Podstata nekvantového výlevu acetylcholinu na nervosvalové synapsi

Transkript

1 PØEHLEDNÉ ÈLÁNKY Podstata nekvantového výlevu acetylcholinu na nervosvalové synapsi Nature of non-quantal acetylcholine release at neuromuscular synapse Vyskoèil F. Fyziologický ústav Akademie vìd Èeské republiky, Praha, Katedra fyziologie živoèichù a èlovìka, Pøírodovìdecká fakulta, Univerzita Karlova, Praha SOUHRN Cílem tohoto èlánku je popsat pokrok, který nastal v oblasti popisu a vysvìtlení fenoménu nekvantového výlevu acetylcholinu (NQR), a na základì vlastních i literárních dat zdùraznit funkèní význam tohoto typu uvolòování. Klíèová slova: acetylcholin, nervosvalové spojení, nekvantový výlev, synapse SUMMARY The purpose of this report is to describe what progress was made in defining and explaining the phenomenon of NQR and to stress some functional roles of this type of release, as based on our own data and other observations. Key words: acetylcholine, neuromuscular junction, non-quantal release, synapse František Vyskoèil (Institute of Physiology, Academy of sciences of the Czech Republic, Prague and Department of Animal Physiology, Faculty of Sciences, Charles University, Prague): Nature of non-quantal acetylcholine release at neuromuscular synapse, Ès. fyziologie 57 (2 3): 83 90, ÚVOD Je všeobecně přijato, že se přenos vzruchu z motorických nervů na kosterní svaly na nervosvalové ploténce uskutečňuje stejně jako u většiny chemických synapsí uvolněním a působením relativně stabilního počtu molekul neuropřenašeče, zde acetylcholinu (ACh), tvořících jednotlivá kvanta. Hovoříme o kvantovém přenosu informace. Počet kvant je různý a kolísá od několika desítek na ploténkách teplokrevných obratlovců až po několik set u obojživelníků. Kvanta acetylcholinu (ACh) se synchronně uvolní v okamžiku příchodu vlny akčního potenciálu do posledního Ranwierova zářezu a pasivní depolarizací nervových zakončení, kdy se otevírají napěťově závislé vápníkové kanály a vniklý obláček vápenatých iontů aktivuje tzv. SNARE proteiny, které vedou ke splynutí membrán synaptického váčku a zakončení (pro přehled viz Slater, 2007). Sevřený šik molekul ACh v jednom kvantu aktivuje postsynaptické receptory nikotinového typu, které jsou také předmětem našeho zájmu (viz Svobodová et al., 2006; Lindovský et al., 2008). Vzniká depolarizační vlna excitačního ploténkového potenciálu (EPP), přerůstá v akční potenciál a ten cestou T-tubulů a uvolnění Ca 2+ z myoplazmatického retikula nakonec iniciuje kontrakci svalového vlákna. V klidu, bez nervové stimulace, je také pozorováno spontánní uvolnění jednotlivých kvant s frekvencí 3 10 s -1. Ale tyto malé milivoltové ploténkové potenciály vznikající uvolněním jediného kvanta nedosahují většinou prahu podráždění svalových vláken, a jsou proto označovány jako miniaturní ploténkové potenciály (MEPPs). Nicméně, v 70. letech z minulého století titíž zakladatelé kvantové hypotézy neurosekrece Bernard Katz a Riccardo Miledi a nezávisle na nich F. Vyskočil a P. Illes navrhli alternativní cestu přenosu molekul ACh z cytoplazmatického prostoru nervových zakončení do synaptické štěrbiny proces nazvaný nekvantové uvolnění (NQR) (Katz a Miledi, Československá fyziologie 57/2008 č

2 1977; Vyskočil a Illes, 1977). Tento proces je regulován mnoha fyzikálními, biochemickými a farmakologickými vlivy, a proto nemůže být považován za nějaký jednoduchý nespecifický únik děravou membránou. Účelem této první části dvoudílného přehledu je popsat, jakého pokroku bylo dosaženo při definování a vysvětlení fenoménu NQR. V druhé části chceme zdůraznit některé zatím popsané fyziologické role tohoto typu uvolnění na základě našich experimentálních údajů a samozřejmě i prací jiných autorů. PRVNÍ PROJEVY NQR Určité náznaky toho, že acetylcholin je schopen uvolnit se z nervového zakončení do okolí jinak než v kvantech, byly získány v šedesátých a sedmdesátých letech 20. století. Někteří autoři se pokusili určit množství ACh uvolněného z neuromuskulárního preparátu pomocí dostupných biochemických metod. Zjistili, že množství ACh v lázni, ve které se inkubovala nejčastěji izolovaná bránice předléčená anticholinesterázou (anti-ache), daleko převýšilo tu koncentraci, která by mohla být připsána na účet spontánně se uvolňujících kvant tvořících MEPPs (Mitchell a Silverová 1963; Fletcher a Forrester 1975). Depolarizace nervových a svalových vláken vyšším draslíkem (od 8 14 mm K + ) zvýšila celkový ACh 2 3krát, ale počet kvant vzrostl téměř desetkrát. Stejně tak jsme později zjistili, že při stimulaci nervu frekvencí 2 Hz vzrostlo celkové uvolnění ACh 1,4krát, ale množství kvant 45krát (Vizi a Vyskočil, 1979). Proto hlavní část klidového ACh musí být výsledkem jiného než kvantového uvolnění, a to buď z axonu, nervové terminály, nebo ze svalu. Experimenty s denervovanými svaly (Zemková et al., 1987; Nikolsky et al. 1996) potvrdily všechny možnosti, ale s převahou NQR z nervového zakončení (Krnjevic a Straughan, 1964; Potter, 1970; Doležal a Tuček, 1983, 1992). Vezmeme-li v úvahu četnost spontánního kvantu uvolnění (asi 5 kvant za sekundu), počet molekul ACh v kvantu (asi ) (Kuffler a Yoshikami, 1975) a počet synapsí v studovaném svalu, je snadné dospět k závěru, že pouze několik procent z celkového množství ACh se v klidu uvolňuje ve formě kvant. Další výzkum byl založen na