Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Transkript

1 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 23 Preparativní chromatografie je používána pro separaci látek, které jsou určeny pro další zpracování. Množství získávané substance se výrazně liší podle aplikace. Několik mikrogramů (jeden pík) je dostačující pro záznam UV spektra, obecně je eluát měřen přímo v UV detekční cele. Minimálně 10 mg čisté látky je potřeba pro 1 H NMR, 13 C NHR a MS a dalších 5 mg pro určení empirického vzorce elementární analýzou. Pro syntézu derivátů zkoumaných komponent nebo zjišťování jejich reaktivity jsou zapotřebí množství od 10 do 100 mg. I takováto množství jsou dosažitelná v analytickém uspořádáním, i když je proces s tímto systémem zdlouhavý (tento přístup je označován, jako navyšování scaling up, to znamená rozšíření záběru techniky do původně nezamýšlené úrovně). Nicméně chromatograficky mohou být čištěna i množství g. Tato aplikace klasické kolonové chromatografie byla dokonce po dlouhou dobu nejdůležitější. Separace v tomto měřítku může být výrazně urychlena a vylepšena použitím modifikovaného HPLC uspořádání. V průmyslovém měřítku jsou stavěny kolony i o průměrech 1,6 m a separační kapacitou mezi 1 až 3 kg h -1. Tato kapitola popisuje separace v množství od 10 mg až po několik gramů, ale uvedené zásady jsou podobné pro separace menších i větších množství látek. Poznámka: Každá analytická separace může být provedena v preparativním měřítku!

2 v praxi Analytická chromatografie je obecně začátkem každé preparativní separace a musí být nalezeny podmínky, za kterých se vzorek pokud možno izokraticky rozdělí a to s dobrým rozlišením: a) Pro preparativní použití jsou gradientové separace nevhodné, protože jejich použití separaci prodražuje. Místo toho je lepší vzorek vhodným způsobem předzpracovat nebo přečistit. b) Čím je lepší rozlišení v analytickém měřítku, tím více může být preparativní kolona přetížena. Chromatogram níže ukazuje analytickou separaci produktů termolýzy transdihydrokarvonoximu: Struktury produktů nebyly známy, dokonce ani nebylo jisté, že jeden pík v chromatogramu odpovídá jedinému produktu.

3 Po optimalizaci analytické separace byla vybrána preparativní kolona, která je plněna 5, 7 nebo 10 µm částicemi (pro jednoduché separace požadující méně než 100 teoretických pater je vhodnější kolona s hrubšími částicemi okolo 40 µm) a je dostupná od několika výrobců. Pro vzorky mg je nutná kolona o vnitřním průměru 10 mm a pro vzorky od 100 mg do 1 g roste průměr kolony až na 21,5 mm. Přenos podmínek z analytické separace na preparativní separaci je jednodušší, pokud jsou kolony naplněny stejnou stacionární fázi. Pro reprodukovatelné retenční časy vyžadují širší kolony čerpadla poskytující vysoký průtok a lineární dávkování mobilní fáze s konstantním složením. Retenční čas je závislý na rychlosti průtoku mobilní fáze, ten roste s druhou mocninou průměru kolony: 1 ml min -1 u kolony s průměrem 4 mm vzroste pro 10 mm kolonu na 6,25 ml min -1! Vybraný detektor musí být málo citlivý. Jsou preferovány detektory na bázi měření indexu lomu nebo UV detektor s optickou dráhou pouze 0,1-0,5 mm. Minimální optickou dráhu mají tzv. detektory filmové, ve kterých eluát protéká po nakloněné skleněné destičce. Směs by neměla obsahovat žádné silně zadržované komponenty. Pro ověření můžeme využít chromatografii na tenké vrstvě (neměla by zůstat stopa na začátku). Pokud je třeba, může být vzorek čištěn adsorpční filtrací nebo kolonovou chromatografií. Toho se využívá zejména v případě reakčních směsí nebo přírodních vzorků. Pokud nemůžeme zcela vyloučit nečistoty a rozklad v koloně je nezbytné použít ochranou (quard) kolonu. Ztrátám vzorku může být zabráněno neplněním smyčky do jejího maximálního objemu. Mobilní fáze by měla být velice čistá a snadno odpařitelná, abychom jednoduše získali separovaný produkt. Pro přípravu pufrů můžeme použít kyseliny: octovou, trifluoroctovou, mravenčí, dále amoniak, hydrogenuhličitan amonný, triethylamin, trimethylamin, ethanolamin a pyridin. Preparativní separace výše zmíněné reakční směsi, ze které byly získány čtyři čisté látky, je ukázána na chromatogramu níže. K určení struktury byl použit NMR. Některé píky nemají ideální tvar v důsledku přetížení kolony. Kromě čistoty píků musí být v preparativním měřítku uvažováno i ekonomické hledisko (cena mobilní a stacionární fáze) a výkon (množství látky/čas).

