(Atomic Emission Detector)

Transkript

1 Detektory GC - II Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2 Atomový emisní detektor - AED (Atomic Emission Detector)

3 Princip detektoru Vzorek je nejprve atomizován a následně jsou atomy excitovány nejčastěji mikrovlnným vysoce energetickým zdrojem za vzniku vysokoteplotní plasmy (microwave induced plasma MIP) Při návtratu excitovaných atomů do základního stavu vyzařují charakteristická spektra měřená spektrometrem Před vstupem do oblasti plasmy se dodávají pomocné plyny k omezení tvorby úsad, které by případně interferovaly s emitovaným zářením Teplota plasmy je K Detekují se prvky jako: C, H, 2 H, N, O, S, P, halogeny Detekce více prvků současně je možná, jsou ale měřitelné jen jisté kombinace (vzhledem k nutnosti různých pomocných plynů pro různé prvky) Helium, používané jako nosný plyn, musí být % Dynamický lineární rozsah ~10 4

4

5

6 2.4.6 Elektrochemické detektory Elektrolytický Hallův vodivostní detektor (Electrolytic Hall Conductivity Detector)

7 Princip detektoru Eluované složky jsou podrobeny chemické reakci vedoucí ke vzniku iontových látek, které jsou následně míchány s vhodnými rozpouštědly a je měřena vodivost vzniklého roztoku Pro selektivní detekci organických látek obsahujících halogeny se užívá redukce eluátu v proudu vodíku jako pomocného plynu na Ni katalyzátoru při teplotě 850 C Reakcí se tvoří HCl, chlorovodík je veden do deionizovaného n-propanolu a detekuje se změna vodivosti tohoto roztoku Pro PCB se musí teplota katalyzátorů posunou k 950 C Na podobném principu je možno stanovit síru a dusík. Využívá se redukce vodíkem na sirovodík a amoniak Pro detekci organických látek obsahujících jen C, H a O lze využít jejich oxidace na platinovém katalyzátoru v atmosféře kyslíku. Elektrochemická cela je v tomto případě citlivá na kyslík a úbytek kyslíku je detekován

8 Mez detekce (MD) a lineární dynamický rozsah (LDR) vybraných detektorů v GC Detektor MD [g/ml] LDR FID ECD TCD NPD FPD PID

9 2.5 Kvalitativní vyhodnocení píků Vyhodnocení na základě retenčních údajů Základní princip kvalitativního vyhodnocení vychází ze znalosti retenčních dat chromatografované látky, která jsou pro danou látku charakteristická Identifikace je založena na srovnání retenčních časů, resp. objemů standardu a neznámé látky při totožných podmínkách separace Pokud jsou retenční časy shodné na více kolonách, obyčejně se použije kolona nepolární, středně polární a polární, je možno předpokládat, že látky jsou shodné V případě složitých směsí je tato metoda komplikována obtížností přiřazování píků na různých kolonách. Kromě toho je tento postup náročný i časově Retenční data se vyjadřují nejrůznějšími způsoby, nejběžnější jsou tyto: a) Pomocí specifických retenčních objemů V g b) Pomocí relativní retence ke zvolenému standardu c) Na základě retenčních indexů

10 ad a) Specifické retenční objemy, jsou teoreticky hodnotami exaktními. Vyžadují pro výpočet znalost údajů, které vždy nejsou k dispozici nebo se v průběhu doby mění, např. množství stacionární fáze na koloně Hodnoty nejsou popisné ad b) Vyjádření elučních dat pomocí relativních retenčních hodnot je názornější. V tomto případě se retenční čas, objem neznámé látky určuje relativně vzhledem ke standardu Nevýhodou je, že není možno používat jen jeden standard pro všechny látky ad c) Nejvhodnější je zavedení retenčních indexů Kovatsův retenční index I x vyjadřuje retenční chování sledované látky v jednotné stupnici, kdy za pevné body základní stupnice byly zvoleny retenční hodnoty n-alkanů Vyhodnocení na základě pyrogramů Otisk palce Vyhodnocení na základě preparativní GC Identifikace vypreparovaných komponent mnoha technikami: NMR, UV, IČ, MS, elementární analýza atd.