srovnání obsahu a uvolnění ACh v inervovaný a denervovaných svalech, respektive svalových oblastí s ploténkami a bez nich. Ukázalo se, že téměř polovina ACh v lázni je svalového původu (Mitchell a Silver, 1963; Krnjevic a Straughan, 1964; Potter, 1970; Doležal a Tuček, 1983, 1992). Bylo prokázáno, že svalový ACh je syntetizován pomocí dvou různých enzymů: cholinacetyltransferázy (ES ) a karnitinacetyltransferázy (ES ). Ty se liší podle své lokalizace ve svalech, farmakologickými vlastnostmi a citlivostí na denervaci (Molenaar a Polak, 1980; Tuček 1982). Pokud jde o uvolnění ACh ze svalových vláken a jeho fyziologickou roli, tuto otázku je ještě třeba dořešit a problém jde nad rámec tohoto přehledu. Ale co je důležité přibližně 50 % ACh není uvolněno v klidu ani ze svalu, ani na ploténce v kvantech. Tato část by tedy měla být chápána jako uvolnění nekvantové. Jinými slovy, na vlastním nervovém zakončení existují dva hlavní mechanismy výlevu kvantový a nekvantový (NQR), nebo také jinak, vezikulární a nevezikulární, přičemž ten kvantový představuje jen malý zlomek výlevu celkového (Vyskočil, 2003). Z hlediska naší koncepce NQR (Vyskočil et al., 1989), můžeme vysvětlit následující jev publikovaný už v roce 1954 Douglasem a Patonem (Douglas a Paton, 1954). Autoři popsali u kočky depolarizaci svalových vláken o několik mv v oblasti dvou ploténkových zón m. gracilis za pár desítek sekund po injekci s anti-ache do krční žíly. Rozložení elektrického potenciálu podél svalu bylo měřeno pohybem kovové elektrody na povrchu procházející ploténkový regionech svalu v parafín lázni. Tyto pokusy ukázaly, že extracelulárně měřená depolarizace se v obou ploténkových zónách rozvíjí po anticholinesteráze a což je podstatné pro posouzení příčiny chybí po denervaci. Ještě dodejme, že tato depolarizace nebyla doprovázen svalovými stahy, což vylučuje účast akčních potenciálů v nervových terminálách nebo zvýšené kvantové uvolnění. Tato zpráva zřejmě popisuje první elektrofyziologické pozorování toho, co dnes nazýváme NQR acetylcholinu z nervových zakončení. Později jsme použili podobný princip (Zemková et al. 1990). Myší hemidiafragma, která má ploténkové zóny nahloučené do příčného proužku, byla svisle zavěšena a pomalu ponořována do nádobky, v níž rozhraní kapalinavzduch sloužilo jako záznamová elektroda. Extracelulární záznamy (obr. lb) ukazují depolarizaci v okamžiku, kdy hladina roztoku projížděla při ponořování ploténkovou zónu. Obr. 1: Rozložení potenciálu podél m. gracilis koèky (A) a myší hemidiafragmy (B) (podle Douglas a Paton, 1954 a Vyskoèil et al., 1989). Spodní stopa na B ukazuje malou ploténkovou pozitivitu (surplus hyperpolarization), která odráží lehkou hyperpolarizaci (surplus hyperpolarizaci), kterou pravidelnì pozorujeme ve svalech s aktivní synaptickou cholinesterázou. Po aplikaci anticholinesterázy paraoxonu vznikla naopak místní depolarizace (vzestupná vlna, horní záznam) zøejmì v dùsledku uvolòovaného nekvantového ACh. Referenèní elektroda (Ag / AgCl drátek) byla umístìna na horní èásti svalu. 84 Československá fyziologie 57/2008 č. 2 3

3 H-EFEKT JAKO ELEKTROFYZIOLOGICKÉ MĚŘÍTKO NEKVANTOVÉHO VÝLEVU A. Definice H-efektu a podmínky jeho vzniku Důležitým metodickým krokem ke studiu NQR byly nezávislé pokusy Katze a Milediho (1977) a Vyskočila a Illese (1977), kteří použili metodu tzv. H-efektu. Metoda je založena na skutečnosti, že pokud je acetylcholinesteráza inhibována, ACh se může hromadit v synaptické štěrbině a způsobit dlouhodobou depolarizaci postsynaptické membrány, kterou můžeme eliminovat použitím (+)-tubocurarinu (kurare, TC), známého blokátoru postsynaptických nikotinových receptorů. Hyperpolarizace, která se vyvíjí po aplikaci TC ať už z mikropipety do synaptické zóny, nebo přímo do svalové lázně, byla nazvána H-efekt. Katz a Miledi (1977) popsali u žáby velmi malý H-efekt, asi 0,04 mv, kdežto u myších svalových vláken se zavedenou intracelulární mikroelektrodou jsme zaznamenali mnohem vyšší, přibližně 2 mv H-efekt v ploténkové oblasti (Vyskočil a Illes, 1977). Tato hyperpolarizace navozená TC se prakticky nevyskytuje už ve vzdálenosti 3 5 mm od nervového zakončení s výskytem miniaturních ploténkových potenciálů, tj. v extrasynaptické zóně bránic myši, křečka zlatého a potkana, které se nejčastěji používají pro studium NQR. Proužek bránice je ponořen do lázně s ireverzibilní anticholinesterázou paradoxonem nebo arminem (diethoxy-p-nitrofenyl-fosfát, viz většinu prací) po dobu 30 minut a poté důkladně promyty normálním fyziologickým roztokem. Měření klidových membránových potenciálů (RMP) intracelulární skleněnou mikroelektrodou se provádí minut po tomto postupu při kontrolách nebo v přítomnosti různých drog; buď kontinuálně z jednoho svalového vlákna, nebo rychlým změřením RMP ve 20 nebo více vláknech během 5 10 minut období před a v dalších 20 nebo více vláknech 5 10 minut po přidání 10 μm TC do média. Jak již bylo zmíněno, rozdíly (tj. hyperpolarizace, H-efekt) mezi střední hodnotou RMPs před a po TC jsou obecně považovány za depolarizaci způsobenou nekvantovým uvolněním ACh a velikost H-efektu je mírou NQR. Jak kontinuální, tak statistická metoda poskytuje stejné výsledky, jen měření po desítky minut z jednoho vlákna jsou technicky i časově náročnější (Vyskočil a Illes, 1977, 1978, Yu a Van der Kloot, 1990). Kontinuální