Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie exprimovaných v eukaryotických organismech Diplomová práce Vypracovala: Vedoucí práce: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. Školitel: Mgr. Hynek Mrázek Škola: Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta Studijní obor: Biochemie Rok: 2010

2 Prohlašuji, ţe jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením Prof. RNDr. Karla Bezoušky, DSc. a všechny pouţité prameny jsem řádně citovala. V Praze dne... Podpis:... 2

3 Poděkování Děkuji Prof.RNDr. Karlu Bezouškovi, DSc. za odborný dozor, umoţnění vykonání této diplomové práce a cenné rady. Dále děkuji svému školiteli Mgr. Hynku Mrázkovi za vedení diplomové práce, rady, připomínky, trpělivost a ochotu kdykoliv poradit. V neposlední řadě bych ráda poděkovala všem členům Laboratoře architektury proteinů Mikrobiologického ústavu Akademie věd České republiky za pomoc při provádění experimentů a příjemné pracovní prostředí. Díky patří i členům mé rodiny za jejich podporu během mého studia. 3

4 Obsah Abstrakt... 6 Abstract... 7 Seznam zkratek... 8 Teoretická část I. Úvod Imunitní systém a jeho funkce Komponenty imunitního systému Mechanismy imunity Membránové proteiny NK buňky NK buněčné rozpoznávání Funkce NK buněk v organismu Receptory NK buněk Receptory rodiny NKR-P Struktura molekuly NKR-P Funkce receptoru NKR-P Ligandy a vazebná afinita receptoru NKR-P Kvasinka Pichia pastoris a její expresní systém Přehled historie expresního systému Pichia pastoris Výhody exprese proteinů v Pichia pastoris Pichia pastoris jako methylotrofní kvasinka Expresní kmeny a produkce proteinů kvasinkou Pichia pastoris Expresní vektor Pichia pastoris Post-translační modifikace Pichia pastoris II. Cíle diplomové práce Experimentální část III. Materiál a přístroje Přístroje Chemikálie Roztoky a pufry Média Antibiotika Enzymy a inhibitory Primery Vektory Kvasinkové a bakteriální kmeny IV. Použité metody Práce s DNA PCR polymerasová řetězová reakce Purifikace PCR produktů Elektroforesa v agarosovém gelu Restrikční štěpení Isolace DNA z agarosového gelu Ligace insertů rnkr-p1a a rnkr-p1b do vektoru ppiczα Transformace ligační směsi do bakteriálních buněk

5 14.8. Minipreparativní isolace DNA Rychlá preparace DNA ( Easyprep ) Velkokapacitní preparace plasmidu Fenol/chloroformová extrakce DNA Precipitace DNA Spektrofotometrické stanovení čistoty a koncentrace DNA Linearizace expresního vektoru ppicz Práce s kulturami kvasinek Pichia pastoris Příprava buněk na elektroporaci Transformace buněk Pichia pastoris elektroporací Isolace DNA z kolonií Pichia pastoris Selekce pozitivního klonu pro produkci proteinů rnkr-p Produkce proteinů rnkr-p1a a B a její optimalizace Práce s proteiny Příprava vzorků po produkci na analýzu SDS elektroforesou Diskontinuální SDS-PAGE Visualizace proteinů Coomassie Brilliant Blue R-250 a stříbrem Zakoncentrování vzorků Dialýza Stanovení koncentrace proteinů dle Bradfordové Chromatografické metody Identifikace exprimovaného proteinu hmotnostní spektrometrií V. Výsledky Příprava expresního vektoru Selekce pozitivního klonu pro produkci proteinů rnkr-p Optimalizace produkce proteinů rnkr-p Extracelulární exprese receptorů rnkr-p1 v Pichia pastoris Purifikace exprimovaných proteinů rnkr-p Intracelulární exprese receptorů rnkr-p1 v Pichia pastoris VI. Diskuse VII. Závěr Seznam literatury

6 Abstrakt Důleţitou součástí imunitního systému jsou NK (natural killer) buňky, které mají schopnost identifikovat antigeny a cizorodé látky přítomné v organismu prostřednictvím molekulově rozmanitých receptorů. Mezi receptory přirozených zabíječů patří lektinové proteiny NKR-P1A a NKR-P1B, jejichţ ligandy jsou převáţně terminální oligosacharidy glykoproteinů na cílových (např. nádorových) buňkách. Po interakci sacharidových struktur na povrchu antigenů s jejich vazebnými partnery na NK receptorech jsou spouštěny výkonné mechanismy NK buněk, které příslušné cílové buňky zabíjí. V současné době jsou poznatky v oblasti NK buněk, jejich receptorů a interakcích s ligandy značně vyuţívány při léčbě nádorů, virových a autoimunitních onemocnění. Exprese heterologních proteinů v eukaryotických organismech s sebou přináší mnoho výhod. Methylotrofní kvasinka Pichia pastoris je, na rozdíl od prokaryotických organismů, schopná post-translačních modifikací, jejichţ výsledkem jsou biologicky aktivní molekuly exprimovaných proteinů. Expresní systém P. pastoris má obvykle vysokou úroveň exprese proteinů a je obecně pokládán za rychlejší, snaţší a levnější ve srovnání s jinými eukaryotními systémy. V této diplomové práci jsou předkládány výsledky přípravy expresního vektoru, vhodného pro expresi potkaních proteinů NKR-P1A a NKR-P1B, jejich extracelulární a intracelulární produkce v kvasince Pichia pastoris a purifikace exprimovaných produktů. Klíčová slova NK buňky, receptory NK buněk, rnkr-p1, Pichia pastoris, α-mf signální sekvence, intracelulární/extracelulární produkce heterologních proteinů 6

7 Abstract NK (natural killer) cells, with their ability to identify antigens and extraneous substances, available in the organism through various moleculary receptors, are an important component of the immune system. The NKR-P1A and NKR-P1B proteins belong to the lectin receptors of natural killer cells. Primary ligands of lectin receptors comprise terminal oligosaccharides of glycoproteins on the surface of target (e.g. tumor) cells. The interaction between carbohydrate structures on the surface of antigens and their binding partners on NK receptors is followed by triggering the effector function of NK cells against the targets. The NK cells and NK receptors findings and their interactions with ligands are greatly utilized in the treatment of cancer, viral and autoimmune diseases. Heterologous protein production in the eukaryotic organism brings a lot of advantages. Unlike the prokaryotic organism, the methylotrophic yeast Pichia pastoris has the capability of performing many posttranslational modifications resulting in production of biological active protein molecule. Usually, the P. pastoris expression system disposes of high level protein expression and is also generally regarded as being faster, easier, and less expensive to use than expression systems derived from other eukaryotes. In this thesis, I will review the results of expression vector design and preparation, extracellular and intracellular production of the rat NKR-P1A and NKR-P1B receptors in yeast Pichia pastoris and the purification of expression products. (In Czech) Keywords NK cells, NK cell receptor, rnkr-p1, Pichia pastoris, α-mf signal sequence, intracellular/extracellular heterologous protein production 7

8 Seznam zkratek -MF -mating factor AC adenylatcyklasa ADCC buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) AOX alkohol oxidasa APS peroxosíran amonný (Amonium PerSulphate) bp pár bází BSA hovězí sérový albumin camp cyklický adenosinmonofosfát CAT katalasa CBB R-250 Coomasie Brilliant Blue R-250 CRD lektinová doména vázající sacharid (Carbohydrate Recognition Domain) CTLDs doména podobná lektinům C-typu (C-Type Lectin-Like Domains) DAG diacylglycerol DHA dihydroxyaceton DHAS dihydroxyaceton synthasa dntp deoxyribonukleotidtrifosfát dsdna dvouřetězová DNA (double-stranded DNA) DTT dithiotreitol E. coli Escherichia coli EDTA ethylendiamintetraoctová kyselina EtOH ethanol FAD Flavin Adenin Dinukleotid Fuc fukosa Gal galaktosa GalNAc N-acetylgalaktosamin GAP glyceraldehyd-3-fosfát GlcNAc N-acetylglukosamin 8

9 GM-SCF faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) GPI glykosylfosfatidylinositol HAc kyselina octová HLA lidský histokompatibilní antigen (Human Leukocyte Antigen) HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography) IFN interferon Ig imunoglobulin IGF-I Insulin-Like Growth Factor I IL interleukin IP 3 inositoltrifosfát IPTG isopropylthio-β-d-galaktosid ITAM imunitní aktivační receptorový motiv tyrosinového typu (Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif) ITIM imunitní inhibiční receptorový motiv tyrosinového typu (Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibitor Motif) KIR receptory Killer Inhibitory Receptors LAK buňka Lymphokine Activated Killer Cell LB médium Luria-Bertani medium LRC Leukocyte Receptor Complex MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Man manosa ManNAc N-acetylmanosamin MBÚ Mikrobiologický ústav MeOH methanol MHC hlavní histokompatibilní complex (Major Histocompatibility Complex) MS hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry) Mut - methanol utilization minus Mut + methanol utilization plus Mut S methanol utilization slow 9

10 NCRs Natural Cytotoxicity Receptors NK buňky Natural Killer cells NKC NK complex NKD NK cell domains NeuAc kyseliny sialové PAGE polyacrylamide gel electrophoresis PCR polymerasová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction) PI 3 K fosfatidylinositol-3 kinasa PIPES 1, 4 piperazindiethansulfonová kyselina PLC fosfolipasa C PMSF fenylmethylsulfonylfluorid P. pastoris Pichia pastoris PTK protein-tyrosin-kinasy RP-HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie s obrácenou fází (Reversed Phase-HPLC) RT-PCR Reverse Transcription PCR S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SCP Single Cell Protein SDS dodecylsulfát sodný SDS elektroforesa diskontinuální elektroforesa v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS TCR antigenní receptor T-lymfocytů (T-Cell Receptor) TEMED N,N,N,N -tetramethylethylendiamin TFA trifluoroctová kyselina TNF Tumor Necrosis Factor TOF Time-Of-Flight TRAIL TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Tris tris(hydroxymethyl)aminomethan 10

11 Teoretická část I. Úvod 1. Imunitní systém a jeho funkce Prostředí, ve kterém ţijeme, se v mnoha případech jeví jako člověku nebezpečné z hlediska výskytu různých druhů mikroorganismů. Organismus se proti takovým parazitům a cizorodým látkám brání pomocí imunitního systému, který musí být schopen rozlišit cizí od vlastního, resp. škodlivé od uţitečného pouţitím specifických a nespecifických mechanismů. Mezi další základní funkce imunitního systému patří autotolerance (rozpoznávání a tolerování vlastních tkání) a imunitní dohled (odstraňování abnormálních buněk nádorových, poškozených aj.) Komponenty imunitního systému Hlavními součástmi imunitního systému jsou lymfatická tkáň a lymfatické orgány. Dělí se na primární, kde dochází ke vzniku, diferenciaci a zrání imunokompetentních buněk, a na sekundární, která jsou místem antigenně specifických reakcí imunitního systému. Do primárních lymfatických orgánů patří kostní dřeň a brzlík (thymus), kdeţto jako sekundární orgány jsou označovány slezina, lymfatické uzliny a jejich shluky. 1 Imunocyty (buňky imunitního systému) a molekuly imunitního systému jsou dalšími důleţitými sloţkami imunitního systému. Kaţdý imunocyt plní určitou úlohu, jejíţ cílem je rozpoznat a reagovat na jakoukoliv částici tělu cizí. Velká část buněk je tvořena rozdílnými typy bílých krvinek - leukocyty, jenţ vznikají z pluripotentních kmenových buněk v kostní dřeni Z kmenových buněk vychází dvě základní linie myeloidní a lymfoidní 1 (Obr. 1, str. 12). Podstatnou část buněk, které vznikají z myeloidní linie, jsou fagocytující leukocyty se schopností produkce cytokinů. Řadíme sem monocyty, granulocyty, trombocyty, erytrocyty i dendritické buňky. Tyto buňky zasahují vţdy stejným způsobem a stejnou silou i po několikanásobném setkání s antigenem, tudíţ pracují na principu nespecifických mechanismů. Leukocyty myeloidní linie se schopností předkládat antigen T buňkám 11

12 (dendritické buňky, monocyty i makrofágy) tvoří spojnici mezi antigenně nespecifickou a specifickou imunitou. 1 Na druhé straně za specifické mechanismy jsou odpovědné buňky diferencované z lymfoidní linie lymfocyty B a T a také NK buňky (z angl. natural killer přirození zabíječi), které tvoří přechod mezi oběma druhy imunitních mechanismů. Kaţdá specifická imunitní buňka je předurčena k rozpoznání pouze jediného typu antigenu. Opakované setkání s cizorodou látkou vyvolává stále silnější a rychlejší imunitní odpověď. Jedná se o dlouhoţijící paměťové buňky. 2 Obr. 1: Buňky imunitního systému (upraveno dle 1 ) 1.2. Mechanismy imunity Existují dvě základní skupiny mechanismů účinků imunitního systému. Nespecifická imunita (téţ vrozená, neadaptivní) je prvořadá obrana organismu proti mikroorganismům a škodlivinám. Vyznačuje se velmi rychlou reakcí na jejich přítomnost, je méně cílená, ale vţdy v pohotovosti. Není závislá na předchozím setkání s antigeny, u nichţ rozpoznává jen kolektivní vlastnosti, jeví tudíţ ve vztahu k antigenům nespecifické rysy a postrádá tzv. imunologickou paměť. Do skupiny vrozené imunity se řadí sloţky komplementu, interferony, lektiny a, jak jiţ bylo řečeno, i fagocytující buňky a NK lymfocyty. 1 Adaptivní mechanismy jsou antigenně specifické a k jejich aktivaci dochází aţ po setkání s daným antigenem. Reakce je zprostředkovaná pomocí vysoce specializovaných 12

13 molekul, jako jsou protilátky a antigenně specifické receptory T lymfocytů. Na rozdíl od vrozené imunity je u adaptivního mechanismu přítomna výrazná vlastnost imunologické paměti, kdy část populace B a T lymfocytů se po setkání s antigenem mění na paměťové buňky, které mohou započít sekundární etapu imunitní odpovědi. Celkový proces specifické imunitní reakce trvá řádově dny aţ týdny Membránové proteiny Povrch buněk je pokryt celou řadou jiných molekul. Tyto povrchové molekuly obstarávají kontakt buňky s okolím a mají funkci adhezní, signalizační, transportní i rozpoznávací. Převáţnou většinu komunikace buňky s vnějším prostředím zprostředkovávají membránové (glyko)proteiny. 3 Podle způsobu zakotvení v membráně je dělíme na několik typů. Membránové proteiny I. druhu mají N-konec umístěný extracelulárně, samotnou lipidovou membránou prochází část hydrofobního řetězce o délce kolem 20 aminokyselin a C-konec se nachází v cytoplasmě (Obr. 2a). Je to nejčastější případ transmembránových proteinů. Méně běţným typem je II. třída membránových proteinů, která má C-terminální část vně buňky a N-konec směřuje do cytoplasmatického prostoru (Obr. 2b). Na rozdíl od I. a II. třídy se u III. typu vyskytují proteiny, které prochází membránou vícekrát (převáţně čtyřikrát či sedmkrát) (obr.2c). Na Obr. 2d je zobrazena IV. skupina molekul, kde se trasmembránové domény několika různých polypeptidů skládají a tvoří kanál skrze membránu. V. třída proteinů je na membráně drţena zejména kovalentně vázanými lipidy (Obr. 2e). Další skupina proteinů je prezentována molekulami, které jsou na membráně upevněny glykolipodovou kotvou i transmembránovou doménou. Na část polypeptidového řetězce, leţící v extracelulárním prostoru, je napojen glykosylfosfatidylinositol (GPI) (Obr. 2f). 1, 4 13

14 v krvi. 5 NK lymfocyty jsou vedle B a T buněk jedním z typů bílých krvinek. Jedná se o Všechny sloţky imunitního systému spolu velmi úzce interagují a vzájemně se ovlivňují pomocí adhezních molekul, tj. přímým kontaktem, nebo rozpustnými cytokiny NK buňky NK buňky byly objeveny před více neţ 30 lety, kdy byla charakterizována jejich schopnost zabíjet některé druhy nádorů jiţ po prvním setkání s nádorovými buňkami. Prvotní pokusy ukazovaly na schopnost NK lymfocytů inhibovat rozmáhání metastáz velké granulární lymfocyty, jenţ stojí na rozmezí vrozené a adaptivní imunity. Na rozdíl od B a T buněk, které jsou nositeli antigenně specifických imunitních mechanismů, přirození zabíječi nepřeskupují geny kódující řetězce imunoglobulinů a T buněčného receptoru. Proto NK buňky postrádají repertoár specifických receptorů pro antigeny. NK buňky jsou evolučně blíţe T buňkám, s nimiţ mají podobné vlastnosti. Existuje skupina lymfocytů, která nese znaky jak NK buněk (řada receptorů, např. NKR-P1 (z angl NK cell receptor protein 1), tak i T lymfocytů (receptor pro T buňky, TCR). Pro své vlastnosti byly pojmenovány NKT lymfocyty. 6 Stále rozvíjející se znalosti v oboru NK buněk, mezibuněčných interakcích a biologii buněčných receptorů nám ukazují důleţitost a sloţitost NK lymfocytů a jejich význam v diagnostice a terapii malignit NK buněčné rozpoznávání Přestoţe NK buňky nemají antigenně specifické receptory, mají schopnost rozpoznat a zabíjet nádorové buňky nebo buňky infikované virem a zároveň se vyhnout poškození normálních buněk vlastního organismu. 1 Průlom v porozumění principu NK buněčného rozpoznání přinesla tzv. missing self hypotéza. Podle ní mají NK buňky za úkol rozeznávat a eliminovat všechny buňky, které nedostatečně vystavují na svém povrchu MHC (Major Histocompatibility Complex) molekuly I.třídy. 8 Viry infikované či nádorové buňky se brání útoku T lymfocytů právě tím, ţe se snaţí sníţit produkci MHC I. molekul na svém povrchu. To však vede k aktivaci NK buněk a k zahájení imunitních reakcí. Na druhé straně, jestliţe se receptory cílové buňky naváţí na MHC molekulu vlastního 14