11 Vyhodnocení na základě specifické reakce Identifikace píků může být provedena také pomocí specifických reakcí určitých látek s vhodnými činidly Reakce může probíhat mimo chromatografický systém nebo na chromatografických trubicích napojených na separační kolonu Jako náplň se používají látky, které tvoří s analyzovanou látkou adukt nebo jsou vázány jiným způsobem Např. stříbrné soli tvoří π-elektronové komplexy s olefiny a zachytávají se na koloně, parafiny jsou nezachyceny Nebo např. pro zachycení alkanů se užívá molekulové síto 5A apod. Porovnání chromatogramu vzorku bez a s provedením reakce je možno učinit kvalitativní závěry o jeho složení Vyhodnocení pomocí velmi specifických detektorů Např. Hmotnostní spektrum složky může být v některých případech jednoznačným důkazem přítomnosti určité látky. Srovnání retenčních časů a spekter se standardem je v určitých případech postačující pro identifikaci složky

12 2.6 Kvantitativní vyhodnocení píků Zdroje chyb 1. Technika dávkování 2. Adsorpce/rozklad v chromatografu 3. Detektor 4. Měření parametrů píku 5. Metoda vyhodnocení kvantity Technika dávkování Především je nezbytné vybrat vhodnou techniku nástřiku pro danou separaci. Dále je nutná zručnost při manuálním dávkování. Obecně lepší reprodukovatelnost nástřiku je při dávkování autosamplerem Adsorpce/rozklad v chromatografu Podmínkou pro přesné správné a reprodukovatelné kvantitativní výsledky je zajištění průchodu složky systémem bez její nevratné sorpce nebo rozkladu kdekoli v systému

13 Vliv detektoru Podmínky na detektoru musí být takové, aby nedocházelo ke změnám parametrů ovlivňujících odezvu detektoru. Bývá to např. nutnost stability průtoků všech plynů, stability tlaku, napětí a teploty detektoru, aj. Měření parametrů píku Parametry píku (plocha, výška atd.) mohou být měřeny manuálně nebo integrátorem, případně datastanicí Jak manuální tak strojové určení parametrů píku může být zatíženo značnými chybami Metoda vyhodnocení kvantity Výpočty množství složky ve vzorku na základě zjištěných parametrů odpovídajícího píku jsou založeny zpravidla na kalibracích Vhodný způsob kalibrace je základním předpokladem pro obdržení správných a přesných výsledků

14 Měření parametrů píku Parametry chromatografického píku mohou být určovány: a) Manuálně z chromatogramu b) Pomocí integratoru (datastanice) ad a) Manuální vyhodnocování plochy píků 1. Metody neužívající žádné předpoklady o tvaru píku, tzn. nezávislé na modelech píku Tyto metody jsou srovnatelně přesné pro symetrické i nesymetrické píky Počítání čtverců Vystřihování a vážení píku Planimetrie

15 2. Metody předpokládající shodu tvaru měřeného píku s určitým modelem píku (Gauss, EMG apod.) Triangulace Plocha = 0.5 H w b /k k=0.968 Metoda předpokládá Gaussovo rozdělení a je korektní jen pro symetrické nepřekrývající se píky

16 Metoda Výška x Šířka v polovině výšky Plocha = H w 0.5 /k k=0.939 Metoda předpokládá Gaussovo rozdělení a je korektní jen pro symetrické nepřekrývající se píky

17 Condal-Boschova metoda Plocha = 0.5H[w w 0.85 ]/k k=1.00 Metoda předpokládá Gaussovo rozdělení Metoda částečně kompenzuje vliv asymetrie na přesnost naměřené plochy

18

19 Foleyova metoda Plocha = H w 0.25 Metoda vychází s EMG Metoda proto vhodná pro určení plochy asymetrického píku

20 Aplikace EMG funkce ke generování píků se zvětšující se asymetrií, vyjádřenou poměrem τ/σ?? kde τ/σ= 0-4, vede k určení chyb jednotlivých metod pro výpočet plochy vzhledem k EMG funkci

21

22 Měření výšky a šířky píků

23 Měření výšky a šířky píků

24 ad b) Měření parametrů píku pomocí integrátoru Technika používaná v současnosti v daleko větší míře než manuální zpracování dat Nejdůležitělší parametry jsou frekvence vzorkování a spojování bodů (data bunching) Konstrukce základní linie, integrační značky, separace nerozdělených píků

25 Kvantifikace složek Výpočet množství složky ve vzorku může být založen na měření výšky nebo ploch píků Výpočet kvantity pomocí výšky píku: Šum základní linie ovlivňuje správnost měření výšky píku méně než určení plochy píku, především pokud je poměr signál/šum < ~30 Manuální měření výšky píku je snadnější než zjišťování jeho plochy Výpočet kvantity pomocí plochy píku: Případná nelinearita odezvy detektoru a asymetrie píku snižují správnost měření výšky píku významněji než měření plochy Plocha píku je obecně vhodnějším nástrojem pro kvantifikaci složky než výška píku

