infection affecting human nervous system. TBE virus (TBEV) is the etiological agent of disease. The human being is typically infected by ticks during their feeding. Less frequent natural route of human TBEV infection is associated with the consumption of unpasteurized milk or milk products from infected goats, sheep, and cows. We performed sero-epidemiological study to analyse presence of TBE in small ruminants in the Czech Republic. In total, 571 samples from 56 farms were examined. We found high seroprevalence of TBE in tested localities with 24% and 39% of positive samples in goats and sheep, respectively. Positive samples were detected at 78% and 98% of goat and sheep farms, respectively. We developed infectious models to measure post-infectious antibody production and its stability. Apart from pasteurization of milk and vaccination of humans, immunisation of small ruminants is other potential possibility of protection against alimentary infection with TBEV. We therefore developed an experimental vaccine against TBE for veterinary use. Experiments performed on model and target animals demonstrated safety of vaccine and its ability to induce production of neutralizing antibodies against TBEV, and protect immunised animals against development of this infection. doc. RNDr. Daniel Růžek, Ph.D., vedoucí vědecký pracovník Úvod Klíšťová encefalitida (KE) je jedno z nejzávažnějších infekčních onemocnění lidí postihující centrální nervový systém (CNS) vyskytující se v Evropě. Česká republika je dlouhodobě řazena mezi země s nejvyšší incidencí KE, každý rok bývá diagnostikováno přibližně 600 případů klinického onemocnění. Onemocnění způsobuje virus KE (VKE), který je řazen mezi arboviry, což je skupina virů, které přenášejí krevsající členovci. Z taxonomického hlediska patří virus do čeledi Flaviviridae, rodu Flavivirus. VETERINÁŘSTVÍ 8/

36 Hospodářská zvířata Dědičná informace je uložena v jednovláknové RNA umožňující v cílové buňce produkci tří strukturních (C, M, E) a sedmi nestrukturních proteinů. Protein C a virová RNA tvoří nukleokapsidu, která je obalena membránou obsahující proteiny M a E. Obalový protein E je zodpovědný za vazbu na povrchové receptory cílové buňky a umožňuje vlastní infekci. 1 Člověk je virem nejčastěji nakažen během infestace (přichycení a sání krve) infikovaným klíštětem. Druhým přirozeným způsobem nákazy je alimentární infekce po pozření mléka nebo mléčných produktů obsahujících VKE. V České republice je nejvýznamnějším přenašečem viru klíště obecné (Ixodes ricinus). VKE se proto vyskytuje výhradně v areálech rozšíření tohoto krevsajícího roztoče a frekvence výskytu KE u lidí s mírným zpožděním kopíruje míru aktivity klíšťat během roku. Klíště, které získá virus během sání krve na infikovaném obratlovci, zůstává infikované po zbytek života. Prokázán byl jak transstadiální, tak transovariální přenos viru. Virus KE tak může cirkulovat v rámci vývojového cyklu svého přenašeče a dlouhodobě přežívat na vhodné lokalitě (ohnisku nákazy), která je dána souhrnem příznivých biotických i abiotických podmínek. 2 Při infekci člověka dochází nejprve k lokální replikaci viru v místě přisátí klíštěte, následně je virus zanesen do spádových lymfatických uzlin, kde dojde k jeho pomnožení. První fáze onemocnění přichází přibližně po jednom až dvou týdnech inkubační doby a provází ji obvykle nespecifické horečnaté příznaky. Objevují se bolesti hlavy, kloubů, teplota, únava a nevolnost. Zhruba po jednom týdnu obtíže ustupují a většina pacientů se tak spontánně vyléčí. V některých případech (přibližně u jedné čtvrtiny pacientů) obvykle po jednom týdnu od vymizení prvotních příznaků virus pronikne do CNS a onemocnění přejde do sekundární (neurologické) fáze. Typickým obrazem této formy onemocnění je meningitida nebo meningoencefalitida. Poškození CNS je způsobeno množením VKE v nervové tkáni, s tím související zánětlivou imunitní odpovědi a navazujícími imunopatologickými procesy. Nejtěžší forma onemocnění se manifestuje jako kombinovaný zánět mozku a míchy (encefalomyelitida), který může vyústit ve smrtelnou formu infekce. 3 Fatální případy KE se v Evropě vyskytují přibližně u 1 % nemocných, přičemž se vzrůstajícím věkem pacienta se zvyšuje riziko vzniku závažnějšího onemocnění s častějším výskytem trvalých následků. 4 Dosud neexistuje účinný lék s přímým antivirovým účinkem na VKE. Léčba je v současnosti pouze symptomatická, o závažné případy je pečováno na infekčním oddělení či jednotce intenzivní péče. Z hlediska zdraví lidí vzrůstá v případě KE význam preventivních přístupů omezující přenos a rozvoj infekce. Vedle základních pravidel ochrany před infestací přenašeči, jako je použití repelentních přípravků a prohlídka těla po návratu z rizikové oblasti, je zásadním preventivním opatřením proti KE vakcinace dostupnými preparáty s vysokou účinností. 5 Přežvýkavci a klíšťová encefalitida V případě přežvýkavců probíhá infekce obvykle bez příznaků a nepředstavuje tak pro nakažené zvíře zdravotní problém. Jejich infekce však může vyústit v ohrožení člověka, který konzumuje mléko nebo mléčné produkty kontaminované VKE. Alimentární způsob infekce VKE je druhým nejčastějším způsobem nákazy člověka. Na rozdíl od náhodného výskytu KE při onemocněních vzniklých nakažením přímo od infikovaných klíšťat mají alimentárně získané infekce často rodinný výskyt, který souvisí s konzumací mléka nebo mléčných výrobků obsahujících VKE. 6 Po pozření potraviny infikované virem dochází k primárnímu pomnožení VKE v lymfatické tkáni, která je vázána na trávicí soustavu. Experimentálně byl tento způsob infekce potvrzen na myším modelu. 7 Analogicky jako při získání infekce od klíštěte následně onemocnění pokračuje viremickou fází a v případě závažnější formy proniká virus do CNS a může vyvolávat meningoencefalitidu. Ve srovnání s infekcemi získanými od klíšťat nemívají obvykle infekce získané alimentární cestou tak těžký průběh a také trvalé následky (neurologické postižení, parézy) se vyskytují v menší míře. 3 Jako zdroj infekce člověka VKE alimentární cestou bylo diagnostikováno mléko koz, ovcí a krav, které obsahovalo VKE. 8 Zvířata jsou obvykle infikována VKE na pastvě při infestaci infikovaným klíštětem, následně dochází k přechodné viremii a poté přichází několikadenní období, kdy je virus přítomen v mléce. Experimentálně bylo prokázáno, že v případě koz a ovcí je možné virus v mléce detekovat přibližně jeden týden po infekci. 9,10 Podobně v kravském mléce je možné virus prokázat ještě 8. den po infekci. 11 Stabilita viru v mléce je dlouhodobá. Experimentálně bylo ověřeno, že VKE zůstává v mléce při 4 C infekční až po dobu 14 dnů. Infekční virus se podařilo detekovat i v produktech připravených z mléka, jako např. kyselé mléko, máslo, smetana, tvaroh a syrovátka. 12 Účinný způsob inaktivace VKE v mléce je pasterizace při 72 C. 13 Infekce VKE alimentární cestou byly popsány ve většině zemí, kde se toto onemocnění přirozeně vyskytuje. Největší zdokumentovaná epidemie KE, která byla způsobena konzumací mléka, proběhla v roce 1951 v Rožňavě v bývalém Československu. Během epidemie bylo nakaženo přes 660 lidí a 271 z nich muselo být hospitalizováno kvůli závažnému průběhu onemocnění. Následným šetřením bylo zjištěno, že zdrojem infekce bylo kozí mléko obsahující VKE, které bylo přimícháváno do kravského mléka a touto cestou se dostalo do širší distribuce. 14 V poslední době byly v České republice zaznamenány pouze lokální epidemie alimentární KE, které měly obvykle rodinný charakter. Mezi roky 1997 až 2008 bylo v České republice zaznamenáno 64 případů alimentárních infekcí KE, což odpovídá 0,9 % všech případů diagnostikovaných KE v uvedených letech. V těchto případech se infekce objevila po požití nepasterizovaného kozího mléka (56,3 %), ovčího sýra (32,8 %) nebo kravského mléka (10,9 %). 14 Sporadické výskyty lokálních epidemií jsou dokumentovány na Slovensku, popsány byly případy získání infekce z ovčího sýru 15 nebo mléka malých přežvýkavců. 16 Další případy alimentárních infekcí spojených s konzumací mléka nebo mléčných produk- 580 VETERINÁŘSTVÍ 8/2018