15 organismu, začnou vysílat signály, jeţ inhibují NK buňky a tím chrání vlastní buňky. 9 Je třeba si uvědomit, ţe aktivace NK lymfocytů je velmi sloţitý proces, jelikoţ i přes potlačení inhibičních vlastností nejsou aktivita přirozených zabíječů a následné zahubení cílové buňky zaručené. NK buněčné rozpoznávání je výslednicí rovnováhy mezi pozitivními (aktivujícími) a inhibičními (negativními) signály pocházejících z membránových receptorů. 7 Na obr. 3a je znázorněn případ, kdy NK buňka interaguje s normální buňkou, která na svém povrchu exprimuje přiměřené mnoţství molekul MHC I.třídy, a proto nedochází k zahubení této buňky NK lymfocytem. Naopak na obr. 3b je vyobrazena situace, kdy cílová buňka neexprimuje molekuly MHC I. na svém povrchu např. vlivem virové infekce, a proto MHC vázající inhibiční receptor na NK buňce nemá vazebného partnera a nemůţe poskytnout NK buňce ţádný signál. Výsledkem je zabití cílové buňky. V tomto případě je cílová buňka vnímaná NK buňkou podle hypotézy missing self. Obr. 3: NK buněčné rozpoznávání 10 a) Inhibiční receptory na povrchu NK buňky rozpoznávají molekuly MHC I.třídy na cílové buňce a dochází k potlačení aktivace NK lymfocytu. b) Na aktivační receptory NK buňky se váţí jeho ligandy nacházející se na povrchu cílové buňky, a jestliţe inhibiční NK receptory nemají vazebné partnery, je výsledkem stimulace NK buňky. Při nedostatku MHC I. molekul na cílové buňce nejsou tyto stimulační signály dále potlačovány a NK buňka na ně odpovídá produkcí cytokinů a uvolněním granul. Následuje cytotoxická aktivita NK buňky. 15

16 2.2. Funkce NK buněk v organismu NK buňky mají v organismu mnoho různých funkcí. Mezi nejvýznamnější patří cytotoxická aktivita, regulační funkce, obrana proti virům, infekcím a protinádorová aktivita. Antivirová funkce Při antivirové funkci vyuţívají NK buňky rozmanitých mechanismů na obranu proti virovým infekcím a existují různé popudy, které spouští tuto antivirovou aktivitu. 11 Početnými studiemi se zjistilo, ţe virem infikované buňky aktivují NK buňky k produkci IFNγ. Některé viry indukují expresi IL-12, tím je vyvolána produkce IFNγ NK buňkami a dochází k napadání a ničení infikovaných buněk. 12 NK buňky zasahují například proti herpesviru, chřipkovému viru, retrovirům, adenovirům a mnoha dalším. 13 Cytotoxická aktivita NK buněk NK buňka ničí cílovou buňku prostřednictvím mechanismů vyţadujících přímý kontakt mezi touto a NK buňkou. Příslušné cytotoxické mechanismy jsou buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity ADCC), lytická cesta závislá na vápníku (Ca 2+ ) a mechanismus zprostředkovaný tzv. receptory 1, 14 smrti. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (ADCC) ADCC je důleţitým mechanismem imunity proti nádorovým a virem infikovaným buňkám. NK buňky mají na svém povrchu specifické receptory (Fc-receptor CD16) třídy IgG, které slouţí k rozeznání různých typů buněk a aktivují cytotoxický mechanismus NK lymfocytu. Po setkání NK buňky s buňkou, která je opsonizována protilátkami třídy IgG, 1, 15 dochází k navázání Fc-receptoru CD16 (FcγRIII) na Fc části protilátek. CD16 je nízkoafinitní receptor vyskytující se na povrchu NK buněk, granulocytů, aktivovaných makrofagů a na některých T lymfocytech. 16 Transportem signálu přes molekulu CD16 se aktivují protein-tyrosin-kinasy (PTK) rodiny Src a Syk vazbou na fosforylované zbytky v ITAM (z angl. Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motifs) oblasti cytoplasmatické domény. Farmakologická inhibice PTK aktivity brání spuštění ADCC. 17 Protilátkově závislá buněčná cytotoxicita má zásadní význam v protinádorové léčbě

17 Lytická cesta závislá na vápníku Lytická fáze působení NK buněk je zajišťována velkým mnoţstvím cytotoxických granulí přítomných v cytoplasmě těchto buněk. Jedná se převáţně o protein perforin a serinové proteasy zvané granzymy. 14 Po aktivaci NK buňky dochází k vycestování cytotoxických granulí směrem k plazmatické membráně v místě kontaktu cílové a NK buňky. 1 Perforiny jsou z granulí uvolňovány do úzkých otvorů mezi buňkami (tzv. degranulace). Granzymy do buňky vstupují póry, které jsou vytvářeny perforiny. Působením granzymů dochází ke štěpení prekurzorů proteas ze skupiny kaspas. Výsledkem řetězce reakcí, způsobených kaspasami, je proces apoptosy a následná smrt 1, 19 buňky. Receptory smrti Dalším moţným způsobem, jak usmrtit abnormální buňku, je cesta přes tzv. receptory smrti. Ty patří mezi cytokiny rodiny TNF (Tumor Necrosis Factor) a mají schopnost spouštět programovou smrt buňky. 20 NK lymfocyty exprimují na svém povrchu tři reprezentanty receptorů smrti: TNF, Fas ligand a TNF příbuzný apoptosu vyvolávající ligand TRAIL (z angl. TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand). Receptory smrti se váţí na své ligandy přítomné na povrchu různých typů buněk (v případě apoptického receptoru Fas (CD95) se jedná o Fas ligand, FasL) a vyvolávají aktivaci kaspasové kaskády vedoucí k apoptické smrti buňky. Schopnost receptorů smrti a jejich ligandů ničit nádorové buňky 1, 21 se vyuţívá v protinádorové terapii. Regulační funkce NK buněk Vedle cytotoxického působení NK buněk je třeba upozornit také na jejich podstatný regulační význam v imunitním systému. Spolupráce NK buněk s ostatními komponentami imunity je zprostředkována hlavně prostřednictvím sekretovaných cytokinů. 1 Uplatňují se zejména IFN, a IFN. IFN stimuluje makrofágy, zvyšuje jejich aktivitu během virové infekce 22 a podporuje sekreci IL-12, který je významný při odstraňování patogenů uvnitř buňky. 23 Dále tento cytokin zvyšuje expresi MHC molekul II. třídy, a tím prezentaci antigenů T lymfocytům. IFN také kontroluje proliferaci a má cytolytické účinky. 1 Významnou roli při regulaci má také produkce cytokinů ovlivňujících funkce T H 1 a T H 2 buněk. T H 1 lymfocyty produkují IFN, tím sniţují počet T buněk diferencujících do 17

18 jater. 30 Schématické zobrazení způsobů likvidace nádorové buňky NK buňkou je T H 2 lymfocytů 24 a dochází k rozpoznávání patogenů a obraně organismu proti virům. 22 V neposlední řadě je třeba zmínit produkci dalších cytokinů: TNF a TNF, GM-SCF (z angl. Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor), IL-2, který stimuluje růst a IL-3 stimulující hemopoetické prekurzory. 1 Cytokiny produkované NK buňkami v periferní krvi mohou mít důleţité funkce v děloţní tkáni. Kromě svého vlivu na trofoblasty hrají také zásadní roli při regulaci dalších typů děloţních buněk. 25 Na příkladu procesu tolerance ve vztahu matka-plod se ukazuje, jak je organismus matky schopen uţivit plod. Studie prokázaly, ţe během těhotenství se NK buňky v těle matky tvoří ve zvýšeném mnoţství. Embryonální trofoblasty, tvořící kontakt mezi buňkami matky a plodu, exprimují neklasické molekuly MHC I. třídy, HLA-G, které slouţí jako ligandy pro NK receptory a inhibují NK buňky. 26, 27 Tím je plod chráněn před poškozením. Protinádorová aktivita NK buněk Na boji s abnormálními a nádorovými buňkami se podílí jak dendritické a cytotoxické T buňky, tak i NK lymfocyty. Cytotoxické mechanismy, které umoţňují NK buňkám ničit nádorové buňky, jsou: cytotoxické granule s perforinem a granzymy, dále navození apoptosy přes receptory smrti 1 a třetí mechanismus, zatím nejméně prostudovaný, vyuţívá molekuly oxidu dusnatého. Cytotoxická aktivita NK buněk je silně indukována cytokiny (např. IL-2 a IL-12) a to je úzce spojeno se syntézou molekuly NO. Ukazuje se, ţe NO je nejen zprostředkovatelem zabíjení cílových buněk pomocí NK buněk, ale také hraje důleţitou roli v regulaci NK buněčné aktivity. 28 Je prováděna řada studií zabývajících se protinádorovou léčbou. V oblasti imunoterapií se vyuţívá aktivace endogenních NK buněk a buněk dárce aktivovaných ex vivo, nebo protilátek jako nosiče léčiv či toxinů. 29, 1 Úspěchy byly pozorovány také při vyuţití LAK buněk (z angl. Lymphokine Activated Killer Cell) při léčbě karcinomů plic a znázorněno na obr. 4, str. 19. NK lymfocyty mohou vyuţít cesty exocytosy granul obsahujících perforin a granzymy. Po několikaminutové interakci efektor-nádorová buňka se cytotoxické granule přeorientovávají směrem k nádorové buňce a jejich obsah se vylučuje do intercelulárního prostoru mezi efektorem a nádorovou buňkou cestou závislou na vápníkových iontech. Tato granula obsahují perforin, který porušuje membránu 18

19 nádorové buňky a dovoluje vstup serinových proteas (granzymů). Dva nejrozšířenější granzymy (A a B) byly pouţity v zprostředkované apoptóze cílových buněk cestou závislou i nezávislou na kaspasach. Signalizace prostřednictvím aktivačních receptorů vzbuzuje tuto aktivitu, kdeţto inhibiční receptory tomu brání. (obr. 4a). Další moţností je pouţití receptorů smrti. Některé NK buňky exprimují Fas ligand nebo TRAIL, které se váţí na příslušné receptory přítomné na nádorových buňkách Fas receptor, resp. TRAIL receptor. Tato interakce způsobuje apoptosu nádorových buněk. Protein c-flip blokuje indukci apoptosy probíhající touto cestou (obr. 4b). Třetí mechanismus zničení nádorové buňky je prostřednictvím oxidu dusnatého (obr. 4c). NK buňky vylučují řadu efektorových molekul, jako například IFN-. Ten uplatňuje protinádorové funkce mnoha různými způsoby. Oxid dusnatý, NO, je jednou z nejsilnějších efektorových molekul imunitního systému a dokáţe regulovat cytotoxickou aktivitu NK buněk. Je produkován indukovatelnou synthetasou oxidu dusnatého, inos, která je indukována cytokiny IFN- a TNF. 31 Obr. 4: Efektorové funkce NK buněk eliminující nádorové buňky (upraveno dle 31 ): a) Cesta exocytosy granul obsahujících perforin a granzymy, b) pouţití receptorů smrti, c) způsob likvidace nádorové buňky prostřednictvím oxidu dusnatého, NO. 19

20 2.3. Receptory NK buněk NK buňky exprimují na svém povrchu inhibiční receptory specifické pro molekuly MHC I. třídy a aktivační receptory s různou specifitou. Tyto povrchové molekuly zprostředkovávají kontakt NK lymfocytu s okolím. Rozdělením receptorů podle struktury získáváme dvě velké rodiny receptorů imunoglobulinová rodina, do které patří receptory KIR (z angl. Killer Inhibitory receptors) a rodina lektinů C-typu. 32 Inhibiční receptory Oslabení či ukončení některých imunitních odpovědí není dáno pouze ztrátou aktivačních signálů. Jak jiţ bylo naznačeno dříve, konečná funkce NK buňky je dána rovnováhou mezi pozitivními a negativními signály. Jako příklad můţeme uvést bilanci mezi receptory obsahující sekvenci ITAM s receptory zahrnující motiv ITIM (z angl. Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibitor Motif), kde výsledkem můţe být sníţená nebo chybějící buněčná odpověď. 33 Inhibiční receptory obsahují ve své cytoplasmatické části jeden či více motivů ITIM Jedná se o sekvenci (I/V/L/S)-X-Y-X-X-(L/V), kde X označuje jakoukoliv aminokyselinu. Inhibiční aktivita těchto receptorů je z velké části dána interakcí mezi fosforylovanými tyrosinovými zbytky a cytoplasmatickými efektory. Fosforylace tyrosinů v sekvenci ITIM probíhá pomocí proteinkinas z rodiny Src. Fosfotyrosin můţe následně doplnit jeden ze dvou negativních regulátorů obsahujících SH2 doménu - inositol fosfatásu SHIP, nebo tyrosin fosfatasu SHP1. Některé motivy ITIM se váţí na jiné tyrosin fosfatasy SHP2. Tato signalizační cesta je však zatím nejméně prozkoumána. Výsledkem celého 33, 34 procesu je inhibice cytotoxicity NK buněk a vylučování cytokinů. Specifickými ligandy těchto receptorů jsou molekuly MHC I. třídy. Jsou známé tři rodiny receptorů, které jsou spojovány s NK buněčným rozpoznáváním MHC I. molekul Ly49, CD94/NKG2 a rodina KIR. 35 Molekuly Ly49 jsou membránové glykoproteiny II. druhu rodiny lektinů C-typu. Na povrchu NK buněk a paměťových T lymfocytů jsou exprimovány jako homodiméry. Různé formy této molekuly rozpoznávají celou řadu potkaních molekul MHC I. Lidské molekuly MHC se nazývají HLA (Human Leukocyte Antigen). Odlišné lidské KIR molekuly rozeznávají polymorfní epitopy na molekulách HLA-A, -B a C. Heterodimér CD94/NKG2 se nachází jak na lidských, tak i na myších 20

21 buňkách a rozpoznává molekuly HLA-E, resp. myší Qa1 b molekuly. 33 Mezi inhibiční receptory také patří potkaní NKR-P1B, který je studován v této diplomové práci. Aktivační receptory Aktivace většiny imunitních buněk nastává pomocí povrchových buněčných receptorů, jejichţ antigen rozpoznávající nebo ligand vázající podjednotky nekovalentně interagují s jednou či více transmembránových adaptorových molekul (např. DAP12, CD3 aj.). Adaptory obsahují krátkou extracelulární oblast, dále transmembránovou část a cytoplasmatický úsek o různé délce. Ve spojení s receptorem T buněk (TCR), B- lymfocytů, některými aktivačními receptory NK buněk či Fc receptory mají adaptorové molekuly za úkol přenášet signály těmto molekulám. Důleţitou součástí adaptorů je aktivační motiv ITAM, jehoţ sekvence je YXXL/I(X 6-8 )YXXL/I, v níţ X označuje jakoukoliv aminokyselinu. Hlavní funkce receptorů je aktivace protein tyrosin kinas PTK z rodiny Src. Ta vede k fosforylaci obou tyrosinů v sekvenci ITAM, coţ dává podnět k aktivaci signalizační dráhy vyuţívající SH2 doménu s tyrosin kinasami Syk a ZAP-70. V závislosti na zralosti buňky nebo na druhu její specifity mohou tyto signalizační kaskády vyústit v procesy podporující vývoj buňky, buněčnou smrt či naopak přeţití buňky, nebo ve spuštění funkce efektorů zahrnující produkci cytokinů a buněčnou cytotoxicitu. 33 K aktivačním receptorům můţeme zařadit molekuly NKp30, NKp46, a NKG2D 36, dále lidské receptory CD69 37 a CD94/NKG2C 32 a potkaní NKR-P1A 38 zkoumaný v této diplomové práci. Receptory imunoglubulinové rodiny Receptory patřící do imunoglobulinové superrodiny jsou kódovány rozsáhlým genovým komplexem, tzv. LRC (z angl. leukocyte receptor complex) na chromosomu 19q , 40 Zahrnují především molekuly KIRs a NCRs ( z angl. Natural Cytotoxicity Receptors). Mezi NCR receptory patří aktivační proteiny Nkp46 (lidský a myší), Nkp44 (lidský) a Nkp30 (lidský a neexprimovaný myší pseudogen). 41 Receptory KIR jsou lidskými receptory a jsou exprimovány na NK i T buňkách. Jedná se o transmembránové glykoproteiny I. třídy, které se podle počtu imunoglobulinových domén v extracelulární části dělí do dvou skupin KIR2D (se dvěma doménami) a KIR3D obsahující tři domény. Cytoplasmatická oblast KIRs je ve své délce variabilní, a proto některé receptory mají krátkou cytoplasmatickou doménu (KIR2DS, 21