metoda je používána většinou jen pro demonstraci tohoto jevu (obr. 2). Metoda hodnocení intenzity NQR pomocí H-efektu nebyla uznána okamžitě. Někteří autoři (Grinnel et al., 1989, Meriney et al., 1989) argumentovali tím, že H-efekt může být pouze laboratorní jevem, možným jen v přítomnosti anticholinesteráz, které mohou samy mít slabé cholinomimetické účinky a jejichž eliminace TC vede k hyperpolarizaci. Nebo je H-efekt výsledkem schopnosti samotných AChE inhibitorů stimulovat uvolňování a akumulaci ACh v izolovaných neuromuskulárních preparátech. Nicméně několik typů pokusů potvrdilo validitu H-efektu. Především jsme ukázali, že H-efekt je přítomen ve svalech izolovaných z myší, u nichž byla AChE blokována ještě Obr. 2: Úèinek (+)-tubocurarine (TC) na membránový potenciál v jednotlivých vláknech žabího m. sartorius (A. Katz a Miledi, 1977; kalibrace èasu 30 s, kalibrace amplitudy 84 na) a myší bránice (Vyskoèil a Illes, 1977) s inhibovanou AChE. TC zpùsobil vymizení MEPPs (mepp s, rychlé hroty smìrem nahoru, levá èást záznamù) a pomalou hyperpolarizaèní vlnu (H-efekt). Velmi malý H-efekt u žáby je zøejmì zpùsoben nejen nižším vstupní odporem svalových vláken, ale také menším nekvantovým uvolnìním, v porovnání s myší nebo potkanem. in vivo. Jeho velikost v tomto případě byla podobná H-efektu navozenému in vitro (Nikolsky et al., 1992). Obavy, že H-efekt je důsledkem odstranění slabého cholinomimetického účinku inhibitorů AChE, byly rozptýleny i experimenty, kdy byla nekvantová sekrece inhibována různými metodami (viz dále); v těchto případech aplikace anti-ache žádný měřitelný H-efekt nevyvolala. (Vyskočil et al. 1983; Doležal et al., 1983). Přesvědčivé údaje, že H-efekt není v důsledku přímého účinku anti-ache byly získány na preparátech s nízkou či chybějící AChE. Za prvé, v ko-kulturách motoneuronů a myocytů drápatky Xenopus bez AChE aplikace TC nebo α- bungarotoxin (oba inhibují čidla ACh, nachr receptory) vedly k významné hyperpolarizaci inervovaných myocytů (H-efektu), což nebylo pozorováno v neinervovaných myocytech (Sun a Poo, 1985). U 7 9denních myší, kde svaly nemají ještě funkčně dozrálou AChE, byl H-efekt také zaznamenán po přidání TC, aniž by byly použity jakékoli AChE inhibitory (Vyskočil a Vrbová, 1993). Konečně, H-efekt byl pozorován v bránici myší s knockoutovaným genem pro kolagen Q. Tento kolagen je rozhodující pro ukotvení AChE v bazální membráně v synaptické mezeře, takže tato AChE chybí a není třeba žádné anticholinesterázy (Minic et al., 2002). Proto máme solidní základy pro domněnku, že H-efekt je odpovídající elektrofyziologickou metodou, která odráží velikost nekvantového ACh uvolňovaného z nervových zakončení. Nicméně je H-efekt založen na postsynaptické depolarizaci NQR acetylcholinem, a proto je nezbytné stále sledovat počet, citlivost a kinetiku čidel postsynaptických receptorů, stejně jako změny ve vstupním odporu postsynaptické membrány. To umožňuje především paralelní monitorování parametrů MEPPs, které jsou tedy významné pro kalibraci metody a kvantitativní hodnocení NQR. B. Iontové a teplotní závislosti Když jsme se chtěli dozvědět více o faktorech určujících NQR, začali jsme klasickým způsobem studovat vliv Československá fyziologie 57/2008 č

4 různých modifikací iontového složení lázně na H-efekt a srovnávali s působením na výlev kvantový (Vyskočil et al., 1983). Jak evokované EPPs, tak spontánní MEPPs jsou ovlivněny koncentrací Ca 2+ v lázni, ale s rozdílnou kinetikou. Pro evokované kvantové EPPs a tedy přenos impulsu je vstup Ca 2+ naprosto kritický a snížení koncentrace pod 0,5 mm vede k téměř okamžitému snížení počtu kvant pod hodnotu pro vznik svalového akčního potenciálu. Pro získání informace o Ca závislosti NQR jsme studovali amplitudu H efektu v roztocích Ca 2+ koncentracemi od nominální nuly do 15 mm. H-efekt byl maximální při 2 mm Ca 2+, tj. při normální fyziologické hodnotě, a klesal jak při růstu, tak poklesu Ca. Ale změny byly mnohem pomalejší a nové ekvilibrium bylo dosaženo až pro více než 60 minutách (Nikolsky et al., 1991a). Podobná závislost na Ca 2+ byla zjištěna v embryonální neuromuskulární synapsi v tkáňové kultuře Xenopus (Sun a Poo, 1985), kde H-efekt zmizel už v 8 mm Ca 2+. Změny koncentrace K+ v lázni od 0,5 až 15 mm a hypertonický roztok (oba postupy zvyšují MEPPs frekvence) ovlivnily H-efekt pouze mírně (Vyskočil et al., 1983), ale byla zjištěna překvapivě silná závislost na vnější koncentraci Mg 2+ (Zemková a Vyskočil, 1989; Vyskočil a Vrbová, 1993). Při absenci Mg 2+ byl H-efekt maximální; přítomnost 1 mm Mg 2+ snížila H-efekt o třetinu a prakticky byl neměřitelný v koncentracích 3 4 mm Mg 2+. Teplotní závislost H-efektu má komplexní charakter. Bylo zjištěno, že v rozmezí 10 až 35 С má intenzita NQR dvě relativní maxima při teplotě 20 a 35 С a minima na úrovni 25 až 10 С; v druhém případě byl H-efekt už neměřitelný. Při posuzování je třeba mít na paměti, že NQR může klesat nejen když je výlevový mechanismus v membráně inhibován, ale i za situace, kdy se cytosolický ACh vylévá rychleji, než se doplňuje syntézou z cholinu a acetyl koenzymu A. Komplikovaná teplotní závislost H-efektu odráží zřejmě různou teplotní závislost syntézy Ach, jeho vylučování pomocí transportéru a možná i kinetiku dalších regulačních mechanismů (ATP aj., viz druhá část). Zároveň je