37 Hospodářská zvířata tů obsahujících VKE jsou popsány z Polska, 17 Estonska, 18 Rakouska, 19 Maďarska 20 a Slovinska. 21 Séroprevalence KE u malých přežvýkavců v České republice V návaznosti na pilotní studii, kterou jsme provedli v letech , 2 pokračoval v letech 2017 a 2018 epidemiologický průzkum analyzující séroprevalenci KE u malých přežvýkavců v České republice. Za celou dobu hodnocení bylo vyšetřeno celkem 571 vzorků sér malých přežvýkavců na přítomnost specifických protilátek proti VKE. Odběry byly provedeny ve 24 chovech koz (hodnoceno 229 jedinců) a ve 32 chovech ovcí (hodnoceno 342 jedinců) v rámci celé republiky. Věk vyšetřovaných zvířat se pohyboval mezi jedním a devíti lety. Analýza byla prováděna sérologicky s využitím komerčního ELISA kitu (IMMUNOZYM FSME IgG all-species kit, Progen Biotechnik GmbH), který umožňuje vyhodnotit koncentraci specifických protilátek proti VKE v jednotkách VIEU/ml. Vyšetřovaným materiálem bylo sérum připravené ze srážlivé krve. V rámci studie bylo v případě koz zachyceno 54 (24 %) pozitivních vzorků, specifické protilátky proti VKE byly zaznamenány na 19 (79 %) z 24 testovaných lokalit (tab. 1). U ovcí bylo detekováno 132 (39 %) pozitivních sér ovcí, výskyt KE byl zaznamenán na 31 (97 %) z 32 testovaných farem (tab. 2), což jsou výsledky analogické pilotní studii. 2 Tab. 1 Kozy Farma Počet Počet pozitivních Séroprevalence vzorků vzorků (%) celkem Ve vztahu k věku testovaných zvířat bylo zjištěno, že s rostoucím věkem zvířat se zvyšuje procento sérologicky pozitivních jedinců a také vzrůstá koncentrace specifických protilátek přítomných v mililitru krve. Je tedy pravděpodobné, že v návaznosti na stáří zvířat vzrůstá i pravděpodobnost infekce VKE. Mimo zhodnocení rizika analyzovaného chovu pro případnou alimentární infekci přineslo toto testování další důležitý výsledek, a to zmapování lokalit přirozeného výskytu VKE pro vyhodnocení rizika potenciální infekce lidí při infestaci klíšťaty. Jako sentinelové organismy k vyhledávání ohnisek KE byli podobným způsobem využiti malí přežvýkavci například ve Švýcarsku. 22 Získané výsledky dokumentují, že prevalence infekcí VKE u malých přežvýkavců v ČR je značná. Konzumace syrového mléka, resp. tepelně neošetřených mléčných produktů tak může představovat riziko infekce KE, proto je pasterace nebo převaření mléka doporučováno jako standardní preventivní způsob ochrany před alimentární infekcí VKE. Mimo očkování lidí, které spolehlivě chrání i před alimentární infekcí VKE, se další potenciální možností ochrany spotřebitele jeví i vakcinace zvířat produ- Tab. 2 Ovce Farma Počet Počet pozitivních Séroprevalence vzorků vzorků (%) , celkem VETERINÁŘSTVÍ 8/