22 KIR3DS), jiné naopak dlouhou (KIR2DL a KIR3DL) s přítomným inhibičním motivem ITIM. Molekuly s krátkou cytoplasmatickou doménou obsahují ve své transmembránové části Lys zbytek, který je zapotřebí při případné interakci s adaptorovým proteinem DAP Ligandy pro KIRs jsou klasické molekuly HLA-A, -B a C. Dalším systémem receptorů, schopných rozpoznávat tyto molekuly, je CD94/NKG2 patřící do rodiny lektinů C-typu. 42 Receptory KIR jsou monomerní a specifické pro celou řadu molekul MHC I. třídy. 43 Lektiny a lektinové receptory C-typu Definice lektinů byla poprvé vyslovena v roce 1980 skupinou kolem I. J. Goldsteina z University v Michiganu. Lektiny (z latinského legere = zvolit si) se vymezují jako glykoproteiny nebo proteiny schopné vázat sacharidy, původ takovýchto molekul je neimunní a mezi jejich schopnosti patří shlukování buněk anebo precipitace glukokonjugátů. 44 Lektiny ale nepatří do skupiny protilátek, jelikoţ nemají imunoglobulinovou strukturu 45, a neřadí se ani mezi enzymy, protoţe vazbou na sacharidy nemění jejich strukturu. Schopnost lektinů vázat sacharidové struktury je dána polypeptidovým úsekem v jejich molekulách, tzv. sacharid rozpoznávající domény CRD (z angl. Carbohydrate Recognition Domain). 46 Lektiny se vyskytují v rostlinách, bakteriích i ţivočiších, mohou se rozpouštět v některých biologických tekutinách (př. konkanavalin A) nebo se nachází vázané na membránu (např. lektiny z králičích či potkaních jater). 44 Ţivočišné lektiny mají široké pole působnosti podílí se na buněčných interakcích, přenosu proteinů i mechanismech obrany. 45 Pojmenovaní lektinů C-typu vzniklo na základě skutečnosti, ţe jejich CRD domény potřebují ke své aktivitě přítomnost vápenatých kationtů Ca 2+ (z angl. Calcium-dependent lectins). Takové CRD oblasti obsahují místa (kapsy) na vazbu Ca 2+, která jsou nezbytná pro navázání sacharidových ligandů. V CRD doméně C-lektinových receptorů se nachází lektinová rýha ve formě dvou antiparalelních skládaných listů a dvou helixů. 47 Sekvenční motiv domény je dán aminokyselinami, kde 14 jich je neměnných a 18 z nich je vysoce konzervovaných. 48 Existuje však i velká rodina receptorů postrádajících úseky pro vazbu vápenatých iontů a následné moţné interakce se sacharidovými strukturami. Tyto proteiny mají tzv. CTLDs (z angl. C-Type Lectin-Like Domains), které jsou evolučně a strukturně odlišné od CRDs klasických lektinů C-typu. C-terminální 22

23 domény receptorů NK buněk se podle tohoto principu pojmenování nazývají NK buněčné domény, NKD (z angl. NK cell domains) a jsou zástupci podrodiny CTLDs. 46 Receptory rodiny lektinů C-typu patří mezi integrální membránové proteiny II. typu a jsou exprimovány na NK buněčném povrchu.. Genový komplex zodpovědný za produkci takovýchto receptorů se nazývá NK komplex, NKC (z angl NK complex). Je 46, 49 lokalizován na chromosomu 12 u lidí, u myší na 6. a u potkanů na 4. chromosomu. Schématické znázornění podoby lektinového receptoru C-typu je na obr. 5. Tyto receptory mohou být na povrchu NK buněk exprimovány i jako heterodimery (např. NKG2A/CD94). C-terminální část s CRD doménou leţí vně buňky, přes oblast tzv. krčku, obsahujícího disulfidové můstky, je spojena s transmembránovou částí a dále s vnitrobuněčnou N- terminální sekvencí podílející se na signalizačních mechanismech. 46 Ty se uskutečňují prostřednictvím protein tyrosin kinas (např. Syk), protein fosfatas či asociací s některými adaptorovými molekulami (DAP10, DAP12, FcR řetězec). Výsledkem je přenos aktivačních nebo inhibičních signálů NK buňce, na které jsou příslušné receptory vylučovány. 50 Obr. 5: Struktura homodimerního receptoru rodiny lektinů C-typu (upraveno dle 46 ) CRD doména (červeně), na kterou se mohou vázat sacharidové struktury leţí vně buňky, oblast krčku obsahuje cystein(y) odpovědné za dimerizaci, N-terminální část se nachází v intracelulárním prostoru a hraje důleţitou roli při signalizaci. Do skupiny receptorů produkovaných NK genovým komplexem patří rodiny NKR-P1 (u lidí, potkanů i myší), Clr, NKG2 (lidské a potkaní), CD94 (u lidí) a Ly49 (myší a potkaní). 49, 51 Všechny zmíněné skupiny kromě Clr kódují jak aktivační, tak inhibiční receptory NK buněk. Mezi inhibiční molekuly se řadí Ly49, kdeţto NKG2D je aktivačním receptorem, který je podle nejnovějších studií schopen rozpoznat stresové ligandy H-60 a Rae1, jenţ jsou předkládany na povrchu nádorových nebo virem infikovaných buněk

24 Rodina Ly49 se skládá nejméně z třinácti členů Ly49A-J a Ly49-L, -O a P. 52 Jedná se o homodimerní transmembránové glykoproteiny II. typu specifické pro molekuly MHC I. třídy. Ligandy Ly49 proteinů jsou molekuly H-2 I. třídy. 53,54 Další zajímavou skupinou lektinů C- typu tvoří molekuly CD94/NKG2. Pracovní kolektiv L.L.Laniera dokázal, ţe lidské NKG2 receptory mohou tvořit disulfidicky vázané heterodimery s dalšími členy superrodiny lektinů C-typu, proteiny CD Invariantní částí tohoto heterodimeru je molekula CD94, která patří mezi integrální membránové proteiny II. typu a která má velmi krátkou intracelulární část bez signalizační sekvence. Protein CD94 se váţe na několik isoforem svého vazebného partnera - NKG2A, -B, -C, -E. NKG2D má odlišnou homologii neţ ostatní členové rodiny, a proto nepodléhá asociaci s CD Rodina lidských proteinů NKG2 se skládá ze sedmi členů NKG2A-F a isoforma H. Jak bylo naznačeno výše, pro svou odlišnost je NKG2D z této velké rodiny vyčleňován a je představitelem vlastní skupiny lektinů C-typu. Aktivačními členy rodiny NKG2 jsou isoformy C, popř. E, -F a H. Obsahují nabitý aminokyselinový zbytek v transmembránové doméně, který zprostředkovává interakci s adaptorovou molekulou DAP12 obsahující motiv ITAM. Naopak receptory NKG2A a B v sobě nesou inhibiční motiv ITIM. 56 Receptory CD94/NKG2 jsou vylučovány na povrchu NK buněk a na CD8 + T lymfocytech a jejich ligandy jsou neklasické molekuly HLA-E třídy I

25 3. Receptory rodiny NKR-P1 Hlavní roli jak ve vrozené imunitě, tak i ve vyvolání adaptivní imunitní odpovědi hrají NK a NKT buňky. Jejich genový NK komplex kóduje molekuly NKR-P1 (CD161), které slouţí jako fenotypové ukazatele obou druhů buněk a účastní se jejich regulačních funkcí. Mechanismus aktivace a signalizační pochody proteinu NKR-P1 jsou zatím stále málo prozkoumané. 57 Molekuly NKR-P1 byly poprvé nalezeny pomocí myší protilátky mab, 3.2.3, která je schopná rozpoznávat disulfidicky vázaný homodimer na NK buňkách potkanů, T buňkách a granulocytech. 57 Později byly objeveny i na dendritických buňkách. 58 Pouţitím takové vhodné protilátky a receptoru NKR-P1 dochází k indukci produkce IL-1 a IL-12 monocyty, resp. dendritickými buňkami. To napovídá skutečnosti, ţe povrchové receptory NKR-P1 mohou hrát důleţitou roli při aktivaci a funkci některých buněk imunitního systému. 59 Dlouho byly známé tři druhy NKR-P1 receptorů, A, -B a C, v C57BL/6 NK buňkách myší. V roce 2001 Plougastel a spolupracovníci získali klonováním další tři členy této rodiny proteinů isoformy D, -E a F. 60 NKR-P1B nese ve své cytoplasmatické části inhibiční motiv ITIM, můţe být exprimován bez molekuly adaptoru a předpokládá se, ţe slouţí jako inhibiční receptor. 49 Produkty A a C naopak nemají motiv ITIM a pravděpodobně jsou vylučovány pouze v asociaci s adaptorovými molekulami nesoucími ITAM (např. FcR v případě NKR-P1C). 61 Pro isoformu C byla přímo prokázaná jeho aktivační schopnost. 62 U lidí existuje pouze protein NKR-P1A exprimovaný na NK a T buňkách Struktura molekuly NKR-P1 Protein NKR-P1 spadá do superrodiny lektinů C-typu. Spolu s dalšími členy této skupiny (molekuly NKG2, Ly49 nebo CD69) je kódován NK genovým komplexem a na povrchu buněk se vyskytuje jako homodimer spojený disulfidovým můstkem. Velikost kaţdé podjednotky je přibliţně 30 kda. Celková sekvence molekuly potkaního NKR-P1 obsahuje 223 aminokyselin, N-terminální intracelulární signální sekvence a transmembránová doména spolu tvoří prvních 65 aminokyselin, následuje oblast krčku o 25

26 délce přibliţně 50 AMK, extracelulární doména příbuzná CRD lektinů C-typu kódující 101 AMK a krátká C-koncová část (obr. 6). 64 Intracelulární část struktury receptoru NKR-P1 obsahuje konservované tyrosinové a serinové zbytky, které mohou podléhat fosforylaci a být tak prostředníkem signalizačních cest. 64 Podle sekvenčních analýz bylo zjištěno, ţe cytoplasmatická doména potkaního a myšího NKR-P1 obsahuje motiv Cys-X-Cys-Pro, jenţ se objevuje také u receptorů CD4 a CD8. U nich zajišťuje interakci s dalším párem Cys na N-konci protein tyrosin kinas rodiny Src (p56 lck ). Zhruba do poloviny 90.let nebyla funkce vazby proteinu NKR-P1 na p56 lck známá. Molekulárně biologické a biochemické metody ukázaly, ţe integrita cysteinových párů u obou vazebných partnerů sehrává kritickou úlohu v zprostředkování interakce. Výsledky experimentů nasvědčují slabší asociaci mezi molekulami NKR-P1 a p56 lck v porovnání s interakčními dvojicemi p56 lck -CD8 a p56 lck -CD4. To svědčí o vyšší hranici aktivace u molekul NKR-P1 a CD8, které se účastní cytotoxických mechanismů, v porovnáním s receptorem CD4 zapojený do funkce pomocných T buněk (T H ). 65 Obr. 6: Schématický diagram struktury rnkr-p1 (upraveno dle 66, 67 ) v intracelulární části se nachází N-terminální sekvence začínající methioninem, následuje transmembránová doména, extracelulární oblast obsahující tzv. krček a doménu vázající ligandy. Na obrázku jsou znázorněné i intramolekulární disulfidické vazby a čtyři nevázané cysteiny odpovědné za dimerizaci proteinu NKR-P1. Extracelulární lektinová doména, odpovědná za vazbu sacharidů, receptoru rnkr- P1 obsahuje vazebnou rýhu, která se rozkládá po celé vazebné doméně. Vazebná rýha zaobírá plochu od oblasti domény blíţe membráně, určené pro vazbu neredukujícího konce chitotetraosy, po část domény vázající redukující ManNAc v oblasti vzdálené od membrány. Ve vazbě monosacharidů hraje závaţnou roli poloha neredukující GlcNAc. 66 Vazebná rýha je lemována několika aminokyselinami, které jsou přímo zapojeny do vazby sacharidů. 46 Isoformy proteinu rnkr-p1a a B se liší v několika aminokyselinách a podstatná je záměna dvou z nich. Val 177, který tvoří hydrofobní interakci s N-acetylem na GlcNAc, je u NKR-P1B nahrazen Ala 177. Druhou substitucí je Asn 179 v isoformě B za 26

27 Ser 179 u rnkr-p1a. Tato náhrada nejspíše sehrává důleţitou úlohu v odlišnosti vazebných schopností obou forem receptoru. Větší postranní řetězec Asn 179 v porovnání s malou OH skupinou Ser 179 by mohla stericky bránit vazbě oligosacharidů a komplexnějších sacharidových ligandů Funkce receptoru NKR-P1 Rodina receptorů lektinů C-typu má v imunitním systému široké uplatnění. Jedná se o velmi rozsáhlou skupinu proteinů s různými funkčními a strukturními vlastnostmi. Například mezi nejdůleţitější úlohy selektinů patří zprostředkování buněčné adheze a migrace buněk, kdeţto skupina receptorů manosového druhu se specializuje na vazbu a vychytávání patogenních látek. 68 Receptory NKR-P1, jakoţto povrchové molekuly NK buněk, se účastní rozpoznávání antigenů (např MHC molekuly I. třídy) i produkce celé řady cytokinů (např IFN, IL-3). 69, 1 Dvě hlavní funkce proteinů rodiny NKR-P1 jsou funkce aktivace a inhibice cytotoxických pochodů. Ukázalo se, ţe funkce receptorů není určená pouze rozdíly v cytoplasmatických doménách, ale velmi důleţitá je i glykosylace ligandů, která můţe výrazně ovlivnit uplatnění receptorů lektinového typu. 68 NKR-P1 má schopnost rozpoznávat jak sacharidové struktury na povrchu eukaryotických buněk (nádorové buňky), tak i mikrobiální sacharidy, které jsou důleţité pro rozeznání a spuštění imunitních signalizačních drah. 70 Navzdory tomu, ţe potkaní NKR-P1A a B jsou z 93 procent shodné ve své aminokyselinové sekvenci, jejich funkce v NK buněčné signalizaci je opačná. 63 Zatímco NKR-P1A stimuluje po vazbě ligandu (např. protilátky) cytotoxické pochody, tvorbu inositoltrifosfátu (jakoţto druhého posla), následnou mobilizaci intracelulárního vápníku, aktivitu kinas, produkci cytokinů a degranulaci cytotoxických granulí NK buněk, NKR-P1B inhibuje cytotoxickou aktivitu. 64, 71 Studie z roku 1999 prokazuje, ţe aktivace molekuly NKR-P1B vyvolává signalizační děj spojený s tyrosin fosfatasou SHP1, která je negativním regulátorem a která inhibuje aktivaci NK buněk. To společně se skutečností, ţe receptor NKR-P1B obsahuje v cytoplasmatické doméně motiv ITIM, svědčí o tom, ţe se jedná o inhibiční molekulu. 72 Stále však zůstává nejasné, jakým způsobem jsou odlišné signalizační pochody zprostředkovávány na molekulární úrovni. 71 Existují studie upozorňující na asociaci receptoru NKR-P1 s dalšími molekulami. Prvním příkladem můţe být spojení NKR-P1 s FcR řetězcem, jenţ je nezbytnou sloţkou 27

28 Fc receptoru pro IgG a IgE. Tato asociace nezávisí na komplexech Fc receptoru a je podstatná pro aktivaci NK buněk prostřednictvím molekuly NKR-P1. 73 Schopnost receptoru NKR-P1 způsobit řadu biologických reakcí v NK buňkách by mohla být spojená s vnitrobuněčnými signalizačními cestami, které by se spouštěly po vazbě ligandu na NKR-P1. V membráně NK buněk potkanů jsou přítomny různé G proteiny a některé z nich mohou být součástí signalizačních kaskád v NK buňkách. Taková asociace receptoru NKR-P1 s heterotrimerními G proteiny (tři podjednotky -, a ) byla prokázaná. 74 V inaktivní formě G proteinu je na podjednotku navázán GDP, kdeţto po aktivaci dochází ke vzniku vazby -GTP a rozpadu heterotrimeru na komplexy -GTP a (obr. 7). Oba tyto heterodimery se mohou vázat na jiné enzymy. Podjednotka se sdruţuje s adenylatcyklasou (AC) či fosfolipasou C (PLC) za tvorby druhých poslů camp (cyklický adenosinmonofosfát), resp. IP 3 (inositoltrifosfát) a DAG (diacylglycerol). Na druhé straně komplex můţe aktivovat nejen PLC 2 a 3, AC, fosfatidylinositol-3 kinasu (PI 3 K), sloţky MAPK signalizační kaskády, ale i iontové kanály. 74, 75 Významné je také působení G proteinů v zprostředkování potkaní NK buněčné lýze nádorových buněk. Na závěr lze říci, ţe podrobnější zkoumání spojení receptoru NKR-P1 s G proteiny nám můţe dopomoci k pochopení rozmanitých biologických funkcí této rodiny proteinů v NK buňkách. 74 Obr. 7: Signalizační cesty zprostředkované sdružením receptorů s G proteiny (upraveno dle 75 ) Po vazbě ligandu (A) na receptor (R) dochází k usnadnění spojení aktivačního receptoru (R * ) s intracelulárním heterotrimerním G proteinem. Komplex R * -G protein podporuje výměnu GDP na GTP na podjednotce. Tím je způsoben také rozpad celku na komplexy -GTP, a R *. V této situaci jsou obě heterodimerní podjednotky přístupné pro modulaci aktivity širokého spektra efektorů. Ukončení signalizace nastává v okamţiku, kdy vnitřní GTPasová aktivita podjednotky způsobí odstranění -fosfátu z GTP. Na podjednotce zůstává GDP a toto spojení se znovu sdruţuje s komplexem a cyklus se uzavírá. Proteiny RGS urychlují vnitřní GTPasou aktivitu podjednotky, čímţ krátí trvání signalizačních pochodů. 28

