DETEKCE SUBLETÁLNĚ POŠKOZENÝCH MIKROORGANISMŮ (BAKTERIÍ A KVASINEK)

Transkript

1 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Fakulta potravinářské a biochemické technologie 1 Ústav technologie mléka a tuků 2 Ústav kvasné biochemie a bioinženýrství DETEKCE SUBLETÁLNĚ POŠKOZENÝCH MIKROORGANISMŮ (BAKTERIÍ A KVASINEK) Eva Šviráková 1 Jaromír Fiala 2, Milada Plocková 1 Třešť

2 SUBLETÁLNÍ POŠKOZENÍ MIKROORGANISMŮ (SPM) RŮZNÉ TECHNOLOGICKÉ OPERACE Záhřev, mražení, sušení, lyofilizace, radiace, fermentace nebo přídavek antimikrobiálních a chemických látek POŠKOZENÍ Letální Subletální FAKTORY ZPŮSOBUJÍCÍ SPM Fyzikální: Chemické: - Teplota - Hydrostatický tlak - Pulsní elektrické pole - Mikrovlnné záření - Osmotický tlak - UV záření - Bakteriociny -Chelatační činidla - Povrchově aktivní látky - Laktoperoxidasový systém - Kyseliny, alkoholy

3 ZTRÁTA ŽIVOTASCHOPNOSTI MIKROORGANISMŮ Snížená reprodukce MO není možné stanovit jejich počet Narušení slabých interakcí makromolekul buněk Změna propustnosti a destabilizace buněčných membrán Denaturace proteinů či enzymů REPARACE SPM: Začlenění a reorganizace poškozených makromolekul buňky (DNA, proteiny, peptidoglykany buněčné stěny) Obnovení původní konformace sloučenin RESUSCITACE SPM: Přestavba poškozených částí či makromolekul buňky Normální stavba a funkce MO Teplota - Doba působení - Kultivační médium - Reparační/ Resuscitační médium

4 DETEKCE ŽIVOTASCHOPNOSTI MO KLASICKÉ METODY Růst MO na pevných médiích barevné kolonie Citlivost SPM k selektivním činidlům Omezení růstu SPM na selektivních půdách nesprávné výsledky Časová náročnost ALTERNATIVNÍ METODY Stanovení: - metabolická aktivita -buněčná integrita -přítomnost nukleových kyselin (DNA, mrna, rrna) (Singh and McFeters, 1990)

5 Obr. 1 Schematické znázornění detekce životaschopnosti bakteriálních buněk (Keer and Birch, 2003).

6 MIKROBIOLOGICKÉ METODY PLOTNOVÁ METODA S MODIFIKACEMI: 1. Plotnová metoda s modifikací tenké agarové vrstvy (TAL) (Wu and Fung, 2001) 2. Plotnová metoda s modifikací jednostupňové obnovy SPM na obohacených médiích (Knabel, 2002) 3. Plotnová metoda s využitím analýzy obrazu (Singh and McFeters, 1990)

7 PLOTNOVÁ METODA S MODIFIKACÍ TENKÉ AGAROVÉ VRSTVY (TAL) PRINCIP: přelití ztuhlého selektivního média (7 ml) neselektivním médiem (2 x 7 ml) obnova poškozených buněk v horní vrstvě neselektivního média NESELEKTIVNÍ média růst nepoškozených i SP buněk SELEKTIVNÍ média růst nepoškozených buněk (organická barviva, antibiotika, žlučové soli a povrchově aktivní látky) (Wu and Fung, 2001)

8 Inokulace poškozených buněk mikroorganismů na neselektivní agarovou vrstvu Neselektivní agar (14 ml) Selektivní agar (7 ml) Petriho miska Poškozené buňky jsou na neselektivním agaru obnoveny a pronikají do selektivního agaru, kde rostou nebo reagují se selektivními činidly, které pronikly do horní neselektivní vrstvy Obr. 2 Plotnová metoda s modifikací tenké agarové vrstvy (Wu and Fung, 2001).