38 Hospodářská zvířata kujících mléko. Experimentálně bylo ověřeno, že vakcinace koz humánní vakcínou proti KE zabraňuje rozvoji infekce a brání vylučování VKE do mléka. 23 Vývoj vakcíny k veterinárnímu užití chránící malé přežvýkavce před infekcí VKE se stal předmětem grantového projektu Národní agentury pro zemědělský výzkum, který je v současnosti řešen na Výzkumném ústavu veterinárního lékařství, v. v. i., ve spolupráci s Biovetou a. s. Experimentální infekce malých přežvýkavců V souvislosti s řešením grantového projektu, jehož cílem je vývoj vakcíny proti KE k veterinárnímu užití, jsme provedli sérii experimentálních infekcí s cílem zavedení infekčního modelu využitelného při vakcinačních studiích. Experimentální infekční pokus byl proveden na modelu viru KE a ovce domácí produkující mléko. Tři ovce byly infikovány českým prototypovým kmenem KE (Hypr), tři zvířata byla infikována terénním izolátem KE 9001 a další dvě zvířata posloužila jako neinfikované kontroly. V rámci experimentu byly hodnoceny následující parametry: zdravotní stav zvířat, tvorba specifických protilátek proti VKE a přítomnost viru v séru a mléku. Vzorky krve a mléka byly odebírány po dobu 28 dnů po infekci (DPI). Specifické protilátky byly stanovovány pomocí ELISA kitu (viz výše). Experimentální infekce vedla u všech infikovaných zvířat ke tvorbě specifických protilátek s nástupem kolem desátého dne po infekci se stoupajícím množstvím do ukončení experimentu (28 DPI). Virus neutralizačním testem bylo následně prokázáno, že počínaje 14 DPI jsou v séru z experimentálně infikovaných zvířat přítomné neutralizační protilátky. U pěti infikovaných zvířat bylo zachyceno i vzrůstající množství specifických protilátek v mléku, avšak ve výrazně nižších množstvích ve srovnání se sérem. Viremie (analyzovaná metodou plakové titrace) byla zjištěna u dvou ze tří zvířat infikovaných prototypovým kmenem Hypr a u dvou ze tří zvířat infikovaných terénním kmenem KE 9001 od prvního do třetího dne po experimentální infekci. Virus v mléku byl zachycen pouze u jednoho experimentálně infikovaného zvířete, a to metodou real-time RT-PCR pátý den po infekci a metodou plakové titrace šestý den po infekci. Analogický infekční experiment byl proveden i na koze domácí produkující mléko. V tomto případě se však virus nepodařilo v séru ani mléku infikovaných zvířat zachytit. Specifické protilátky proti VKE byly zachyceny od 14 DPI a jejich množství vzrůstalo do 28 DPI (maximální zachycené koncentrace byly až 209 VIEU/ml). Následným dlouhodobým sledováním do 56 DPI bylo zjištěno, že množství specfických protilátek v séru u dvou zvířat (ze skupiny čtyři infikovaných) klesá až na úroveň kontrolních hodnot (cca 20 VIEU/ml). Z těchto výsledků je možné vyvozovat, že u některých zvířat post-infekční protilátky nepřetrvávají dlouhodobě a proto je pravděpodobné, že výskyt KE v chovech malých přežvýkavců zachycené naším sérologickým průzkumem, resp. podíl zvířat, která prodělala infekci VKE, mohl být ve skutečnosti vyšší. přežívání (%) vakcinované myši nevakcinované myši čas po infekci (dny) Schéma 1 Účinnost vakcíny na myším modelu. Přežívání vakcinovaných a nevakcinovaných myší v infekčním experimentu, při kterém byly myši nakaženy kmenem VKE (KE 9001) specifické protilátky proti VKE (VIEU/ml) vakcinované ovce nevakcinované ovce aplikace vakcíny čas (dny) Schéma 2 Imunogenita vakcíny proti KE k veterinárnímu užití. Tvorba specifických protilátek proti VKE u vakcinovaných ovcí. Vynesena je průměrná hodnota všech analyzovaných vzorků ve skupinách se směrodatnou odchylkou. Modrá šipka označuje termín aplikace vakcíny 582 VETERINÁŘSTVÍ 8/2018

39 Hospodářská zvířata Vakcína proti klíšťové encefalitidě pro veterinární užití Antigen pro vakcínu proti KE k veterinárnímu užití byl připraven jako celovirionový preparát. VKE kmen Hypr byl pomnožen na buněčné linii BHK-21 (linie epiteliálních buněk z ledviny křečka). Následně byl virus purifikován z kultivačního média pomocí srážení, ultracetrifugací na gradientu a koncentrován filtračními systémy. Purifikace antigenu byla ověřena pomocí denaturační polyakrylamidové gelové elektroforézy a následné imunodetekce. Pomocí těchto metod bylo prokázáno, že hlavní obalový protein viru E protein, je majoritní součástí purifikovaného antigenu a je rozpoznáván specifickou protilátkou proti tomuto proteinu. Pro účely přípravy vakcíny byl purifikovaný VKE inaktivován formaldehydem. Úspěšnost inaktivace byla ověřena invitro na buněčné linii PS (linie epiteliálních buněk z ledviny prasete). Vlastní vakcína obsahuje purifikovaný inaktivovaný virus, adjuvans a fyziologický roztok. Bezpečnost, imunogenita a účinnost připravené vakcíny byla ověřena nejprve na myším modelu. Skupina pěti laboratorních myší byla subkutánně imunizována připravenou vakcínou. Imunizační proces byl proveden třemi dávkami vakcíny s časovými prodlevami 14 dnů mezi jednotlivými dávkami. Vakcína byla bezpečná a byla zvířaty dobře snášena. Týden po poslední aplikaci vakcíny bylo stanoveno množství specifických protilátek proti VKE v séru imunizovaných myší metodou ELISA. Připravená vakcína vyvolala tvorbu specifických anti-vke protilátek. Účinnost vakcíny byla ověřena infekčním pokusem s využitím terénního kmene VKE (KE 9001). Imunizované myši (pět jedinců) byly experimentálně infikovány letální dávkou VKE. Imunizace navodila ochranu před rozvojem letální infekce u všech imunizovaných myší (schéma 1). Naproti tomu u všech experimentálně infikovaných nevakcinovaných myší (pět jedinců) došlo k rozvoji fatální formy klíšťové encefalitidy. Následně byla testována bezpečnost, imunogenita a účinnost vakcíny na cílových zvířatech ovcích. Tři zvířata byla vakcinována v obdobném schématu, které bylo použito u myší. Vakcína byla bezpečná a byla zvířaty dobře snášena. Následná detekce specifických protilátek proti VKE prokázala jejich tvorbu u vakcinovaných zvířat (schéma 2). Virus neutralizačním testem bylo ověřeno, že tyto specifické protilátky mají virus neutralizační účinek. U nevakcinovaných zvířat nebyly specifické protilátky detekovány. V případě ověřování účinnosti vakcinace na ovcích byla sledována hladina viremie po infekci u vakcinovaných a nevakcinovaných zvířat. Imunizovaná zvířata (tři jedinci) a neimunizovaná zvířata (čtyři jedinci) byla infikována terénním kmenem VKE (KE 9001), následně jim byla ve vybraných časových intervalech odebírána krev za účelem detekce VKE. Imunizace ovcí připravenou vakcínou zabránila viremii, VKE nebyl zachycen u žádného ze tří vakcinovaných zvířat. Naproti tomu u tří zvířat z nevakcinované skupiny (čtyři jedinci) byla plakovou metodou prokázána přítomnost VKE v krvi. Na základě výše uvedených výsledků je zřejmé, že připravená vakcína vyvolává produkci specifických protilátek a chrání vakcinovaná zvířata před rozvojem onemocnění. Vakcína byla pod názvem Vakcína proti klíšťové encefalitidě k veterinárnímu užití zapsána na Úřadu průmyslového vlastnictví jako užitný vzor CZ U1. Na dalším výzkumu směrem k praktickému využití vakcíny ve veterinární oblasti dále spolupracuje Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i., a Bioveta a. s. Držitel rozhodnutí o registraci a povolení k výrobě: FATRO - Veterinary Pharmaceutical Industry Ozzano Emilia (BO), Itálie tel.: fax: fatro@fatro.it Distributor pro ČR a SR: Pohoří-Chotouň 90, Jílové u Prahy, Česká republika tel./fax: prodej@bri.cz 40 mg/ml / 0,036 mg/ml LOKÁLNÍ ANESTETIKUM PRO HOSPODÁŘSKÁ ZVÍŘATA ZALOŽENÉ NA KOMBINACI PROKAINU A ADRENALINU dlouhotrvající anestézie nízká systémová absorpce snížené krvácení bez ochranných lhůt VETERINÁŘSTVÍ 8/