29 3.3. Ligandy a vazebná afinita receptoru NKR-P1 Rozpoznání cílové buňky a přenos aktivačního či inhibičního signálu je dán interakcemi mezi různými oligosacharidovými strukturami a NKR-P1 receptory na povrchu NK buňky. NK buněčný receptor protein 1 se řadí mezi molekuly schopné vázat sacharidy vyuţitím své extracelulární lektinové domény závislé na vápníku. 76 Původní biochemická studie ukázala v případě receptoru NKR-P1A, ţe přítomnost vápenatých iontů je nezbytná pro správné sbalení tohoto proteinu in vitro. Vápník tvoří součást vazebné domény ve formě jeden mol navázaného vápníku na jeden mol domény. Při neutrálním ph je Ca 2+ silně spojený s proteinem a jen malá část můţe být oddělena pomocí chelatačních činidel, např. EDTA. NKR-P1 můţe být odvápněn v kyselém i zásaditém prostředí s následkem ztráty vazby sacharidů. 46 V podmínkách ph=8 dochází k obnovení interakce mezi Ca 2+ a proteinem a opětovnému získání schopnosti vázat sacharidové struktury. 64 Studiem zkrácených rozpustných forem proteinu NKR-P1 byla zjištěna vazba na následující monosacharidy: GalNAc, GlcNAc, Fuc, Gal, Man. 64 Pro potkaní NKR-P1A a B se ukázalo, ţe mají podobnou afinitu k monosacharidovým ligandům, kde nejlepším ligandem v obou případech je ManNAc. Na druhé straně afinita NKR-P1B k některým oligosacharidům a glykodendrimerům je mnohem niţší neţ pro isoformu A. 66 Inhibiční síla ligandů je dána pořadím ManNAc >> GalNAc >> GlcNAc >> Fuc >> Man > Gal. Hexosaminy získané de-n-acetylací zmíněných monosacharidů jsou špatnými ligandy, kdeţto dodatečný hydrofobní aglykon výrazně zvyšuje vazbu, hlavně v případě -O-glykosidického spojení. 46 V porovnání s monosacharidy jsou afinity k některým N-acetylhexosaminovým oligosacharidům výrazně vyšší, kde nejintenzivnější vazby tvoří chitotetraosy. 70 V nedávných letech byly vyvinuty nové, vysoce afinitní ligandy pro protein NKR-P1. Jedná se o syntetické sloučeniny zaloţené na polyamidoaminovém či polylysinovém skeletu, ke kterému se prostřednictvím pevné glykosidické vazby váţe -N-acetyl-D-glukosamin. Experimenty bylo prokázáno, ţe takové glykodendrimery jsou vhodnými ligandy pro NKR-P1 in vitro. 46, 77 Obdobně, jako je tomu u ligandů zaloţených na struktuře GlcNAc, mohou i tyto vysoko afinitní sloučeniny vykazovat značně silnou odezvu při protinádorové léčbě in vivo

30 Studovanými ligandy pro inhibiční receptory NKR-P1B a -D jsou také Ocil/Clr (osteoclast inhibitory lectin/c-type lectin-related) proteiny, které jsou k receptorům NKR-P1 vázány v NK genovém komplexu. Exprese Ocil/Clr molekul na nádorových buňkách myší inhibuje NK buněčné zabíjení. Inhibice můţe být zastavena novou protilátkou mab (4A6) specifickou pro Ocil/Clr. 38 Zkoumání a poznání různých ligandů receptoru NKR-P1 je důleţité z hlediska získání informace a znalosti pro pochopení jeho úlohy, významu a fungování v přírodě. 30

31 4. Kvasinka Pichia pastoris a její expresní systém Kvasinka Pichia pastoris je spolu s dalšími methylotrofními kvasinkami ve středu pozornosti jak vědy, tak i průmyslu. Jedním z hlavních důvodů je studium regulace genové exprese za indukce methanolem. Methanol přísně kontroluje produkci genu kódující alkohol oxidasu, která je prvním enzymem v metabolismu methanolu. Druhým moţným bodem sledování v methylotrofních kvasinkách je způsob, jakým jsou některé enzymy (např alkohol oxidasa, katalasa) přemisťovány do peroxisomů. V oblasti průmyslu jsou tyto eukaryotní organismy vyuţívány na výrobu kvasinkové biomasy či produkci SCP (z angl. Single Cell Protein) Přehled historie expresního systému Pichia pastoris Schopnost P. pastoris vyuţívat methanol, jakoţto alternativní zdroj uhlíku a energie, byla poprvé popsána před více neţ 40 lety pracovní skupinou Koichi Ogaty. 80 Prvoplánově byla Pichia pastoris určena na výrobu SCP společností Phillips Petroleum Company z důvodu nízké ceny methanolu. Nicméně pro nepříznivou ekonomickou situaci (ropná krize a náhlý nárůst cen methanu, z kterého lze syntetizovat methanol) nebyl tento projekt realizován. Proto v 80. letech minulého století uzavřeli Phillips Petroleum Company a Salk Institute Biotechnology/Industrial Associate Inc. (SIBIA) smouvu o vývoji P. pastoris slouţící jako expresní systém heterologních proteinů. 81 Zájem o pouţívání této kvasinky na produkci rekombinantních proteinů pramení z její schopnosti růst do vysokých hodnot buněčných hustot v jednoduchém médiu společně s jinými proteiny, které jsou exprimovány v početném mnoţství pouze, pokud je v tomto médiu přítomen methanol. Jeden z vysoce exprimovaných proteinů při pouţití média s methanolem je enzym alkohol oxidasa 1 (AOX1). Naopak při růstu buněk na glycerolu či glukose se AOX1 nalézá v médiu minimálně. 82 Výzkumníci v SIBIA identifikovali a isolovali promotor i gen AOX1 a vyvinuli kmeny, vektory a metody na molekulárně genetickou maninulaci P. pastoris. 83 V dnešní době je expresní systém této kvasinky komerčně dostupný od firmy Invitrogen. 31

32 4.2. Výhody exprese proteinů v Pichia pastoris Vedle zmíněné moţnosti produkce heterologních proteinů pod přísnou kontrolou silného AOX1 promotoru a schopnosti P. pastoris dosahovat vysokých buněčných hustot v jednoduchém médiu, existují i další přednosti tohoto expresního systému. Na rozdíl od fakultativních aerobních organismů, jako jsou kvasinky Saccharomyces cerevisiae 84, které při nedostatku kyslíku přepínají svůj metabolismus z respirace na kvašení, je při růstu v přítomnosti methanolu P. pastoris obligátní aerob. 85 To můţe být velmi uţitečné během reakcí v bioreaktorech, protoţe se u velkých bioreaktorů často vyskytují lokální zóny s kyslíkem v omezeném mnoţství, coţ, jak se ukázalo, ovlivňuje fyziologické vlastnosti buněk fakultativních organismů a vede k redukci výtěţku biomasy a sníţení produkce rekombinantních proteinů. 86 Mezi další klady P. pastoris patří i skutečnost, ţe pro genetické manipulace jejího expresního systému je potřeba podobných technik, jako je tomu u kvasinky S. cerevisiae, která je jedním z nejlépe charakterizovaných experimentálních eukaryotických systémů v moderní biologii. 83 U kvasinky P. pastoris, jakoţto jednobuněčném organismu, je manipulace a kultivace buněk poměrně snadná. Pichia pastoris je schopná post-translačních modifikací jako jsou proteolytické zpracovávání, skládání proteinů, tvorba disulfidových můstků i glykosylace. To také vysvětluje, proč některé proteiny produkované v bakteriích končí jako inaktivní inklusní tělíska, kdeţto po jejich expresi v P. pastoris se stávají biologicky aktivními molekulami. Obecně se expresní systém P. pastoris pokládá za rychlejší, snadnější a levnější ve srovnání s jinými eukaryotními systémy (např. hmyzí čí savčí buněčné kultury) a také má obvykle vyšší úroveň exprese proteinů Pichia pastoris jako methylotrofní kvasinka Methylotrofní kvasinky, zahrnující druhy Candida, Pichia, Hansenula a Torulopsis, mají metabolismus upravený na zpracování methanolu. Některé z potřebných enzymů jsou lokalizovány ve specializovaných organelách (peroxisomy). Zmíněné druhy kvasinek jsou také schopné metabolizovat glycerol, ethanol a acetát. 87 Metabolismus methanolu začíná v peroxisomech, ve kterých se vyskytují tři klíčové enzymy pro jeho zpracování alkohol oxidasa (AOX), katalasa (CAT) a dihydroxyaceton synthasa (DHAS). Další procesy pokračují v cytosolu a konečným výtěţkem jsou energie a sloţky na tvorbu biomasy (obr. 8, str.33). 81 Peroxisomy jsou pro 32

33 schopnost buňky metabolizovat methanol zásadní, jelikoţ brání vstupu toxických produktů oxidace methanolu do ostatních částí buňky. Prvním krokem v metabolismu methanolu v P. pastoris je jeho oxidace na formaldehyd a peroxid vodíku katalyzovaná enzymem alkohol oxidasa (AOX), akceptorem elektronu je molekula kyslíku (obr. 8). 81 Molekula AOX je homooktamer, kde kaţdá podjednotka obsahuje nekovalentně vázaný FAD (Flavin Adenin Dinukleotid). Enzym AOX má nízkou afinitu k molekule kyslíku a zdá se, ţe methylotrofní kvasinky tento nedostatek vyrovnávají syntézou velkého mnoţství alkohol oxidasy. 83 Alkohol oxidasa P. pastoris je kódována dvěma geny AOX1 a AOX2. Za většinu produkce a aktivity alkohol oxidasy v buňce odpovídá AOX1 gen. Exprese tohoto genu je přísně regulována a indukována methanolem a je kontrolována na úrovni transkripce. Regulace AOX1 genu je podobná regulaci GAL1 genu u kvasinky S. cerevisiae, kde kontrola zahrnuje dva mechanismy represe/de-represe a indukční mechanismus. Na rozdíl od regulace GAL1 genu, podmínky de-represe (např. nepřítomnost glukosy v médiu) nevedou k hojné transkripci AOX1 genu. Je zřejmé, ţe pro indukci přepisu tohoto genu do vyšších úrovní je potřeba přítomnost methanolu. 83 Obr. 8: Schématické zobrazení reakcí v peroxisomech u methylotrofní kvasinky Pichia pastoris (upraveno dle 81 ) AOX, alkohol oxidasa, CAT, katalasa, DHAS, dihydroxyaceton synthasa, GAP, glyceraldehyd-3-fosfát, DHA, dihydroxyaceton 33

34 4.4. Expresní kmeny a produkce proteinů kvasinkou Pichia pastoris U kvasinky P. pastoris existují tři fenotypy expresních hostitelských kmenů Mut + (z angl. methanol utilization plus), Mut S (z angl. methanol utilization slow) a Mut - (z angl. methanol utilization minus). Kmeny s neporušeným AOX1 genem mohou růst na methanolu do vysokých stupňů a označují se jako Mut + fenotypy. U Mut S kmenů jsou AOX1 geny vypnuté, a proto jsou buňky závislé na značně slabším AOX2 genu. Výsledkem je pomalejší růst na methanolu. Dojde-li k deleci AOX1 i AOX2 genu nejsou buňky schopné ţádného růstu na methanolu a nazývají se Mut - fenotypy. Těmto kmenům se dává přednost v případech, kdy methanol není vhodným zdrojem uhlíku. 83 Na kontrolu fenotypu je v expresních kazetách P. pastoris řada sloţek, které umoţňují vypínání AOX1 či obou AOX1 i AOX2 genů během vkládání rekombinantních genů do chromosomu kvasinky. Exprese heterologních proteinů můţe probíhat intracelulárně nebo do produkčního média. Jelikoţ P. pastoris produkuje jen malé mnoţství endogenních proteinů a pouţité médium neobsahuje další proteiny, tvoří heterologní proteiny většinu obsaţených proteinů 88, 89 v médiu. Oddělením ţádaných proteinů od ostatních buněčných komponent lze dosáhnout prvního stupně purifikace. Moţnost sekrece je obvykle omezená na proteiny, které jsou vylučovány jejich nativními hostiteli. Aby byl poţadovaný protein nasměrován na sekreční metabolickou dráhu, vyţaduje produkce přítomnost signální sekvence. S největším úspěchem se vyuţívá -MF faktor (z angl. -mating factor) pre-pro signální sekvence z S. cerevisiae. V některých případech je dokonce lepším sekrečním signálem pro expresi v P. pastoris, neţ vedoucí sekvence nativního heterologního proteinu. 83 Signální faktor se skládá z 19 aminokyselin, tvořících pre- sekvenci, a následné pro- části s 66 aminokyselinami, která obsahuje tři shodná N-glykosidická místa a část pro zpracování Kex2 endopeptidasy. 81 Důleţitým faktorem pro produkci proteinů je volba podmínek kultivace kvasinek. Svou roli tu sehrávají tvar a velikost kultivační nádoby, koncentrace methanolu, ph, sloţení a objem média. Pichia pastoris je schopná rozvoje i za podmínek ph 3-6 bez výrazných změn ve specifickém růstu. Nízké ph eliminuje proliferaci mnoha kontaminujících mikroorganismů a také umoţňuje redukci proteolytické aktivity proteas, uvolňovaných z porušených buněk. Proteolýze lze předcházet i pouţitím média 34

35 obsahujícího pepton či kvasnicový autolyzát, přidáním amoniových iontů nebo L-argininhydrochloridu. Bylo zjištěno, ţe délka indukce působí na stupeň proteolýzy. Rozpad proteinů roste s časem, zatímco počet ţivotaschopných buněk klesá Expresní vektor Pichia pastoris Existuje mnoţství expresních vektorů P. pastoris se širokou škálou genotypových vlastností. Kolektivními charakteristiky jsou přítomnost AOX1 promotoru, následovaný jedním či více restrikčními místy pro vloţení cizího genu a transkripční terminální sekvence z AOX1 genu P. pastoris, který řídí 3 zpracování a polyadenylaci mrnas. Pro sekreci heterologních proteinů se za AOX1 promotorem vyskytuje DNA sekvence, která kóduje sekreční signál. Nejpouţívanější je -MF vedoucí sekvence z S. cerevisiae předcházející klónovacímu místu a vyplývající v sekreci ţádaných genových produktů. 83,90 Dalším společným rysem expresních vektorů je jejich resistence na různé druhy antibiotik. Jedna řada plasmidů (ppic3k a ppic9k) obsahuje gen na resistenci proti kanamycinu. Problémem těchto vektorů je jejich značná velikost ( kb) a následné obtíţnosti při klónování in vitro, a exprese geneticky nestabilních produktů. Druhá skupina vektorů (ppicz, obr. 9, str. 36) nese Sh ble gen ze Streptoallteichus hindustanus. Výhodou tohoto genu je jeho menší velikost (375 bp) a snadnější manipulace. Na rozdíl od proteinů exprimovaných z výše uvedených plasmidů, Sh ble genový produkt má schopnost odolávat antibiotiku zeocinu v E. coli, kvasinkách i jiných eukaryotech. Tento druh vektorů také obsahuje mnohonásobnou klónovací část s několika restrikčními místy pro vloţení cizího genu a sekvence, kódující polyhistidinovou kotvu His 6 a myc epitop, které mohou slouţit jako označení cílových proteinů na jejich C-konci. Ve vektorech s genem pro zeocin jsou expresní kazety obohaceny o místa BamHI a BglII, které umoţňují konstrukci multimerního vektoru

36 Obr. 9: Expresní vektor ppicz P. pastoris 91 : důleţitými sekvencemi jsou 5 AOX1 promotor, signální sekvence -faktor, myc epitop a gen na resistenci proti zeocinu Post-translační modifikace Pichia pastoris Některé nedostatky prokaryotních organismů (např E. coli), jako jsou postrádání endoplasmatického retikula či Golgiho aparátu, vedly k vyvíjení eukaryotních produkčních systému, mezi něţ patří kvasinka Pichia pastoris. Ta má schopnost vykonávat řadu post-translačních modifikací, mezi které řadíme zpracování signálních sekvencí, vytvoření správné konformace exprimovaného proteinu, tvorbu disulfidových vazeb a N- a O-glykosylace. Glykosylace sekrečních eukaryotických proteinů kvasinkou P. pastoris se liší od glykosylace ve vyšších organismech. U savců jsou O-vázané oligosacharidy sloţeny z mnoha druhů cukerných zbytků, např. N-acetylgalaktosamin (GalNAc), galaktosa (Gal) či kyseliny sialové (NeuAc). Na druhé straně, niţší eukaryota, jako je P. pastoris, vykonávají O-glykosylaci sloţenou pouze z manosových zbytků (Man). 81 Oligomanosové jednotky mohou být připojené -1,6 k -1,3 manose v Man -1,3-Man -1,4-GlcNAc 2 sacharidovém jádru. Výsledkem je rozmanitá heterogenita struktury proteinů. 90 Je zřejmé, ţe různí hostitelé mohou připojovat O-vázané cukerné sloţky na různé zbytky v jednom proteinu. Nesmíme však předpokládat, ţe jelikoţ není protein O-glykosylován svým přirozeným hostitelem, nebude ho glykosylovat i P. pastoris. Naopak bylo objeveno, ţe tato kvasinka připojuje O-vázané manosové zbytky k přibliţně 15% exprimovaného lidského IGF-I (z angl. Insulin-Like Growth Factor I), ačkoliv tento protein není v lidském 36

