Vnesení plasmidů do buněk transformace Chemická transformace principy, příprava kompetentních buněk Elektroporace princip, příprava

Transkript

1

2 Obsah MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÁ ČÁST... 4 Úvod do problematiky projektu... 4 Vybrané pojmy (operon, promotor, čtecí rámec, komplementarita bází, GMO)... 6 E. coli jako nezastupitelný pomocník při klonování DNA Mikroorganismy pro produkci polysacharidů a rekombinantních proteinů Bakteriální expresní systémy Kvasinkové expresní systémy Hmyzí expresní systémy Savčí expresní systémy Výběr genu a jeho izolace Specifika prokaryontních genů kódujících rekombinantní protein Specifika eukaryontních genů kódujících rekombinantní protein Techniky izolace známého genu a cdna (PCR, RT-PCR, RACE) 39 Práce s genovými a proteinovými databázemi Klonovací a expresní plasmidy Základní technika klonování (restrikce ligace) Minipreparace a maxipreparace DNA Restrikční analýza a dělení NK v agarosovém gelu Lokalizace transgenu v buňce - extrachromosomální, rekombinace do genomu

3 Vnesení plasmidů do buněk transformace Chemická transformace principy, příprava kompetentních buněk Elektroporace princip, příprava kompetentních buněk, podmínky Stabilita plasmidů v buňkách Episomální DNA Antibiotická selekce Homologní rekombinace Ověření exprese genů na laboratorní úrovni Fenotypová analýza, PCR analýza Skríning produkce rekombinantních proteinů ORIZONTÁLNÍ PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE Historie Výměna genetické informace Bakterie Eukaryota Vznik imunity jako obrany integrity Genom člověka Pangenom Závěy Doporučená literatura Internetové zdroje

4 MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÁ ČÁST Úvod do problematiky projektu Základním cílem projektu je demonstrace a praktické provedení dílčích experimentů vedoucích k biotechnologické produkci hyaluronové kyseliny (HA), použitelné pro farmakologické účely. U člověka se HA tvoří jako součást chrupavky kloubů, synoviální tekutiny kloubů, ale i kůže, kde významnou měrou přispívá k hojení ran. Na HA, jako součást mimobuněčné hmoty (extracelulární matrix), se prostřednictvím receptoru (CD44) vážou buňky imunitní, aby zde mohly zahájit svou obrannou funkci. HA je dále zapojena například do vývoje nervové soustavy. V neposlední řadě se HA uplatňuje při nádorovém bujení a rozvoji metastáz. Z chemického hlediska je ha lineární polymer tvořený opakující se sekvencí dvou jednotek: D-glukuronové kyseliny a D-N-acetyglukosaminu spojených střídavými glykosidickými vazbami β-1,4 a β-1,3 (Obr. 2.1). 4

5 Obrázek 2.1. Struktura kyseliny hyaluronové Je známo, že některé bakterie z řádu Lactobacillales tvoří HA jako součást bakteriálního pouzdra chránícího bakterii před působením imunitního systému hostitele. Její struktura je identická s ha lidskou. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus představuje jednu z bakterií používaných k biotechnologické přípravě HA. Bakterie produkuje mimo jiné enzym -glukuronidasu, odštěpující z neredukujícího konce HA glukuronovou kyselinu (GK) viz. Obrázek. 2.2, která je dále metabolizována jako zdroj energie. Geny podílející se na metabolismu GK jsou sdruženy v jednom operonu (βglucuronic-acid-utilizing operon), jehož exprese je přítomností volné GK aktivována. Aktivace operonu, ač finálně vedoucí k zisku energie z GK, představuje pro bakterii významnou metabolickou zátěž spojenou se zpomalením rychlosti dělení buněk. Obrázek glukuronidasa štěpí glukuronosid na glukuronát 5

6 V této kapitole bude probrána základní terminologie a molekulárně biologické techniky umožňující pochopení veškerých dílčích metodických postupů vedoucích k přípravě mutantního kmene Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, který neexprimuje enzym β-glukuronidasu v důsledku navozené ztrátové (deleční) mutace příslušného genu (gusa). Principiální výhodou biotechnologického použití bakteriálního kmene, který netvoří β-glukuronidasu, je zvýšení rychlosti růstu mutantních bakterií a následné zvýšení výtěžku ha z jednotkového objemu bakteriální kultury v důsledku energetické úspory inaktivací β-glucuronic-acid-utilizing operonu. Vybrané pojmy (operon, promotor, čtecí rámec, komplementarita bází, GMO) Jelikož v následujících kapitolách budou používány některé pojmy, které usnadňují popis metod molekulárního klonování, nejdříve uvedeme jejich definice, případně vysvětlení souvislostí. Operon skupina genů nebo segment DNA, které fungují jako jedna transkripční jednotka. Zahrnuje operátor, promotor a jeden nebo více strukturních genů, které jsou transkribovány do polycistronické mrna. Gen základní, fyzická a funkční jednotka dědičnosti. Strukturní gen úsek DNA zapojený do produkce polypeptidového řetězce. Určuje strukturu proteinu a RNA molekuly, ale zahrnuje i oblasti zapojené do regulace jejich exprese. 6

7 Operátor oblast DNA, na kterou se váže specifický protein (represor) bránící iniciaci transkripce z přilehlého promotoru. Promotor oblast DNA, na kterou se váže RNA polymerasa a transkripční faktory, zahajující transkripci mrna. Cis-trans komplementační test párovací test, sloužící k určení toho, zda dvě různé recesivní mutace na opačných chromozomech diploidního organismu (pozice in trans) se vzájemně kompenzují (komplementují). Pokud ano, postihují různé geny, pokud ne, postihují stejný gen. Tento test se označuje i jako test alelismu (Obr. 2.3). Cistron nejmenší genetická jednotka nevykazující genetickou komplementaci ve výše zmíněném cis-trans testu, ale vykazující genetickou komplementaci, jestliže tytéž mutace jsou na jednom chromozomu (v poloze in cis). Cistron je tedy slučitelný s pojmem kódující částí jednoho genu. Cis regulace odpovídající cis poloze v cis-trans testu. Polycistronická mrna mrna kódující více než jeden protein. Vnitřní místo nasedání ribozomů vzhledem k tomu, že z polycistronické mrna se přepisují různé proteiny, musí docházet k nasedání a sestavení ribozomu i mezi úseky mrna kódující jednotlivé proteiny. Obrázek 2.3. Princip segregačního cis-trans testu 7

8 Čtecí rámec transferové RNA (trna) nasedají na templátovou mrna a přinášejí nově syntetizovanému peptidu další aminokyseliny k jeho prodlužování. Jednotlivé trna rozlišují podle principu komplementarity příslušnou trojici nukleotidů na mrna. Z takovýchto trojic je souvisle vytvořena kódující část mrna. Při návrhu klonovacích postupů spojujících dvě oblasti genů kódujících budoucí fúzní protein je třeba bedlivě dbát, aby při spojování dvou DNA vznikl opět souvislý sled tripletů bez vmezeření či výpadku báze DNA, neboť jinak by došlo k posunutí čtení tripletů a k přepisu nesmyslného proteinu. Komplementarita bází báze se spojují vždy A-T nebo C-G. Toto pravidlo je nutné dodržet při navrhování překryvných míst a kohezivních konců DNA během klonování. Kohezivní konce dvouvláknové DNA jednovláknový úsek DNA molekuly přesahující buď na 5 nebo 3 konci dvouvláknovou DNA, který v rámci komplementarity bází může vázat komplementární úsek jiné DNA molekuly. Pokud na obou koncích DNA molekuly A1 jsou přesahující konce odlišné sekvence (vzájemně nekomplementární) a DNA B2 je ukončena konci komplementárními k úsekům molekuly A1, můžeme tyto dvě molekuly spojit (ligovat) tak, že je předem zajištěna správná orientace obou úseků DNA vůči sobě (Obr. 2.4). Kohezivní konce můžeme připravit štěpením DNA dvojšroubovice DNA endonukleázou. Pokud použijeme dvě odlišně štěpící endonukleasy, vznikne DNA 8

9 úsek se dvěma různými kohezivními konci. Stejným ošetřením jiné molekuly vytvoříme pár dvou DNA fragmentů, které je možno následně stranově specificky spojit (Obr. 2.4). Použitím restrikčních endonukleáz, které po rozštěpení DNA vytvoří přesahující konec ve formě palindromu, je zajištěna komplementarita všech konců vzniklých štěpením jednou endonukleázou. Palindrom sekvence DNA, která je vzájemně komplementární podle svého středu (AGCCT nebo ACTGCAGT). Obrázek 2.4. Využití kohezivních konců pro jednosměrné klonování Pro snadnější pochopení některých výše uvedených pojmů popišme stručně Lac operon E. coli. Představuje jeden z prvních popsaných operonů. Je tvořen skupinou přilehlých společně regulovaných genů zapojených do metabolismu laktózy lacz, lacy a laca. Pokud buňky rostou v médiu bohatém na glukózu, exprese genů lac operonu je blokována lac represorem (produkt přilehlého laci genu), který se váže na operátor a brání tak nasedání RNA polymerasy. Pokud však buňky rostou v médiu obsahujícím laktózu nebo její nemetabolizovatelné analogy jako isopropyl-1-thio-β-d-galaktosid (IPTG), represor je vazbou β-galaktosidů uvolněn z vazby na operátoru a RNA polymerasa může nasedat a zahájit transkripci polycistronické mrna lac operonu. Gen 9

10 lacz kóduje β-galaktosidasu, gen lacy kóduje permeasu pro β-galaktosidy a gen laca kóduje galaktosid-acetyltransferasu, enzymy nezbytné pro metabolické využití laktózy. Plasmid extrachromozomální DNA, která se replikuje a může se přenášet z generace na generaci, pokud je to pro hostitelskou bakterii výhodné. Příkladem výhodnosti je, že plasmid kóduje protein zajišťující rezistenci na určité antibiotikum. Jiný příklad je, že plasmid kóduje proteiny nezbytné pro vazbu bakterií na hostitelské tkáně v průběhu infekce nebo umožňuje bakterii lépe se bránit imunitnímu dozoru hostitele (například povrchové antigeny borelií). Plasmid může být cirkulární (většina) nebo lineární (znám u laktobacillů, borelií, streptomycet). Aby mohl být plasmid replikován, musí obsahovat místo, kde je replikace zahájena. Nejčastěji používané plasmidy jsou deriváty dvou E. coli plasmidů ColE1 a pmb1. Oba plasmidy se vyskytují v hostitelské buňce v počtu kopií. Toto číslo je kontrolováno plasmidovým replikátorem, což je úsek plasmidu nesoucí začátek replikace ori a další regulační sekvence či geny kódující regulační proteiny, nikoliv však polymerasy a endonukleasy. Replikátory ColE1 a pmb1 jsou podobné. Replikátor ColE1 je dlouhý 600 párů bází, kóduje ori místo zahájení replikace hostitelskou DNA polymerázou, RNA primer a dva negativní regulátory RNAI a protein Rop. Všechny enzymy účastnící se procesu replikace pochází z hostitelské bakterie. Kritickým bodem zahájení replikace je vytvoření správné sekundární struktury dočasně vytvořeného RNAII transkriptu, syntetizovaného hostitelskou RNA polymerázou, která spouští jeho rozštěpení hostitelskou RNázouH, a následné zahájení replikace hostitelskou DNA polymerázou. Regulace replikace spočívá v narušení sekundární struktury RNAII transkriptu vazbou regulační RNAI a stabilizací této vazby proteinem Rop, což znemožní zahájení replikace (Obr. 2.5). Mutací sekvencí RNAI či rop genů je možné značně zvýšit počet kopií plasmidu na jednu buňku. Některé mutace replikátoru vedou k počtu kopií na jednu buňku až Na druhou stranu plasmidy s velmi nízkým počtem kopií se replikují synchronně s buněčným cyklem hostitelské bakterie, neboť pro zahájení své replikace vyžadují některé hostitelské proteiny, jejich exprese je spojena se zahájením buněčného dělení. Tyto plasmidy většinou nesou geny zajišťující regulovanou segregaci plasmidů mezi dceřiné buňky. Přehled replikátorů používaných v molekulárním klonování je uveden v Tab Tabulka 2.1. Nejčastěji používané replikátory Název Příklad Délka (bp) Selekční znak prototypu Počet kopií a Reference Pmb1 Pbr322 4, 362 Ap r, Tet r Vysoký; Bolivar et al.,