40 Hospodářská zvířata Závěr V rámci sérologické studie bylo zjištěno, že výskyt infekcí VKE v chovech malých přežvýkavců je poměrně častý. Jednoznačně proto doporučujeme standardní postup preventivní ochrany spotřebitele před alimentární infekcí spočívající v pasteraci nebo převařování syrového mléka. Další možností ochrany se jeví vakcinace přežvýkavců produkujících mléko proti infekci VKE. Proto jsme připravili experimentální vakcínu proti KE pro veterinární použití. Sérií experimentů na modelových a cílových organismech jsme prokázali, že vakcína je bezpečná a účinná. Do budoucna je plánováno využití připravené vakcíny k ochraně malých přežvýkavců před infekcí VKE vedoucí k eliminaci rizika alimentární infekce. Další možné využití připravené vakcíny ve veterinární praxi může být ochrana některých druhů domácích zvířat (např. psi a koně), u kterých se v určitých případech může KE manifestovat podobně závažným způsobem jako u člověka. Poděkování Práce vznikla za podpory projektu KEVAK QJ a RO0518 Ministerstva zemědělství ČR a projektu LO1218 financovaného Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy v rámci programu NPU I. Literatura: 1. HEINZ, F. X. Epitope mapping of flavivirus glycoproteins. Adv Virus Res 1986;31: SALÁT, J., ŠLOSÁRKOVÁ, S., RŮŽEK, D. Klíšťová encefalitida u malých přežvýkavců. Veterinářství 2017,67: GRITSUN, T. S., LASHKEVICH, V. A., GOULD, E. A. Tick-borne encephalitis. Antiviral Res 2003;57: LINDQUIST, L., VAPALAHTI, O. Tick-borne encephalitis. Lancet 2008;371: KUNZ, C. TBE vaccination and the Austrian experience. Vaccine. 2003;21:S KŘÍŽ, B., BENEŠ, Č., DANIEL, M. Alimentary transmission of tick-borne encephalitis in the Czech Republic ( ). Epidemiol Microbiol Immunol 2009;58: POGODINA, V. Experimental study of the pathogenesis of tick-borne encephalitis on alimentary infection. II. Study of pathways of excretion of virus from white mice. Probl Virol 1960;5: GREŠÍKOVÁ, M. Kliešťova encefalitída trvalý verejno-zdravotnícky problém. Veda, SAV, Bratislava GREŠÍKOVÁ, M. Vylučovanie vírusu kliešťovej encefalitídy kozím mliekom. Veter Čas 1957;5: GREŠÍKOVÁ, M. Recovery of the tick-borne encephalitis virus from the blood and milk of subcutaneously infected sheep. Acta Virol 1958;2: GREŠÍKOVÁ, M. Excretion of the tick-borne encephalitis virus in the milk of subcutaneously infested cows. Acta Virol 1958;2: GREŠÍKOVÁ, M. Perzistencia vírusu kliešťovej encefalitídy v mlieku a mliečnych výrobkoch. Čs. Epidem Mikrobiol Imunol. 1959;8: GREŠÍKOVÁ, M. HAVÁRNEK, I., GORNER, F. Vplyv pasterizácie na infektivitu vírusu kliestovej encefalitídy. Vet Cas 1960;9: BLAŠKOVIČ, D. Epidémia encefalitídy v Rožňavskom prírodnom ohnisku nákaz. SAV, Bratislava GREŠÍKOVÁ, M., SEKEYOVA, M., STUPALOVA, S., NECAS, S. Sheep milk-borne epidemic of tick-borne encephalitis in Slovakia. Intervirology 1975;5: LABUDA, M., ELECKOVÁ, E., LICKOVÁ, M., SABÓ, A. Tick-borne encephalitis virus foci in Slovakia. Int J Med Microbiol 2002;291, Suppl 33: MATUSZCZYK, I., TARNOWSKA, H., ZABICKA, J., GUT, W. The outbreak of an epidemic of tick-borne encephalitis in Kielec province induced by milk ingestion. Przegl Epidemiol 1997;51: KERBO, K., DONCHENKO, I., KUTSAR, K., VASILENKO, V. Tick-borne encephalitis outbreak in Estonia linked to raw goat milk. Euro Surveill 2005;10: HOLZMANN, H., ABERLE, S. W., STIASNY, K., WERNER, P., MISCHAK, A., ZAINER, B., NETZER, M., KOPPI, S., BECHTER, E., HEINZ, F. X. Tick-borne encephalitis from eating goat cheese in a mountain region of Austria. Emerg Infect Dis 2009;15: CAINI, S., SZOMOR, K., FERENCZI, E., SZEKELYNE GASPAR, A., CSOHAN, A., KRISZTALOVICS, K., MOLNAR, Z., HORVATH, J. Tick-borne encephalitis transmitted by unpasteurised cow milk in western Hungary, September to October Euro Surveill 2012;17: HUDOPISK, N., KORVA, M., JANET, E., SIMETINGER, M., GRGIČ-VITEK, M., GUBENŠEK, J., NATEK, V., KRAIGHER, A., STRLE, F., AVŠIČ-ŽUPANC, T. Tickborne encephalitis associated with consumption of raw goat milk, Slovenia, Emerg Infect Dis 2013;19: RIEILLE, N., KLAUS, C., HOFFMANN, D., PÉTER, O.,VOORDOUW, M. J. Goats as sentinel hosts for the detection of tick-borne encephalitis risk areas in the Canton of Valais, Switzerland. BMC Vet Res 2017;13: BALOGH, Z., EGYED, L., FERENCZI, E., BÁN, E., SZOMOR, K. N., TAKÁCS, M., BERENCSI, G. Experimental infection of goats with tick-borne encephalitis virus and the possibilities to prevent virus transmission by raw goat milk. Intervirology 2011;55: Adresa autora: RNDr. Jiří Salát, Ph.D. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i. Hudcova Brno salat@vri.cz 584 VETERINÁŘSTVÍ 8/2018