4 Problem Látka musí být připravena v čisté formě pomocí preparativní HPLC. Separační proces je plně automatizován využitím autoinjektoru a počítačem řízeným sběrem frakcí. Mohou být použity následující kolonové systémy: a) Analytická kolona 4,6 mm 25 cm s 5 µm stacionární fází. Množství žádané složky ve vzorku je 1,2 mg na jeden nástřik, rozlišení je úplné. Průtok mobilní fáze je 2 ml min -1, separace trvá 8 min. b) Preparativní kolona 22 mm 25 cm s 5 µm stacionární fází. Množství složky ve vzorku je 120 mg, kompletní rozlišení. Průtok mobilní fáze je 14 ml min -1, separace trvá 30 min. c) Preparativní kolona 22 mm 25 cm s 40 µm stacionární fází. Množství složky ve vzorku je 120 mg, ale výtěžek je jen 80% kvůli neúplnému rozlišení. Průtok mobilní fáze je 14 ml min -1, separace trvá 30 min. Vypočítejte separační výkon těchto systémů v mg/h. Vypočítejte cenu produktu ( g -1 ) pro systémy (neuvažujte amortizaci a nákupní náklady jsou stejné u všech tří kolon). Cena

5 mobilní fáze je 24 l -1, ale 90% se dá za 5 l -1 redestilovat a použít znovu. V každém případě po 200 nástřicích musí být stacionární fáze vyměněna a to za a) 60, b) 1400, c) 110. Řešení Výkon: a) 9 mg h -1, b) 240 mg h -1, c) 156 mg h -1. Cena a) 340 g -1, b) 83 g -1, c) 43 g -1. Efekty související s přetížením kolony V preparativní HPLC je běžné přetížení kolon. Tato přetížení můžeme rozdělit do tří kategorií: a) objemové přetížení b) hmotnostní přetížení (také nazývané koncentrační) c) přetížení detektoru Vlivy jednotlivých typů přetížení jsou ukázány v obrázku níže. V analytické HPLC pracujeme s malými objemy vzorků, které nemohou ovlivnit šířku píků. Podobně také hmotnost vzorku je příliš nízká na to, aby způsobila přetížení. Při objemovém přetížení je objem nástřiku tak velký, že je ovlivněna šířka píku (koncentrace vzorku je nízká, a tím nedochází k hmotnostnímu přetížení). Jak je patrné z obrázku níže, šířka píku v polovině výšky, x, při výstupu i výstupu z kolony je stejná. Rovněž koncentrace v maximu píku zůstává neměnná (pokud pík není významně zředěn při vysoké hodnotě k). Je zřejmé, že při objemovém přetížení mají píky obdélníkové tvary.