intenzita spontánního kvantového uvolňování (frekvence MEPPs) zvyšována s teplotou exponenciálně (Lupa et al., 1986; Nikolsky a Voronin, 1986). Oba procesy uvolňování ACh mají tedy různé teplotní a iontové závislosti, což naznačuje, že zejména NQR se řídí poměrně složitou souhrou několika nezávislých procesů. MOŽNÉ MECHANISMY NEKVANTOVÉHO VÝLEVU A. Vezikulární ACh Transportér Vzhledem k tomu, že membrána nervového zakončení by měla být prakticky nepropustná ke kationu velikosti ACh, je pravděpodobné, že v ní bude existovat nějaký druh dopravního systému, který přenáší ACh z cytosolu do synaptické štěrbiny. Charles Edwards (Edwards et al.,1985; 1988; Vyskočil 1985) se spolupracovníky předložili hyprotézu, že při nekvantovém uvolnění ACh hrají významnou úlohu vezikulární ACh transportéry (VAChT), které zásobují synaptické měchýřky acetylcholinem výměnou za protony (Parsons a Koenigsberger, 1980; Anderson et al., 1982). Při výlevu kvant dochází ke krátkodobému (kiss and-run) nebo delšímu (kiss-and-stay) splývání jejich membrán. Jestliže zachová vesikulární VAChT v membráně nervu po splynutí svou funkční orientaci, může se stát cestou pro nekvantový výlev, kterým proudí ACh ven, především během kissand-stay exocytózy, která je nyní nejvíce preferovaným mechanismem uvolnění kvanta (He a Wu, 2007). Tuto hypotézu jsme testovali farmakologicky. Ukázalo, že mezi asi 80 sloučeninami, které inhibovaly v měchýřcích VAChT, byly nejúčinnější vesamikol (phenylpiperidinocyclohexanol), quinacrine a tetrafenylborát (Anderson et al., 1983 a, b). Tyto sloučeniny také utlumily velmi účinně H-efekt v podobných koncentracích jako VAChT (Edwars et al., 1985) a tím byla VAChT hypotéza podpořena. Dokonce se to podařilo prokázat nejen statistickým měřením desítek RMP, ale přímo na několika svalových vláknech s dlouhodobě zavedenou mikroelektrodou. Místní aplikace vesamikolu do blízkosti ploténky vyvolala během několika vteřin hyperpolarizaci (blokádou NQR) beze změny amplitudy MEPPs (obr. 3, Vyskočil, 1985). vesamicol Obr. 3: Mikroelektrodové intracelulární záznamy z jednoho svalového vlákna myší bránice pøi aplikaci 0,1 mm vesamikolu z pipetky (A pøi RMP -74 mv, B pøi depolarizaci na -50 mv) a kontrolního Ringerova roztoku (C) z r Vesamikol odstranil depolarizaci nekvantovým výlevem (depolarizaèní vlna smìrem dolù), ale nikoliv spontánní kvantový výlev, miniaturní ploténkové potenciály, které jsou pøi pomalém pohybu osciloskopického paprsku vidìt jako hustá síś rychlých depolarizací smìrem nahoru. Vpravo dole je extrapolace poklesu amplitud (ordináta) MEPPs (plná linie) a H-efektu (pøerušovaná linie) pøi depolarizaci (abscisa), ukazující pøibližnì stejnou úroveò reversního potenciálu kolem -5 mv. Vpravo nahoøe je schéma VAChT hypotézy. Po exocytóze kvanta a splynutí membrán je NQR (non-quantal) uskuteèòován stejnì jako hromadìní ACh ve váècích (ACh uptake). 86 Československá fyziologie 57/2008 č. 2 3

5 VAChT realizuje antiport ACh + a H + (vnitřek váčků je nejprve kyselý díky aktivnímu transportu protonů) (Anderson et al., 1982) a pokud nekvantové uvolnění podobně vyžaduje také gradient protonů, pak by se měl i NQR zvýšit při poklesu ph ve vaničce a naopak snížení protonového gradientu v opačném směru, než je požadováno pro H + /ACh + výměnu by mělo NQR, potažmo H-efekt snížit. Tento předpoklad se také potvrdil. Při ph 6,4 až 7,4, přidání TC vyvolalo obvyklý H-efekt. Nicméně, při ph 8,4 nebo 9,4 H byl efekt mnohem menší ve srovnání s kyselejšími (neproustnými) pufry kolem ph 6, kde byl H-efekt potencován (Edwards et al., 1985). Také jsme jistili, že H-efekt zvyšuje inhibitor Na/K pumpy ouabain (Vyskočil a Illes, 1977, Zemková et al., 1990). Mohlo by to být způsobeno tím, že blokáda Na + /K + - ATPázy touto drogou odstraní zdroj protonů v nervových terminálách (blokuje hydrolýzu ATP, kdy vzniká proton), což by mělo tendenci učinit cytoplazmu více alkalickou, a tato změna v koncentračním gradientu protonů přes membránu by mohla usnadnit ACh-protonovou výměnu přes VAChT dopravník. Jiná možnost vyplývá z poznatku, že ouabain může prodloužit dobu mezi exocytózou váčku (splynutím) a endocytózou, kdy je váček vtažen zpět do terminály a recyklován (obrázek 3). Tudíž se může prodloužit doba, po kterou se VAChTs z váčků začleňují do nervových membrán (Haimann et al., 1985). V souhrnu lze říci, že účinky vesamikolu, quinakrinu, tetrafenylborátu, změny ph, a také vysokofrekvenční stimulace (Zemková et al., 1990) jsou v souladu s myšlenkou, že NQR používá výměníkový systém podobný nebo identický s vezikulárním VAChT. Objevily se zprávy, že embryonální myocyty jsou také schopny syntézy a uvolnění ACh v kvantovém (Girod et al. 1995) i nekvantovém módu (Fu et al., 1987; 1998). I tady VAChT inhibitory vesamikol a quinakrin snižují pravděpodobnost otevření receptorových kanálů uvolněným ACh, což silně naznačuje, že VAChT je rovněž přítomen v membráně myocytů a oba způsoby uvolnění jsou vývojově konzervovány. B. Cholinový transportér Jsou však možné i jiné, také experimentálně podložené mechanismy NQR. Jedním z nich je cholinový vysokoafinní transportér. Cholin je prekursorem AСh syntézy v cytosolu, ale je nutné ho nejprve dopravit dovnitř ze synaptické štěrbiny, což realizuje právě tento transportér. Ukázalo se, že H-efekt je zcela odstraněn již 10 minut po aplikaci