11 Cole1 Pmk16 ~ 4,500 Kan r, Tet r, Cole1 imm Vysoký; > 15 Kahn et al., 1979 P15a Pacyc184 ~ 4,000 Eml r, Tet r Vysoký; ~ 15 Chang et al., 1978 Psc101 Plg338 ~ 7,300 Kan r, Tet r Nízký; ~ 6 Stoker et al., 1982 F Pdf41 ~ 12,800 Trpe Nízký; 1 2 Kahn et al., 1979 R6k Prk353 ~ 11,100 Trpe Nízký; < 15 Kahn et al., 1979 R1 r1drd-17 Pbeu50 ~ 10,000 r r Ap, Tet Nízký pod 30 C Vysoký nad 35 C b Uhlin et al., 1983 Rk2 Prk2501 ~ 11,100 Kan r, Tet r Nízký; 2 4 Kahn et al., 1979 a počet kopií odpovídá prototypovému plasmidu. Mutace v replikátoru může značně ovlivnit počet kopií. Například u puc řady (pmb1) mutace replikátorů vedou až k kopiím na jednu buňku. Převzato z Current Protocols in molecular biology, Wiley, New York. b citlivé na teplotu kultivace. Inkompatibilita plasmidů je stav, kdy dva neidentické plasmidy nemohou společně koexistovat v jedné buňce dlouhou dobu, pokud nejsou oba udržovány pomocí rozdílných selekčních znaků, například antibiotik. K inkompatibilitě dochází zejména, pokud dva plasmidy sdílejí podobné regulační mechanismy replikace. Inkompatibilita je důsledkem neschopnosti korigovat fluktuace vyplývající z náhodné selekce jednotlivých kopií k iniciaci replikace a následnému rozdělení plasmidů do dceřiných buněk. Jelikož ColE1 a pmb1 mají podobné replikátory, a jsou tedy podobně regulovány RNAI, jsou ve stejné skupině inkompatibility a nemohou dlouhodobě koexistovat v jedné buňce. Pozor, dva plasmidy vzniklé rekombinací (například vnesením dvou velmi podobných inzertů) se liší pouze svou velikostí a jsou rovněž inkompatibilní. Episom DNA element, který se může replikovat nezávisle na replikaci chromozomu (stejně jako plasmid) nebo se může integrovat do chromozomu a zde se replikovat společně s chromozomální DNA. Po opětném vystřižení z chromozomu existuje jako cirkulární extrachromozomální DNA, která obsahuje i geny pocházející z chromozomu. Obrázek 2.5. Regulace replikace ColE1 a pmb1 plasmidu pomocí RNAII a Rop 11

12 MCS místo v klonovacím plasmidu určené pro vnášení cizorodé DNA. Je tvořeno úsekem DNA složeným z krátkých sekvencí rozlišovaných různými restrikčními endonukleasami. Pro smysluplnost postupu tato restrikční místa nesmí být umístěna v jiných oblastech plasmidu. V mnoha plasmidech je MCS umístěno uvnitř genu lacz jako součást lac operonu. GMO geneticky modifikovaný organismus. V průběhu molekulárního klonování vnášíme různé DNA úseky do plasmidů a tyto vnášíme do hostitelských bakterií za účelem selekce a amplifikace plasmidů. Vnesením cizorodé DNA jinou než přirozenou cestou (jako je infekce bakteriofágem či virem, konjugace přirozených plasmidů atd.). Vzniká buňka, která obsahuje laboratorně manipulovanou DNA a podle definice se jedná o geneticky modifikovaný organismus. Pro manipulace vedoucí ke vzniku GMO je nutné, aby měla laboratoř povolení k této manipulaci od Ministerstva životního prostředí MŽP (v kategorii rizika i stačí podat oznámení MŽP) a aby pravidelně, jednou za rok, oznámila MŽP formou ročního hlášení (vždy k 15. únoru následujícího roku), jak nakládala s GMO. Legislativa související s manipulací s GMO, jednotlivé kategorie a způsoby nakládání jsou definovány zákony a vyhláškami České republiky (zákon 12

13 178/2001; 185/2001; 78/2004; 346/2005; vyhláška 209/2004; 195/2005; 86/2006) a nařízeními Evropského parlamentu a rady (ES) (1830/2003; 1946/2003). V ročním hlášení je kladen důraz na dodržení podmínek deklarovaných v oznámení o nakládání. Toto roční hlášení musí schválit odborný poradce pro GMO, který je u každé instituce jmenován statutárním zástupcem. Pracovníci nakládající s GMO musí být pravidelně školeni. Příklad obsahu pravidelné roční zprávy je uveden v Tab Tabulka 2.2. Formulář ročního hlášení pro uzavřené nakládání s GMO Uživatel Datum a číslo rozhodnutí o zápisu do seznamu uživatelů Používané GMO (podle zápisu GMO v seznamu uživatelů) Odborný poradce Účel nakládání s GMO Pracoviště Kontaktní osoba na pracovišti Kategorie rizika Přibližné množství použitých GMO Veškeré změny v nakládání proti údajům uvedeným v žádosti o zápis do seznamu uživatelů (např. Pokud nebyly některé GMO v uplynulém roce používány) Likvidace GMO Mimořádné události v průběhu nakládání s GMO a přijatá opatření Kontroly výskytu GMO mimo uzavřený prostor Jakákoliv pozorovaná souvislost s přímým či nepřímým ohrožením lidského zdraví Další poznatky získané při nakládání s GMO, které mají vliv na hodnocení rizika Bude uzavřené nakládání s GMO pokračovat v dalším roce? Pokud ne, uvést důvod ukončení. Pokud ano, jsou plánovány nějaké změny? Shrnutí (porovnání skutečného průběhu nakládání s GMO s údaji uvedenými v žádosti o zapsání do seznamu uživatelů) E. coli jako nezastupitelný pomocník při klonování DNA V průběhu molekulárního klonování se téměř každý experimentátor setká s nutností využít nějaký klonovací či expresní plasmid. Jejich konstrukce a amplifikace se, 13

14 s výhodou danou jejich původem, provádí s pomocí hostitelského mikroorganismu, jakým je nejčastěji E. coli. Tato jedna z nejlépe prostudovaných bakterií umožňuje velmi přesně amplifikovat plasmidovou DNA, selektovat připravené rekombinantní varianty plasmidu a v mnoha případech získat s vysokým výtěžkem i rekombinantní proteiny plasmidem kódované. E. coli je Gram negativní tyčka s cirkulárním chromozomem o velikosti zhruba párů bází. Je schopna růstu na minimálním médiu obsahujícím zdroj uhlíku jako je glukóza a soli, které jsou zdrojem dusíku, fosforu a stopových kovů. Na médiích obohacených aminokyselinami, prekurzory nukleotidů, vitamíny atd. však roste mnohem rychleji. Po naočkování malého množství bakterií (inokula) do obohacených médií se bakterie po úvodní fázi lag dělí exponenciálně se zdvojovacím časem minut. Tato exponenciální fáze se nazývá log fáze. V log fázi růstu setrvává bakterie, dokud nespotřebuje veškeré živiny či kyslík, nebo pokud množství zplodin metabolismu, jako jsou například kyseliny, nepřesáhne hranici inhibice růstu. Většina kmenů E. coli používaných při rekombinaci DNA je derivována z nepatogenní linie E. coli K-12, izolované v roce 1922 ze stolice pacienta uzdravujícího se z difterie v Palo Alto v Kalifornii. F faktor fertility (nebo sex) faktor umožňuje přenos genetického materiálu z jedné E. coli, která F faktor obsahuje (F +, samčí, dárcovská) do druhé, která F faktor neobsahuje (f -, samičí, příjemcovská) při procesu zvaném konjugace. F faktor může být v buňce ve formě plasmidu, episomu, nebo jako součást bakteriálního chromozomu (Hfr high frequency of recombination). F plasmid tak, jak byl původně popsán, má délku téměř 10 5 párů bází. Pro molekulárně biologické aplikace se používá minimalizovaná verze, která kromě genů záměrně vnesených do f plasmidu (nebo f episomu) obsahuje ori místo pro zahájení replikace, rep gen kódující replikasu, případně par segregační geny kódující jednotlivé podjednotky topoizomerasy IV a ccd (ccd stands for coupled cell division) geny. S výhodou jsou do F plasmidu vnášeny geny rezistence na antibiotikum, pomocí kterého je plasmid udržován v následujících generacích a dále například gen kódující ω fragment -galaktosidasy umožňující α komplementaci. Příkladem je F episom v bakterii XL-1 Blue F [::tn10 proab + laci q δ(lacz)m15]. F označuje, že se jedná o bakterii, která je potomkem kmene, v němž se F faktor integrovaný do chromozomu uvolnil i s několika chromozomovými geny a dále setrvává ve formě episomu. Geny získané z chromozomální DNA jsou uvnitř hranatých závorek. Zde se jedná o část transpozonu Tn10 nesoucího gen rezistence na tetracyklin, geny proab kódující γ-glutamyl fosfát reduktasu a kinasu, účastnící se metabolismu prolinu, dále represor laktózového operonu laci, který je z tohoto episomu nadprodukován, a gen kódující ω fragment -galaktosidasy δ(lacz)m15. 14