6 V praxi může být objemové přetížení kolony zvyšováno, dokud se nezačnou píky navzájem dotýkat. Tento maximální objem nástřiku, V L, může být vypočítán z údajů v analytickém chromatogramu:

7 Kde V 0 je mrtvý objem (void volume), α je separační faktor píků, k A je retenční faktor prvního píku a N je počet teoretických pater kolony. Nástřik V L je možný pouze pokud nedochází k hmotnostnímu přetížení (vzorek je ředěný). V opačném případě musí být objem nástřiku nižší. Problém Ředěný roztok obsahuje komponentu A, kterou je potřeba izolovat pomocí preparativní HPLC od nečistot. Separační faktor složky A od nejbližší komponenty je 1,5 a retenční faktor je 4. Použitá analytická kolona má 6400 teoretických pater a mrtvý objem 2 ml. Vypočtěte maximální povolený objem nástřiku, při kterém se pík komponenty A dotkne nejbližšího píku. Řešení Jestliže je hmotnost vzorku (vypočítáno násobením objemu a koncentrace) vyšší než určitá hodnota, je lokální koncentrace vzorku v koloně příliš vysoká a nedovoluje ustavení rovnováhy: nastává hmotnostní přetížení. Výsledné píky mají trojúhelníkový tvar. Ve většině případů se objevuje chvostování s poklesem retenčních časů, jak je ukázáno v obrázku výše. Někdy se hmotnostní přetížení projevuje frontujícími píky společně s nárůstem retenčních časů. Obecně chce každý uživatel preparativní HPLC získat co nejčistější látky za jednotku času, a proto je nutné pracovat v režimu přetížení. Jestliže jsou vzorky ředěné, bude časté objemové přetížení a s koncentrovanějšími vzorky je běžnější hmotnostní přetížení. Často se projevují oba efekty a píky jsou ořezané, jak je ukázáno ve spodní části obrázku výše (s rostoucí retencí se ztrácí plošina a píky jsou trojúhelníkové). Maximální množství nástřiku je u koncentrovaných vzorků určeno empiricky: objem je zvyšován, dokud se píky nedotýkají. Neředěné vzorky nejsou vhodné. Vzorek nemusí být rozpuštěn v silnějším rozpouštědle než je mobilní fáze. Obecně v preparativní HPLC jsou aplikovány velké objemy vzorků a rozpouštědlo vzorku by mohlo narušovat rovnováhu na koloně, čímž by separace nemusely být reprodukovatelné. Vzorek musí být dobře rozpustný v mobilní fázi, jinak hrozí ucpání kolony. Přetížení detektoru se objevuje, když už detektor není schopen zaznamenat další nárůst koncentrace, a projeví se formou obdélníku i při největším utlumení signálu. Přetížení potom může být špatně interpretováno, jako přetížení kolony. Pro preparativní HPLC jsou užívány

8 necitlivé detektory, tak v případě UV detektoru to znamená detektor s krátkou optickou dráhou. V určitém rozsahu garantuje čistotu frakce detektor indexu lomu. Pokud použijeme UV detektor a pík složky se částečně překrývá s píkem neabsorbující nečistoty, detektor to není schopen registrovat a produkt bude znečištěn. Sběr frakcí V porovnání s průtokem mobilní fáze musí mít spojovací kapilára mezi detektorem a sběračem frakcí malý objem. Problém Kapilára (PFTE trubice) mezi detekční celou a sběrnou nádobou má rozměr 20 cm 0,3 mm. Mezi zaznamenáním signálu a sběrem frakce by neměla uběhnout doba větší než 1 s, aby proběhl sběr frakce správně. Jaký by měl být minimální průtok mobilní fáze? Řešení Pro občasné preparativní separace mohou být frakce sbírány do Erlenmayerovy baňky nebo skleněné reakční nádobky u výstupu z detektoru. Pokud je použit sběrač frakcí, měl by být přímo řízen zapisovačem nebo detektorem. Při zpracovávání velkého množství produktu je výhodné použít plně automatizované systémy. Sběr frakcí musí být kontrolován programem, který ohlídá čas i signál, aby byly jednotlivé píky separovány do zvláštních nádob a nebyly přitom rozděleny. Jestli nejsou zaznamenány píky, měl by eluent odcházet znovu do zásobníku solventu, recyklace mobilní fáze. Další automatický nástřik by měl proběhnout ihned po skončení chromatogramu. Čistota získaných frakcí klesá, pokud jsou píky špatně rozlišeny (obr. níže). Vzniklou situaci je možné zlepšit oddělením prostřední frakce a jejím opětovným nástřikem v další chromatografii.