37 organismu glykosylován. 83 Mimoto se nemůţe povaţovat za samozřejmé, ţe vybrané Ser a Thr zbytky pro O-glykosylaci kvasinkou P. pastoris budou stejné, jako je tomu v původním hostiteli. 81 Způsob N-glykosylace je u P. pastoris také jiný, neţ je tomu u vyšších eukaryot. Savčí Golgiho aparát zajišťuje sérii zkracovacích a elongačních reakcí, které vytváří komplexní oligosacharidy, kdeţto buňky Pichia poskytují manosové struktury aţ do velikosti 40 manosových zbytků. 92 Tato hyperglykosylace se podobá té, která byla pozorována u S. cerevisiae. Produkty glykosylace v P. pastoris jsou však oligosacharidy o mnohem menší délce, neţ je tomu u kvasinky S. cerevisiae. 93 I přes společné znaky se sacharidovými strukturami proteinů produkovaných S. cerevisiae, byly u P. pastoris vypozorovány nejméně tři rozdíly. První z nich je častá absence hyperglykosylace. Pouţitím technik na analýzu sacharidů bylo zjištěno, ţe charakteristickými vnějšími řetězci proteinů z P. pastoris jsou Man 8 GlcNAc 2 nebo Man 9 GlcNAc 2. Druhým zajímavým rozdílem je nezpůsobilost P. pastoris zapojovat -1,3 manosu k řetězcům oligosacharidů. Tato absence terminální -1,3-manosylace je v kontrastu s oligosacharidy S. cerevisiae, kde je tento druh zakončování sacharidového řetězce běţný. Poslední odlišností je přítomnost -1,6-vázané manosy k strukturám invertasy sekretované P. pastoris a dalším 81, 83 proteinům. Dlouhé N-vázané manosové zbytky připojované k proteinům kvasinkami představují podstatný problém ve vyuţití sekretovaných proteinů ve farmaceutickém průmyslu. Hypermanosylace produkovaných glykoproteinů ruší tok reakcí na výrobu a zpracování exprimovaných heterologních glykoproteinů a vede k sekreci terapeutických proteinových činidel, které jsou velmi rychle odstraňovány z krevního řečiště z důvodu přítomnosti terminálních manosových zbytků. 92 Rozsáhlé N-glykosylované řetězce jsou potencionálními překáţkami v procesu správného sbalení a funkce heterologního proteinu

38 II. Cíle diplomové práce Příprava expresního vektoru obsahujícího DNA kódující extracelulární části molekul rnkr-p1a a rnkr-p1b Exprese proteinů rnkr-p1a a rnkr-p1b v eukaryotickém expresním systému Purifikace receptorů rnkr-p1a a rnkr-p1b a jejich příprava na další experimenty v laboratoři 38

39 Experimentální část III. Materiál a přístroje 5. Přístroje Analytické váhy A D, USA Automatické pipety Gilson, USA Centrifuga J-6M Beckman, USA Centrifuga J2-2I Beckman, USA Centrifuga MPW-365 Mechanika Precyzyjna,Polsko Centrifuga Z 382 K Hermle, Německo Centrifuga stolní, Spectrofuge 16M Edison, USA Čtečka destiček Safire TECAN, Rakousko Dialyzační trubice (M r cut off 10000) Sigma, USA Filtry PVDF 0,22 μm Millipore, USA HPLC systém BioSys 510 Beckman, USA Chladnička Zanussi, Itálie Chladnička Skandiluxe, Dánsko Koncentrátory Centriprep, Centricon, Microcon Amicon, USA Kolona Q-Sepharose Pharmacia, USA Kolona Superdex 200 HR 10/30 Pharmacia, USA Kolona Vydac-C4 Dionex, USA Magnetická míchačka MM 2A Laboratorní přistroje Praha, ČR Mrazicí box (-80 C) Ultra Low Revco, USA Mrazicí box (-20 C) Zanussi, Itálie ph metr Φ200 Beckman, USA Předváţky HF1200G A D, USA Souprava pro elektroforesu Sigma, USA Souprava pro ultrafiltraci Sigma, USA 39

40 Spektrofotometr SPEKTROMOM195D MOM, Maďarsko Třepačka Bigger Bill Thermolyne, USA Třepačka na Erlenmayerovy baňky Gallenkamp Ltd., UK Vakuová odparka Speedvac Jouan, Francie Ultrazvuková lázeň KRAINTEK, Slovensko Vortexový mixér VELP Scientifica, Itálie Zdroj deionizované vody MilliQ Millipore, USA Zdroj napětí EPS 500/400 Pharmacia, USA 6. Chemikálie Všechny pouţité chemikálie byly v nejvyšší komerčně dostupné čistotě, minimálně však čistoty p. a. Acetonitril Merck, Německo Agar Oxoid, USA Agarosa Fluka, Německo Akrylamid Sigma, USA APS Sigma, USA Azid sodný Sigma, USA Bacto-tryptone Oxoid, USA Bacto-yeast extract Oxoid, USA Bis-Tris Sigma, USA Bromfenolová modř Sigma, USA BSA Sigma, USA Citrát sodný Lachema, ČR Coomassie Brilliant Blue R-250 Serva, USA Činidlo pro stanovení dle Bradfordové Bio-Rad, Německo dntp set New England Biolabs, USA Dihydrogenfosforečnan draselný Lachema, ČR Dusičnan stříbrný Sigma,USA DTT Fluka, Švýcarsko EDTA Fluka, Švýcarsko Ethidiumbromid Sigma,USA 40

41 Ethylmorfolin Sigma,USA Fenol Sigma,USA Ethanol Lachema, ČR Glukosa Lachema, ČR Glycerol Sigma, USA Glycin Fluka, Švýcarsko Guanidin hydrochlorid Jersey Lab Supply, USA Hydrogenfosforečnan sodný Lachema, ČR Hydroxid sodný Lachema, ČR Chlorid sodný Lachema, ČR Chloroform Lachema, ČR Isoamylalkohol SSSR Isopropanol Lachema, ČR Kyselina chlorovodíková Lachema, ČR Kyselina octová Lachema, ČR Kyselina trifluoroctová Lachema, ČR Methanol Lachema, ČR N,N -methylen-bis-akrylamid Sigma, USA Octan draselný Fluka, Švýcarsko Octan sodný Lachema, ČR PEG 6000 Fluka, Švýcarsko PIPES Sigma, USA PMSF Sigma, USA SDS Jersey Lab Supply, USA Q-Sepharosa Amersham, UK Sorbitol Serva, USA Standard pro SDS-PAGE Serva, USA TEMED Serva, USA TFA Serva, USA Thiosíran sodný Sigma-Aldrich, USA Tris Jersey Lab Supply, USA Uhličitan draselný Sigma-Aldrich, USA YNB Becton, Dickinson&Co, USA 41

42 7. Roztoky a pufry AA směs: 30% akrylamid, 1% N,N -methylen-bis-akrylamid Barvicí roztok pro SDS elektroforesu: 45% MeOH, 10% HAc, 0,25% CBB R-250 Chloroform/isoamylalkohol 24:1 Dialyzační pufr 1: 0,5M NaCl, 10mM Tris, 1mM NaN 3, ph=7,5 Dialyzační pufr 2: 50mM NaCl, 10mM Tris, 1mM NaN 3, ph=7,5 EDTA: 0,5M, ph=8,0 Elektrodový pufr pro SDS elektroforesu: 10mM Tris-Cl, 250 mm glycin, 0,1% SDS, ph=8,3 Ethylmorfolinový pufr: 50mM ethylmorfolin, 10% acetonitril Fenol: nasycený TE pufrem, ph=8,0 Fenol (v TE)/chloroform/isoamylalkohol 25:24:1 Fixační a odbarvovací roztok pro SDS elektroforesu: 35% EtOH, 10% HAc Komerční roztok G1 pro minipreparativní isolaci DNA: 50mM Tris-HCl, ph = 8,0, 10mM EDTA, 100 g/ml RNAsa A Komerční roztok G2 pro minipreparativní isolaci DNA: 200mM NaOH, 1% SDS Komerční roztok G3 pro minipreparativní isolaci DNA: acetát, guanidin hydrochlorid Komerční roztok G4 pro minipreparativní isolaci DNA: ethanol, NaCl, EDTA, Tris-Cl Komerční roztok GX pro minipreparativní isolaci DNA: guanidin hydrochlorid 42

43 Komerční roztok H1 pro purifikaci PCR produktů: guanidin hydrochlorid, isopropanol Komerční roztok H2 pro purifikaci PCR produktů: ethanol, NaCl, EDTA, Tris-Cl Komerční roztok L1 pro isolaci DNA z agarosového gelu: NaClO 4, octan sodný, TBE-rozpouštěč Komerční roztok L2 pro isolaci DNA z agarosového gelu: ethanol, NaCl, ADTA, Tris-Cl Ligační T4 pufr: 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl 2, 10mM Dithiothreitol 1mM ATP, ph=7,5 10x koncentrovaný, New England Biolabs, USA Lysační pufr: 1M Tris, ph=8,0, 0,1M EDTA, 10% glukosa, lysozym 1 mg/ml, RNAsa 10 µg/ml Marker pro SDS elektroforesu: BSA 66 kda, ovalalbumin 44 kda, trypsinogen 24 kda, lysozym 14 kda Mobilní fáze A pro RP-HPLC proteinu rnkr-p1: 5% acetonitril, 0,1% TFA Mobilní fáze B pro RP-HPLC proteinu rnkr-p1: 95% acetonitril, 0,07% TFA NEB2 pufr: 50mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl 2, 1mM dithiothreitol, ph=7,9 10x koncentrovaný, New England Biolabs, USA Octan draselný: 5M, ph=8,9 Pufr A pro iontově výměnnou chromatografii proteinu rnkr-p1: 15mM Tris-Cl, 15mM NaCl, 1mM NaN 3, ph=8,5 Pufr B pro iontově výměnnou chromatografii proteinu rnkr-p1: 5mM Tris-Cl, 1M NaCl, 1mM NaN 3, ph=8,5 Pufr na rozbití kvasinkových buněk (tzv. Breaking Buffer): 50mM NaH 2 PO 4 ph=7,4. 1mM PMSF, 1 M leupeptin, 1 M pepstatin, 1mM EDTA, 5% glycerol Pufr pro gelovou permeační chromatografii proteinu rnkr-p1: 10mM PIPES, 50mM NaCl, 1mM NaN 3, ph=6,8 43

44 Roztok I pro přípravu plasmidů: 50mM glukosa, 25mM Tris-Cl, ph=8,0, 10mM EDTA Roztok II pro přípravu plasmidů: 3mM octan draselný, 10% HAc Roztok YNB (Yeast Nitrogen Base): 13,4% YNB SCED pufr: 1M sorbitol, 10mM citrát sodný, ph=7,5, 10mM EDTA, 10mM DTT TAE pufr: 40mM Tris, 20mM HAc, 1mM EDTA, ph=8,0 ThermoPol. Reaction Buffer: 10mM KCl, 10mM (NH 4 ) 2 SO 4, 20mM Tris-HCl, 2mM MgSO 4, 0,1% Triton-X-100, ph=8,8 10x koncentrovaný, New England Biolabs, USA Vyvíjecí roztok pro barvení stříbrem: 37% formaldehyd, 3% K 2 CO 3 a 0,001% Na 2 S 2 O 3 Vzorkový pufr pro agarosovou elektroforesu (STOP roztok): 50mM EDTA, 50% glycerol, 0,05% bromfenolová modř, ph=8,0 Vzorkový pufr pro SDS elektroforesu: 50 mm Tris-Cl ph=6,8, 100 mm DTT, 2% SDS, 0,01% bromfenolová modř, 10% glycerol 8. Média BMGY, resp. BMMY médium (Buffered Glycerol-complex Medium, resp. Buffered Methanol-complex Medium) 1% bacto-yeast extract, 2% bacto-tryptone, 100 mm fosforečnan draselný ph=6,0, 1,34% YNB, 4*10-5 % biotin, 1% glycerol, resp. 0,5% methanol LB agar: 1,25% agar v LB médiu LB médium: 1% bacto-tryptone, 0,5% bacto-yeast extract, 1% NaCl, ph=7,4 44

45 Nízkosolné (Low salt) LB médium: 1% bacto-tryptone, 0,5% bacto-yeast extract, 0,5% NaCl, ph=7,5 Nízkosolný (Low salt) LB agar: 1,5% agar v nízkosolném (Low salt) LB médiu YPD médium (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium): 1% bacto-yeast extract, 2% bacto-tryptone, 2% glukosa YPD agar: 1% bacto-yeast extract, 2% bacto-tryptone, 2% glukosa, 2% agar, 100 g/ml zeocin 9. Antibiotika Kanamycin 35 g/ml Tetracyklin 12,5 g/ml Zeocin 100 g/ml 10. Enzymy a inhibitory DeepVent DNA polymerasa (2 U/ l) New England Biolabs, USA DNAsa I (deoxyribonukleasa I) Sigma, USA EcoRI New England Biolabs, USA Leupeptin Sigma, USA Pepstatin Sigma, USA PMSF Sigma, USA RNAsa I (ribonukleasa I) Sigma, USA SacI New England Biolabs, USA T4 DNA ligasa (5 U/ l) MBI Fermentas, Litva Trypsin Promega, USA XbaI New England Biolabs, USA Zymolyasa Exbio s.r.o., ČR 45

46 11. Primery PINKRAFW: 5 - TGT GAA TTC GAG AAC CTG AGT AAA ACA GGT AGT 3 Generi Biotech, ČR PINKRREV: 5 - TGT TCT AGA TCA TTT TAG TTC CTT TTG ACA GA 3 Generi Biotech, ČR PINKRBFW: 5 - TGT GAA TTC GAG AAC AGG ACA AAA ACA ACA GAT 3 Generi Biotech, ČR 12. Vektory ppicz Invitrogen, USA 13. Kvasinkové a bakteriální kmeny X-33 (genotyp: wild-type, fenotyp: Mut + ) Invitrogen, USA TOP10 (genotyp: F - mcra, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80laczδm15, ΔlacX74, reca1, arad139, Δ(araleu)7697, galu, galk, rpsl(str R ), enda1, nupg) Invitrogen, USA 46

47 IV. Použité metody 14. Práce s DNA PCR polymerasová řetězová reakce Polymerasová řetězová reakce (PCR Polymerase Chain Reaction) je jednoduchou a vysoce účinnou metodou klonování konkrétního úseku DNA. Podstatou této techniky je cyklicky se opakující střídání tří různých teplot denaturační teplota (95 C), která slouţí k oddělení řetězců dsdna, dále tzv. annealing teplota, při níţ dochází ke specifickému nasedání primerů (krátké oligonukleotidy se strukturou určující, které úseky DNA budou amplifikovány) na komplementární sekvence templátu DNA a poslední teplotou (72-75 C) je teplotní optimum DNA polymerasy, která syntetizuje nový komplementární řetězec DNA. Reakce probíhá in vitro v termocyklátoru, jenţ je schopen cyklicky střídat výše udané teploty krát a výsledkem je zisk velkého mnoţství namnoţené DNA mezi oligonukleotidy. Příprava insertů rnkr-p1a, rnkr-p1b a vektoru ppiczα pro další experimenty začíná jejich PCR amplifikací. Sloţení reakční směsi je uvedeno v následující tabulce 1 a celkový objem směsi je 50 l. Jako templát je pouţita cdna připravena reverzní transkripcí z RNA izolované z potkaních NK buněk. Tabulka 1: Složení reakční směsi pro PCR Složky reakce Objem [ l] ThermoPol. Reaction Buffer (10x konc.) 5 10mM dntps set (New England Biolabs) 1 10µM reverse primer 2 10µM forward primer 2 10µM templát DNA 1 100mM MgSO 4 1,5 DeepVent DNA polymerasa (2 U/µl) 1 H 2 O 36,5 Celkem 50 47

48 Po smíchání všech těchto komponent se reakční směs umístí do termocyklátoru, kde probíhají níţe uvedené cykly (tabulka 2). Tabulka 2: PCR program termocyklátoru Program Počet cyklů Teplota [ C] Délka trvání [s] Teplota připojení primerů ( annealing ) je 60 C. Výsledek PCR reakce je analyzován elektroforesou v agarosovém gelu. Produkty PCR reakce jsou také čištěny pomocí komerčního protokolu firmy Genomed 94. Inserty a vektor jsou dále štěpeny příslušnými restrikčními enzymy a připravovány na ligaci Purifikace PCR produktů Čištění produktů po PCR reakci proběhlo pomocí komerční soupravy na PCR purifikaci od firmy Genomed 94. Ke 100 l vzorku po amplifikaci se přidá 400 l pufru H1 a důkladně se promíchá. Směs je aplikována na JETQUICK kolonku umístěnou do 2 ml sběrné mikrozkumavky. Následně proběhne centrifugace při g, 1 minutu. Eluát je odstraněn a kolonka je promyta 500 l roztoku H2. Potom probíhá odstředění při g, 1 minutu. Po odlití eluátu se centrifugace zopakuje. Následuje eluce DNA z JETQUICK kolonky, kde eluát je sbírán do nové 1,5 ml mikrozkumavky. Po nanesení 30 l sterilní vody o teplotě 70 C je kolonka ponechána 1 minutu stát a poté je centrifugována za podmínek g, 2 minuty. Eluována DNA se nachází ve vodě a je uschována při teplotě -20 C. 48