41 Příloha 3 Salát, J., Formanová, P., Huňady, M., Eyer, L., Růžek, D. Development and testing of a new tick-borne encephalitis virus vaccine candidate for veterinary use Vaccine 2018; in press. DOI: /j.vaccine

42

43 Vaccine xxx (2018) xxx xxx Contents lists available at ScienceDirect Vaccine journal homepage: Short communication Development and testing of a new tick-borne encephalitis virus vaccine candidate for veterinary use Jiří Salát a,,1, Petra Formanová a,d,1, Milan Huňady b, Luděk Eyer a,c, Martin Palus a,c, Daniel Ruzek a,c, a Department of Virology, Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic b Bioveta, Inc., Ivanovice na Hane, Czech Republic c Institute of Parasitology, Biology Centre of the Czech Academy of Sciences, Ceske Budejovice, Czech Republic d Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Brno, Czech Republic article info abstract Article history: Received 16 August 2018 Received in revised form 2 October 2018 Accepted 6 October 2018 Available online xxxx Keywords: Tick-borne encephalitis Vaccine Sheep Alimentary infection Veterinary vaccine In tick-borne encephalitis (TBE) endemic areas, consumption of unpasteurized milk or milk products from grazing domestic ruminants (goats, cattle, and sheep) represents a risk of TBE virus (TBEV) infection for humans. In addition to vaccination of humans, human alimentary TBEV infections can be avoided by pasteurizing milk or by vaccination of the ruminants. However, there is presently no TBEV vaccine for veterinary use. Here, we developed a new veterinary TBE vaccine candidate based on cell culturederived, purified, and formaldehyde-inactivated TBEV (strain Hypr). The safety and immunogenicity of the vaccine was evaluated in mice and sheep and was well-tolerated while eliciting the production of high levels of virus-neutralizing antibodies. Vaccination provided full protection against lethal TBE in mice, prevented development of viremia in sheep and presence of TBEV in milk of lactating ewes. This vaccine is a good candidate for immunization of ruminants to prevent alimentary milk-borne TBEV infections in humans. Ó 2018 Elsevier Ltd. All rights reserved. 1. Introduction Tick-borne encephalitis (TBE) is a serious human disease affecting the central nervous system occurring across Europe and Asia. In some areas, the incidence of TBE has markedly increased over the last decades [1]. The disease is caused by tick-borne encephalitis virus (TBEV), a member of the family Flavivirdae, genus Flavivirus. The typical serious manifestation of TBE is encephalitis or meningoencephalitis with a possible fatal outcome. The majority of human cases of TBE are a consequence of virus transmission following the bite of an infected tick. The less frequent natural route of human TBEV infection is associated with the consumption of unpasteurized milk or milk products from infected ruminants, mainly goats but also sheep and cows [2 4]. One of the biggest TBE outbreaks was described in Roznava, formerly part of Czechoslovakia, in During this epidemic, more than 600 humans were infected after consuming goat milk containing TBEV [5]. The consumption of unpasteurized milk and milk products is increasing in Europe mostly because of better taste and its alleged health benefits [6,7]. Therefore, milk-borne infections continue to play an important role in TBEV transmission in the endemic regions [6]. The vaccination of humans protects individuals from TBE acquired either by tick bite or by the alimentary route; in addition, the vaccination of grazing ruminants in endemic areas can protect humans from alimentary TBE. It was demonstrated that the vaccination of goats with human anti-tbe vaccine is effective in protecting against subsequent TBEV challenge and the milk of the vaccinated and challenged animals was not infectious [7]. However, currently produced human TBEV vaccines are not approved for veterinary use, and the costs of these vaccines limit their potential use for immunization of animals. Here, we developed a new cell-culture derived, purified, and formaldehyde-inactivated TBEV vaccine candidate, which is intended for veterinary use. The vaccine was tested in mice and sheep and demonstrated good safety and immunization profiles, making it a promising candidate for vaccination of ruminants to prevent alimentary milk-borne TBEV infections in humans. Corresponding authors at: Veterinary Research Institute, Hudcova 296/70, CZ Brno, Czech Republic. addresses: salat@vri.cz (J. Salát), ruzekd@paru.cas.cz (D. Ruzek). 1 These authors contributed equally to this work X/Ó 2018 Elsevier Ltd. All rights reserved. Please cite this article in press as: Salát J et al. Development and testing of a new tick-borne encephalitis virus vaccine candidate for veterinary use. Vaccine (2018),