15 α komplementace je fenomén, kdy exprese dvou genů, z nichž jeden kóduje N terminální úsek -galaktosidasy (α fragment) a druhý kóduje C terminální úsek - galaktosidasy (ω fragment), vede k vytvoření funkčního enzymu sestavením dvou polypeptidových podjednotek po jejich translaci. To umožňuje prokázat přítomnost obou genů při kultivaci buněk v přítomnosti substrátu -galaktosidasy [X-Gal, (5-bromo-4- chloro-3-indolyl- d-galaktosid)], vedoucí k modrému zabarvení buněk. Příkladem využití tohoto fenoménu je rychlé monitorování úspěšnosti vnášení DNA fragmentů do klonovacích plasmidů. -galaktosidasa zde slouží jako reporterový gen. Plasmidy vhodné pro tyto aplikace mají MCS umístěné uvnitř genu lacz, kódujícího fragment - galaktosidasy, jako součást modifikovaného lac operonu. Hostitelské E. coli exprimují ω fragment -galaktosidasy nejčastěji z F episomu. Při vnesení DNA inzertu do MCS dojde při translaci lacz genu k porušení aminokyselinové sekvence fragmentu - galaktosidasy, která nemůže komplementací vytvořit funkční protein -galaktosidasu, což je viditelné po naočkování bakterií na pevnou agarovou půdu s X-Gal a IPTG. Kolonie bakterií nesoucích nerekombinovaný plasmid (bez DNA sekvence vnesené dovnitř genu pro fragment) jsou modré, kdežto kolonie s vneseným DNA inzertem modré nejsou (Obr. 2.6). Obrázek 2.6. Modrá-bílá selekce transformovaných bakterií 15

16 Kanamycin Gentamici n Chloramfenikol v metanolu Ampicilin Antibiotika antibiotika představují neodmyslitelný nástroj v molekulárním klonování. Umožňují selektovat bakteriální linie, do nichž byl úspěšně vpraven plasmid kódující protein inaktivující použité antibiotikum. Gen pro tento protein (antibiotickou rezistenci) se nachází mimo klonovací místo (oblast vnášení cizorodé DNA). Pomocí dalšího antibiotika, nebo antibiotik, je dále možné udržovat v bakterii pomocné plasmidy či episomy, pokud nesou příslušné geny rezistence. Takové plasmidy a episomy zajišťují potřebné fenotypové vlastnosti konkrétního bakteriálního kmene. Antibiotika jsou použitelná i pro selekci transfekovaných savčích buněčných linií. Selekční tlak antibiotik umožňuje mimo jiné selektovat buněčný klon, u nějž se plasmid integroval do genomické DNA, se kterou se přenáší na následující dceřiné generace. Vzniká tak stabilně transfekovaná buněčná linie. Pokud byl integrován plasmid nesoucí nejen gen rezistence na antibiotikum, ale i gen kódující rekombinantní protein, můžeme selekcí získat klon s dostatečně vysokou produkcí daného rekombinantního proteinu. Nejčastěji používaná antibiotika při selekci bakterií jsou uvedena v Tab Tabulka 2.3. Antibiotika používaná v molekulárním klonování Název Pracovní Mechanismus působení Mechanismus rezistence (mg/ml) Baktericidní; zabíjí rostoucí E. coli, -laktamasa hydrolyzuje ampicilin dříve, inhibuje syntézu stěny potlačením než se dostane do buňky tvorby příčných vazeb mezi peptidoglykany 20 Bakteriostatický; inhibuje Chloramfenikol acetyltransferasa proteosyntézu interakcí s 50s inaktivuje chloramfenikol podjednotkou ribozomu a inhibuje reakci peptidyltransferasy 15 Baktericidní; inhibuje Aminoglykozid acetyltransferasa a proteosyntézu interakcí s l6 aminoglykozid nukleotidyl transferasa proteinem 50s podjednotky inaktivuje gentamicin; mutace v rplf ribozomu brání vazbě gentamicinu 30 Baktericidní; inhibuje Aminoglykozid (neomycin) proteosyntézu, inhibuje translokaci fosfotransferasa, aminoglykozid a vyvolává poruchy čtení tripletů acetyltransferasa a aminoglykozid nukleotidyl transferasa inaktivuje gentamicin a kanamycin 16

17 Tetracyklin v 70% etanolu 12 Bakteriostatický; inhibuje Aktivní eflux tetracyklinu z buňky proteosyntézu bránění ve vazbě aminoacyl trna na místo a ribozomu Nonsense suppression potlačení efektu stop kodonů v důsledku přítomnosti abnormálních trna, které se vážou na stop triplet, přinášejí aminokyselinu a umožňují další průběh translace. Na možnou přítomnost abnormálních trna je nutno myslet při výběru E. coli pro zamýšlený experiment. Supresorové geny jsou uvedeny v genotypu bakterie. Příklady supresorových genů jsou supd, supe atd. Většina supresorových trna nasedá na stop kodony Amber (UAG) nebo Orche (UAA). Mikroorganismy pro produkci polysacharidů a rekombinantních proteinů Při práci s mikroorganismy i tkáňovými kulturami je třeba dodržovat zásady sterilní práce, zejména při přípravě bakteriálního inokula. Ač je často komplikované kultivovat zvolenou populaci buněk, kontaminace se může objevit, aniž bychom jí to jakkoliv usnadňovali. Nicméně zásady sterilní práce umožňují minimalizovat toto riziko. Pro přípravu sterilních kultivačních médií pro kultivaci bakterií, pufrů a vody se nejčastěji používá sterilizace autoklávováním. Při autoklávování se mikroorganismy ničí nasycenou vodní parou při teplotě nejčastěji 121 C, po dobu minimálně minut a zvýšeném tlaku. Autoklávování je možné opakovat za hodin, což je čas nezbytný pro vyklíčení eventuálně přítomných spór, které jsou jinak k autoklávování rezistentní. Sklo, plast a nástroje se autoklávují za teploty 134 C po dobu minut. Autoklávovat lze i citlivější materiály, jako jsou plasty (polyetylen, polykarbonát, silikon; nevhodný k autoklávování je polystyren, částečně se může poškodit polypropylen). Doporučení je vždy otestovat vhodnost konkrétního plastu pro autoklávování. Autoklávování se nepoužívá pro sterilizaci médií pro tkáňové kultury. Nástroje a sklo je možné dále sterilizovat horkovzdušnou sterilizací za teploty 180 C po dobu 1 2 hodiny. Horkovzdušná sterilizace se kromě vlastní sterilizace používá i k inaktivaci RNA pro účely přípravy materiálu na izolaci RNA. Zde je však nutné použít mnohem drastičtější podmínky, a to 180 C po dobu 8 hodin. Horkovzdušná sterilizace je vhodná zejména pro sterilizaci skla a nástrojů z nerez oceli. Není vhodná pro sterilizaci ostrých nástrojů, neboť ostří se při opakovaném vystavení vysoké teplotě vzduchu rychle tupí. 17

18 Komerčně dodávaný plast a pomůcky pro sterilní manipulaci se průmyslově sterilizují zářením. Sterilizace etylenoxidem nebo formaldehydem není vhodná zejména pro materiály přicházející do kontaktu s tkáňovými kulturami, neboť i nepatrné zbytky těchto látek mohou působit toxicky na kultivované buňky. Izolace rekombinantního proteinu je procedura, která sestává z několika klíčových kroků. V první řadě je nutné zvážit, jaký expresní systém bude vhodný pro produkci rekombinantního proteinu. Tomu je nutné přizpůsobit následující klonovací postup. Volba expresního systému je ovlivněna velikostí rekombinovaného proteinu, potřebou zachovat nezbytné posttranslační modifikace, rozpustnost proteinu a požadované množství (Tab. 2.4, 2.5). Následuje izolace cdna kódující daný protein. V dalším kroku je třeba navrhnout, sestavit, izolovat a namnožit plasmid, který umožní expresi rekombinantního proteinu. Na závěr je tento plasmid vnesen do vhodného hostitele, který podle něj vytváří rekombinantní protein. E. coli zde slouží jako vysoce přesný nástroj umožňující selekci a amplifikaci rekombinovaných plasmidů vzniklých molekulárním klonováním a vnesených do E. coli některou z takzvaných transformačních metod. Transformované bakterie jsou naočkovány na tuhé agarové kultivační půdy tak, aby kolonie, které zde vyrostou, byly od sebe dostatečně prostorově separovány. Díky fenoménu inkompatibility plasmidů nesou kolonie, které vyrostou z bakterií naočkovaných na tuhou půdu, jen jednu variantu rekombinovaného plasmidu. Aby na tuhé půdě narostly pouze E. coli, které nesou rekombinovaný plasmid, obsahuje kultivační půda antibiotikum, ke kterému jsou odolné pouze bakterie obsahující plasmid (plasmidem transformované bakterie, rekombinované bakterie), neboť plasmid kóduje znak rezistence na příslušné antibiotikum. Selekce jednotlivých kolonií nesoucích plasmid je nezbytná proto, že rekombinované plasmidy vzniklé molekulárním klonováním nejsou vždy správně sestavené, mohou obsahovat kontaminující DNA, mohou nést různé mutace, nemusí obsahovat žádnou vnesenou cdna, či mohou obsahovat vnesenou cdna v nesprávné orientaci atd.. Jiná situace nastává při produkci polysacharidu jako ha. Zde vycházíme ze spontánní tvorby dané makromolekuly (HA), molekulární klonování a manipulace s expresní bakteriální linií slouží pouze ke zvýšení výtěžku makromolekuly produkované vybraným kmenem bakterií přirozeně se vyskytujícím v přírodě. Tabulka 3.4. Velikost rekombinantního proteinu a expresní systémy Velikost proteinu Povaha proteinu E. coli Kvasinky Hmyzí buňky Savčí buňky 18

19 < 8 kda +++ Fúzní > 8 kda Intracelulární 8 50 kda Sekretované > 50 kda Sekretované a povrchové +++ Bakteriální expresní systémy Bakteriální systémy jsou používány pro klonování DNA i pro expresi rekombinantních proteinů. Výhodou bakteriálního systému, zejména E. coli, je dobrá znalost jejich chování a kultivačních podmínek, krátký zdvojovací čas E. coli, dostupnost efektivních metod pro transformaci, izolaci DNA i rekombinantních proteinů atd. Vhodné linie E. coli jsou schopny amplifikovat malé plasmidy, ale i obří plasmidy bacmidy, které mají velikost několika stovek párů bází. E. coli rostou jak v tekutých, tak na tuhých plotnách v normální atmosféře při teplotách od 23 C do 37 C. Při klonování DNA se používá standardně 37 C. Pro expresi rekombinantních proteinů je možno použít teplotu 37 C, nebo teplotu snížit, čímž se může snížit i potenciální toxicita rekombinantního proteinu. Při produkci rekombinantního proteinu v E. coli dosahujeme obecně nejvyšších výtěžků dosahujících až 5 gramů proteinu na 1 litr biomasy (Tab. 2.5). Rekombinantní proteiny produkované v E. coli však nejsou dostatečně posttranslačně modifikovány (chybí obecně: N-glykozylace, C-glykozylace, tvorba disulfidických můstků, štěpení prekurzorových proteinů specifickými proteasami, skládání proteinu). Jelikož jejich intracelulární transport je většinou odlišný od situace při jejich přirozené produkci a asistenční proteiny, jako proteiny tepelného šoku (hsp), mohou mít poněkud odlišné funkce v bakteriálním hostiteli, mohou se rekombinantní proteiny exprimované v E. coli shlukovat do inkluzních tělísek lokalizovaných v cytoplasmatickém nebo periplasmatickém prostoru. Tabulka 2.5. Výtěžky expresních systémů v průmyslové praxi 19