9 PLOTNOVÁ METODA S MODIFIKACÍ JEDNOSTUPŇOVÉ OBNOVY SPM NA OBOHACENÝCH MÉDIÍCH DVOUSTUPŇOVÁ OBNOVA SPM: Inokulace vzorku v neselektivních (obohacených) bujónech Přídavek selektivních činidel/nebo přenos vzorku do selektivního (obohaceného) bujónu Zvýšení detekce SPM omezení ( nebo čas obnovy) JEDNOSTUPŇOVÁ OBNOVA SPM: Výběr specifických selektivních činidel potlačení růstu ostatních MO žádné omezení růstu SPM Optimální podmínky pro regeneraci SPM v přítomnosti selektivních činidel Dostatek času na obnovu a pomnožení SPM Listeria monocytogenes - optimalizované médium Penn State University (opsu) (Knabel, 2002)

10 0,5 0,4 SUBLETÁLNÍ POŠKOZENÍ KMENE ESCHERICHIA COLI SMĚSÍ ORGANICKÝCH KYSELIN Neselektivní bujón Selektivní bujón 0,3 A 615 0,2 0, Doba kultivace [h] Obr. 3. Detekce růstu kmene Escherichia coli DMF 7502 (kultivace v neselektivním živném bujónu, a v selektivním živném bujónu s SDS, při 30 C během 34 h) po subletálním poškození směsí organických kyselin: kyselina mléčná (272 mg.l -1 ), kyselina octová (1030 mg.l -1 ), kyselina propionová (835 mg.l -1 ) (Horníková, 2002).

11 PLOTNOVÁ METODA S VYUŽITÍM ANALÝZY OBRAZU Rychlé kvantitativní stanovení počtu živých MO a SPM Rychlé a přesné stanovení morfologických a biochemických změn Barvení akridinovou oranží Epifluorescenční mikroskop Detekce (délka + šířka) buněk Analýza obrazu (Singh and McFeters, 1990) STUPEŇ POŠKOZENÍ POPULACE = =počet živých + SP buněk - počet živých buněk (neselektivní agar) (selektivní agar)

12 INSTRUMENTÁLNÍ METODY A. Průtoková cytometrie B. Spektrofotometrie C. Fluorescenční sonda D. Optická a scanovací mikroskopie E. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

13 PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE INFORMACE: a) Intracelulární komponenty buněk (bílkoviny, nukleové kyseliny, steroly) barvitelné fluorescenčními barvivy b) Buněčný transport látek (léčiva) c) Fáze buněčného cyklu d) Subletální i letální poškození e) Základní charakteristiky buněčné populace (tvar, velikost, granularita, životaschopnost) PRINCIP: Průchod laserového paprsku (λ = 488 nm) - buněčná suspenze obarvená i neobarvená fluorescenčním barvivem (propidium jodid, ethidium bromid, fluorescin diacetát, fluorescin isothiokyanát) (Harrigan, 1998) Odezva přímého paprsku korelace s granularitou částic Odezva paprsku odraženého pod úhlem 90 korelace s velikostí částic Výsledek analýzy - histogram (Crissman and Steinkamp, 1985; Budde and Rasch, 2001)

14 a) histogram b) bodový diagram Obr. 4 Princip průtokové cytometrie (Fiala a kol., 2002). Obr. 5 Možnosti vyjádření výsledků analýzy průtokovým cytometrem: a), b).

15 SPEKTROFOTOMETRIE PRINCIP: Tepelně poškozené buňky MO uvolňují do okolního prostředí proteiny (PR) a nukleové kyseliny (NK) Množství PR a NK = rozsah poškození buněk MO (Woo et al., 2000) Metoda podle Bradforda (1976): Zjištění množství uvolněného proteinu z poškozených buněk Měření absorbance A 595 (Woo et al., 2000) Vazba barviva (Coomassie Briliant Blue G-250) na protein Standard - hovězí sérový albumin

16 FLUORESCENČNÍ SONDA FLUORESCENČNÍ SONDA: Určení rozsahu poškození buňky Určení propustnosti vnější membrány Fluorescenční sonda: 1-N-fenylnaftylamin SP buňky vykazují intenzivnější fluorescenci než buňky nepoškozené (Boziaris and Adams, 1999) Kyselina mléčná vykazuje permeabilizační účinky na buněčnou membránu bakterií (Alakomi et al., 2000)

17 OPTICKÁ A SCANOVACÍ MIKROSKOPIE OPTICKÝ MIKROSKOP/ ELEKTRONOVÝ SCANOVACÍ MIKROSKOP: Kvalitativní posouzení rozsahu SP MO (Woo et al., 2000) Sledování povrchů buněk MO vystavených působení SF Sledování povrchů nepoškozených buněk MO Stresový faktor mikrovlnné záření (Woo et al., 2000): Destrukce povrchových struktur buňky Poškození buňky = pozměněné + drsný povrch Nepoškozené buňky = hladký povrch