hemicholinia-3, který je specifickým inhibitorem cholinového transportéru. Navíc, H-efekt je úspěšně eliminován i při použití jiného způsobu inhibice zpětného transportu cholinu při nahrazení Na + za ionty Li + ve svalové lázni (Nikolsky et al., 1991b), protože transportér pracuje v režimu symportu s Na +. Možná ale jeho inhibice jednoduše zastaví syntézu ACh a rychlé vyčerpání cytosolického ACh se projeví vymizením H-efektu. Tomu by napovídaly nálezy, že naopak přidání 1 μm cholinu roztoku a 3 Hz stimulace nervu prodlužuje perzistenci bez výraznějšího poklesu H-efektu po akutní denervaci na dobu několika hodin (Nikolsky et al., 1991a, obr. 4). Zda je cholinový transportér schopen přenosu ACh z cytosolu ven (podobně jako na dopaminový transportér, viz Carvelli et al., 2008) a může přepravovat retrográdně cholin a ortográdně Ach, nevíme a problém vyžaduje přímý průkaz nejlépe po zabudování těchto přenašečů do umělé membrány ( black membrane ). Existuje ještě další možnost. Bylo zjištěno, že cholinový H-effect (mv) Choline (10-5 M) + Stimulation (20 Hz) Hemicholinium (10-6 M) Replacement of Na + by Li + Choline (10-5 M) + stimulation (3 Hz) Time (h) Choline (10-5 M) Control Obr. 4: Intenzita nekvantového uvolnìní ACh mìøená jako H-efekt (ordináta) za rùzných úèinnosti vysokoafinního cholinového pøenašeèe. Abscisa èas (time) v hodinách. Kontrolní køivka ukazuje spontánní vymizeni NQR po 4 hodinách inkubace a tedy i denervace. Rychle vymizí pøi inhibici cholinového transportéru hemicholiniem-3 nebo odstranìním kotransportovaného Na iontu náhradou litiem a vysokofrekvenèní stimulací nervu (20 Hz). Pomaleji mizí pøi nabídce cholinu, a neklesá pøi nízkofrekvenèní stimulaci v pøítomnosti cholinu. Podle Nikolsky et al., 1991a. transportér je také kolokalizován s VAChT v membráně jedné subpopulace synaptických váčků v terminálách cholinergních neuronů myší míchy (Ferguson, et al., 2003). Po splynutí membrány váčku s terminálou se může vytvořit funkční komplex pro přepravu NQR acetylcholinu. Jak inhibice hemicholiniem-3, tak vesamikolem ho pak může vyřadit a tok NQR se zastaví. VELIKOST NEKVANTOVÉHO VÝLEVU Již bylo řečeno, že biochemická stanovení a biotesty* ukázaly, že spontánní kvantová sekrece představuje jen několik procent z celkového uvolněného ACh in vitro (Mitchell a Silverová, 1963; Fletcher a Forrester, 1975; Vizi a Vyskočil 1979). Srovnáním synaptické a extrasynaptické části svalu se zjistilo, že téměř polovina z uvolněného ACh je svalového původu (Tuček, 1982; Doležal a Tuček, 1983; 1992) a že NQR lze prokázat přímo v myocytech (Fu et al., 1998). U savců je úroveň nekvantového uvolnění ACh z nervových *V døevních dobách farmakologie se bìžnì používaly pro stanovení koncentrací bioaktivních látek, cholinomimetik, dopaminu aj. kontrakce proužkù hladké svaloviny z morèecího støeva (taenia coli nebo taenia caeci). Dnes se tento typ bioeseje v literatuøe vyskytuje už zøídka. Československá fyziologie 57/2008 č

6 zakončení poměrně velká, až do výše % z celkového uvolnění ACh v klidové ploténkové zóně (Vizi a Vyskočil, 1979).Ve svalech, ve kterých je nekvantové uvolnění blokováno například zvýšením Mg 2+, nebo několik hodin po denervaci, H-efekt podobné amplitudy může být vyvolán aplikací přibližně 0,1 μm ACh nebo jeho analogu karbacholinu do lázně. Lze proto předpokládat, že hladina NQR v ploténkách bránice myši nebo potkana je v řádu stovek nm. U žabích plotének je NQR mnohem menší a odpovídá 1 10 nm (Katz a Miledi, 1977) a podle některých (Meriney et al., 1989; Grinnel et al., 1989) je neměřitelný na kolagenázou opracovaných ploténkách (kolagenáza může poškodit NQR transportér, srovnej Marastoni et al., 2008). Několik předběžných pokusů však ukázalo, že u žáby (Rana temporaria) je H-efekt srovnatelný s bránicí (několik mv) při teplotách nad 30 C (Vyskočil, 1978). Výrazný NQR byl také změřen terčíkovým zámkem u růstových konusů motoneuronů drápatky in vitro (Young a Poo, 1983). Předpoklad, že NQR je vyvolán koncentrací ACh v řádu desítek až stovek nm v synaptické štěrbině, je podporován také následujícími experimentálními daty. Zjistili jsme, že RMP membrány svalových vláken s neporušenou cholinesterázou je v synaptické oblasti vyšší o 1 3 mv než v oblasti extrasynaptické, tj. 3 5 mm od intracelulárních nervových větévek. (Vyskočil et al., 1983; Shih, 1986; Vyskočil a Illes, 1978; Nikolsky et al., 1994; Vyskočil et al., 1995). Tato lokální hyperpolarizace může být odstraněna stejnými faktory, které eliminují NQR (denervací, zvýšením Mg 2 + nebo snížením Ca 2+ ). Aplikace nm ACh vedla k opětovnému objevení této hyperpolarizace (Vyskočil, 1974; Vyskočil et al., 1983; Nikolsky et al., 1994; Vyskočil et al.1995) (viz též obr. 3). V prvních elektrofyziologických pokusech na hlodavcích, s mikroelektrodou kontinuálně zavedenou v jednotlivých vláknech, a tudíž s postupně klesajícím RMP, byl H-efekt okolo1 2 mv. Ale ve většině následujících sděleních byly naměřeny hodnoty asi 5 6 mv (např. Galkin et al., 2001; Mukhtarov et al., 1999; Malomouzh et al., 2003; 2005; 2007). Někdy byly pozorovány zatím ne zcela vysvětlené výkyvy H-efektu, ať už spontánní nebo v závislosti na nervovém dráždění, pomocí kontinuálního extracelulárního měření v ploténkové zóně (Zemková et al., 1990). Velký H-efekt, a to až do 8 9 mv, byl nalezen u diafragmy potkana, když