20 Protein E. coli Kvasinky P. pastoris, S.cerevisiae Hmyzí buňky Savčí buňky Sekretovaný [g/l biomasy] < 0,5 0,2 4 0,25 0,001 0,5 0,001 0,1 Intracelulární rozpustný [g/l biomasy] 0,5 5 0, ,001 Intracelulární inkluze [g/l biomasy] 0, E. coli vytváří inkluzní tělíska přirozeně za účelem ukládání zásob. U savčích buněk vznikají inkluzní tělíska nejčastěji z virových kapsidových proteinů. Nejsou ohraničena membránou. Inkluzní tělíska z rekombinantních proteinů jsou tvořena nerozpustnými agregáty nesprávně složeného proteinu bez biologické aktivity. Velikost inkluzních tělísek se pohybuje od 0,2 do 0,6 m. Jsou pozorovatelná ve fázovém kontrastu jako temná intracelulární tělíska. Sekrece rekombinantního proteinu je jednou z cest minimalizace tvorby inkluzí. Sekrece proteinů přes dvojitou buněčnou membránu E. coli je však velmi málo efektivní a pro velké rekombinantní proteiny většinou dosud technologicky nezvládnutá. Nicméně jsou popsány mechanismy, které zřejmě v budoucnu umožní modifikaci rekombinantních proteinů k efektivní sekreci. Sekrece se děje prostřednictvím transportních drah, kterých bylo u E. coli popsáno šest. Sekrece typu I je závislá na ABC transporterech (ATP-binding cassette) a proteiny prochází periplasmatickým prostorem pomocí kanálu, který je od něj do jisté míry izoluje. Využití sekrečního mechanismu typu i je limitováno velikostí efektivně sekretovaných proteinů. Její hodnota je pod 200 aminokyselin. Sekrece je navozena připojením sekretorního signálu (HlyA) k C konci rekombinantního proteinu, který je možné po izolaci proteinu odstranit enzymaticky. Sekrece typu II je závislá na SEC (SecB), SRP (signal recognition particle) nebo TAT (twin-arginin translocation) drahách. Tyto dráhy jsou zodpovědné za první krok sekrečního mechanismu typu II transport do periplasmatického prostoru. 1) SEC sekrece je zodpovědná za sekreci většiny rekombinantních proteinů do periplasmatického prostoru. U proteinu je před transportem přes sec nejdříve rozvolněna vyšší konformační struktura a po vstupu do periplasmatického prostoru je protein opět složen do vyšší konformace. Na této dráze je zapojeno minimálně 9 proteinů (Trigger Factor, SecA, SecB, SecY, SecE, SecG, SecD, SecF a YajC). 2) SRP závislá sekrece probíhá jako 20

21 jediná kotranslačním mechanismem, což znamená, že protein je translokován do periplasmatického prostoru dříve, než se poprvé složí. Tato dráha je biotechnologicky využitelná pro rychle se skládající proteiny, jako jsou DARP proteiny (designed ankyrin repeat proteins). 3) dráha TAT je jediná, která translokuje plně složené proteiny přes vnitřní membránu buňky. Signální sekvence využitelné pro transport rekombinantních proteinů jsou známy. Ne každý rekombinantní protein však může být transportován uvedenými drahami a je nutné laboratorně ověřit jejich vhodnost. Následující sekrece proteinu mimo buňku je realizována zřejmě společným transportním mechanismem, který je zprostředkován komplexem proteinů, které jsou doposud málo popsány a které nejsou efektivně exprimovány za laboratorních podmínek. Sekrece typu II je mechanismus zodpovědný za kumulaci mnoha rekombinantních proteinů v periplasmatickém prostoru, kde mohou vytvářet inkluzní tělíska. Výhoda sekrece rekombinantního proteinu v E. coli spočívá v tom, že proteiny prochází periplasmatickým prostorem, kde jsou vystaveny lokálním disulfid-izomerasam a foldasam, které přispívají ke správnému složení proteinu. V periplasmatickém prostoru je navíc méně proteas než v cytoplasmě (Obr. 2.7). Obrázek 2.7. Sekretorní dráha typu II v E. coli 21

22 Tvorba inkluzních tělísek může být potlačena snížením teploty kultivace E. coli, použitím slabšího promotoru nebo snížením koncentrace induktoru exprese (například IPTG u proteinů exprimovaných z laktózového operonu). Vznik inkluzních tělísek komplikuje izolaci proteinu a často vyžaduje použití denaturačních činidel k jejich rozpuštění. Na druhou stranu je možné inkluzní tělíska nejdříve separovat centrifugací, potom rozpustit a protein následně renaturovat takzvaným refoldováním proteinu do jeho správné vyšší konformace, což může vést k dosažení vyšší finální čistoty rekombinantního proteinu. Problémem produkce proteinů v E. coli se může stát kontaminace lipopolysacharidem lipofilní složkou buněčné stěny Gram negativních bakterií, která v savčím organismu vyvolává reakci imunitního systému spojenou se zvýšenou teplotou a vyplavením prozánětlivých cytokinů (Obr. 2.8). Působí tedy jako tzv. pyrogen. Pokud je lipopolysacharidu, taky zvaného endotoxin, aplikováno větší množství aplikováno do krevního oběhu, může vyvolat až šokový stav ohrožující jedince na životě. Přítomnost endotoxinu může být tolerovatelná při aplikacích produktu in vitro, ale pro aplikace in vivo je vždy nutná depyrogenace. Ta se dá provádět metodami chromatografickými, ať už jde o iontoměničovou chromatografii, gelovou permeační chromatografii či chromatografii afinitní (např. Za využití imobilizovaného polymyxinu, polylyzinu nebo proteinu vážícího lipopolysacharid - LBP). Je také možno využít extrakci endotoxinu do organické fáze tvořené detergentem, např. Tritonem-X114. Tyto metody však často snižují finální výtěžek produktu a mohou ovlivnit stabilitu a nativní konfiguraci proteinu. Náročné je také testování obsahu endotoxinu. Pro velkou biologickou aktivitu již malého množství je nutno provádět bilogický test založení na lyzátu amebocytů hrotnatce druhu Limulus polyphemus (LAL limulus amebocyte lysate). 22

23 Obrázek 2.8. Struktura molekuly lipopolysacharidu E. coli je možné kultivovat v různých modifikacích minimálních nebo obohacených kultivačních médií (bujónů). Minimální médium: A médium: obsahuje v 1 litru média 1 g (NH 4) 2SO 4; 4,5 g KH 2PO 4; 10,5 g K 2HPO 4; 0,5 g citrát sodný 2H 2O; 1 mm MgSO 4 x 7H 2O; 0,2% glycerol (nebo cukr). Bohatá média: Luria-Bertani nebo Lenox Broth (LB): obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 5 g kvasničného autolyzátu; 5 g NaCl; (1 mn NaOH). H medium: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 8 g NaCl. Lambda broth: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 2,5 g NaCl. E. coli přes uvedené limitace představují jeden z nejvíce používaných expresních systémů. V případě nutnosti zachovat nezbytné posttranslační modifikace se používá evolučně vyšší, ale finančně náročnější expresní systém nejčastěji kvasinkový nebo savčí. Srovnání zastoupení jednotlivých expresních systémů pro komerční produkci rekombinantních proteinů je uvedeno v Tab

24 Tabulka 2.6. Posttranslační modifikace rekombinantních proteinů Expresní systém Posttranslační modifikace N-glykozylace O-glykozylace Fosforylace Acetylace Acylace γ-karboxylace E. coli Chybí Kvasinky Vysoce manosilované glykany Hmyzí buňky Jednoduchá, bez sializace Savčí buňky Komplexní Kvasinkové expresní systémy Kvasinky představují eukaryontní expresní systém, který obecně mnohem vhodněji posttranslačně modifikuje rekombinantní proteiny eukaryontního původu. Rovněž sekrece proteinu je dobře realizovatelná připojením sekretorních signálů. Příprava expresního systému je oproti E. coli mnohem delší a je nezbytné selektovat a charakterizovat několik expresních kvasinkových klonů, neboť obvykle se intenzita tvorby rekombinantního proteinu značně liší klon od klonu. Nicméně produkce rekombinantních proteinů v kvasinkách je oproti savčím expresním systémům levná. Kvasinky je možné kultivovat do vysokých koncentrací buněčné suspenze a zdvojovací čas kvasinek je oproti savčím buňkám mnohem kratší. Nejčastěji se používají Sacharomyces cerevisiae a Pichia pastoris. Obě kvasinky se zásadně liší zejména v dosažitelné sekreci rekombinantního proteinu a podílu sekretovaného proteinu z celkového množství proteinů syntetizovaných buňkou, které pro S. serevisiae dosahuje maximálně 1 % kdežto u P. pastoris až 10 % (Tab. 2.7). Tabulka 2.7. Srovnání četnosti komerčního využití jednotlivých expresních systémů Produkt Společnost Systém Koagulační faktory (VII, VIII, IX) Novo-Nordisk/Bayer/Centeon Genetics Baxter/Centeon/Wyeth BHK buňky CHO buňky Calcitonin Unigene E. coli CHO buňky 24

25 DNasa (cystická fobróza) Roche CHO buňky Erythropoetin Janssen Cilag/Amgen/Boehringer CHO buňky Darbepoetin Amgen CHO buňky Folikuly stimulující hormon Serono/Organon CHO buňky Luteinizační hormon Serono CHO buňky Gonadotropin Serono CHO buňky Glukagon Novo-Nordisk S. cerevisiae Glukocerebrosidasa (Gaucherova nemoc) Genzyme CHO buňky Růstové hormony (somatotropiny) Upjohn/Lilly/Novo-Nordisk/Ferring Serono Serono/Bio-Technology Gener. Corp E. coli Myší linie CHO buňky Eutropin Lg Chemical S. cerevisiae Growth factors (GCSF, GMCSF) Novartis/Essex/Amgen/Roche E. coli Chugai Pharmaceuticals CHO buňky Platelet derived growth factor (PDGF) Janssen-Cilag S. cerevisiae PDGF-agonista Zymogenetics S. cerevisiae Hepatitis B vakcína Glaxosmithkline Rhein-Biotech S. cerevisiae H. polymorpha Hirudin Aventis/Novartis S. cerevisiae Insulin a muteiny Aventis/Lilly/Berlin-Chemie E. coli Insulin Bio-Technology General Corp Novo-Nordisk E. coli S. cerevisiae Interferon alpha a muteins Roche/Essex/Yamanouchi E. coli Interferon beta Schering Biogen/Serono E. coli CHO buňky Interferon gamma (mutein) Amgen/Boehringer E. coli Interleukin 2 Chiron E. coli Oprelvekin (agonista IL-11) Wyeth Romi 8866 Op-1 (osteogenní, neuroprotekt. fakt) Curis/Striker E. coli Tkáňový aktivátor plasminogenu Genentech/Roche/Boehringer CHO buňky Aktivátor plasminogenu Genentech/Roche/Boehringer E. coli Faktor kmenových buněk (SCF) Amgen CHO buňky 25