49 14.3. Elektroforesa v agarosovém gelu Elektroforesu v agarosovém gelu lze pouţít k identifikaci, separaci i purifikaci vzorku DNA. Gel je sloţen z přiměřeného mnoţství agarosy (v tomto případě 0,5 g), rozpuštěné v 50 ml TAE pufru. Volbou koncentrace agarosy v připraveném separačním gelu je moţné dosáhnout optimálního rozlišení v určité oblasti velikostí DNA. Pro delší fragmenty je třeba pouţít gel o niţší koncentraci agarosy. Roztok 1% agarosy se povaří a po zchladnutí na přibliţně 50 C se přidá 2,5 l roztoku ethidiumbromidu (1 mg/ml). Směs se nalije do vaničky, zasune se šablona ( hřeben ) a gel se nechá ztuhnout. Po ztuhnutí se šablona odstraní a do vzniklých jamek se nanesou analyzované vzorky obarvené STOP roztokem s bromfenolovou modří. Elektroforesa probíhá při konstantním napětí 3 V na 1 cm vzdálenosti elektrod po dobu minut, DNA přitom putuje ke kladné elektrodě. Jako elektrodový pufr je pouţit TAE pufr. Pro vizualizaci DNA se pouţívá interkalační činidlo ethidiumbromid, které je aktivováno pomocí ultrafialového světla Restrikční štěpení Před ligací insertů rnkr-p1a a B do vektoru ppicz je třeba všechny tyto sloţky štěpit restrikčními enzymy (EcoRI a XbaI). Tímto se získají fragmenty s tzv. lepivými konci, kterými se inserty zapojí do vektoru ppicz. Princip restrikčního štěpení enzymu EcoRI je zobrazen na obr. 10. K 60 l přečištěných PCR produktům se přídá po 4 l enzymů EcoRI a XbaI, 8 l desetkrát koncentrovaného pufru NEB2 a 12 l vody. Celkový objem směsi je 80 l. Reakce probíhá při 37 C po dobu 2 hodin. Tímto způsobem je provedena restrikce insertů rnkr-p1a a B i vektoru ppicz. 49

50 14.5. Isolace DNA z agarosového gelu Po úspěšném rozštěpení fragmentů DNA (inserty a vektor) v agarosovém gelu se mohou poţadované fragmenty vyříznout skalpelem a přenést do vhodných mikrozkumavek. V tomto případě byl pro isolaci DNA pouţit protokol firmy Genomed 94. Na kaţdých 100 mg gelu se přidává 300 l roztoku L1 na rozpuštění gelu. Vzorek je s tímto roztokem inkubován po dobu 15 minut v 50 C a kaţdé 3 minuty je promíchán pro lepší rozpuštění agarosového gelu. Poté je směs nanesena na JETQUICK kolonku a odstředěna při g, 1 minutu. Eluát se odstraní, kolonka se promyje 500 l promývacího pufru L2 a opět se odstředí při g, 1 minutu. JETQUICK kolonka je následně umístěna do nové 1,5 ml mikrozkumavky, je promyta 30 l sterilní vody, která je předem předehřátá na 70 C, ponechána 1 minutu při laboratorní teplotě a následně centrifugována po dobu 2 minut při g. Linearizovaná DNA je uchována při 20 C Ligace insertů rnkr-p1a a rnkr-p1b do vektoru ppiczα Frakce DNA (inserty rnkr-p1a, rnkr-p1b a vektor ppiczα) isolované z agarosového gelu se rozpustí v 10 μl H 2 O. Reakce začíná smísením všech sloţek uvedených v tabulce 3. Ligace probíhá přes noc při 25ºC. Tabulka 3: Složky pro ligaci insertů rnkr-p1a a -B do vektoru ppiczα Složky ligační směsi Objem [ l] vektor ppiczα 1 insert rnkr-p1a či B v H 2 O 8 ligační T4 pufr (10x konc.) 1 20mM ATP 0,5 PEG U/ml T4 DNA ligasa 0,4 Celkem 10 50

51 14.7. Transformace ligační směsi do bakteriálních buněk Buňky bakteriálního kmenu TOP10 se nechají pomalu rozmrazit na ledu. Poté se k nim přidájí 2 μl vektoru ppiczα s ligovanou DNA. Po 30 minutách inkubace na ledu probíhá tzv. tepelný šok ( heat shock ), při kterém jsou buňky vystaveny teplotě 42ºC po dobu 45 s a pak ihned umístěny na led. Následuje přidání 1 ml nízkosolného (Low salt) LB média bez antibiotik k reakční směsi a 1 hodinová inkubace při 37ºC. Poté jsou buňky rozetřeny ochlazenou skleněnou tyčinkou na misku s tuhým nízkosolným LB médiem obsahujícím zeocin. Kultivace probíhá při 37 C do vytvoření viditelných samostatných kolonií Minipreparativní isolace DNA Pro minipreparativní isolaci DNA byl pouţit komerční protokol firmy Genomed 93. Bakteriální buňky jsou odstředěny centrifugací při g, 1 minutu a supernatant je pečlivě odstraněn. K peletě se přidá 250 μl roztoku G1 a resuspenduje se. Poté se k homogenní směsi přidá 250 μl roztoku G2, opatrně se promíchá převrácením mikrozkumavky a nechá se inkubovat 5 minut při laboratorní teplotě. K roztoku je následně přidáno 350 μl roztoku G3, šetrně se promíchá převrácením mikrozkumavky do vzniku homogenní směsi. Poté je směs odstředěna při g, 10 minut, laboratorní teplota. Supernatant je nanesen na JETQUICK kolonku, která je umístěna do 2 ml mikrozkumavky. Poté proběhne centrifugace po dobu 1 minuty, g. Eluát nacházející se v 2 ml mikrozkumavce je odstraněn, na kolonku na naneseno 500 μl pufru GX a je opět odstředěno při g, 1 minutu. Eluát je odstraněn, na kolonku je naneseno 500 μl pufru G4 a je opět odstředěno při g, 1 minutu. Eluát je znovu odlit, kolonka je opět centrifugována při g, 1 minutu. Eluce plasmidu probíhá do nové 1,5 ml mikrozkumavky, do které je umístěna JETQUICK kolonka. Na ní je naneseno 50 μl předem zahřáté sterilní vody (65-70 C) a směs je ponechána 1 minutu při laboratorní teplotě. Poté dochází k centrifugaci po dobu 2 minut při g. Získaná DNA se nyní můţe pouţít pro další experimenty, jako je restrikční analýza. Vzorek se uchovává ve vodě při -20 C. K ověření úspěšnosti minipreparativní isolace DNA je pouţita analýza pomocí elektroforesy v agarosovém gelu. 51

52 14.9. Rychlá preparace DNA ( Easyprep ) Buňky jsou odstředěny při 6000 g, 1 minutu, poté se k nim přidá 30 µl lysačního pufru a roztok se povaří po dobu 90 s. Následuje inkubace 10 minut na ledu a opět centrifugace při g, 10 minut. Poţadovaný plasmid se nachází v supernatantu Velkokapacitní preparace plasmidu Velkokapacitní preparace plasmidu začíná zaočkováním bakteriální kultury do LB média, obsahujícího příslušná antibiotika. Kultivace probíhá přes noc za stálého třepání (240 ot/min) při 37 C. Kultura je následně odstředěna při 2500 g, 10 minut, 4 C, pelet je resuspendován v 20 ml roztoku glukosy (roztok I pro přípravu plasmidů) a znovu odstředěn za podmínek 5000 g, 10 minut, 4 C. Po odlití supernatantu se pelet opět resuspenduje v glukosovém roztoku s 5 mg/ml lysozymem, dobře se promíchá a nechá stát při laboratorní teplotě 5 minut. Poté se k buňkám přidá 7 ml roztoku 0,2M NaOH s 1% SDS, ponechá se na ledu 10 minut a přidá se 5,2 ml roztoku octanu draselného (roztok II pro přípravu plasmidů). Kultura se promíchá a nechá stát na ledu 10 minut. Následuje odstředění při g, 30 minut, 4 C, precipitace supernatantu, obsahujícího nukleové kyseliny, 15 ml isopropanolu a opětovné odstředění (12000 g, 30 minut, 20 C). Pelet je promyt 70% ethanolem, ethanol odlit a vysráţené nukleové kyseliny jsou usušeny při laboratorní teplotě. Poté je DNA rozpuštěna ve 2 ml sterilní H 2 O s 10 l RNázy (10 mg/ml) a inkubována 30 minut při 37 C. Následuje fenol/chloroformová extrakce, která je popsána v odstavci , str. 53. Z vodné fáze je DNA vysráţena ethanolem a po vysušení opět rozpuštěna ve 160 l vody, 40 l 4M NaCl a 200 l 13% polyetylenglykolu. Hodinová precipitace probíhá na ledu, pelet je odstředěn a rozpuštěn ve 200 l sterilní H 2 O. Poté se ještě jednou provede fenol/chloroformová extrakce a sráţení ethanolem. Vysušená DNA je rozpuštěna v 55 l sterilní H 2 O je stanovena její koncentrace (viz kapitola , str. 53). Po velkokapacitní preparaci DNA následuje agarosová elektroforesa pro ověření isolace. 52

53 Fenol/chloroformová extrakce DNA Fenol/chloroformová metoda extrakce ponechává nukleové kyseliny rozpuštěné ve vodném prostředí a odstraňuje ostatní sloţky lyzátu, především proteiny. K roztoku s DNA se přidá stejné mnoţství fenolu nasyceného TE pufrem. Po důkladném protřepání se provede centrifugace při g, 10 minut a opatrně se odsaje horní vodná fáze (obr. 11). K té se přidá opět přibliţně stejné mnoţství směsi fenol/chloroform/isoamylalkohol a po protřepání se znovu odstředí (16000 g, 10 minut). K odsáté horní fázi se přidá opět stejné mnoţství chloroformu syceného isoamylalkoholem (24:1), aby došlo k odstranění stop fenolu v roztoku. Po protřepání a odstředění (16000 g, 5 minut) je moţné z přečištěného vodného roztoku DNA vysráţet Precipitace DNA DNA je moţné precipitovat pomocí vychlazeného ethanolu, neboť tato nukleová kyselina je rozpustná ve vodě, ale nikoliv v alkoholu. Pro lepší vysráţení je vhodné kyselé prostředí, které zajistí ztrátu náboje DNA a její následnou nerozpustnost. Proto se do roztoku DNA přidává 1 10 objemu 3M octanu sodného o ph=5,2 a 2,5 násobek objemu 96% EtOH. Sráţení probíhá 30 minut při -70 C, nebo 60 minut při -20 C. Poté je roztok odstředěn při g, 10 minut, 4 C. Pelet je sloţen z DNA a solí, které mu dodávají bílé zabarvení. Solí je třeba se zbavit promytím peletu 70% EtOH. Vzorek je nakonec usušen na vakuové odparce Spektrofotometrické stanovení čistoty a koncentrace DNA Spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA je zaloţeno na faktu, ţe DNA absorbuje záření o vlnové délce 260 nm. U vhodně zředěného roztoku se zjistí hodnota absorbance při této vlnové délce a na jejím základě se vypočítá koncentrace DNA ve vzorku. Platí vztah, kdy 1 jednotka A 260 je rovna 50 g DNA/ml roztoku. Současně lze stanovit hodnotu absorbance při 280 nm (vlnová délka, při které dochází k maximální 53

54 absorpci záření proteiny) a poměrem absorbancí A 260 /A 280 vyjádřit čistotu DNA. U čisté DNA se tento poměr pohybuje kolem hodnot Linearizace expresního vektoru ppicz Příprava plasmidu na transformaci elektroporací spočívá v linearizaci vektoru ppicz, který obsahuje poţadovaný gen pro proteiny rnkr-p1a a B. K 9 l vzorku DNA se přidá 1 l desetkrát koncentrovaného pufru a 0,5 l restrikčního enzymu (SacI). Reakční směs je inkubována 1,5-2 h při 37 C. Reakce je ukončena přidáním tzv. STOP pufru. Linearizované vektory jsou před pouţitím na elektroporaci dialyzovány 15 minut přes dialyzační membránu proti vodě. 15. Práce s kulturami kvasinek Pichia pastoris Příprava buněk na elektroporaci Do 100 ml YPD média se naočkuje odpovídající mnoţství (1/1000 objemu) buněk P. pastoris a nechá se růst za intenzivního třepání (240 ot/min) při 28 C přes noc. Druhý den se do čerstvého média přeočkuje 1/1000 objemu kultury, která rostla přes noc a opět se ponechá za intenzivního třepání (240 ot/min) při 28 C, dokud optická denzita kultury nedosahuje hodnoty OD 600 = 1,3-1,5 (měření je zaloţeno na odhadu počtu buněk na základě spektrofotometrického měření zákalu při vlnové délce 600 nm). Poté jsou buňky odstředěny při 5000 g, 5 minut, 4 C. Pelet je resuspendován v 500 ml sterilní vychlazené vody, opět centrifugován při 5000 g, 5 minut, 4 C a znovu resuspendován v 250 ml sterilní vychlazené vody. Buňky jsou následně odstředěny při 5000 g, 5 minut, 4 C a pelet je opět resuspendován v 20 ml vychlazeného 1M sorbitolu. Roztok je centrifugován při 5000 g, 5 minut, 4 C a pelet je naposledy resuspendován 1 ml vychlazeného 1M sorbitolu. Buňky jsou uschovány na ledu a ihned vyuţity na elektroporaci. 54

55 15.2. Transformace buněk Pichia pastoris elektroporací Elektroporace můţe být pouţita pro transformaci rostlinných buněk a protoplastů. Roztok obsahující DNA je vystaven elektrickým pulsům o vysokém napětí. V cytoplazmatické membráně se vytvoří póry, kterými můţe DNA proniknout do buňky a integrovat se do genomu. Zjednodušený nákres je zobrazen na obr. 12. Samotný postup této metody začíná smísením 80 l buněčné směsi připravené na elektroporaci (viz předchozí odstavec) s 10 l linearizovaného vektoru ppicz s poţadovaným insertem. Reakční směs se přenese do předem vychlazené 0,2 cm elektroporační kyvety a ponechá se 5 minut na ledu. Poté jsou na roztok aplikovány pulzy napětí 1,5 kv, odpor 200 Ω a elektrická kapacita o hodnotě 100 F. K reakční směsi je ihned přidán 1 ml vychlazeného 1M sorbitolu, roztok je přenesen do vhodné nádobky a inkubován 1-2 h při 28 C bez třepání. Poté jsou transformované buňky rozetřeny na misky s tuhým YPD médiem obsahujícím 100 g/ml zeocinu. Kvasinkové buňky rostou na miskách při 28 C po dobu 3-10 dní aţ do vytvoření viditelných jednotlivých kolonií Isolace DNA z kolonií Pichia pastoris Po nárůstů jednotlivých kolonií kvasinky Pichia pastoris na tuhém YPD médiu jsou vybrané kolonie vypíchnuty a kultivovány v 10 ml BMGY média při intenzivním třepání (240 ot/min) při 28 C do hodnoty OD 600 =5-10. Poté jsou buňky odstředěny při 8500 g, 10 minut, 20 C. Pelet je resuspendován v 10 ml sterilní vody a opět odstředěn, jako v předchozím kroku. Buňky jsou poté resuspendovány ve 2 ml SCED pufru, přidá se 0,1-0,3 mg zymolyasy a ponechá se 50 minut inkubovat při teplotě 37 C. Následně se přidají 2 ml 1% SDS, opatrně se promíchá a uchová 5 minut na ledu. Ke směsi je pak přidán 1,5 ml 5M octanu draselného a opět se šetrně promíchá. Buňky jsou centrifugovány při g, 10 minut, 4 C. Dále se pracuje se supernatantem, ke kterému je přidán dvojnásobný objem ethanolu a 1/10 objemu 3M octanu sodného. Roztok se nechá stát 55

56 15 minut na ledu. Poté se provede centrifugace při g, 10 minut, 4 C. Peleta je resuspendována v 0,7 ml sterilní vody a následně je uskutečněna fenol/chloroformová extrakce, precipitace DNA a nakonec se stanoví koncentrace DNA ve vzorku Selekce pozitivního klonu pro produkci proteinů rnkr-p1 Se vzorky z isolace DNA z kolonií P. Pastoris se provede PCR amplifikace a následná analýza na elektroforese v agarosovém gelu. Vzorky, u kterých se zjistí pozitivní výsledek, tj. ţe expresní vektor byl úspěšně vloţen do kvasinkových buněk, se mohou pouţít na produkci proteinů rnkr-p1a a B. Sloţení PCR reakce vyjadřuje tabulka 4. Jako templát DNA je pouţita isolovaná DNA z kolonií P. Pastoris. Tabulka 4: Složení reakční směsi pro PCR Složky reakce Objem [ l] ThermoPol. Reaction Buffer (10x konc.) 5 10mM dntps set (New England Biolabs) 1 25µM reverse primer 4 25µM forward primer 4 templát DNA 1 100mM MgSO 4 2 enzym DeepVent (2 U/µl) 1 H 2 O 32 Celkem 50 Po smíchání sloţek z tabulky 4 je reakční směs přemístěna do termocyklátoru, kde probíhá samotná PCR amplifikace. Jednotlivé cykly programu v přístroji na PCR jsou shrnuty v tabulce 5 (str. 57). Teplota nasedání primerů na templát DNA je 52 C. 56