byla inhibována NO-syntáza a guanylyl cykláza (Mukhtarov et al., 2000; Malomouzh et al., 2003). V studii o inhibičním účinku ATP byla originální úroveň H-efektu asi 5 mv. Po aplikaci ATP byl H-efekt výrazně snížen, ale nebyl odstraněn úplně ATP. Proto lze spekulovat, že extracelulární ATP reguluje vysoké hodnoty H-efektu, zatímco menší hodnoty v rozmezí 1 2 mv jsou závislé na jiném principu regulace NQR, jak již bylo uvedeno výše, zřejmě cestou VAChT nebo cholinového transportéru. Role ATP pro řízení podstatné části NQR je podporován také zjištěním, že oba typy spontánního uvolňování acetylcholinu (kvantový a nekvantový) vzrostly během prvních 30 minut hypoxie, navozené v roztoku s běžným extracelulární kalciem ([Ca 2+ ] out = 2,0 mm). Je zajímavé, že hypoxií navozené desetinásobné zvýšení frekvence kvantových MEPPs prakticky neexistovalo v nízkých hodnotách vápníku ([Ca 2+ ] = 0,4 mm), kdežto H-efekt rostl (Bukharaeva et al., out 2005). To znamená, že každý z těchto dvou procesů uvolnění je ovlivněn procesy odlišně citlivými na nedostatek kyslíku. Vzestup frekvence MEPPs při nástupu hypoxie zřejmě vyžaduje Ca 2+ vstup do nervových terminál během anoxické depolarizace nervového zakončení, kdežto NQR může být regulován účinněji jinak, možná právě nižší hladinou ATP, která klesá v podmínkách hypoxie. NEKVANTOVÝ VÝLEV BĚHEM DENERVACE A REINERVACE Bylo prokázáno, že po motorické denervaci biochemicky měřené snížení celkového uvolněného ACh předchází poklesu kvantového uvolnění. To naznačuje, že se začíná spontánní NQR snižovat dříve než uvolňování kvantové (obr. 5, Nikolsky et al., 1996). Biochemická měření však nemohou u inervovaných svalů rozlišit mezi ACh z nervových terminál a svalových vláken. Proto byla provedena přímá elektrofyziologická měření H-efektu a MEPPs v průběhu několika dnů po intrathorakální jednostranné denervaci myší bránice a během reinervace zmáčklého n. frenicus. Jednu hodinu po zmáčknutí nervu v blízkosti bránice H-efekt klesl na 50 % a o čtyři hodiny později H-efekt zmizel úplně. Během této doby nebyly zjištěny žádné podstatné změny v kvantové sekreci (frekvenci a amplitudě MEPPs). Pak se postupně začala MEPPs frekvence zvyšovat (díky časné postdenervační depolarizaci a vtoku vápníku), ale po šesti hodinách denervace zásoby měchýřků poklesly, až po 16 hodinách kvantový výlev vymizel úplně a MEPPs nebyly nalezeny v žádném svalovém vlákně. Preferenční vymizení NQR může být způsobeno velmi rychlou inhibicí syntézy ACh v terminále a vyčerpáním cytosolického ACh a tudíž i jeho nekvantového uvolnění. Proč se ale zastaví syntéza tak rychle? Jde o inhibici zpětné reabsorpce cholinu do nervu, nebo je to vliv postdenervační depolarizace provázené otevřením vápníkových kanálů a vtokem Ca 2+ do terminály a následnou aktivací NO syntáz, produkujících inhibiční NO (viz druhou část)? Odpověď zatím neznáme, jen je třeba znovu připomenout, že podobný, dokonce i rychlejší zánik H-efektu (během několika minut) byl pozorován po aplikaci hemicholinia-3 nebo náhradou Na + za Li +. Oba tyto postupy brzdí rychlé vychytávání cholinu do nervových terminál (obr. 4 Nikolsky et al., 1991b). Velmi zajímavý byl proces reinervace. Jak ukazuje obr. 5, byl H-efekt zjištěn ještě tři dny před prvními známkami návratu kvantového uvolnění, tedy před znovuobjevením MEPPs (Nikolsky et al., 1996). První MEPPs byly často velmi pomalé a na K + nezávislé jevy, a velký počet z nich byly menší než 0,2 mv (asi pětina průměrné amplitudy). Úplný návrat MEPPs frekvence a jejich normální citlivost k K + a Ca 2+ byl pozorován až 20 dnů po poškození nervu, a to o několik dnů dříve v proximálních částech bránice blízko vstupu nervu než v distálních částech bránice. NQR evidentně během reinervace axonu předchází nebo úzce navazuje na morfologickou obnovu neuromuskulárního 88 Československá fyziologie 57/2008 č. 2 3

7 Obr. 5: Èasový prùbìh frekvence MEPPs (otevøené kroužky), podílu vláken se zjištìnými MEPPs (plné kroužky) a H-efektu (trojúhelníky) po zmáèknutí nervu ostrou pinzetou (crush, šipka, èas nula). Údaje byly shromáždìny z proximální èásti pravé hemidiafragmy myši a jsou vyjádøeny jako procento z hodnoty kontrol. Každý bod je prùmìr ± S.E.M. z 10 svalù. U každého svalu bylo intracelulární elektrodou zmìøeno 3 15 vláken a získány hodnoty frekvence MEPP a H-efektu (podle Nikolský et al., 1996). ditelné MEPPs), nebo že kvantové uvolnění a začlenění VAChT do membrány zakončení není tak nutné pro NQR, jak jsme si mysleli. Případně lze uvažovat o tom, že v průběhu prvních reinervačních dnů by mohl být VAChT (nebo jiný dosud nezjištěný transportér) syntetizován a začleněn do terminální membrány ještě před tím, než bude zakotven v měchýřcích. Tím by mohl vytvářet na kvantech nezávislou cestu uvolňování ACh z cytosolového prostoru, která předchází zrání měchýřků a uvolňování kvant. Regulací NQR na úrovni receptorů, ATP a NO kaskády a jeho úloze při synaptogenezi se bude zabývat následující část přehledu. Poděkování Autor děkuje Dr. A. Malomužovi, Ph.D., a prof. Dr. E. Nikolskému, DrSc., za cenné poznámky a návrhy. Článek vznikl za přispění Grantu GAAV IAA a AVOZ kontaktu a lze ho tedy považovat za první projev schopnosti nervové terminály syntetizovat a uvolňovat neuropřenašeč během reinervace. Na základě údajů o reinervaci je NQR tedy prokazatelný dokonce i bez zjevného kvantového uvolňování. Z hlediska VAChT hypotézy to znamená, že buď se v období kvantového klidu uvolňují měchýřky ještě nezaplněné ACh ( nevi- Profesor RNDr. František Vyskočil, DrSc., Fyziologický ústav Akademie věd České republiky, Vídeňská 1083, Praha, a Katedra fyziologie živočichů, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Praha vyskocil@biomed.cas.cz LITERATURA 1. Anderson DC, King SC, Parsons SM. Proton gradient linkage to active uptake of [3H]acetylcholine by Torpedo electric organ synaptic vesicles. Biochemistry. 