26 Korekce na rozdílnou odezvu detektorů Při analýze stejných hmotnostních množství složek jsou obvykle získány píky s odlišnými plochami v důsledku odlišných odezev detektoru Pro korelaci ploch s množstvími je nutno zavést korekční faktory Specifickým korekčním faktorem k i se rozumí číslo, kterým je nutno vynásobit plochu píku i tak, aby byla v hmotnostní relaci s referentní složkou Hodnota specifického korekčního faktoru pro referenční látku je rovna Korekční faktory jsou pro TCD a pro FID tabelovány, jejich hodnota je ale závislá na mnoha aspektech, geometrii detektoru, tvaru elektrod, druhu nosného plynu atd. Výpočet specifického korekčního faktoru látky i vzhledem k referentní látce r je roven: miar k i = (29) m A r i A je plocha odpovídajícího píku, m je hmotnost dávkované komponenty

27 Podle vztahu (29) lze počítat hmotnost jakékoli látky x ve vzorku, pro kterou použijeme tabelované hodnoty korekčního faktoru k x : k A m x x r m x = (30) Ar Používá se také molární odezva MR i, odezva (plocha píku) vztažená na mol látky: A i MR i = (31) n i n i je počet molů látky i v nástřiku Relativní molární odezva RMR ir je vyjádřena jako poměr molárních odezev látky i a referentní látky r : MR i Ain r RMR ir = = (32) MR A n r r i

28 Specifickou vlastností FID je odezva na efektivní uhlík, proto lze odhadnout korekční faktor pro známou složku Pro heptan platí: RMR ( ΣC )* = (33) i heptan ef = C ef se rovná počtu efektivních uhlíků, relativní molární odezva inkrementu -CH 2 - je rovna 100

29 Pro jiné inkrementy platí: Inkrement RMR -I Radikál RMR -R -CH 2 -OH 55 Primární OH -45 -CHOH- 35 Sekundární OH -65 -CO-CH CO CO-CH CO CH 2 -CHO CHO CO-CO- 90 -CO CO-CH 2 -CO O-CH 3 - Ether O-CH Ether s delším řetězcem C=CH Dvojná vazba -22

30 Výpočet - ukázky Sloučeniny Vypočtená RMR CH 3 -CO-CH CH 3 -CO-CH 2 -CH CH 3 -(CH 2 ) 4 -CO-CH 2 -CH CH 3 -CH 2 -CH 2 -CHO CH 3 -OH CH 3 -CH 2 -OH

31 Metoda vnitřní normalizace a) Bez užití korekčních faktorů Jde o pouhý výpočet procentického složení směsi na základě změřených ploch všech píků A i A n Procentické zastoupení látky i ve směsi se vypočítá: %A i Ai = 100 (35) A n n Metoda předpokládá stejnou odezvu detektoru pro všechny eleuvané složky Metoda předpokládá eluci a detekovatelnost všech stanovovaných látek

32 b) S použitím korekčních faktorů Jde o výpočet procentického složení směsi na základě změřených ploch všech píků s využitím korekčních faktorů Procentické zastoupení látky i ve směsi se vypočítá: %x i kiai = 100 (36) k A n n n Metoda zahrnuje odlišnost odezvy detektoru pro jednotlivé stanovované látky Metoda předpokládá eluci a detekovatelnost všech stanovovaných látek Metoda není závislá na dávkování přesného objemu vzorku, protože součet %x i x n poskytuje vždy 100 %

33 Metoda externího standardu a) Kalibrace na více koncentračních úrovních (vícebodová kalibrace) Metoda je založena na dávkování standardů stanovovaných látek a sestrojení kalibračních grafů pro každou stanovovanou látku Kalibrace se provede buď nástřikem různých objemů jednoho roztoku standardů nebo nastřikováním stejných objemů různě koncentrovaných roztoků směsi standardů. Druhý postup je správnější Získají se kalibrační závislosti pro jednotlivé látky. Obvykle se konstruují závislosti: plocha píku versus koncentrace složky Z příslušné kalibrační závislosti se na základě znalosti plochy píku dané složky ve vzorku vypočítá její koncentrace Metoda nevyžaduje používání korekčních faktorů Metoda nevyžaduje eluci a detekovatelnost všech složek vzorku