26 Tumor nekrosis faktor (TNF) Boehringer E. coli Modifikováno podle Schmidt, 2004 Kvasinky, na rozdíl od savčích buněk, tvoří jiné struktury N-glykanů (převážně vysoce manosilované, high mannose), které připomínají savčí prekurzory nacházející se v endoplasmatickém retikulu. Tyto jsou savčími buňkami většinou dále modifikovány na kratší řetězce, v nichž terminální manosa je nahrazována N-acetylglukozaminem, galaktózou, fukózou a sialovou kyselinou za vzniku hybridních a komplexních n- oligosacharidů. Kvasinkové buňky je možné modifikovat vnesením vektorů kódujících nezbytné manosidasy (MI a MIIx) a glykozidasy (Obr. 2.9, 2.10). U rekombinantního glykoproteinu musí být tedy předem podrobně analyzována glykozylace. Exprese glykozyltransferáz musí být pak upravena výměnou odpovídajících promotorů za silnější či slabší, nebo musí být použita rekombinovaná hostitelská linie, která produkuje potřebné glykozyltransferasy a podobně. To samozřejmě komplikuje proces přípravy vhodného kvasinkového klonu pro expresi rekombinantního proteinu. Obrázek 2.9. Struktura N- a O-oligosacharidů u savčích glykoproteinů 26

27 Vysoce-manosylovane N-oligosacharidy Hybridni N-oligosacharidy"' v,_,j _'...-{... t,.('\') l mplexni N-oligosacharidy :=)...-d t. v;:+-a-...-'"" Zakladni jadrove stru ktu ry 0 -olig osa char idu JJ--'...,. c. Core I._._.) Core Ill "'.. \,../ 0-man6za Corell ]' Cor'eiV =1- L,J -... ill.jij x O-fuk6za O-gluk6za Glc Manosa Gcl NAc 0GaiNAc Gal.A Fuc NeuAc Xyl6za Fukozylace je proces pi'ipojovani fuk6zy na ruzne pozice zejmena 0- oligosacharidu. K vasink y normalne nepripoj uji f uk6zu k oli gosacharidt'tm na tvofenych glykoproteinech. Proto expresi fukozylovanych proteint't je tedy nezbytne pouzit 27

28 geneticky modifikované kvasinky, nebo přejít na evolučně vyšší expresní systém. Genetická modifikace kvasinek k produkci fukozylovaných proteinů byla publikována poprvé v roce Obrázek Syntéza 1,6 GlcNAc rozvětvených N-oligosacharidů O-glykozylace představuje další rozdíl v posttranslační modifikaci mezi savčími a kvasinkovými expresními systémy. U kvasinek a jiných houbových mikroorganismů je o- glykozylace zahájena v endoplasmatickém retikulu přenosem manosových zbytků z dolichyl fosfát D-manosy na specifický serin nebo treonin aminokyselinové páteře proteinu. V této chvíli je již protein složen a lokální poměry rozhodují o průběhu O- glykozylace. To, který z uvedených serinů a treoninů bude O-glykozylován, je velmi těžké předpovědět a prakticky se to dá s jistotou říci jedině až na základě analýzy glykozylace vytvořeného proteinu. Experimentální průkaz O-glykozylace IGF (insulinu podobný růstový faktor) a IL-2 produkovaných v kvasinkách a v savčích buňkách ukázal zásadní rozdíly mezi oběma systémy. Jiné proteiny jsou glykozylovány v obou systémech identicky (hgm-csf). Odhadnout glykozylaci proteinu je možné pomocí některých predikčních programů pracujících na principu neuronálních sítí. Tyto programy pracují většinou tak, že hledají strukturní podobnosti s jinými proteiny, u nichž byla glykozylace experimentálně popsána. Příkladem je server dánského technického institutu ( který předpovídá pravděpodobnost připojení 28

29 O-vázaných oligosacharidů v savčích buňkách. Prostřednictvím serveru je možné provádět odhad i mnoha dalších posttranslačních modifikací ( Pro kvasinkové expresní systémy však specifický predikční nástroj zatím není vyvinut. Hmyzí expresní systémy Jedním ze systémů majících výhody jak eukaryontních, tak částečně i prokaryontních expresních systémů jsou systémy hmyzí bakulovirové, označované podle hlavního nástroje vnášení DNA do hostitelských buněk bakuloviru, velkého hmyzího dvouvláknového DNA viru Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) nevirulentního pro savce. Tento expresní systém na rozdíl od ostatních pracuje v standardním uspořádání tak, že exprese proteinu se neděje z buněčných linií stabilně transfekovaných, jako je tomu u savčího systému a v podstatě i u bakteriálního systému, ale DNA kódující rekombinantní protein je vnášena do kultury hmyzích buněk formou infekce rekombinovaným bakulovirem. Příprava, ověření a udržování dostatečného množství infekčních virových partikulí (viral stock) představuje nejnáročnější krok celé bakulovirové technologie. Jako hostitelské buňky slouží larvální kultura buněk můry autographa californica nebo Spodoptera frugiperda (Sf9) (Obr. 2.11). V současnosti jsou komerčně dostupné i vektory pro přípravu stabilně transfekovaných linií hmyzích buněk umožňující vynechat náročné udržování a kontrolu suspenze rekombinovaných virů. Obrázek Postup přípravy rekombinovaného bakuloviru 29

30 Výhody bakulovirového expresního systému spočívají zejména ve vysoké výtěžnosti a nepřítomnosti endotoxinu, v podobnosti posttranslační modifikace proteinu s modifikací probíhající v savčích buňkách, v efektivní efektivní sekreci proteinů a v dostupnosti bezsérových médií usnadňující purifikaci sekretovaných rekombinantních proteinů. N-glykozylace rekombinantních proteinů v hmyzích buňkách je převážně typu vysoce manosylovaných oligosacharidů (high mannose). O-glykozylace je podobná savčí glykozylaci, nicméně místa připojení cukrů Ser, Thr jsou opět dána specifickým rozlišením glykozylačních motivů, které nemusí být vždy identické se savčími. V současnosti je dostupná hmyzí linie Mimic Sf9, která stabilně exprimuje několik savčích glykozyltransferas umožňujících tvořit rekombinantní proteiny s dvojitě větvenými N-vázanými oligosacharidy (nesou dva N-acetylglukosaminy na první větvičce manosy), které jsou terminálně sialylované, čímž se více podobají savčím proteinům. 30

31 Savčí expresní systémy Vlastnosti jednotlivých buněčných populací v následujících kapitolách budou uvedeny zejména ve vztahu k biotechnologickým potřebám produkce rekombinantních proteinů a glykoproteinů. V závislosti na původu proteinu či glykoproteinu, který chceme připravit rekombinantní technologií a v závislosti na vlastnostech, které od něj požadujeme, je nutné volit expresní systém. Pro savčí proteiny je nejvhodnější použít příslušný savčí systém. Tím je zajištěna adekvátní posttranslační modifikace, jako je acylace, fosforylace, lipidizace, glykozylace, citrulinace, tvorba disulfidických můstků a mnoho dalších, které evolučně nižší systémy většinou realizují jen částečně. Problém exprese rekombinantních proteinů v savčích liniích spočívá ve vysoké finanční náročnosti a relativně nízkém výtěžku. Z našich zkušeností vyplývá, že očekávaný výtěžek z kultury adherentních buněk kultivovaných na ploše 1 m 2 je řádově ve stovkách mikrogramů až jednotkách miligramů. Významným faktorem je zde buněčná linie použitá k expresi glykoproteinu. Nejvyšší výtěžnost dosahují linie lidských embryonálních ledvinných buněk HEK (293T) a linie ovariálních buněk křečka čínského (CHO). I zde se však ukazuje, že buněčné linie pocházející z tkání téhož organismu produkují proteiny lišící se v posttranslační modifikaci, což může představovat překážku následného použití glykoproteinu například pro imunizaci, jejímž cílem je navození protilátek proti cukerné komponentě antigenu. Pro dosažení vysokého výtěžku je nutné připravit stabilně transfekovanou linii buněk, což znamená, že vnesený gen kódující příslušný rekombinantní protein se musí integrovat do genomu buněk a potom se množí společně s množícími se buňkami. Příprava stabilně transfekované buněčné linie se provádí pomocí recesivní nebo dominantní selekce. Dominantní selekce znamená použití chemikálie normálně toxické pro buňky, která je detoxifikována pomocí proteinu, jenž se produkuje z genu lokalizovaného vedle genu kódujícího rekombinantní protein. Nejdříve tedy v plasmidu, který vneseme do buňky, a posléze v genomu, kam se plasmid integroval. Selekce stabilně transfekované linie trvá několik týdnů a vyžaduje průběžné monitorování míry exprese proteinu, neboť se může stát, že jinak dojde k selektování klonu rezistentního na selekční marker, ale neprodukujícího dostatečné množství rekombinantního proteinu. Příčinou je to, že v genomu hostitelské buňky je integrována jen část plasmidu kódujícího rezistenci na selekční marker nebo že exprese rekombinantního proteinu, která zatěžuje metabolicky buňku, je potlačena. Produkci rekombinantního proteinu je možné zvýšit procesem amplifikace genu kódujícího rekombinantní protein po genomu buňky dlouhodobou kultivací (několik týdnů) buněk za selekčních podmínek (Tab. 2.8). 31

32 Tabulka 2.8. Amplikační markery pro savčí buňky Selekce Adenosin, alanosin a 2 -deoxycoformycin Adenin, azaserin a coformycin -aspartyl hydroxamát nebo albizzin Pala Metotrexát Methionin sulfoximin Cadmium -difluorometylornithin 6-azauridine nebo pyrazofuran Mykofenolová kyselina Gen Adenosin deaminasa Adenyláte deaminasa Asparagin syntetasa Aspartát transcarbamoylasa Dihydrofolát reduktasa Glutamine syntetasa Metalotionein Ornithin dekarboxylasa Ump syntetasa Xantin-guanin phosphoribosyltransferasa Příkladem je selekce buněk metotrexátem, kdy dochází k amplifikaci genu kódujícího dihydrofolát reduktasu (DHFR), který byl vnesen prostřednictvím rekombinantního plasmidu do buňky s deleční mutací obou alel genu kódujícího DHFR (například linie CHO DG44, Invitrogen). To by samo o sobě nemělo smysl pro produkci zvoleného rekombinantního proteinu. Pokud však plasmid konstruujeme tak, že dhfr gen je umístěn za gen kódující rekombinantní protein a oddělen je místem umožňující nasedání ribozomu, transkribovaná mrna je bicistronická a oba proteiny jsou translatovány z jedné mrna molekuly. Toto uspořádání vylučuje, že by se do genomu integroval pouze úsek mrna kódující DHFR, neboť by gen ztratil promotor, a byl by nefunkční. Vnitřní místo pro nasedání ribozomu (internal ribosome entry sites; IRES) bývá v komerčně dostupných plasmidech pro laboratorní aplikace odvozeno například od funkční jednotky popsané u polioviru a viru encefalomyokarditidy. Příkladem je plasmid poptivec (Invitrogen), který obsahuje klonovací místo pro vnášení DNA konstruktu, za kterým následuje IRES odvozené z viru encefalomyokarditidy, z nějž je zahájena translace následujícího cdna úseku kódující DHFR. Tento plasmid mimo jiné umožňuje rychlé vnášení cdna amplifikované pomocí PCR s použitím polymerasy přidávající na oba 3 konce PCR amplikonu netemplátový da (standardní Taq polymerasa). Efektivita klonování je zvýšena tím, že plasmid se dodává již otevřený a na oba konce linearizovaného plasmidu je kovalentně připojena topoizomerasa i viru vakcinie. Ligační reakce pak může probíhat pouhých 5 minut za pokojové teploty (Obr. 2.12). 32