1982, 21: Anderson DC, King SC, Parsons SM. Pharmacological characterization of the acetylcholine transport system in purified Torpedo electric organ synaptic vesicles. Mol. Pharmacol. 1983a, 24: Anderson DC, King SC, Parsons SM. Inhibition of [3H]acetylcholine active transport by tetraphenylborate and other anions. Mol. Pharmacol. 1983b, 24: Bukharaeva EA, Salakhutdinov RI, Vyskočil F, Nikolsky EE. Spontaneous quantal and non-quantal release of acetylcholine at mouse endplate during onset of hypoxia. Physiol. Res. 2005, 54: Carvelli L, Blakely RD, DeFelice LJ. Dopamine transporter/syntaxin 1A interactions regulate transporter channel activity and dopaminergic synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2008, 105: Doležal V, Tuček S. The synthesis and release of acetylcholine in normal and denervated rat diaphragms during incubation in vitro. J. Physiol : Doležal V, Tuček S. Effects of tetrodotoxin, Ca 2+ absence, d-tubocurarine and vesamicol on spontaneous acetylcholine release from rat muscle. J. Physiol. 1992, 458: Doležal V, Vyskočil F, Tuček S. Decrease of the spontaneous nonquantal release of acetylcholine from the phrenic nerve in botulinumpoisoned rat diaphragm. Pflűgers Arch. 1983, 397: Douglas WW, Paton WD. The mechanisms of motor end-plate depolarization due to a cholinesterase-inhibiting drug. J. Physiol. 1954, 124: Edwards C, Doležal V, Tuček S, Zemková H. Vyskočil F. Is an acetylcholine transport system responsible for non-quantal release of acetylcholine at the rodent myoneural junction? Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1985, 82: Edwards C, Doležal V, Tuček S, Zemkova H, Vyskočil F. A possible role for the acetylcholine transport system in non-quantal release of acetylcholine at the rodent myoneural junction. P. R. Health Sci. J. 1988, 7: Fletcher P, Forrester T. The effect of curare on the release of acetylcholine from mammalian motor nerve terminals and an estimate of quantum content. J. Physiol. 1975, 251: Fu W-M, Liou H-C, Chen Y-H Wang S-M. Release of acetylcholine from embryonic myocytes in Xenopus cell cultures. J. Physiol. 1998, 509: Fu W-M, Liu JJ. Regulation of acetylcholine release by presynaptic nicotinic receptors at developing neuromuscular synapses. Mol. Pharmacol. 1997, 51: Galkin AV, Giniatullin RA, Mukhtarov MR, Švandová I, Grishin SN, Vyskočil F. ATP but not adenosine inhibits nonquantal acetylcholine release at the mouse neuromuscular junction. Eur. J. Neurosci. 2001, 13: Girod R, Popov S, Alder J, Zheng JQ, Lohof A, Poo MM. Spontaneous quantal transmitter secretion from myocytes and fibroblasts: comparison with neuronal secretion. J. Neurosci. 1995, 15: Grinnel AD, Gundersen CB, Meriney SD, Young SH. Direct measurement of ACh release from exposed frog nerve terminals: constraints on interpretation of non-quantal release. J. Physiol. 1989, 419: Haimann C, Torri-Tarelli F, Fesce R, Ceccarelli B. Measurement of Československá fyziologie 57/2008 č

8 quantal secretion induced by ouabain and its correlation with depletion of synaptic vesicles. J. Cell. Biol. 1985, 101: He L, Wu LG. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends Neurosci. 2007, 30: Katz B, Miledi R. Transmitter leakage from motor nerve endings. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1977, 196: Krnjevic K, Straughan DW. The release of acetylcholine from the denervated rat diaphragm. J. Physiol. 1964, 170: Kuffler SW, Yoshikami D. The number of transmitter molecules in a quantum: an estimate from iontophoretic application of acetylcholine at the neuromuscular synapse. J. Physiol. 1975, 251: Lindovský J, Kaniaková M, Svobodová L, Vyskočil F, Krůšek J. Role of negatively charged amino acids in beta 4 F-loop in activation and desensitization of alpha 3 beta 4 rat neuronal nicotinic receptors. Biochim. Biophys. Acta. 2008, 1778(4): Lupa MT, Tabti N, Thesleff S, Vyskočil F, Yu SP. The nature and origin of calcium-insensitive miniature end-plate potentials at rodent neuromuscular junctions. J. Physiol. 1986, 381: Malomouzh AI, Mukhtarov MR, Nikolsky EE, Vyskočil F, Lieberman EM, Urazaev A. Glutamate regulation of non-quantal release of acetylcholine in the rat neuromuscular junction. J. Neurochem. 2003, 85: Malomouzh AI, Mukhtarov MR, Nikolsky EE, Vyskočil F. Muscarinic M1 acetylcholine receptors regulate the non-quantal release of acetylcholine in the rat neuromuscular junction via NO-dependent mechanism. J. Neurochem. 2007, 102: Malomouzh AI, Nikolsky EE, Lieberman EM, Sherman JA, Lubischer JL, Grossfeld RM, Urazaev AKh. Effect of N-acetylaspartylglutamate (NAAG) on non-quantal and spontaneous quantal release of acetylcholine at the neuromuscular synapse of rat. J. Neurochem. 