57 Tabulka 5: PCR program termocyklátoru Program Počet cyklů Teplota [ C] Délka trvání [s] Výsledek PCR reakce je analyzován elektroforesou v agarosovém gelu. Pozitivní vzorky jsou pouţity na následnou produkci proteinů Produkce proteinů rnkr-p1a a B a její optimalizace Exprese receptorů rnkr-p1a a B v kvasinkách P. pastoris probíhala extracelulárně do produkčního média. Pro optimalizaci produkce bylo nutné zváţit následující podmínky volba média, jeho objem, ph a sloţení, dále koncentrace methanolu v médiu a provzdušnění produkčního média v průběhu indukce methanolem. Důleţitá je také volba tvaru a velikosti kultivační nádoby, stejně jako teplota během kultivace a mnoţství ot/min při třepání. V neposlední řadě bylo třeba pečlivě sledovat i optimální dobu exprese proteinů. Po ověření pozitivního transformovaného klonu se tento klon zaočkuje do tisíckrát většího objemu BMGY média. Jako kultivační nádoba se pouţije 50 ml Erlenmeyerova baňka. Nechá se inkubovat při 28 C za intenzivního třepání (240 ot/min) do doby, kdy je optická denzita kultury OD 600 =2-6 (přes noc). Buňky jsou poté centrifugovány 5 minut, 2500 g, za laboratorní teploty. Pelet je resuspendován v 5 ml produkčního BMMY média. Z této směsi se tisícinovým objemem zaočkuje do BMMY média v 1-2l Erlenmeyerové baňce, přidá se methanol do konečné koncentrace 0,5% a opět nechá inkubovat za intenzivního třepání 240 ot/min, 28 C. Indukce methanolem probíhá kaţdých 24 hodin. Vzorky na kontrolu průběhu produkce se odebírají v libovolných časových intervalech, např. 2, 19, 24, 48 h. Tímto postupem jsou stanoveny optimální podmínky pro produkci proteinů rnkr-p1 v kvasinkách P. pastoris. Po ukončení produkce je médium odstředěno, supernatant a pelet jsou od sebe odděleny a uchovány při -80 C na analýzu SDS elektroforesou. 57

58 16. Práce s proteiny Příprava vzorků po produkci na analýzu SDS elektroforesou Pro extracelulární expresi proteinů se v dalším postupu vyuţívá supernatantu z odstředěného (10 minut, 5000 g, 4 C) produkčního média. Analýza proteinů přítomných v supernatantu probíhá prostřednictvím SDS elektroforesy s následnou visualizací proteinů pomocí CBB-R250 či stříbra (viz příslušné kapitoly). U intracelulární exprese je nejprve třeba buněčné pelety rozbít. Pelety jsou pomalu rozmraţeny na ledu a ke kaţdému 1 ml vzorku se přidá 100 µl pufru na rozbití kvasinkových buněk (Breaking Buffer). Pelety jsou resuspendovány a ke kaţdé se přidá skleněná kulička o velikosti 0,5 mm. Směs je 30 s mícháná na vortexovém mixéru a následně 30 s inkubována na ledu. Tento postup se opakuje celkem osmkrát. Poté jsou rozbité buněčné pelety centrifugovány 10 minut, 2500 g, 4 C a supernatant je uchován na analýzu SDS elektroforesou. V obou případech exprese jsou vzorky pro analýzu diskontinuální elektroforesou v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS opracovány následujícím způsobem. Supernatanty jsou zředěny vzorkovým pufrem v poměru 1:1, 5 minut povařeny a poté centrifugovány g, 5 min, 20 C Diskontinuální SDS-PAGE Diskontinuální elektroforesa v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS patří v dnešní době k nejoblíbenějším elektroforetickým technikám. Gely jsou vytvořeny polymerací akrylamidu a N,N -methylen-bis-akrylamidu. Polymerace je zahájena volnými radiály, vzniklými při rozkladu persíranu amonného (APS). Stabilizátorem volných radikálů je TEMED. Pro diskontinuální elektroforesu, na rozdíl od klasické, se pouţívají dva různé gely a několik odlišných pufrů o různém ph. Koncentrace akrylamidu v dělícím gelu se volí podle velikosti molekul analyzovaných proteinů. Sloţení separačního a zaostřovacího gelu je vyznačeno v tabulce 6 na str

59 Tabulka 6: Složení separačního a zaostřovacího gelu na SDS elektroforesu Složky v gelu Objem složek [ml] v 15% separačním gelu Objem složek [ml] 5% zaostřovacím gelu Voda 1,1 0,68 AA směs 2,5 0,17 1,5M Tris-HCl (ph=8,8), resp.1m Tris-HCl (ph=6,8) 1,3 (ph=8,8) 0,13 (ph=6,8) 10% SDS 0,05 0,01 TEMED 0,002 0,001 10% APS 0,05 0,01 Mezi čistá skla elektroforetické aparatury je nanesen 15% separační gel o sloţení vyjádřeném v tabulce 6. Gel je převrstven vodou, která je po jeho zpolymerování odlita Na ztuhlý dělící gel je nanesena směs 5% zaostřovacího gelu, mezi skla se vloţí šablona s příslušným počtem jamek a gel se nechá zpolymerizovat. Po skončené polymeraci se šablona odstraní a vytvořené jamky pro vzorek se propláchnou vodou a elektrodovým pufrem. Poté se sestaví aparatura pro elektroforesu, do jamek zaostřovacího gelu se aplikují vzorky a směs standardů (tzv. marker). Elektroforesa probíhá při konstantním proudu ma na jeden gel a V na 1 cm gelu Visualizace proteinů Coomassie Brilliant Blue R-250 a stříbrem Při visualizaci pomocí Coomassie Brilliant Blue R-250 se gely nechají minut v barvícím roztoku pro SDS elektroforesu. Poté je roztok vyměněn za odbarvovací, ve kterém jsou ponechány do odbarvení pozadí. Gely se uschovávají v roztoku 1% kyseliny octové. Visualizace stříbrem probíhá způsobem naznačeným v tabulce 7, str. 60. Gely jsou po ukončení elektroforesy fixovány 3x30 minut ve fixačním roztoku a postupně promývány jednotlivými roztoky po uvedené časové intervaly. Gely jsou po visualizaci stříbřem uchovány v 1% kyselině octové. 59

60 Tabulka 7: Postup při visualizaci proteinů stříbrem Krok Roztok Objem a množství složek roztoku na 1 gel Čas [min] Poznámka 1 30% EtOH 15 ml EtOH + 5 ml HAc 3x30 fixace 10% HAc + 30 ml H 2 O 2 20% EtOH 10 ml EtOH + 40 ml H 2 O 10 fixace 3 H 2 O 50 ml H 2 O 10 promývání 4 0,2 g/l Na 2 S 2 O 3 20 µl 0,5 g/ml Na 2 S 2 O sensibilizace 50 ml H 2 O 5 H 2 O 50 ml H 2 O 2x0,3 promývání 6 2 g/l AgNO 3 0,1 g AgNO ml H 2 O 30 impregnace stříbrem 7 H 2 O 50 ml H 2 O 0,2 promývání 8 0,7 ml/l H 2 CO 35 µl 37% H 2 CO + 1,5g 2-4 vyvolání 30 g/l K 2 CO 3 10 mg/l Na 2 S 2 O 3 K 2 CO µl 0,5 g/ml Na 2 S 2 O ml H 2 O 9 50 g/l Tris-HCl 2,5 g Tris-HCl + 13 ml 1 zastavení 25% HAc HAc + 37 ml H 2 O 10 1% HAc 0,5 ml HAc 49,5 ml H 2 O skladování Zakoncentrování vzorků K zakoncentrování vzorků se pouţívají různé metody. Pro menší objemy lze vyuţít koncentrátorů. V této diplomové práci byly pouţity koncentrátory Centriprep (max g) a Centricon (5000 g) s membránou propustnou pro molekuly o M r < Koncentrátory jsou před pouţitím promyty vodou a pufrem, ve kterém je rozpuštěn protein. Vzorky jsou zahušťovány na objem µl. K uchování koncentrátorů slouţí roztok 1mM NaN 3. U větších objemů roztoků proteinů (např. po dialýze) se pouţívá metody ultrafiltrace. Nejprve se sestaví aparatura, kde se membrána o průměru 76 mm a velikosti pórů 10 kda umístí správnou orientací aktivní strany. Roztok je zakoncentrován na 60

61 přibliţně poloviční objem za pomalého míchání při laboratorní teplotě a tlaku plynu (N 2 ) 0,5 MPa Dialýza Dialýza je separační technika, která vyuţívá difúze nízkomolekulárních látek membránou nepropustnou pro velké molekuly a částice z roztoku o vyšší koncentraci do roztoku o koncentraci niţší. Po vyrovnání koncentrací látek procházejících membránou na obou stranách membrány se celý proces zastaví. Molekuly proteinů pro svoji velikost neprochází dialyzačními membránami. Nejčastěji se dialýza vyuţívá na oddělení solí od roztoku proteinů nebo obecně při separaci vysokomolekulárních látek od nízkomolekulárních nečistot. Dialyzační trubice dlouhé 50 cm se povaří 10 minut v 500 ml roztoku o sloţení 2% NaHCO 3, 1mM EDTA, promyjí se destilovanou vodou, z jedné strany se zajistí dialyzačními svorkami a opatrně se do nich nanesou vzorky. Po pouţití se dialyzační trubice povaří 10 minut v 1mM EDTA a v takovém roztoku se uchovají při 4 C. Supernatanty z produkce proteinů rnkr-p1a a B se převedou do dialyzačních trubic, které se zajistí i z druhé strany dialyzační svorkou. Dialýza probíhá za stálého míchání 6 hodin, při 4 C proti dialyzačnímu pufru 1. Poté je pufr vyměněn za dialyzační pufr 2, proti kterému reakce probíhá přes noc opět za stálého míchání při teplotě 4 C Stanovení koncentrace proteinů dle Bradfordové Koncentrace proteinů se můţe stanovit např. metodou dle Bradfordové. Do jamek mikrotitrační destičky se nanese 5 µl vzorku, 200 µl činidla dle Bradfordové, směs se promíchá a nechá se 5 minut inkubovat při laboratorní teplotě. Jako slepý vzorek se pouţije 5 µl vody místo vzorku do 200 µl činidla. Stanovení probíhá v dubletech pro vyloučení experimentálních chyb. Kalibrační křivka se sestaví z roztoků BSA o známé koncentraci (0,1-0,5 mg/ml). Mnoţství proteinu je stanoveno spektrofotometricky měřením absorbance při vlnové délce 595 nm na čtečce destiček Safire. Koncentrace analyzovaných vzorků je odečtena z kalibrační křivky. 61

62 16.7. Chromatografické metody Iontově výměnná chromatografie Systém HPLC je promyt 1M NaOH a H 2 O a poté je připojena kolona Q-Sepharosy. Po nastavení průtoku 1 ml/min je také promyta 1M NaOH a H 2 O. Poté je kolona promyta pufrem B pro iontově výměnnou chromatografii a následně je ekvilibrována pufrem A, přičemţ jsou oba pufry před nanesením na kolonu filtrovány přes 0,22 μm PVDF filtr za sníţeného tlaku. Po promytí kolony pufrem A pro iontově výměnnou chromatografii je nanesen analyzovaný vzorek s rychlostí průtoku 1 ml/min a lineárním gradientem do 80% pufru B pro iontově výměnnou chromatografii za 80 minut. Po eluci proteinu je kolona opět promyta 1M NaOH, H 2 O a 20% EtOH, ve kterém jsou kolona i systém zakonzervovány. Jímané frakce jsou anyzovány pomocí SDS elektroforesy. Chromatografie s reversní fází HPLC systém je nejprve promyt vodou, 1M NaOH, 1M kyselinou octovou, vodou, mobilní fází B pro RP-HPLC a mobilní fází A pro RP-HPLC. Následně se připojí kolona Vydac-C4 a nastaví se průtok 0,5 ml/min. Kolona je promyta 10 minut pufrem A pro RP- HPLC, za 5 minut do 25% pufru B, za 40 minut do 50% pufru B, za 1 minutu do 100% roztoku B a 10 minut při 100% pufru B. Vzorky jsou před nástřikem na kolonu zakoncentrovány na objem 500 μl a okyseliny TFA. Po nanesení vzorku je kolona promyta pufrem A pro RP-HPLC, poté je spuštěn lineární gradient do 50% pufru B za 45 minut. Po ukončení separací je kolona opět promyta a zakonzervována v mobilní fázi B, systém ve 20% ethanolu. Z jímaných frakcí je ve vakuové odparce odpařen acetonitril a vzorky jsou analyzovány pomocí SDS elektroforesy. Gelová permeační chromatografie Pro gelovou permeační chromatografii je systém HPLC promyt vodou, 1M NaOH, 1M kyselinou octovou, vodou a poté pufrem pro tento druh chromatografie. Po připojení kolony Superdex 200 je průtok nastaven na 0,4 ml/min a kolona je také promyta pufrem pro gelovou chromatografii. Poté je nanesen vzorek, zakoncentrovaný na objem 100 l, a je sledována absorbance při 280 nm. Kolona a HPLC systém jsou uchováný v 20% ethanolu. Sbírané frakce jsou analyzovány na SDS elektroforese. 62

63 16.8. Identifikace exprimovaného proteinu hmotnostní spektrometrií Od svého vzniku prošla hmostnostní spektrometrie velkým vývojem a dnes ji nacházíme skoro ve všech odvětvích přírodních věd. Metoda MALDI (z angl. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) se nejčastěji pouţívá na analýzu peptidů, bílkovin, ale také nukleových kyselin či některých nízkomolekulárních látek. Výhodou této techniky je její vysoká citlivost, rychlost, stabilita vzorku během měření a relativně jednoduché vyhodnocování dat. 96 Hmotnostní spektrometrie MALDI v kombinaci s detektorem TOF (z angl. Time-Of-Fligth, doba letu) je v rámci této diplomové práci pouţita na identifikaci proteinů metodou peptidových map. Peptidové mapování bylo vytvořeno pomocí enzymového štěpení trypsinem. Trypsinové štěpení Z visualizovaných proteinů pomocí CBB-R250 na SDS elektroforese se čistým skalpelem vyříznou zóny, odpovídající předpokládané molekulové hmotnosti proteinů. Zóny, nakrájené na malé kousky, jsou odbarvováný v roztoku 100mM Tris-HCl a 50% acetonitrilu, aţ do úplného odbarvení modrého zabarvení. Poté je roztok odebrán a vyměněn za 100% acetonitril, který kousky gelů srazí, dále probíhá sonikace po dobu 5 minut, odebrání roztoku acetonitrilu a přidání 50 µl 10-30mM Tsep. Následuje inkubace 30 minut při 65 C, opět odebrání roztoku Tsep, sráţení gelu pomocí 100% acetonitrilu, 5 minutová sonikace a výměna roztoku acetonitrilu za destilovanou vodu. Kousky gelů jsou sonikovány, je jim odebrána voda a přidán acetonitril, s kterým jsou téţ sonikovány. Po jeho odstranění je ke gelům přidán 50% acetonitril, který je vysušen na vakuové odparce. Následně je ke kouskům gelů přidáno µl 50mM ethylmorfolinového pufru a takové mnoţství trypsinu, aby v roztoku byl stokrát zředěný. Tato směs je inkubována přes noc při 30 C. Druhý den je k reakční směsi přidána TFA do konečné koncentrace 1%. Po sonikaci je kapalina odebrána do nové mikrozkumavky, ke gelům je přidán 50% acetonitril, směs je sonikována, roztok je odebrán a přidán do mikrozkumavky obsahující štěpící směs. Ke kouskům gelů je nanesen 50% acetonitril a 0,1% TFA, směs je opět sonikována a roztok je přidán do mikrozkumavky se štěpící směsí. Tento roztok s trypsinem, acetonitrilem a TFA je odpařen na vakuové odparce a následně je rozpuštěn v 40 µl 1% TFA. Směs je 63

64 sonikována a odstředěna při g, 1 minutu. Poté je 0,5 µl tohoto roztoku naneseno na terčík pro měření MALDI a po odpaření kapaliny je směs převrstvena 0,5 µl matrice (roztok kyseliny 4-hydroxy-α-kyanoskořicové, CCA). 64