33 Při produkci virových proteinů v savčím expresním systému se můžeme setkat s nečekaně nízkou výtěžností. To může být způsobeno tím, že virem kódovaná mrna má jiné zastoupení tripletů (kodonů) než běžná zdravá savčí buňka. Důsledkem je, že buňka nemá dostatek některých trna pro translaci proteinu. Řešení nabízí takzvaná procedura optimalizace kodonů (codon optimisation), kterou je možné dnes provést pomocí různých webovských aplikací in silico. Princip spočívá v tom, že cdna daného proteinu se přepíše do sekvence aminokyselin a zpětně se přiřadí nová cdna tak, aby poměrné zastoupení trna v hostitelské buňce odpovídalo poměrnému zastoupení příslušných tripletů. Nově navrženou cdna pak musíme připravit buď cílenou mutagenzou, pokud množství záměn nukleotidů není velké, nebo je možné syntetizovat úseky cdna lišící se od původní cdna a těmito nahradit původní nebo syntetizovat celou cdna. Výtěžek rekombinantního proteinu se obvykle zvyšuje v rozsahu jednoho řádu, ale i to je významné zlepšení. Kodonová optimalizace může významnou měrou zefektivnit například i DNA vakcinaci, zejména pokud antigen kódovaný DNA vakcínou pochází z evolučně vzdáleného organismu, jako jsou houby, bakterie anebo již zmíněné viry. Před přistoupením ke kodonové optimalizaci in vitro je nejdříve nutno zvážit její potenciální přínos, nejlépe pilotním laboratorním experimentem. Obrázek Bicistronický plasmid při amplifikaci genu pomocí DHFR 33

34 Tkáňové kultury savčích buněk jsou z hlediska požadavků na zkušenosti experimentátora nejnáročnější. Jak již bylo uvedeno na začátku kapitoly, je nezbytné zachovat aseptičnost veškeré manipulace s buňkami. Jako pojistka se do tkáňových kultur přidávají antibiotika, bránící růstu eventuální kontaminace. V některých situacích však jejich přítomnost může snižovat efektivitu některých nezbytných kroků, jako je vnášení rekombinovaných expresních plasmidů (transfekce) do buněk. Nejčastěji používaná antibiotika a jejich pracovní koncentrace jsou uvedena v Tab Obvykle se používá trvale kombinace penicilinu a streptomycinu. Tabulka 2.9. Antibiotika používaná standardně pro tkáňové kultury 34

35 Antibiotikum Penicilin Finální koncentrace u/ml Streptomycin sulfát g/ml Kanamycin Gentamicin Mykostatin Amfotericin b 100 g/ml 50 g/ml 20 g/ml 0,25 g/ml Pro kultivaci savčích buněk se většinou používají komerčně dodávaná média, která se doplňují L-glutaminem, bovinním fetálním sérem jako zdrojem nutrientů a růstových faktorů a antibiotiky. Základní média jsou: BME (basal medium Eagle s): originální Eaglovo médium pro HeLa buňky v kultuře obsahuje Earleyho balancovaný solný roztok. MEM, E-MEM (minimum essential medium): Eaglem modifikované BME. Vyšší koncentrace aminokyseli. Obsahují Earleyho balancovaný solný roztok nebo Hankův solný roztok, obohacena o neesenciální aminokyseliny. Obsahuje 2 mm L-glutamin. DMEM (Dulbeccos modified Eagle s medium): Dulbekova modifikace bazálního Eaglova média. Obsahuje 4x vyšší koncentraci aminokyselin a vitamínů. Dvě modifikace: high (4,5 g/l glukózy) a low (1,0 g/l glukózy). Dále obsahuje 4 mm L- glutamin a 110 mg/l pyruvátu sodného. RPMI 1640 (Rosswell park memorial institute): 1966 Moor, je modifikací McCoyova basálního 5A média. Při ph > 8 růžová barva a zákal obsahuje fenolovou červeň. Je to způsobeno volnými bazickými amonokyselinami, které jsou méně rozpustné při bazickém ph. Při neutrálním ph je čiré a má růžovou barvu, jako ostatní média. Obsahuje 2 mm L-glutamin. Výběr genu a jeho izolace Specifika prokaryontních genů kódujících rekombinantní protein Prokaryontní geny jsou bez intronu. Pro klonování tedy není nutné pracovat s mrna tak, jak je tomu v případě eukaryontních genů. Možnosti identifikace genu pro izolaci cdna umožňující přípravu rekombinantního proteinu jsou principiálně podobné jako u eukaryot. Pokud je známa sekvence požadovaného genu, je možné s výhodou použít PCR amplifikaci s pomocí specifických primerů. 35

36 Specifika eukaryontních genů kódujících rekombinantní protein Eukaryontní geny jsou mnohem složitější. Genomická DNA obsahuje nejen oblasti, které kódují strukturu proteinu, ale i introny a dlouhé 5 a 3 nepřekládané oblasti. Proto při izolaci genu se nejčastěji pracuje s cdna připravenou reverzní transkripcí mrna izolované z buněk. Odpadá tím komplikovaná a ne vždy přímá cesta eliminace intronů, respektive identifikace rozhraní mezi jednotlivými exony a introny. Příkladem webovské aplikace vyhledávání intron-exon rozhraní je například NetGene2 server ( Výhodné je použít genové databáze, ve kterých jsou uloženy sekvence značného množství proteinů, cdna nebo mrna. Porovnáním sekvence izolovaného genu je tak možno odhadnout strukturu mrna. Jednodušší cesta přípravy cdna reverzní transkripcí mrna je usnadněna tím, že eukaryontní mrna má specifické struktury na obou koncích. Na 5 konci mrna se nachází metylační čepička, kterou je možné použít při izolaci mrna v plné délce například metodou GeneRacer (Invitrogen), kdy je metylační čepička na 5 konci mrna odstraněna kyselou pyrofosfatasou (TAP) a k uvolněnému terminálnímu fosfátu je připojen syntetický RNA oligonukleotid (budoucí místo nasedání PCR primeru) pomocí T4 RNA ligasy. Aby nebyly tytéž RNA oligonukleotidy připojeny i k fragmentům RNA, které byly izolovány společně s mrna, provádí se před odstraněním čepičky defosforylace volných konců izolované RNA pomocí alkalické fosfatasy (CIP). Po připojení RNA primeru na 5 konec mrna se provede standardní reverzní transkripce pomocí reverzní transkriptasy a oligo dt primeru a získaná cdna je použitelná k amplifikaci 5 a 3 úseků cdna pomocí PCR s kombinací primerů genově specifického (GSP) a komplementárního k výše připojenému RNA primeru (pro 5 oblast cdna) nebo genově specifického a oligo da (pro 3 oblast cdna). Spojením obou PCR produktů je možné připravit cdna kódující kompletní rekombinantní protein a identifikovat kompletní 5 a 3 nepřekládané oblasti mrna (Obr. 2.13). Pro dosažení maximální přesnosti je nutné použít přesnou DNA polymerasu s opravnou funkcí, takzvanou proofreading. Tato metoda vyžaduje znalost aspoň krátkého úseku cdna umožňujícího navrhnout vnitřní primery. Alternativně je možné získat 5 koncovou oblast mrna pomocí reverzní transkripce mrna s použitím sekvenčně specifického primeru, po níž je k 3 konci vzniklé cdna připojen netemplátový oligo dc pomocí terminální deoxyribonukleotidyl transferasy (TdT). Tento oligo dc společně se sekvenčně specifickým primerem umožňuje namnožit DNA fragment odpovídající 5 oblasti mrna. Metoda je vhodná pro identifikaci 5 konců i minoritních mrna. V úvodní kapitole byla zmíněna kodonová optimalizace (CUO) cdna za účelem dosažení vyšší produkce proteinu přizpůsobením četnosti tripletů organismu, v němž bude rekombinantní gen syntetizován. Níže je uvedený příklad provedené optimalizace DNA kódující cystein dioxygenasu houby Trichophyton mentagrophytes pro expresi 36

37 v lidských CHO buňkách. K analýze byl použit server a databáze používaných kodonů Výsledek naznačuje, že pokud bychom chtěli exprimovat s maximální účinností tento protein v CHO, museli bychom připravit cdna synteticky. První část ukazuje přehled nutných záměn tripletů mezi T. mentagrophytes a lidskými CHO buňkami. V druhé části je ukázán příklad situace na úrovni cdna nukleotidů (Tab. 2.10). Obrázek Příprava mrna plné délky pomocí GeneRacer (Invitrogen) 37

38 Tabulka CUO T. mentagrophytes (query) a lidské (optimized) cdna 38

39 Techniky izolace známého genu a cdna (PCR, RT-PCR, RACE) Nukleové kyseliny jsou přítomny v různých buněčných kompartmentech jádro, mitochondrie, cytoplasma. Postupy izolace DNA a RNA mohou respektovat tuto kompartmentaci a izolovat nukleovou kyselinu specificky obsaženou v některém z nich, nebo umožňují izolovat DNA nebo RNA obsaženou v celé buňce. Zde se budeme věnovat izolaci celkové genomické DNA, celkové RNA a mrna. Při izolaci jakékoliv nukleové kyseliny je třeba volit metodu v závislosti na požadované čistotě a množství finální NK a na typu buněk, z nichž má být NK izolována. Pro naprostou většinu následných aplikací (zejména enzymatických) je výhodnější dosáhnout vyšší kvality třeba i na úkor celkového množství NK, neboť pro metody jako 39