2005, 94: Marastoni S, Ligresti G, Lorenzon E, Colombatti A, Mongiat M. Extracellular matrix: a matter of life and death. Connect. Tissue Res. 2008, 49: Meriney SD, Young SH, Grinnell AD. Constraints on the interpretation of nonquantal acetylcholine release from frog neuromuscular junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1989, 86: Minic J, Molgo J, Karlsson E, Krejci E. Regulation of acetylcholine release by muscarinic receptors at the mouse neuromuscular junction depends on the activity of acetylcholinesterase. Eur. J. Neurosci. 2002, 15: Mitchell JF, Silver A. The spontaneous release of acetylcholine from the denervated hemidiaphragm of the rat. J. Physiol. 1963, 165: Molenaar PC, Polak RL. Acetylcholine synthesizing enzymes in frog skeletal muscle. J. Neurochem. 1980, 35: Mukhtarov MR, Urazaev AKh, Nikolsky EE, Vyskočil F. Effect of nitric oxide and NO synthase inhibition on nonquantal acetylcholine release in the rat diaphragm. Eur. J. Neurosci. 2000, 12: Mukhtarov MR, Vyskočil F, Urazaev AK, Nikolsky EE. Non-quantal acetylcholine release is increased after nitric oxide synthase inhibition. Physiol. Res. 1999, 48: Nikolsky EE, Oranska TI, Vyskočil F. Non-quantal acetylcholine release after cholinesterase inhibition in vivo. Physiol. Res. 1992, 41: Nikolsky EE, Oranska TI, Vyskočil F. Non-quantal acetylcholine release in the mouse diaphragm after phrenic nerve crush and during recovery. Exp. Physiol. 1996, 81: Nikolsky EE, Voronin VA, Vyskočil F. Kinetic differences in the effect of calcium on quantal and non-quantal acetylcholine release at the murine diaphragm. Neurosci. Lett. 1991a, 123: Nikolsky EE, Voronin VA, Oranska TI, Vyskočil F. The dependence of non-quantal acetylcholine release on the choline-uptake system in the mouse diaphragm. Pflűgers Arch. 1991b, 418: Parsons SM, Koenigsberger R. Specific stimulated uptake of acetylcholine by Torpedo electric organ synaptic vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1980, 77: Potter LT. Synthesis, storage and release of [14C]acetylcholine in isolated rat diaphragm muscles. J. Physiol. 1970, 206: Shih YL. Abolishment of non-quantal release of acetylcholine from the mouse phrenic nerve endings by toosendanin. Jpn J. Physiol. 1986, 36: Slater CR. Structural factors influencing the efficacy of neuromuscular transmission. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008,1132: Sun Y-A, Poo M-m. Non-quantal release of acetylcholine at a developing neuromuscular synapse in culture. J. Neurosci. 1985, 5: Svobodová L, Krůšek J, Hendrych T, Vyskočil F. Physostigmine modulation of acetylcholine currents in COS cells transfected with mouse muscle nicotinic receptor. Neurosci. Lett. 2006, 401(1-2): Tuček S. The synthesis of acetylcholine in skeletal muscles of the rat. J. Physiol. 1982, 322: Vizi ES, Vyskočil F. Changes in total and quantal release of acetylcholine in the mouse diaphragm during activation and inhibition of membrane ATPase. J. Physiol. 1979, 286: Vyskočil F. The regulatory role of membrane Na+-K+-ATPase in nonquantal release of transmitter at the neuromuscular junction. In: The Cholinergic synapse, edited by Tuček S. New York: Elsevier Scientific Pub. Co. 1978, p Vyskočil F. Inhibition of non-quantal acetylcholine leakage by 2(4- phenylpiperidine) cyclohexanol in the mouse diaphragm. Neurosci. Lett. 1985, 59: Vyskočil F. Early postdenervation depolarization is controlled by acetylcholine and glutamate via nitric oxide regulation of the chloride transporter. Neurochem. Res. 2003, 28: Vyskočil F, Illes P. Non-quantal release of transmitter at mouse neuromuscular junction and its dependence on the activity of Na+-K+ ATPase. Pflűgers Archiv 1977, 370: Vyskočil F, Illés P. Electrophysiological examination of transmitter release in non-quantal form in the mouse diaphragm and the activity of membrane ATP-ase. Physiol. Bohemoslov. 1978, 27: Vyskočil F, Nikolsky E, Edwards C. An analysis of the mechanisms underlying the non-quantal release of acetylcholine at the mouse neuromuscular junction. Neuroscience 1983, 9: Vyskočil F, Nikolsky EE, Zemková H, Krusek J. The role of non-quantal release of acetylcholine in regulation of postsynaptic membrane electrogenesis. J. Physiol. 1995, 89: Vyskočil F, Vrbová G. Non-quantal release of acetylcholine affects polyneuronal innervation on developing rat muscle fibres. Eur. J. Neurosci. 1993, 5: Vyskočil F, Zemková H, Edwards C. Non-quantal acetylcholine release. In: Neuromuscular junction, edited Sellin LC, Libelius R, Thesleff S. Elsevier Science Publishers (Biomedical Division) 1989, p Young SH, Poo MM. Spontaneous release of transmitter from growth cones of embryonic neurones. Nature 1983, 305: Yu SP, Van der Kloot W. Non-quantal acetylcholine release at mouse neuromuscular junction: effects of elevated quantal release and aconitine. Neurosci. Lett. 1990, 117: Zemková H, Vyskočil F, Edwards C. A study on early post-denervation changes of non-quantal and quantal acetylcholine release in the rat diaphragm. Pflűgers Arch. 1987, 409: Zemková H, Vyskočil F, Edwards C. The effects of nerve terminal activity on non-quantal release of acetylcholine at the mouse neuromuscular junction. J. Physiol. 1990, 23: Zemková H, Vyskočil F. Effect of Mg 2+ on nonquantal acetylcholine release at the mouse neuromuscular junction. Neurosci. Lett. 1989, 103: Československá fyziologie 57/2008 č. 2 3