34 b) Kalibrace jednobodová Postup je shodný jako ve výše popsaném případě a), s jediným rozdílem, že se kalibrace provede pouze na jedné koncentrační úrovni Metoda nevyžaduje používání korekčních faktorů Metoda nevyžaduje eluci a detekovatelnost všech složek vzorku Metoda předpokládá lineární odezvu detektoru v měřené koncentrační oblasti, procházející počátkem c) Jednobodová kalibrace užitím specifických korekčních faktorů Postup je podobný jako v případě jednobodové kalibrace b), ovšem pro kalibraci stanovované složky je užita složka jiná (referentní) a pro zjištění odpovídající koncentrace stanovované složky ve vzorku je třeba zahrnout do výpočtu odpovídající specifický korekční faktor Metoda používá korekční faktory Metoda nevyžaduje eluci a detekovatelnost všech složek vzorku Metoda předpokládá lineární odezvu detektoru v měřené koncentrační oblasti, procházející počátkem

35 Metoda interního standardu Metoda je založena na přidání známého množství další látky (interního standardu), neinterferující s píky ostatních složek, ke vzorku a) Kalibrace na více koncentračních úrovních s použitím konstantního množství interního standardu (vícebodová kalibrace-metoda I) Provádí se podobně jako externí kalibrace na více koncentračních úrovních s tím, že ke kalibraci se užívají roztoky směsí standardních látek o různé koncentraci, vždy s přídavkem stejného množství interního standardu Kalibrační závislost pro každou složku je konstruována tím způsobem, že na osu y je vynesen poměr: plocha píku složky/plocha píku interního standardu a na osu x množství (nebo koncentrace) složky Metoda nevyžaduje používání korekčních faktorů Metoda nevyžaduje eluci a detekovatelnost všech složek vzorku Metoda není závislá na dávkování přesného objemu vzorku

36 b) Kalibrace na více koncentračních úrovních s použitím různých množství interního standardu (vícebodová kalibrace-metoda II) Provádí se podobně jako zmíněná metoda I s tou odlišností, že se přidávají různá množství interního standardu k různě koncentrovaným roztokům složek standardů při kalibraci Kalibrační závislost pro každou složku je konstruována tím způsobem, že na osu y je vynesen poměr: plocha píku složky/plocha píku interního standardu a na osu x poměr: množství (koncentrace) složky/množství (koncentrace) interního standardu Metoda nevyžaduje používání korekčních faktorů Metoda nevyžaduje eluci a detekovatelnost všech složek vzorku Metoda není závislá na dávkování přesného objemu vzorku

37 c) Kalibrace jednobodová Provádí se podobně jako kalibrace interním standardem na více úrovních s tím, že není třeba konstruovat kalibrační závislost, protože ke kalibraci je užita jen jedna koncentrační hladina Metoda nevyžaduje používání korekčních faktorů Metoda nevyžaduje eluci a detekovatelnost všech složek vzorku Metoda není závislá na dávkování přesného objemu vzorku Metoda předpokládá lineární odezvu detektoru v měřené koncentrační oblasti, procházející počátkem Metoda standardního přídavku Princip metody spočívá v přídavku definovaného množství standardu stanovované látky ke známému množství vzorku Lze provádět jednobodově nebo pomocí více přídavků vícebodově Metoda nevyžaduje používání korekčních faktorů Metoda nevyžaduje eluci a detekovatelnost všech složek vzorku Pro jednobodovou kalibraci metoda předpokládá lineární odezvu detektoru v měřené koncentrační oblasti Metoda umožňuje eliminovat vliv matrice vzorku

38 2.7. Derivatizace v plynové chromatografii Důvody derivatizace v GC: 1. Zvýšení těkavosti a teplotní stability analyzovaných látek Jedním z významných omezení plynové chromatografie je skutečnost, že mnoho látek má příliš nízkou těkavost a nedají se kvantitativně převést do plynné fáze nebo se za zvýšené teploty rozkládají 2. Zamezení nežádoucí sorpce Důležité v případech, že nechráněná funkční skupina příliš silně interaguje se sorbentem nebo s povrchy v plynovém chromatografu 3. Zlepšení selektivity, zvýšení citlivosti a snížení meze detekce Příslušnou chemickou reakcí se molekula modifikuje za vzniku látky, která je selektivně detekována na výstupu z kolony. Např. halogeny při detekci ECD nebo nitro a další dusíkaté funkční skupiny při detekci NPD apod. 4. Zlepšení chromatografického dělení Derivatizace může omezit chvostování píků, zlepšit selektivitu a účinnost dělení, např. převedení karboxylových kyselin na estery

39 Acylace Acylační reakce se používají pro přípravu derivátů alkoholů, fenolů, aminů a thiolů Acylace se provádí pomocí: a) acylchloridů, b) anhydridů kyselin, c) bisacrylamidů V prvních dvou případech se pro vázání vyniklé kyseliny využívá přítomnosti bazických látek při reakci, jako solvent je často užíván pyridin Schematicky lze acylaci pomocí anhydridů popsat následovně: O R OH Ar OH R NH 2 NH R 2 R SH + R' R' CO CO O R O C R' O Ar O C R' O R NH C R' O R 2 N C R' O + R'COOH R S C R'