18 Obr. 6 Kmen Candida utilis DMF nepoškozená kultura (Štáfková, 2001). Obr. 7 Kmen Candida utilis DMF1021 poškozený směsí organických kyselin: kyselina mléčná (272 mg.l -1 ), kyselina octová (1030 mg.l -1 ), kyselina propionová (835 mg.l -1 ) (Štáfková, 2001). Obr. 8 Kmen Candida utilis DMF1021 poškozený směsí organických kyselin s následným působením nisinu (2,5 mg.l -1 ) (Štáfková, 2001).

19 POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) PCR: Stanovení a vyhodnocení počtu buněk sledovaného MO detekce určitých sekvencí DNA Selhání PCR při stanovení životaschopnosti MO ZJIŠTĚNÍ: Korelace mezi stupněm poškození/ životaschopností buněk a zkoumanými úseky DNA nevykazuje příliš dobrou shodu Vhodný indikátor životaschopnosti buněk = mrna Amplifikace mrna = PCR s aplikací reversní transkriptasy (RT-PCR) (Keer and Birch, 2003)

20 ZÁVĚR Většina metod detekce životaschopnosti MO je založena na monitorování určitého signálu, který se změní, pokud dojde k poškození buněk. K progresivním metodám detekce SPM patří instrumentální metody (např. průtoková cytometrie, techniky založené na fluorescenčním barvení buněk). Pozornost detekce SPM je upírána k novým metodám z oblasti molekulární genetiky (např. PCR). Pomalý ústup od klasické detekce plotnovou metodou srůznými modifikacemi.

21 LITERATURA ALAKOMI H. L., SKYTTÄ, E., SAARELA, M., MATILLA-SANDHOLM, T., LATVA-KALA, K., HELANDER I. M. Lactic acid permeabilizers Gram-negative bacteria by disrupting the outer memebrane. Applied and Environmental Microbiology, 2000, vol. 66, pp BOZIARIS, I. S., ADAMS, M. R. Transient susceptibility of injured gram negatives to nisin. Food Microbiology and Food Safety into the Next Millennium. Zeist, The Netherlands: Foundantion Food Micro 99, 1999, pp BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, vol. 72, pp BUDDE, B., RASCH, M. A comparative study on the use of flow cytometry and colony forming units for assessment of the antibacterial effect of bacteriocins. International Journal of Food Microbioogy, 2001, vol. 63, pp CRISSMAN, H. A., STEINKAMP, J. A. Cytometry. Science, 1985, vol. 228, p FIALA, J., MELZOCH, K., ŠVIRÁKOVÁ, E. Zpráva o výsledcích projektu FRVŠ Zavedení průtokové cytometrie do výuky biologických předmětů. VŠCHT, Praha, 2002, str. 3. HARRIGAN, W. F. Laboratory Methods in Food Microbiology. Academic Press Limited, London, 1998, p. 74. HORNÍKOVÁ, L. Diplomová práce Detekce subletálně poškozených bakterií a kvasinek. VŠCHT, Praha, 2002, str. 74. KEER, J. T., BIRCH, L. Molecular assessment of bacterial viability. Journal of Microbiological Methods, 2003, vol. 53, pp KNABEL, J. S. Optimized, one-step, recovery-enrichment broth for enhanced detection of Listeria monocytogenes in pasteurized milk and hot dogs. Journal of AOAC International, 2002, vol. 85, pp SINGH, A., YU, F., McFETERS, G. A. Rapid detection of chlorine-induced bacterial injury by the direct viable count method using image analysis. Applied and Environmental Microbiology, 1990, vol. 56, pp ŠTÁFKOVÁ, M. Diplomová práce - Subletální poškození nežádoucích bakterií a kvasinek. VŠCHT, Praha, 2001, str. 68. WOO, I. S., RHEE, I. K., PARK, H. D. Differential damage in bacterial cells by microwave radiation on the basis of cell wall structure. Applied and Environmental Microbiology, 2000, vol. 66, No. 5, pp WU, V. C. H., FUNG, D. Y. C. Evaluation of thin agar layer method for recovery of heat-injured pathogens. Food Microbiology and Safety, 2001, vol. 66, pp