9 Profily dotýkajících se píků mohou být nepříznivé až do té míry, že nejsme schopni získat druhý pík čistý, na rozdíl od prvního. Jak již bylo řečeno, pro preparativní HPLC je nezbytná velmi čistá mobilní fáze, aby byla zaručena i čistota produktu po odpaření solventu. Problém Vzhledem k ostatním látkám je možné pomocí preparativní HPLC separovat produkt o čistotě 99,5%. Jeho koncentrace v eluátu je 5 mg ml -1. Obsah netěkavých nečistot v mobilní fázi je 0,002% (hmotnost/objem). Vypočítejte čistotu izolovaného produktu po odstranění solventu. Řešení 1 ml eluátu obsahuje 99,5% z 5 mg = 4,975 mg produktu a také 0,025 mg nečistot z ostatních látek a 0,020 mg nečistot ze solventu. To znamená, že na 4,975 mg produktu je celkem 0,045 mg nečistot. Čistota produktu klesla na 99,1%.

10 Recyklace Jestliže je nedostatečné rozlišení dělených složek, jednotlivé píky přestávají být rozeznatelné při zvyšování hmotnosti a objemu vzorku v nástřiku. V takovýchto případech můžeme rozlišení zlepšit opětovnou recirkulací eluátu kolonou na základě následujících technik: a) Eluát je vrácen za detektorem zpět do čerpadla a celým separačním systémem prochází ještě jednou. Čerpadlo musí mít velice malý vnitřní objem a musí rovněž pracovat bez pulsů (tlumič pulzů příliš zvyšuje mimokolonový objem). Jsou nezbytné relativně velké kolony (např. kolona 25 cm 2 mm by byla nevhodná). Nicméně navzdory všem těmto opatřením po každém cyklu významně narůstá šířka píků. V některých případech je možné provést až deset cyklů. b) Systém se dvěma kolonami, kterými prochází mobilní fáze v následujícím pořadí: pumpa kolona 1 vícecestný ventil detektor kolona 2 píky nejsou adekvátně rozlišené sběrač frakcí píky jsou adekvátně rozlišené Eluát může střídavě procházet dvěma kolonami až dvacetkrát. Výhodou tohoto uspořádání na rozdíl od první metody je, že mimokolonové objemy jsou velice malé a objem čerpadla může být libovolný. Nevýhodou je, že cela detektoru musí být tlakově odolná. Vytěsňovací chromatografie I za podmínek přetížení je poměr mezi hmotností vzorku a množstvím stacionární fáze malý a neekonomický (ve většině případů není větší než 10 mg g -1 ). Vytěsňovací chromatografie představuje zcela rozdílný přístup pro preparativní HPLC (viz obr. níže). V této metodě je na chromatografické lože přivedeno velmi velké množství vzorku, peptidů. Tím, že mají různé složky vzorku rozdílnou afinitu ke stacionární fázi, jsou sebou navzájem vytlačovány z adsorpčních míst sorbentu. Pokud je separační účinnost kolony dostatečně vysoká, budou složky eluovány v čistých, ale těsně na sebe navazujících zónách.

11 K vytěsnění zón složek je potřeba po nástřiku vzorku na kolonu přivádět látku s ještě vyšší afinitou ke stacionární fázi. Tato látka je nazývána vytěsňovacím činidlem. Optimální činidlo musí být nalezeno empiricky. Pro stacionární fáze na bázi silikagelu jsou využívány kvarterní aminy (pokud vzorky nejsou kyseliny) a pro reverzní fáze jsou využitelné alkoholy. Kolonu je potřeba po každé separaci regenerovat. Nevýhodou vytěsňovací chromatografie je skutečnost, že optimální podmínky nemohou být snadno přeneseny z analytického rozměru do preparativního pouhým zvětšením měřítka. Nicméně po úspěšné optimalizaci procesu je vytěsňovací chromatografie nejúčinnější metodou a žádná jiná technika neumožňuje tak velký výkon s nízkou spotřebou mobilní fáze.