40 je PCR, reverzní transkripce a ligace jsou i submikro- a subnanogramová množství vysoce kvalitní NK dostačující. První krok při izolaci NK spočívá v uvolnění NK z buňky pomocí vhodného pufru a následné selektivní izolaci NK, respektive selektivním odstraněním ostatních buněčných komponent. Uvolnění NK z buňky znamená prakticky dezintegraci buněčné membrány, případně buněčné stěny, případně dalších buněčných obalů. Toto může být realizováno pomocí detergentů a jiných fyzikálně-chemických postupů. Jiný přístup k dezintegraci zejména tkání a buněčné stěny jsou fyzikálně-chemické neenzymatické postupy. Zejména pro organismy se silnou polysacharidovou stěnou je vhodné použít v úvodu izolace fyzikální postupy dezintegrace této stěny založené na působení tření (tření v třecí misce, Potter-Elvehjem homogenizátor, mlýny), na působení nárazu buňky na pevnou stěnu společně s vysokou turbulencí prostředí (odstředivé dezintegrátory) a na rychlých změnách tlaku a působení varu. Fyzikální metody se aplikují na buňky umístěné v pufrech obsahujících kombinaci detergentů (Triton X100, NP-40), které rozpouštějí buněčné membrány, zásad (NaOH denaturuje DNA, z níž kovalentně uzavřená plasmidová DNA může být snadno renaturována při neutrálním ph) a činidel denaturujících proteiny (SDS, guanidin thiokyanát). Z detergentů, například neionogenní NP-40, je možné použít k rozpuštění buněčné membrány při zachování jaderné membrány, což umožní separovat jadernou NK od cytoplasmatické NK. Metody izolace DNA se často doplňují o krok, který specificky eliminuje kontaminující RNA (jež se při purifikaci chová podobně jako DNA) přidáním ribonukleasy A do startovního pufru. RNasaA jako většina RNas je značně odolný enzym a alkalické lyzační prostředí pro ni není nebezpečné. Aplikací kombinace jednotlivých výše uvedených činidel je možné získat NK v rozpustné formě spolu s dalšími buněčnými složkami, které je ovšem pro optimální fungování naprosté většiny následných, zejména enzymatických, reakcí a pro požadavek dostatečné stability NK v průběhu času nutné odstranit. V tomto kroku je možné použít několik přístupů. Jeden z nejstarších, ale stále široce používaných postupů je extrakce proteinové složky hrubého lyzátu fenolem. Jedná se o extrakci ze suspenze vodného pufru a fenolu (případně s chloroformem nebo moderněji s bromochloropropanem). Centrifugací se tato suspenze rozdělí na vodnou fázi obsahující NK, rozhraní obsahující část denaturovaných proteinů a fenolickou část obsahující další proteinové molekuly. Fenolová extrakce navíc umožňuje cílenou izolaci RNA zbavené DNA tak, že při použití pufru a fenolu s nízkým ph (< 4) a při nízké objemové koncentraci chloroformu (do 20 % použitého objemu fenolu) je DNA nerozpustná ve vodě a pouze RNA zůstává ve vodní fázi. Další výhoda této metody spočívá v tom, že při použití silného deteregentu, jakým je například guanidin thiokyanát nebo guanidin hydrochlorid, je buněčný obsah včetně NK v počáteční bifázické suspenzi (před přidáním chloroformu) stabilní po velmi dlouhou dobu, jestliže je uchován při 80 C, což je zejména vhodné pro snadné prvotní zpracování velkého množství v čase se průběžně kumulujících vzorků, jejichž finální 40

41 analýza je provedena až po relativně dlouhé době. Další výhoda spočívá v možnosti izolovat z jednoho takto uskladněného vzorku, zvlášť DNA, RNA nebo proteiny. Komerčně jsou dostupné kity obsahující pouze jeden roztok složený ze směsi denaturačního pufru a stabilizovaného fenolu, jež jsou přímo použitelné k uchování a následné izolaci NK bez nutnosti míchat jednotlivé reagencie dohromady (Izogen- Nippon Gene, RNA-Stat 60 Tel-Test, RNAzol B Cinna Scientific, Tri-Pure Isolation Reagent Boehringer Mannheim, TRI Reagent Molecular Research Center, TRIzol Reagent Life Technologies apod.). DNA nebo RNA obsažená ve vodní fázi izolované výše uvedenými metodami je následně purifikována od kontaminujících solí precipitací DNA pomocí isopropanolu nebo etanolu. NK vypadává z roztoku. Soli zůstávají rozpuštěné v pufru a je možné je oddělit od pelety. Precipitovaná NK se opakovaně promývá v 70% etanolu a poté se vysuší a rozpustí buď ve vodě, nebo pufru s ph mezi 7 8 pro DNA nebo ve vodě pro RNA. Alternativní postup závěrečného přečištění NK spočívá ve využití chromatografických kolon, kterých je v současnosti na trhu obrovské množství. Základní výhoda kolon spočívá v možnosti selektivní eluce NK o určité velikosti, což je dáno použitým ph a iontovou silou promývacích a elučních pufrů. Vzhledem k tomu, že při eluci NK se používá poměrně vysoká koncentrace solí, následuje po eluci NK opět precipitace výše uvedeným EtOH nebo isopropanolem. Precipitace se vypouští v případě tzv. minipreparací, které slouží k izolaci malého množství NK, kde je účinnost precipitace příliš nízká. Podobně jako ionexy umožňují separovat jednotlivé typy NK, separace genomické DNA, plasmidové DNA a RNA je možná i pomocí ultracentrifugace v gradientu CsCl (Obr. 2.14). Pro zvýšení efektivity separace se před centrifugací přidává do roztoku interkalační činidlo etidium bromid, který je nutné po centrifugaci odstranit odmýváním například n-butanolem nebo pomocí chromatografické kolony. Horní fáze odpovídá genomické DNA, prostřední fáze, kam míří jehla, odpovídá plasmidové DNA a peleta je tvořena RNA. Obrázek Ultracentrifugační frakcionace plasmidové a genomické DNA 41

42 Izolace genomické DNA. Zvláštnosti izolace genomické DNA spočívají zejména v její obrovské molekulové hmotnosti, délce DNA vláken, a tedy křehkosti izolované molekuly. Pro většinu aplikací (s výjimkou přípravy genomických knihoven) však zlomy DNA vlákna neovlivní efektivitu následných metod, neboť zlomy jsou lokalizovány na DNA vláknu náhodně a vždy jsou po izolaci získány i fragmenty, na nichž je kontinuální úsek, který obsahuje sekvenci, jež je cílem našeho zájmu. Obecně však lze říci, že čím je metoda jednodušší z pohledu mechanické manipulace s DNA, tím je výsledná délka DNA vláken větší. Při izolaci genomické DNA se nejčastěji využívá úvodní dezintegrace materiálu v třecí misce za nízkých teplot (v tekutém dusíku je teplota 196 C) nebo lze použít enzymatické štěpení mezibuněčné pojivové hmoty pomocí enzymatického štěpení. Následuje rozpuštění buněčných membrán a denaturace proteinů pomocí ionogenního detergentu (SDS, sarcosyl) a štěpení proteinů proteinasou K, která se nechává působit přes noc při C. Pro ochranu DNA se přidává do lyzačního pufru EDTA, která váže ionty, jež jsou nezbytnými kofaktory DNas. Druhý den se DNA extrahuje opět fenolovou metodou nebo je možné použít solnou extrakci proteinů pomocí NaCl ve výsledné koncentraci 2,2 M. Následuje precipitace etanolem, nebo isopropanolem, umožňující koncentrovat DNA a odstranit většinu solí. Při izolaci genomické DNA z materiálu s vysokým obsahem polysacharidů (rostliny, houby) je možné selektivně precipitovat DNA pomocí CTAB. Izolace RNA. Samostatnou kapitolu tvoří metody pro izolaci RNA. Jako každou jinou NK je možné i RNA izolovat výše uvedenými metodami. Hlavní rozdíl však spočívá v nutnosti postupovat tak, aby nedošlo k degradaci RNA všudypřítomnými RNasami, které jsou značně odolné vůči teplotě, detergentům a nevyžadují pro svou aktivitu žádné kofaktory. Hlavním zdrojem RNas je samozřejmě izolovaný vzorek. Zde však je degradaci možné předejít použitím nízké teploty během zpracování vzorku před 42

43 umístěním do lyzačního pufru. Lyzační pufry jsou většinou složeny z chaotropních činidel (guanidium chlorid, guanidium isothyokyanát), která RNasy inaktivují. Další nebezpečí degradace RNA tedy následuje až po odstranění těchto pufrů, tedy ve fázi precipitace RNA etanolem nebo isopropanolem. Po precipitaci je RNA peleta rozpuštěna ve vhodném pufru nebo v deionizované vodě a tyto musí být prosté RNas, neboť jinak hrozí nebezpečí degradace finálního produktu a znehodnocení celého izolačního postupu. Během další manipulace s izolovanou RNA je nutné zabránit možné kontaminaci vzorku RNasami, jejichž zdrojem jsou ruce experimentátora, bakteriální kontaminace roztoků a laboratorního materiálu. Ošetření laboratorního materiálu umožňujícího degradovat RNasy spočívá v žíhání skleněných pomůcek za vysoké teploty (180 C po 8 hod), nebo ošetření pomůcek chloroformem. Odstranění RNas z vody je možné přidáním dietylpyrokarbonátu, jenž musí působit přes noc a poté se degraduje autoklávováním. Povrchy laboratorních přístrojů a pracovních ploch je možné ošetřit speciálními detergenty ničícími RNas (RNseZAP Sigma). Samozřejmostí je nošení ochranných rukavic, dodržování čistoty, minimalizace času při zpracování vzorku a hlavně využívání plastu na jedno použití, který je certifikován jako RNas prostý. Reverzní transkripce umožňuje přepis RNA do podoby komplementární DNA (cdna). Při izolaci genu pro produkci rekombinantních proteinů se provádí reverzní transkripce mrna pomocí oligo dt primeru, který umožní selektivní přepis pouze mrna a enzymu reverzní transkriptasy. V současnosti jsou k dispozici různé modifikace reverzní transkriptasy nejčastěji odvozené z moloneyového viru myší leukémie (MMLV) nebo viru ptačí myeloblastózy (AMV), připravených rekombinantní technologií. Modifikace se týkají a) zvýšení stability enzymu při vyšších teplotách, vedoucí k vyšší specificitě a rychlosti reakce, b) eliminace aktivity RNasyH, která štípe RNA ve vznikajícím heteroduplexu RNA/cDNA a omezuje maximální délku cdna. Vzniklá cdna je potom templátem pro amplifikaci genu například pomocí PCR. cdna můžeme skladovat dlouhodobě, neboť je mnohem stabilnější než RNA. Další možnost je vnesení cdna do klonovacího plasmidu a uchování v podobě transformovaných rekombinovaných E. coli. PCR se většinou provádí bezprostředně po reverzní transkripci. K dosažení maximální přesnosti se používá polymerasa s proofreading aktivitou, což znamená, že kromě vlastní DNA polymerázové reakce enzym provádí i exonuklasovou 3 5 opravnou kontrolu správnosti párování nukleotidů. Tím je dosaženo poklesu chyb o několik řádů, což je významné pro izolaci bezchybné cdna. S 3 5 exonukleázovou aktivitou souvisí i to, zda DNA polymerasa vytváří jako produkt amplifikace dvouvláknovou DNA končící tupě (proofreading polymerasy), nebo s přesahující da na 3 konci (Taq polymerasa). To je rozhodující pro volbu klonovacího plasmidu, do kterého bude PCR produkt vnesen v případě, že použijeme plasmid pro přímé vnášení PCR produktů. Dostupné jsou obě varianty, ale je nutné ověřit, jakou pro klonování potřebujeme. Druhý významný faktor použité DNA polymerasy je její procesivita, tedy 43

44 schopnost číst templátovou DNA určité délky. Čím je větší procesivita polymerasy, tím je možné amplifikovat delší úseky cdna. Poslední významný faktor je, zda je polymerasa schopná amplifikovat templáty s vysokým obsahem g/c nukleotidů. Jedná se do značné míry o kompatibilitu polymerasy s pufrem modifikovaným pro g/c templáty. Jednotlivé parametry ovšem vylučují jiné, a proto je nutné vždy volit na základě zvolené priority. Příkladem je nabídka firmy New England Biolabs (Obr. 2.15) Obrázek Souvislost různých parametrů polymeras pro PCR 44

