Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii

Transkript

1 Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii Výuková prezentace z: Lékařské mikrobiologie Jan Smíšek ÚLM 3. LF UK 2009

2 Princip identifikace Soubor znaků s rozdílnou diskriminační hodnotou Základní problémy Minimum morfologických znaků Podobné antigeny Genomová nestabilita mutace, plasmidy

3 Principy diagnostiky Přímá diagnostika Přímý průkaz přítomnosti mikroba (kultivace) nebo jeho částí (antigen, DNA) Nepřímá diagnostika Průkaz specifické imunitní reakce proti mikrobovi (specifické protilátky) VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD

4 Odběr materiálu Přímé diagnostické metody Odběr z postiženého orgánového systému ideálně pouze málo invazivní (stěr z tonsil, sputum, krev, moč, mozkomíšní mok) Nepřímé diagnostické metody Průkaz protilátek v séru, vzácněji např. v mozkomíšním moku VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE ODBĚR

5 Přímá diagnostika Klasické metody přímé diagnostiky Mikroskopické vyšetření Kultivační vyšetření Pokročilé metody přímé diagnostiky Specifické testy Biochemické testy Detekce antigenu Citlivost k ATB Moderní metody přímé diagnostiky Detekce DNA

6 Klasická přímá diagnostika Světelná mikroskopie Nativní (nefixované a nebarvené preparáty) pozorované fázovým kontrastem nebo v zástinu slouží jen k popisu základní morfologie Fixované a barvené preparáty Rozdělení podle vlastností buněčné stěny Gramovo barvení (Gram pozitivní a negativní) Ziehl-Neelsenovo barvení (Acidorezistentní)

7 Klasická přímá diagnostika VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE BAKTERIE A MIKROSKOPIE

8 Klasická přímá diagnostika Kultivace na kultivačních půdách Obecné kultivační půdy roste na nich většina mikrobů Selektivní kultivační půdy jsou vhodné pro růst konkrétního skupiny nebo druhu Diagnostické kultivační půdy lze jimi prokázat určitou vlastnost mikroba (zkvašování cukru) Speciální kultivační půdy vhodné k růstu náročných druhů, které nelze běžně kultivovat Na pevných půdách (agarech) hodnotíme morfologii kolonií, na tekutých (bujónech) typ růstu

9 Klasická přímá diagnostika VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE KULTIVACE

10 Klasická přímá diagnostika Mikroskopické a kultivační vyšetření Výhody Snadné Levné Není náročné na technické vybavení Nevýhody Vyžaduje interpretaci zkušeným pracovníkem

11 Pokročilá přímá diagnostika Specifické testy Po interpretaci výsledků mikroskopického a kultivačního vyšetření Odliší od sebe příbuzné a vzájemně podobné mikroby Jsou založeny na specifických chemických vlastnostech či kultivačních podmínkách Chemické vlastnosti průkaz oxidázy, katalázy Kultivační vlastnosti CAMP, satelitismus, rozpustnost ve žlučových solích

12 Pokročilá přímá diagnostika VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD

13 Pokročilá přímá diagnostika Biochemické testy Jsou založeny na schopnosti bakterií metabolizovat různé substráty (cukry, aminokyseliny aj.) Většina bakterií umí zpracovat pouze konkrétní substráty kombinace substrátů typická pro bakterii biochemický profil Komerčně vyráběné testové sady s diagnostickými půdami pro určité skupiny bakterií Enterobakterie fermentující Gram neg. tyčky Nefermentující Gram neg. Tyčky Pro snazší hodnocení zpracování substrátu změna barvy diagnostické půdy

14 Pokročilá přímá diagnostika Biochemické vlastnosti bakterií čeledi Enterobacteriacae (tzv. Krátká pestrá řada ) indol laktóza sacharóza manitol glukóza ureáza Simons SIM HS plyn Pozn. 1 Test na produkci indolu - Kovácsovo činidlo (podobné Ehrlichovu činidlu); test je pozitivní při přítomnosti červené vrstvičky na hladině 2 Test štěpení (utilizace) laktózy, sacharózy a manitolu - indikátorem je bromthymolová modř Test štěpení glukózy - ve Wassermanově zkumavce (je široká), v ní menší zkumavka - tzv. plynovka - pokud je v ní bublina vzduchu, znamená to, že bakterie štěpí glukózu za vzniku plynu 6 Test na produkci ureázy (tzn. schopnost štěpit močovinu) - zkumavka s šikmo nalitým agarem obsahujícím močovinou, indikátorem změny ph je fenolová červeň 7 Amoniumcitrát (Simons) 8 SIM agar - pokud je zákal jen kolem vpichu, bakterie je nepohyblivá (nebo byla její pohyblivost nějakým způsobem ovlivněna); pokud je zákal v celém objemu agaru, bakterie je pohyblivá (např. Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, etc.); dále se na tomto agaru testuje produkce sirovodíku - ten zde tvoří černé sraženiny VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD

15 Pokročilá přímá diagnostika Výsledky se hodnotí podle matice a zaznamenají např. do hodnotícího programu v PC

16 Pokročilá přímá diagnostika Program vyhodnotí pravděpodobnost shody s typovými biochemickými profily konkrétních druhů

17 Pokročilá přímá diagnostika Detekce antigenu Přímý průkaz antigenu v biologickém materiálu průkaz infekce konkrétním druhem Aglutinací (latexová aglutinace) Imunofluorescenčně ELISA Průkaz antigenu v čisté kultuře identifikace konkrétního kmene Používají se diagnostická séra sérotypizace (zpětná aglutinace)

18 Pokročilá přímá diagnostika VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD

19 Pokročilá přímá diagnostika Určení citlivosti k antibiotikům Velký terapeutický význam Určení citlivosti / rezistence konkrétního kmene Disková difúzní metoda nejčastější, disky napuštěné ATB měří se velikost inhibičních zón E test proužek s klesající koncentrací ATB, drahé!!! MIC (Minimální Inhibiční Koncentrace) bujón s klesající koncentrací ATB nejnižší koncentrace při níž bakterie nevyroste = MIC

20 Pokročilá přímá diagnostika VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE ATB

21 Moderní přímá diagnostika Detekce DNA mikroba Hybridizační metody Průkaz navázáním značených genových sond na specifické úseky DNA nebo RNA Amplifikační metody Průkaz pomnožením specifických úseků DNA Polymerázová řetězová reakce (PCR) VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD

22 Nepřímá diagnostika Založena na průkazu specifických protilátek hostitele proti mikrobovi Klasické metody nepřímé diagnostiky KFR, Přímá aglutinace, Hemaglutinace Moderní metody nepřímé diagnostiky ELISA, Western blot VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE SEROLOGIE

23 Diagnostický postup Lokalizovaná infekce (pneumonie) Odběr lokálního materiálu (sputum) Mikroskopie (morfologie, Gram, Ziehl- Neelsen) Kultivace (krevní agar, McConkeyho agar, Sabouraudův agar) Diagnostický test dle výsledků mikroskopie a kultivace CAMP, satelitismus, enterotest atd. Určení citlivosti k ATB terapeutické doporučení

24 Diagnostický postup Závažná specifická infekce (meningitida) Odběr lokálního materiálu (likvor) i krve Rychlý průkaz antigenů v likvoru (latexová aglutinace) Mikroskopie a kultivace likvoru Hemokultura (kultivace krve) Při průkazu bakteriálního původce vyšetření citlivosti k ATB Jinak průkaz protilátek (spirochety a viry) a DNA (viry)