40 Vzniklé deriváty vykazují nižší polaritu a mají výhodnější chromatografické vlastnosti Blokováním protonu je zamezeno jeho interakcím s okolními molekulami. Zamezeny jsou tak disociační a dimerizační reakce a tvorba vodíkových vazeb Ztráta možnosti tvořit vodíkové můstky vede ke zvýšení těkavosti derivátů Do molekuly je možno zavést určitou funkční skupinu vykazující např. vyšší selektivitu vůči detekci. Významné je zavedení halogenů do molekul derivátu. K tomu se používá anhydrid trifluoroctové kyseliny a N-methyl-bis(trifluoracetamid): R CF 3 NH 2 + CF 3 CO CO N CH 3 R NH CO CF 3 + CH 3 NH CO CF 3

41 Dalším derivatizačním činidlem může být N-fluoracyl-imidazol, jenž reaguje snadno s hydroxylovou skupinou a sekundárními a terciálními aminy. Reakcí se neuvolní kyselina, nedochází k případné kyselé hydrolýze vzniklého produktu. Schéma reakce vypadá následovně: R OH + CF 3 O C N N R O COCF 3 + NH N

42 Alkylace (esterifikace) Alkylace je substituce aktivního vodíku alkylovou skupinou Esterifikace karboxylové kyseliny za vzniku methyl esteru je nejdůležitějším příkladem. Pro uskutečnění reakcí je k dispozici řada činidel, ale nejčastější je reakce karboxylové kyseliny za přítomnosti silné Lewisovy kyseliny v prostředí methanolu: RCOOH + BF 3 /MeOH RCOOMe Methyl estery jsou ze všech esterů nejtěkavější, reakce je rychlá a reakční výtěžek vysoký. Vzniklé methylestery jsou těkavé a poskytují symetrické píky Z dalších alkylačních činidel je důležitý trimethylanilinium hydroxid (TMAH). Užívá se především pro derivatizaci barbiturátů, fenolických alkaloidů a derivátů fenylmočoviny. Příklad reakce může vypadat následovně: N + Me 3 /OH - C 2 H 5 Ph C 2 H 5 Ph O O /MeOH O O HN NH CH 3 N N CH 3 O O (Fenobarbitone)

43 Pro derivatizaci kyselin, amidů a fenolů se také užívá pentafluorbenzylbromid, derivát poskytuje velkou odezvu na ECD Příklad reakce: F F F F F F CH 2 Br F + R OH CH 2 Cl 2 solvent R O CH 2 F F F

44 Silylace Silylace jsou pro GC používány ve velké míře. Principem je působení silylačního činidla na sloučeniny obsahující různé polární funkční skupiny s aktivním vodíkem. Vodík může být vázán na kyslík, síru nebo dusík Produkty derivatizace jsou obecně méně polární, těkavější a tepelně stabilnější Obecná reakční schemata jsou následující: R-COOH+ TMSč R-CO-O-Si(CH 3 ) 3 TMS-ester R-OH + TMSč R-O-Si(CH 3 ) 3 TMS-ether R-SH + TMSč R-S-Si(CH 3 ) 3 TMS-sulfid R-NH 2 + TMSč R-NH-Si(CH 3 ) 3 TMS-amin TMS znamená trimethylsilyl-, TMSč je TMSčinidlo

45 Mírné sililační činidlo je hexamethyldisilazan s trimethylchlorsilanem jako katalyzátorem reakce: R-OH + (CH 3 ) 3 Si-Cl R-O-Si(CH 3 ) 3 + HCl 2 R-OH+ (CH 3 ) 3 -Si-NH-Si(CH 3 ) 3 2 R-O-Si(CH 3 ) 3 + NH 3 Vznikající amoniak je v průběhu reakce vázán vznikající kyselinou chlorovodíkovou a reakční rovnováha je posunuta doprava K silným silylačním činidlům patří trimethylsilylamidy. Jejich aplikace jsou rozsáhlé, používají se k derivatizaci aminů, aminokyselin, karboxylových kyselin, alkoholů, merkaptanů, sacharidů a dalších látek obsahujících aktivní vodík Příklad reakce může vypadat následovně: R -NH 3 Cl + 2 CH 3 -CO-N(CH 3 )Si(CH 3 ) 3 R NH-Si(CH 3 ) 3 (MSA) kde MSA = N-methyl-N-trimethylsilylaceamid +(CH 3 ) 3 SiCl +2 CH 3 -CO-NHCH 3