44 2 J. Salát et al. / Vaccine xxx (2018) xxx xxx 2. Materials and methods 2.1. Ethics statement The use of animals was approved by the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (Approval No /2015-MZE and No /2014-MZE-17214) Viruses The TBEV strain Hypr (Czech prototype strain) was used for antigen preparation and for experimental challenge experiments. The TBEV strain 9001 (tick isolate from the Czech Republic) was used in vaccination experiments. Before the vaccine preparation, the Hypr TBEV strain was passaged five times in the brains of suckling mice and once in PS (porcine kidney) cells. The TBEV strain 9001 was passaged two times in the brains of suckling mice, once in PS cells, and once in adult mouse brains Antigen preparation Vaccine preparation was based on whole cell-culture derived, inactivated virus antigen. Virions were produced and purified using a protocol described previously [8]. The purified virus was inactivated with formaldehyde (0.05%) in phosphate-buffered saline (PBS). The inactivation was tested by plaque assay. The purity of antigen was analysed using reducing SDS-PAGE (TruePage Precast Gels, Sigma-Aldrich), western blotting, and immunodetection using primary antibody (Mouse AntiFlavivirus Group Antigen Monoclonal Antibody, Millipore Group), secondary antibody conjugated with horse radish peroxidase (Goat anti-mouse IgG Fc Fragment, Bethyl), and tetramethylbenzidine. The concentration of antigen was measured using Bradford reagent (Sigma- Aldrich) following the manufacturer s instructions Vaccine composition A single dose of vaccine was composed of a mixture of purified inactivated TBEV antigen (10 lg), 10% Alhydrogel adjuvant (Invivo- Gen), and PBS. The final volume of the single vaccine dose was 0.15 ml for mice and 1 ml for sheep Experimental vaccination of mice and challenge infection A group of ten BALB/c mice (females, 6 weeks old, Envigo) was vaccinated by subcutaneous injections. Three doses of the prepared vaccine were administered in two week intervals. Samples of blood were taken from the tail vein of mice 10 days after the last vaccine administration and the concentration of specific anti-tbev antibodies was measured by ELISA. A control group of ten BALB/c mice (females, 6 weeks old) was injected with adjuvant only. To evaluate the protective effect of vaccination, all immunised and control mice were infected intraperitoneally with TBEV (10 3 plaque forming units [PFU] per mice) two weeks after the third dose injection. Five mice in each group were infected with the Hypr strain and the other five mice in each group were injected with the TBEV strain The morbidity and survival time of the infected mice were evaluated daily during a four-week experimental period. Mice were euthanized when serious signs of TBE neuroinfection appeared Experimental vaccination of sheep and challenge infection Both female and male sheep, six-months-old, were used in the experiment. A group of three sheep was vaccinated subcutaneously (three doses in a 14-day interval). A control group of four sheep was injected with adjuvant only. Samples of blood were taken on 0, 14, 28, 35, 42, and 49 days post the first vaccine administration. Concentrations of specific anti-tbev antibodies were assessed by ELISA. The virus neutralisation test (VNT) was used to evaluate the neutralization effect of antibodies on TBEV, as described below. Finally, six weeks after the last vaccine dose, both groups of sheep were subcutaneously infected with TBEV strain 9001 (10 7 PFU per sheep). The clinical conditions of the animals were evaluated daily and samples of blood were taken every day of the first week and then at 8, 10, 12, 14, 21, and 28 days post-infection (DPI) to evaluate the effect of vaccination on viremia development. The presence of TBEV in the sera of infected sheep was assessed by plaque assay. The analogous experiment was performed with lactating ewes (four vaccinated and four non-vaccinated animals). The same time intervals were used for sampling. Moreover samples of milk were taken for TBEV RNA detection Plaque assay The virus concentration was evaluated by plaque assay as described previously [9,10]. Virus titers were expressed as the number of PFU/ml Quantitative RT-PCR (RT-qPCR) RNA was isolated from milk or sera samples using the QIAmp Viral RNA mini kit (Qiagen) following manufacturer s instructions. RT-qPCR measurements were performed on the LightCycler 480 II in a 96-well plate block (Roche) using the the Advanced kit for Tick-borne encephalitis (Genesig) and Lyophilised OneStep qrt- PCR (Oasig) following manufactures manufacturer s instructions. TBEV copy numbers/ml were calculated from calibration curves based on standards provided by the manufacturer (Genesig) Specific anti-tbev antibody detection The IMMUNOZYM FSME IgG All-Species kit (Progen GmbH) was used to detect anti-tbev antibodies in the sera of the immunised animals, following the manufacturer s instructions. This ELISA evaluates the concentration of specific IgG antibodies against TBEV in Vienna Units (VIEU/ml). The VNT for detection of virus neutralization antibodies in serum samples was performed as described previously [10] Statistical analysis The difference in antibody levels between vaccinated and control mice was tested using the t-test for unequal variance (N = 10 for each group). Temporal differences in antibody levels between vaccinated and control sheep were tested using the t-test for equal (0, 42 DPI) or unequal variance (14, 28, 35, 49 DPI; N = 3 and 4 for vaccinated and control animals, respectively). The a level was Bonferroni corrected to 0.05/6 = The presence of neutralizing antibodies in the sera of vaccinated (N = 3) and control (N = 4) sheep and of TBEV in sera after infection of these animals were tested by v2 test. Differences in survival times among groups of mice were tested by Survival Analysis (multiple-sample test) and log-rank tests for between-group analysis. The a level was Bonferroni corrected to 0.05/2 = Statistical analyses were performed using PAST software (PAST, v.3.20, ohammer/past/) and Statistica for Windows 13.1 (StatSoft, 2017). Please cite this article in press as: Salát J et al. Development and testing of a new tick-borne encephalitis virus vaccine candidate for veterinary use. Vaccine (2018),

45 J. Salát et al. / Vaccine xxx (2018) xxx xxx 3 3. Results and discussion In addition to transmission during tick feeding, humans can be infected with TBEV through alimentary transmission after consumption of milk or milk products containing the virus. Outbreaks of milk-borne TBE were reported from Austria [11], Hungary [4], Slovenia [12], Poland [13], and Estonia [14]. In the Czech Republic, milk-borne TBE represents approximately 1% of all TBE cases reported [15]. Slovakia has the highest long-term occurrence of alimentary TBE in Europe [6]. Seroepidemiological studies showed that a high percentage of grazing ruminants come in contact with TBEV in endemic areas [16]. Here, we aimed to develop a vaccine candidate suitable for ruminants to prevent milk-borne transmission of TBEV to humans. The vaccination antigen was prepared as a whole inactivated virus. The TBEV (Hypr) was grown in the BHK21 cell line and purified by gradient centrifugation. The main protein band identified on reducing SDS-PAGE migrated close to the 52 kda molecular Fig. 1. Vaccination of mice and challenge experiments. (A) The concentration of specific anti-tbev antibodies in the sera of vaccinated and control mice. BALB/c mice (n = 10/group) were vaccinated by subcutaneous injections of the vaccine. Three doses of vaccine were administered in two week intervals. A control group (BALB/c, n = 10) was injected with adjuvant only. Samples of blood were taken from the tail vein of mice 10 days after the last vaccine administration and the concentration of specific anti- TBEV antibodies was measured by ELISA. Results are shown as the mean ± S.D. The statistical difference **** (p ) between the vaccinated and control groups is indicated. (B) Survival of vaccinated and control mice after the challenge infection with TBEV. Vaccinated and control mice were infected (1000 PFU/mice) with either the vaccine TBEV strain Hypr or another strain, Kaplan-Meier Cumulative Survival Analysis was used for graphical representation of the data. The statistical difference ** (p 0.01) between the vaccinated and control groups is indicated. Please cite this article in press as: Salát J et al. Development and testing of a new tick-borne encephalitis virus vaccine candidate for veterinary use. Vaccine (2018),