65 V. Výsledky 17. Příprava expresního vektoru K přípravě expresního vektoru byl pouţit vektor ppiczα od firmy Invitrogen (obr. 9, str.36). Tento vektor obsahuje důleţitou α-mf signální sekvenci, která zajišťuje expresi heterologních proteinů do produkčního média. Dále v sobě vektor ppiczα nese gen pro zeocin, jakoţto selekční marker, jenţ umoţňuje transformovaným klonům být resistentní vůči tomuto antibiotiku. Do vektoru ppiczα byl vloţen insert rnkr-p1 získaný isolací RNA z NK buněk potkanů a následným RT-PCR. Aminokyselinové sekvence insertů rnkr-p1a a -B jsou na obr. 12 a 13 a schéma DNA sekvence vektoru je znázorněno na obr. 14, str. 66. E N L S K T G S P A K L K C P K D W L S H R D K C F H V S Q T S I T W K E S L A D C G G K G A T L L L V Q D Q E E L R F L R N L T K R I S S S F W I G L S Y T L S D E N W K W I N G S T L N S D V L S I T G D T E K D S C A S V S Q D K V L S E S C D S D N I W V C Q K E L K Obr. 12: Aminokyselinová sekvence insertu rnkr-p1a: Jedná se o konstrukt extracelulární domény receptoru NK buněk se 135 aminokyselinami, kde zeleně jsou vyznačeny cysteiny, které tvoří 3 disulfidové vazby. E N R T K T T D S P A K L K C P K D W H S H Q D K C F H V S Q T S I T W K G S L A D C G G K G A T L L L V Q D Q E E L R F L R N L T K R I S S S F W I G L S Y T L S D E K W K W I N G S T L N S D A L N I T G D T E K D S C A S V S Q D K V L S E S C D S D N I W I C Q K E L K Obr. 13: Aminokyselinová sekvence insertu rnkr-p1b: Jedná se o konstrukt extracelulární domény receptoru NK buněk se 136 aminokyselinami, kde zeleně jsou vyznačeny cysteiny, které tvoří 3 disulfidové vazby. 65

66 Obr. 14: DNA sekvence vektoru ppiczα s vyznačenými místy pro klonování 90 : vektor obsahuje restrikční místa pro endonukleasy EcoRI a XbaI. Experimenty byly zahájeny PCR amplifikací konstruktů rnkr-p1a a rnkr-p1b, kde jako templát poslouţila cdna připravená reverzní transkripcí z RNA izolované z potkaních NK buněk. Produkty těchto reakcí byly přečištěny pomocí komerční sady na PCR purifikaci 94. Po provedení elektroforesy v agarosovém gelu byly inserty i vektor vystaveny restrikčnímu štěpení enzymy EcoRI a XbaI, jakoţto příprava na následnou ligaci. Průběh PCR reakce pro inserty i vektor je naznačen na obr. 15 (str. 67). Primer 1 (tzv. forward ) obsahoval restrikční místo pro enzym EcoRI a primer 2 (tzv. reverse ) v sobě nesl sekvenci pro restrikční endonukleasu XbaI. Na obr. 15 jsou zobrazeny 66

67 sekvence obou primerů pro protein rnkr-p1a. Sekvence primerů jsou téţ uvedené v seznamu pouţitého materiálu (str.45). Obr. 15: Průběh PCR reakce: Schématické vyjádření rozpletení jedné molekuly DNA a nasedání primerů na rozpletená vlákna. Na obrázku jsou zobrazené sekvence primerů pro protein rnkr-p1a a místa, ve kterých dochází k restrikci (EcoRI, XbaI). Na obr. 16 je uveden výsledek agarosové elektroforesy pro PCR produkty insertů (neštěpených i štěpených restrikčními enzymy) a přečištěného vektoru ppiczα. Obr. 16: Výsledek elektroforesy v 1% agarosovém gelu se vzorky po PCR amplifikaci Celková velikost vektoru ppiczα je 3593 bp. DNA sekvence insertu rnkr-p1a má velikost 426 bp a po odštěpení EcoRI a XbaI je velikost 416 bp. Insert rnkr-p1b má před restrikčním štěpením 429 bp a po něm 421 bp. Z výsledku PCR amplifikace na obr. 16 je patrný velmi dobrý výtěţek reakce. 67

68 Přečištěné PCR produkty (inserty a vektor) byly po štěpení restrikčními enzymy připraveny na ligaci. Nejprve proběhla isolace fragmentů o odpovídající velikosti z agarosového gelu (kapitola 14.5., str. 50). Fragmenty rnkr-p1a a B s místy pro EcoRI a XbaI byly vneseny do vektoru ppiczα, který byl také podroben restrikčnímu štěpení zmíněnými enzymy. Schéma ligace insertů do vektoru je na obr. 17. Ligace probíhala přes noc při 25 C. Obr. 17: Znázornění ligace insertů rnkr-p1a a rnkr-p1b do vektoru ppiczα v místech EcoRI a XbaI Po ligační reakci konstruktů rnkr-p1a a B do vektoru ppiczα následovala transforace do bakteriálního kmene E. coli TOP10. Transformace proběhla pouţitím metody tepelného šoku. Po nárůstu viditelných kolonií jich 6 bylo přeneseno do LB média, následovala inkubace přes noc při 37 C, dále přeočkování kultur do nového LB média a opětovná inkubace přes noc při 37 C. Následně byla provedena minipreparativní isolace DNA, jejíţ úspěšnost byla ověřena restrikčním štěpením enzymem EcoRI. Výsledek byl analyzován na agarosové elektroforese (obr. 18, str. 69). Velikost expresního vektoru obsahujícího insert rnkr-p1a je 3946 bp a konstrukt s rnkr-p1b má 3951 bp. 68

69 Obr. 18: Restrikční kontrola ligačních produktů: Výsledek agarosové elektroforesy v 1% gelu se vzorky cdna z minipreparativní isolace po provedení ligace insertů rnkr- P1A a B do vektoru ppiczα. cdna byla štěpena restrikčním enzymem EcoRI. Obr. 19: Ligační produkty po minipreparativní isolaci DNA neštěpené restričním enzymem EcoRI: Výsledek agarosové elektroforesy v 0,6% gelu se vzorky cdna z minipreparativní isolace po provedení ligace insertů rnkr-p1a a B do vektoru ppiczα. cdna nebyla štěpena restrikčním enzymem EcoRI. Obr. 19 ukazuje 0,6% gel agarosové elektroforesy s produkty ligace neštěpené restrikčním enzymem EcoRI. Slouţí jako negativní kontrola a srovnání s výsledky na obr. 18, kde štěpení bylo provedeno. Pro velkopreparativní isolaci plasmidové DNA byly vybrány kolonie A3 pro rnkr-p1a a kolonie B5 pro rnkr-p1b. Po provedení velkopreparativní isolace plasmidové DNA byly vzorky odneseny na centrum DNA sekvenování MBÚ AV ČR, kde byla jejich sekvence potvrzena. 69

70 18. Selekce pozitivního klonu pro produkci proteinů rnkr-p1 Po úšpěšné přípravě expresního vektoru ppiczα s vloţeným insertem (rnkr-p1a nebo rnkr-p1b) byl tento vektor linearizován enzymem SacI a poté transformován do buněk kvasinky Pichia pastoris. Pro transformaci byla pouţita technika elektroporace, která se ukázala jako velmi účinná. Transformované buňky byly rozetřeny na misky s tuhým YPD médiem obsahujícím 100 µg/ml zeocinu a po nárůstu viditelných jednotlivých kolonií (3-10 dní) byly vypíchnuty 4 kolonie z kaţdého druhu (rnkr-p1a nebo rnkr-p1b). Ověření integrace plasmidové DNA do genomu kvasinky proběhlo isolací DNA z těchto kolonií, které byly kultivovány v 10 ml BMGY média. Následovala PCR amplifikace a analýza na elektroforese v agarosovém gelu. Výsledek PCR analýzy je zobrazen na obr. 20. Byly získány dohromady čtyři (dva pro rnkr-p1a a dva pro isoformu B) pozitivní klony pro následnou produkci proteinů. Na obr. 20 jsou vidět fragmenty o velikosti okolo 500 bp, coţ odpovídá velikosti naších insertů (rnkr-p1a má 416 bp a rnkr-p1b 421 bp). Obr. 20: PCR analýza vzorků po isolaci DNA z transformovaných kolonií P. pastoris: transformace proběhla metodou elektroporace, analýza byla provedena elektroforesou v 1% agarosovém gelu. V drahách 1-4 jsou vidět pozitivní výsledky pro vloţení expresního vektoru ppiczα obsahujícího inserty rnkr-p1a a B do buněk kvasinek P. pastoris. 70

71 19. Optimalizace produkce proteinů rnkr-p1 Exprese proteinů rnkr-p1a a rnkr-p1b probíhala extracelulárně do produkčního média BMMY. Analýza exprese proběhla pomocí SDS elektroforesy, výsledek je zobrazen na obr. 21. Panel ukazuje optimalizaci produkce receptorů rnkr-p1a a rnkr-p1b. Vzorky byly odebírány z produkčního BMMY média po vyznačených hodinách (2, 19, 25 a 48 h) od indukce methanolem. Je vidět, ţe po 2 hodinách od indukce se ţádné proteiny neprodukují. Situace se mění po uplynutí 19 hodin, kdy v zónách nad 14,5 kda se na 15% polyakrylamidovém gelu SDS elektroforesy objevují prouţky naznačující přítomnnost hledaných receptorů rnkr-p1a a B. Třetí sada vzorků, odebírané 25 hodin po indukci methanolem, jeví podobné výsledky jako v předchozím případě. Avšak po 48 hodinách dochází k určíté ztrátě proteinu rnkr-p1a, kdeţto produkce isoformy B se zvýšila. Nakonec byly stanoveny jako optimální podmínky - exprese do 100 ml BMMY média v 1l Erlenmeyerových baňkách, indukce methanolem do konečné koncentrace v médiu 0,5%, inkubace při 28 C za intenzivního třepání (240 ot/min), optimální doba produkce pro protein rnkr-p1a byla určena na 19 h a pro isoformu B 48 h. Obr. 21: Optimalizace produkce proteinů rnkr-p1a a rnkr-p1b: Vzorky s označením A1-4, resp B1-4, odpovídají různým kultivovaným koloniím P. pastoris, které obsahují expresní vektor s DNA pro rnkr-p1a, resp. rnkr-p1b. Červeně jsou označeny zóny, ve kterých se nachází ţádané proteiny. 71

72 20. Extracelulární exprese receptorů rnkr-p1 v Pichia pastoris Po vyhodnocení výsledků z optimalizace produkce, proběhla exprese ţádaných proteinů ještě jednou. Na následujícím panelu (obr. 22) vidíme výsledek SDS elektroforesy po produkci proteinů po 36 a 48 hodinách od indukce methanolem. Vyznačené zóny, odpovídající receptorům rnkr-p1a a rnkr-p1b, byly z gelu vyříznuty a analyzovány na hmotnostní spektrometrii, kde výsledky jsou zobrazeny v následujícím odstavci. Obr. 22: Produkce receptorů rnkr-p1a a rnkr-p1b v P. pastoris: Označení A, resp. B, odpovídá vzorkům pro rnkr-p1a, resp. pro rnkr-p1b exprimovaným v expresním systému kvasinky. Předpokládaná velikost proteinů na SDS elektroforese je na obrázku vyznačena červeně. Identifikace exprimovaných proteinů rnkr-p1a a rnkr-p1b Zóny z SDS elektroforesy (obr. 22) o předpokládané velikosti hledaných receptorů byly z gelů vyříznuty a podrobeny trypsinovému štěpení a následné analýze hmotnostní spektrometrií MALDI/TOF. Postup práce je podrobněji popsán v metodické části (kapitola 16.8., str. 63). Výsledky finger printu MALDI-MS jsou uvedeny na následujících obr. 23 a

73 Obr. 23: Spektrum rnkr-p1a měřené na MALDI/TOF-MS Obr. 24: Spektrum rnkr-p1b měřené na MALDI/TOF-MS 73

74 21. Purifikace exprimovaných proteinů rnkr-p1 Pro purifikaci identifikovaných proteinů bylo zvoleno několik chromatografických metod. Vzorky byly před provedením chromatografií dialyzovány způsobem, který je popsán v kapitole Dialýza. Z chromatografických metod proběhla nejprve iontově výměnná chromatografie, dále chromatografie s reversní fází a nakonec gelová permeační chromatografie. Iontově výměnná chromatografie Pro tuto metodu byla pouţita kolona Q-Sepharosy, která byla ekvilibrována pufrem A pro ionexovou chromatografii proteinů o ph=8,5. Proteiny rnkr-p1a a rnkr-p1b se eluovaly s vnějším objemem, jelikoţ se při hodnotě ph=8,5 se na kolonu nechytaly. Předpokládané hodnoty jejich isoelektrických bodů jsou: pi (rnkr-p1a)=5,7 a pi (rnkr-p1b)=6,3. Chromatogram pro oba proteiny je na obr. 25 a následná analýza sbíraných frakcí v 15% polyakrylamidovém gelu SDS elektroforesy je zobrazena na obr. 26. Obr. 25: Chromatogram z iontově výměnné chromatografie proteinů rnkr-p1a a rnkr-p1b 74

75 Eluce zbývajících proteinů ve vzorcích po produkci byla zajištěna lineárním gradientem do 80% pufru B pro ionexovou chromatografii za 80 minut. Mnoţství eluovaných proteinů bylo sledováno spektrofotometricky měřením absorbance při 280 nm. Následná SDS elektroforesa proběhla s pouţitím 15% separačního gelu. U proteinu rnkr-p1a byla zakoncentrována frakce 1 (obr. 26), pro protein rnkr-p1b byly frakce 1 a 2 (na obr. 26 červeně vyznačeny) spojeny a téţ zakoncentrovány pomocí koncentrátorů Centriprep a pouţity na další chromatografickou metodu. Chromatografie s reversní fází Zakoncentrované frakce z iontově výměnné chromatografie byly okyseleny kyselinou trifluoroctovou a naneseny na kolonu Vydac-C4 (1x25 cm) ekvilibrovanou pufrem A pro RP-HPLC. Eluce vzorku proběhla spuštěním lineárního gradientu do 50% pufru B pro RP-HPLC za 45 minut. Obr. 27: Chromatogram z chromatografie s revesní fází proteinů rnkr-p1a: Červenými šipkami jsou označena místa, ve kterých byly sbírány frakce F9, F10 a F11. 75

76 Průběh chromatografií s reversní fází pro proteiny rnkr-p1a, resp. rnkr-p1b jsou na obr. 27, resp. obr. 29. Po lineárním gradientu byla kolona Vydac-C4 promyta za 1 minutu do 100% roztoku B a poté 10 minut při 100% pufru B. U jímaných frakcí byly na vakuové odparce odstraněny zbytky acetonitrilu a následně byly frakce analyzovány na SDS elekroforese s pouţitím 15% polyakrylamidového gelu. Výsledky jsou zobrazeny na obr. 28, resp. obr. 30. Červeně jsou vyznačeny zóny odpovídající velikosti proteinů rnkr-p1a a rnkr-p1b. Obr. 29: Chromatogram z chromatografie s revesní fází proteinů rnkr-p1b: Červenými šipkami jsou označena místa, ve kterých byly sbírány frakce f6-f10. Pro protein rnkr-p1a byly spojeny a zakoncentrovány frakce F9, F10 a F11, u isoformy B frakce f6, f7, f8, f9 a f10. Takto připravené vzorky byly pouţity na následující purifikační techniku. 76

77 Gelová permeační chromatografie Vzorky z předcházejícího purifikačního kroku byly zahuštěné na objem 100 µl a naneseny na kolonu Superdex 200 (1x30 cm), která byla předem ekvilibrována pufrem pro gelově permeační chromatografii. Proteiny byly eluovány při průtoku 0,4 ml/min a jejich mnoţství bylo sledováno spektrofotometricky měřením absorbance při 280 nm. Chromatogramy jsou zobrazeny na obr. 31. Sbírané frakce byly analyzovány na SDS elektroforese v 15% polyakrylamidovém gelu. Výsledky analýzy ukazuje obr. 32. Obr. 31: Chromatogramy gelově permeační chromatografie pro proteiny rnkr-p1a a rnkr-p1b: A) průběh chromatografie pro receptor rnkr-p1a, B) průběh chromatografie pro receptor rnkr-p1b. Červenými šipkami jsou vyznačena místa, ve kterých byly sbírány frakce fa a fb. Oba proteiny byly purifikovány na koloně Superdex 200. Obr. 32: Analýza frakcí po gelově permeační chromatografii proteinů rnkr-p1a a rnkr-p1b pomocí SDS elektroforesy: M označuje marker, fa je frakce obsahující receptor rnkr-p1a a frakce fb obsahovala protein rnkr-p1b. SDS elektroforesa proběhla v 15% polyakrylamidovém gelu. Frakce, ve kterých byla prokázaná přítomnost proteinů rnkr-p1a a rnkr-p1b, tj. frakce fa a fb, byly zakoncentrovány na mnoţství 5 mg/ml pro isoformu A a 6 mg/ml pro 77

78 protein rnkr-p1b. Stanovení koncentrace proběhlo metodou dle Bradfordové, kde podrobnější postup je popsán v metodické části diplomové práce. 22. Intracelulární exprese receptorů rnkr-p1 v Pichia pastoris Podmínky intracelulární exprese byly stejné, jako pro produkci proteinů do produkčního média. Vzorky byly zpracovány metodou popsanou v odstavci 16.1., str. 58. Analýza výsledků proběhla pomocí SDS elektroforesy, která je zobrazena na následujícím obr. 33. Obr. 33: Intracelulární produkce receptorů rnkr-p1a a rnkr-p1b v P. pastoris: Označení A, resp. B, odpovídá vzorkům pro rnkr-p1a, resp. pro rnkr-p1b exprimovaným v expresním systému kvasinky. Předpokládaná velikost proteinů na SDS elektroforese je na obrázku vyznačena červeně. U vzorků A3 a B1 byla přítomnost receptorů potvrzena na MALDI/TOF-MS. U vzorků A3 a B1 byly zóny, vyznačené červeně na obr. 33, z 15% polyakrylamidového gelu vyříznuty a po trypsinovém štěpení u nich byly pomocí MALDI/TOF-MS potvrzena přítomnost proteinů rnkr-p1a a rnkr-p1b. 78