45 Práce s genovými a proteinovými databázemi Současný mohutný rozvoj informačních technologií umožnil vytvoření genových a proteinových databází, které jsou vzájemně propojeny, takže vyhledávání a srovnávání popsaných genů a proteinů je relativně velmi snadné. Do databází jsou většinou vkládány výsledky sekvenace genomické DNA nebo cdna získané reverzní transkripcí mrna. Proteinové sekvence jsou naopak velmi často výsledkem nikoliv přímého sekvenování izolovaných proteinů, ale výsledkem přepisu cdna sekvence do aminokyselinové sekvence in silico, tedy pomocí počítače. Dále jsou dostupné databáze fragmentů exprimovaných sekvencí (database of expressed sequence Tags dbest), které usnadňují lokalizaci exonů na genomické DNA úrovni. Propojení různých databází je možné demonstrovat na schématu sekcí národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) Národního institutu zdraví USA (NIH) (Obr. 2.16). Obrázek Schéma vzájemného provázání databází NCBI NIH 45

46 Klonovací a expresní plasmidy Vnášení DNA do plasmidu je možné několika způsoby. Klasický způsob spočívá v ligaci DNA do plasmidu pomocí DNA ligasy (Obr. 2.17). Jinou možností je vnášení PCR produktů buď běžnou ligační reakcí, nebo přímým klonováním PCR produktů do linearizovaných plasmidů aktivovaných topoizomerasou I (Obr. 2.18). Jiná možnost je přenos DNA fragmentu z jednoho plasmidu do druhého místně specifickou rekombinací, jako je tomu například u systému Gateway od firmy Invitrogen (Obr. 2.19). Obrázek Plasmid s MCS pro ligaci DNA insertu DNA ligasovou reakcí 46

47 Obrázek Plasmid pro jednosměrné PCR klonování 47

48 Místně specifická rekombinace u systému Gateway je odvozená od místně specifické rekombinace probíhající u lambda fága. Rekombinace je katalyzována enzymovou směsí označovanou jako klonasa II, která rozlišuje signální sekvence attl1 a attl2 v donorovém plasmidu, vyštípne úsek DNA mezi nimi a liguje jej mezi signální sekvence attr1 a attr2 akceptorového plasmidu. Obrázek Gateway pro místně specifickou rekombinaci (Invitrogen) 48

49 Základní technika klonování (restrikce ligace) Restrikce DNA. Analýza DNA pomocí restrikčních endonukleas. Restrikční endonukleasy byly poprvé popsány u bakterií v souvislosti se schopností bakterií odolávat infekci DNA viry. Restrikční endonukleasy tvoří velmi širokou rodinu proteinů, jež svou velikostí variují od 157 aa (PvuII) až do 1250 (CjeI) a více. Z hlediska praktického využití, zejména při analýze DNA a rovněž při klonování, je třeba připomenout několik základních pojmů. Izoschisomery se označují všechny restriktasy, které rozlišují stejnou sekvenci DNA. Rozlišovaná DNA sekvence vykazuje často symetrii. Palindrom je úsek dvouřetězcové DNA, jehož pořadí bází je v obou vláknech totožné při protisměrném čtení. Mnoho restrikčních endonukleas štěpí DNA sekvenci, která má vlastnosti palindromu. Jiné restriktasy naopak štípou sekvenci, která není palindromem. Mnohé z takových restriktas štípou mimo rozlišovanou sekvenci (definovaný počet nukleotidů dále), což je možné s výhodou využít při klonování DNA. Restrikční místo přidáme k izolované sekvenci například prostřednictvím PCR primerů na jejich 5 konec, a tedy vně klonované sekvence. Produkt PCR klonujeme k další DNA po restrikci enzymem (např. BbsI), jež rozliší příslušnou sekvenci, ale štípe mimo ni, a to směrem do amplifikované DNA (Tab. 2.11). 49

50 Tabulka Klonování bez vnesení restrikčního místa do cílové sekvence GAAGACTT CGGCGCC TGG TTC CCC CTT TTC CTTCTGAAGCCG CGG ACC AAG GGG GAA AAG upstream primer 5 klonované sekvence GAAGACCC GCC GAG AAG CTG T CTTCTGGGCGGC TC TTC GAC A downstream primer 3 klonované sekvence NNNNNNNNNNNNNNNNGAAAAGGGGGAACCAGGCGCCGAAGTCTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNCTTTTCCCCCTTGGTCCGCGGCTTCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN spojení mezi 5 DNA úsekem a 3 DNA úsekem Sekvence rozlišovaná restriktasou BbsI, sekvence oddělující místo rozlišované BbsI a štípané BbsI, 3 konec DNA fragmentu lokalizovaného směrem k 5 konci (odpovídá například N terminální části fúzního proteinu), sekvence 5 konce DNA fragmentu lokalizovaného směrem k 5 konci (odpovídá například C terminální části fúzního proteinu). Kromě výše uvedených restrikčních endonukleas se využívají specifické exonukleasy a restriktasy, které štípou specificky jednovláknovou DNA, jednovláknovou RNA nebo RNA v hybridu s DNA atd. Minipreparace a maxipreparace DNA Preparace plasmidové DNA. V jednotlivých krocích klonování je nutné získat čistou plasmidovou DNA pro další postupy. Prvním krokem je tedy izolace plasmidové DNA, která může být provedena jako mikropreparační metoda (množství získané DNA dosahuje 20 g), například pro následnou PCR analýzu nebo následné PCR klonování, midipreparační metoda (množství získané DNA dosahuje 500 g) použitelná pro všechny standardní postupy, zejména ligaci fragmentů DNA získaných restrikcí specifickými endonukleasami. Maxi a mega preparativní postupy (množství získané DNA dosahuje 5 10 mg) umožňují připravit DNA například pro DNA vakcinaci, kde dávky na jednu experimentální imunizaci dosahují g pro malá laboratorní zvířata a až 8 mg pro člověka. Pro izolaci plasmidové DNA je možné, podobně jako při izolaci genomické DNA, použit 1) ultracentrifugační frakcionaci celkové nukleové kyseliny na genomickou DNA, plasmidovou DNA a RNA, 2) purifikaci plasmidové DNA od níž je genomická DNA odseparována pomocí inotoměniče, nebo 3) separaci plasmidové DNA od genomické 50

51 DNA po precipitaci celkové DNA pomocí rozdílné rozpustnosti plasmidové a genomické DNA. Většina procedur pro purifikaci plasmidové DNA je založena na metodě alkalické hydrolýzy. Spočívá v separaci buněk od kultivačního média, resuspendování buněčné pelety v Tris-Cl pufru s glukózou a EDTA a následné alkalické lýze, kdy je buňka lyzována a proteiny s DNA jsou denaturovány pomocí SDS a NaOH. Následuje vysrážení SDS s vysokomolekulární DNA a denaturovanými proteiny prostřednictvím octanu draselného. Kovalentně uzavřené plasmidy renaturují a zůstávají rozpuštěny v pufru. Precipitát je následně odstraněn centrifugací nebo filtrací a izolovaná plasmidová DNA (rozpuštěná v supernatantu) je precipitována isopropanolem nebo purifikována na iontoměničové koloně. Po eluci je DNA rozpuštěna v pufru s optimálním ph 8 (například Tris-Cl). Do pufru je možné přidat EDTA, která odebráním iontů kovů inaktivuje DNA. Purifikace pomocí iontově výměnné chromatografie umožňuje volbou vhodné koncentrace NaCl během promývání a eluce separovat jednotlivé druhy nukleových kyselin (Obr. 2.20). Obrázek Eluce jednotlivých NK podle koncentrace NaCl Restrikční analýza a dělení NK v agarosovém gelu. Agarosový gel umožňuje separovat nukleové kyseliny o délce od 50 nukleotidů do nukleotidů. Standardní agarosová elektroforéza separuje optimálně fragmenty dvouvláknové DNA o velikosti 50 až párů bází. Optimální rozlišení v určitém 51

52 rozsahu velikostí DNA a RNA je možné dosáhnout volbou koncentrace agarosy v připraveném separačním gelu (Tab. 2.12, Tab. 2.13, Obr. 2.21). Tabulka Optimální dělící podmínky pro agarosovou elektroforézu Délka fragmentů DNA [kb] ,8 12 0,5 10 0,4 7 0,2 3 Optimální koncentrace agarosy [%] 0,5 0,7 1,0 1,2 1,5 Pro separaci se používá acetátový nebo borátový pufr. DNA se v elektrickém poli při ph 8 pohybuje jako záporně nabitá molekula ke kladně nabité elektrodě anodě. Intenzita separačního napětí bývá 1 5 V/cm vzdálenosti připojených elektrod. Rozdíly ve struktuře DNA molekuly ovlivňují významně pohyblivost DNA. Pro vizualizaci DNA se používá interkalační činidlo ethidium bromid (EtBr), který je aktivován pomocí ultrafialového světla a emituje světlo v oblasti oranžové barvy (610 nm). Ethidium bromid je silný mutagen a suspektní karcinogen. Detekční mez při použití EtBr je dána velikostí DNA fragmentů a nemá lineární závislost. V průměru dosahuje asi 2 5 ng DNA na jeden diskrétní 5 mm dlouhý proužek. Při analýze genomické DNA je tedy nutné použít mnohonásobně vyšší množství DNA g na 5mm dlouhou jamku. EtBr ovlivňuje i pohyblivost jednotlivých forem DNA šroubovice. Ethidium bromid svou interkalací do DNA ruší negativní suprahelikální strukturu formy I DNA a po překročení kritické hodnoty koncentrace volného EtBr free-dye concentration (0,1 0,5 g/ml) dochází k tvorbě kladné suprahelikální struktury u formy I DNA. Tak pohyblivost od negativního superhelixu přes prostou cirkulární DNA k pozitivnímu superhelixu nejdříve klesá a potom opět roste. U forem II a III interkalace EtBr do struktury způsobuje prodloužení DNA molekuly a vzrůst rigidity, čímž může pohyblivost pouze klesat, a to až o 15 %. Tabulka Morfologie a pohyblivost DNA na agarosovém gelu Forma Morfologie Pohyblivost I Suprahelix. Negativní relaxovaná pozitiv. Nejvyšší nízká nejvyšší II Prostá (zářezy) cirkulární Nízká III Lineární dvojvlákno Vysoká 52

53 Obrázek Závislost pohyblivosti DNA na její morfologii Pro separaci vysokomolekulární DNA je nutné použít PFE (elektroforéza v pulsním elektrickém poli) nebo chef (contour clamped homogenous electric field = homogenní elektrické pole založené na řízené rotaci polarit přilehlých elektrod). Malé DNA fragmenty a malé rozdíly délky DNA molekuly je možné analyzovat v polyakrylamidovém gelu s borátovým pufrem. Tyto gely se používají jednak pro separaci oligonukleotidů, jednak pro sekvenační účely. Na rozdíl od standardního agarosového gelu probíhá separace DNA v akrylamidovém gelu velmi pomalu. Standardní agarosová elektroforéza není vhodná ani pro separaci RNA. Tuto je nutné dělit v agarosovém gelu za denaturačních podmínek, tedy v pufru obsahujícím nejčastěji 7 % formamidu. RNA vzorek v nanášecím pufru obsahujícím ústoj, formaldehyd a formamid je nutné před nasazením do gelu denaturovat 15 min při 55 C. Po separaci RNA je nutné před vizualizací ethidium bromidem odmýt nejdříve 53