46 4 J. Salát et al. / Vaccine xxx (2018) xxx xxx Fig. 2. The concentration of specific anti-tbev antibodies in the sera of vaccinated sheep. A group of three sheep was vaccinated subcutaneously (three doses in a 14-day interval black arrows). A control group of four sheep was injected with adjuvant only. Samples of blood were collected at the indicated times and the levels of specific TBEV antibodies were measured by ELISA (lines). Virus neutralizing antibody titres (NAb titre) were measured by VNT (columns). Results are shown as the mean ± S.D. The statistical difference between the vaccinated and control group is indicated by ** (P 0.01) and *** (P 0.001). marker band, corresponding to the E-protein (54 kda) of TBEV (Supplementary Fig. 1A). The identity of the protein band was confirmed by western blotting and immuno-detection using a specific monoclonal antibody recognising the E-protein of flaviviruses (Supplementary Fig. 1B). The purified virus was inactivated by formaldehyde for vaccination. The experimental vaccine contained inactivated TBEV, adjuvant, and PBS, similarly as in human TBEV vaccines [17]. The safety and effectivity of the prepared vaccine were tested using mice as model animals. Immunised mice did not show any side effect during vaccination. The sera of immunised and control animals (10 mice per group) were collected ten days after the last dose of vaccine to determine specific TBEV antibodies were present. The concentration of specific antibodies ranged from 100 to 178 VIEU/ml in the sera of vaccinated mice. No specific anti-tbev antibodies could be detected in the sera of the control animals (Fig. 1A; t = 14.7; p < ). Mice were then challenged with a lethal dose of TBEV to verify the protective effect of the prepared vaccine against the development of TBE. This experiment adhered to the recommendations of the WHO for testing TBEV vaccines [18]. Vaccinated and control mice were infected (10 3 PFU/mouse) either with the TBEV vaccination strain (Hypr) or TBEV strain 9001 to confirm the vaccine efficacy. The mean survival time of control mice infected with TBEV was 7.8 ± 0.8 and 7.8 ± 0.4 DPI for Hypr and 9001, respectively. In contrast, all vaccinated and infected mice survived until the end of the experiment at 28 DPI (Fig. 1B; v2 = 16.9, p < 0.001). Mortality was higher in control animals compared with vaccinated mice infected with TBEV Hypr or TBEV 9001 (Log-Rank test: p = for both comparisons). Subsequently, the efficacy of the vaccine was tested on the target animals - sheep. Groups of three sheep were vaccinated with the prepared vaccine. There were no side effects observed during the whole experimental period. Collected samples of sera from immunised and control sheep were analysed for the presence of specific TBEV antibodies over time (Fig. 2). The antibodies were detected in the sera of vaccinated animals at 14 days post the first vaccine dose (DPV) and their concentration increased up to 400 VIEU/ml at the end of the antibody assessment period at 49 DPV. Specific antibodies were not detected in the sera of control sheep. The difference in specific antibody presence in sera of vaccinated animal compared to controls was statistically significant at 28 (t = 13.9, p = 0.003), 35 (t = 25.9, p = 0.001), 42 (t = 54.1, p < 0.001), and 49 (t = 12.3, p = 0.006) DPV. Specific antibodies present in the sera of immunised animals collected at 14 DPV and onwards were able to effectively neutralize TBEV, which was confirmed by the VNT (Fig. 2). In contrast, no TBEV neutralization was seen in the sera of control animals (v2 = 7.0, p = 0.008). In a challenge experiment, vaccinated and control sheep were infected with TBEV strain 9001 (10 7 PFU/sheep). Infected animals did not show any signs of TBE. This finding is in agreement with previous observations that the majority of small ruminants infected with TBEV don t suffer from any clinically apparent disease [7]. There is only one report of a clinically manifested TBE in a single sheep [19]. Sera of the infected animals were tested for the presence of TBEV to confirm the protective effect of vaccination using a plaque assay. Viremia was not recorded in the sera of vaccinated animals. In contrast, TBEV was detected in blood samples of non-vaccinated and infected animals in three out of four animals at 2 DPI and in one of four animals at 3 DPI (mean titre PFU/ml). The presence of TBEV in blood samples was confirmed by RT-qPCR. TBEV RNA was detected in three out of four animals at 2 DPI (mean TBEV copy number/ml (v2 = 3.9, p = 0.047). Challenge experiment on vaccinated lactating ewes confirmed protective effect of vaccination against virus presence in milk. The TBEV RNA was detected only in milk samples from two out of four non-vaccinated infected animals by qpcr (mean 3.1 ± TBEV copy number/ml) at 6 DPI, whereas no TBE positive milk samples were detected in any of vaccinated animals. A previous study detected viremia in the sera of TBEV-infected sheep typically at 2 DPI and virus in milk typically at 5 and 6 DPI [20], which corresponds with our results. 4. Conclusions The study describes the development of a new vaccine candidate against TBE for veterinary use. Challenge experiments performed on vaccinated animals demonstrated a high safety profile for the vaccine, the induction of neutralizing antibodies against TBEV, and protection of immunised animals against TBE infection and prevented presence of TBEV in milk of lactating ewes. Our next Please cite this article in press as: Salát J et al. Development and testing of a new tick-borne encephalitis virus vaccine candidate for veterinary use. Vaccine (2018),

47 J. Salát et al. / Vaccine xxx (2018) xxx xxx 5 studies will be focused on testing the vaccine in goats and measuring the long-term antibody persistence in the sera of the immunised animals. The vaccine will be also tested in other animals susceptible for clinical TBE, such as dogs. One of possible limitations of our study is vaccination 3 times every 2 weeks; in our next study we aim to optimize the design with basic immunization with two doses, which would be more appropriate in the light of future commercial use. Conflict of interest Potential conflict of interest: MH is an employee of Bioveta, Inc., a producer of veterinary drugs and vaccines. All of the authors had access to all of the data generated and contributed to the analyses and interpretations. The method of vaccine preparation is protected by the invention - utility model No issued by the Industrial Property Office, Prague, Czech Republic. Acknowledgements The study was supported by project QJ and RO0518 of the Ministry of Agriculture of the Czech Republic; by project LO1218 with financial support from the Ministry of Education, Youth, and Sports of the Czech Republic under the NPU I program; and by Project FIT (Pharmacology, Immunotherapy, nanotoxicology), which was funded by the European Regional Development Fund. We thank Markéta Ondračková for help with statistical analyses. Appendix A. Supplementary material Supplementary data associated with this article can be found, in the online version, at References [1] Erber W, Schmitt H-J. Vuković Janković T. Epidemiology by country - an overview. In: Dobler G, Erber W, Schmitt H-J, editors. Tick-borne encephalitis (TBE), Singapore: Global Health Press; p ISBN: [2] Gresikova M, Sekeyova M, Stupalova S, Necas S. Sheep milk-borne epidemic of tick-borne encephalitis in Slovakia. Intervirology 1975;5: org/ / [3] Labuda M, Elecková E, Licková M, Sabó A. Tick-borne encephalitis virus foci in Slovakia. Int J Med Microbiol 2002;291(Suppl 33): /S (02)80008-X. [4] Caini S, Szomor K, Ferenczi E, Szekelyne Gaspar A, Csohan A, Krisztalovics K, et al. Tick-borne encephalitis transmitted by unpasteurised cow milk in western Hungary, September to October Euro Surveill 2012;17:12. [5] Blaskovic D. An epidemic of encephalitis in a natural focus of infections at Roznava (in Slovak, with English summary). Akademia Vied Bratislava; [6] Kerlik J, Avdicova M, Stefkovicova M, Tarkovska V, Pantikova-Valachova M, Molcanyi T, et al. Slovakia reports highest occurrence of alimentary tick-borne encephalitis in Europe: analysis of tick-borne encepahlitis outbreaks in Slovakia during Travel Med Infect Dis /j.tmaid [7] Balogh Z, Egyed L, Ferenczi E, Bán E, Szomor KN, Takács M, et al. Experimental infection of goats with tick-borne encephalitis virus and the possibilities to prevent virus transmission by raw goat milk. Intervirology 2012;55: [8] Füzik T, Formanová P, Růžek D, Yoshii K, Niedrig M, Plevka P. Structure of tickborne encephalitis virus and its neutralization by a monoclonal antibody. Nature Commun 2018;9: [9] De Madrid AT, Porterfield JS. A simple micro-culture method for study of group B arboviruses. Bull World Health Organ 1969;40: [10] Palus M, Vojtíšková J, Salát J, Kopecký J, Grubhoffer L, Lipoldová M, et al. Mice with different susceptibility to tick-borne encephalitis virus infection show selective neutralizing antibody response and inflammatory reaction in the central nervous system. J Neuroinflammation 2013;10: / [11] Holzmann H, Aberle SW, Stiasny K, Werner P, Mischak A, Zainer B, et al. Tickborne encephalitis from eating goat cheese in a mountain region of Austria. Emerg Infect Dis 2009;15: [12] Hudopisk N, Korva M, Janet E, Simetinger M, Grgic-Vitek M, Gubensek J, et al. Tick-borne encephalitis associated with consumption of raw goat milk, Slovenia, Emerg Infect Dis 2013;19: eid [13] Matuszczyk I, Tarnowska H, Zabicka J, Gut W. The outbreak of an epidemic of tick-borne encephalitis in Kielec province induced by milk ingestion (in Polish, with English summary). Przegl Epidemiol 1997;51: [14] Kerbo K, Donchenko I, Kutsar K, Vasilenko V. Tick-borne encephalitis outbreak in Estonia linked to raw goat milk, May-June Euro Surveill 2005;10:6. [15] Kriz B, Benes C, Daniel M. Alimentary transmission of tick-borne encephalitis in the Czech Republic ( ). Epidemiol Mikrobiol Imunol 2009;58: [16] Rieille N, Klaus C, Hoffmann D, Péter O, Voordouw MJ. Goats as sentinel hosts for the detection of tick-borne encephalitis risk areas in the Canton of Valais. Switzerland. BMC Vet Res 2017;13: y. [17] Pöllabauer EM, Kollaritsch H, Dobler G, Erber W, Schmitt H-J. Prevention: vaccines + ImmunoglobulinsPrevention: vaccines + Immunoglobulins. In: Tick-borne encephalitis (TBE). Singapore: Global Health Press; p ISBN: [18] WHO expert committee on biological standardization. Requirements for tickborne encephalitis vaccine (inactivated). In: WHO Technical Report Series, 889. Geneva: World Health Organization; p [19] Bohm B, Schade B, Bauer B, Hoffmann B, Hoffmann D, Ziegler U, et al. Tickborne encephalitis in a naturally infected sheep. BMC Vet Res 2017;13: [20] Gresikova M. Recovery of the tick-borne encephalitis virus from the blood and milk of subcutaneously infected sheep. Acta Virol 1958;2: Please cite this article in press as: Salát J et al. Development and testing of a new tick-borne encephalitis virus vaccine candidate for veterinary use. Vaccine (2018),

48 Vydal: Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. Hudcova 70, Brno Název: Vakcinační postup vedoucí k ochraně ovcí před infekcí klíšťovou encefalitidou Autoři: RNDr. Jiří Salát, Ph.D. MVDr. Milan Huňady Mgr. Petra Formanová RNDr. Luděk Eyer, Ph.D. Doc. RNDr. Daniel Růžek, Ph.D. Léčebný postup byl vytvořen v rámci projektu Národní agentury zemědělského výzkumu - KEVAK QJ

49

50

51 Ústřední veterinární správa Státní veterinární správy Slezská 100/7, Praha 2, T: , F: Elektronická adresa podatelny: ID datové schránky: d2vairv Č. j.: SVS/2018/ G Vyřizuje: MVDr. Milada Dubská Telefon: Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. RNDr. Jiří Salát, Ph.D. Hudcova 296/ Brno V Praze dne Oponentní posudek - Vakcinační postup vedoucí k ochraně ovcí před infekcí klíšťovou encefalitidou Vážený pane doktore, v příloze Vám zasílám oponentní posudek na léčebný postup Vakcinační postup vedoucí k ochraně ovcí před infekcí klíšťovou encefalitidou. S pozdravem MVDr. Petr Šatrán, Ph.D. ředitel odboru ochrany zdraví a pohody zvířat podepsáno elektronicky Příloha 1: Oponentní posudek-vakcinační postup vedoucí k ochraně ovcí před infekcí klíšťovou encefalitidou Bankovní spojení: ČNB /0710 IČ:

52

53