kovem. reakce probíhá u řady

Transkript

1 Spektrometrická analýza CÍL CVIČENÍ a) Zvládnout obsluhu automatizovaného spektrometru, sledování kinetiky enzymové reakce a inhibice enzymové aktivity těžkým kovem. b) Zvládnout základy spektrometrické analýzy nukleových kyselinn ÚVOD DO CVIČENÍ a) Kinetika enzymové reakce a inhibice enzymové aktivity Rostlinné i živočišné organismy obsahují enzymy, které v organismu zastávaní funkci katalyzátorů urychlující reakcee tím, že umožňují snížit její aktivační bariéru. Principem reakce za přítomnosti enzymu v roli katalyzátoruu je v prvním kroku vznik meziproduktu - komplexu enzym-substrát (ES). Ten umožňuje započetí reakce s překonáním podstatně nižší energetické bariéry. Po té následuje rozklad meziproduktu, který vede rovněž přes nízkou energetickou bariéru, za vniku produktu. Průběh reakce: E S k 1 ES Kinetiku enzymové reakce spočítáme dle metody Michaelis-Mentenové a paramenty této rovnice úpravou dle Lineweaver-Burka. To je možné za předpokladu, žee enzymová reakce probíhá dle výše uvedené rovnice. k 2 P E Obrázek 1: Grafické vyjádření metody Michaelis-Mentenové a Lineweaver-Burka Díky znečištění životního prostředí se může stát, že do organismu, ať už rostlinného nebo živočišného, může proniknout látka, která způsobuje inhibici různých enzymů tzn.. snižuje jejich aktivitu. Takováto látka se nazývá inhibitor. V experimentu budeme pracovat s enzymem ureázou (obr. 2) (EC , močovina amidohydroláza). Jedná se o obecně rozšířený enzym u rostlin a je také přítomna u řady eukaryotických mikroorganismů a baktérií. Skládá z 840 aminokyselinových zbytků a molekulová hmotnost je větší než 90 kda. Hraje klíčovou roli v katalýze rozkladu močoviny

2 za vzniku oxidu uhličitého a amoniaku. Pro stanovení aktivity enzymu e byla vypracována řada přímých i nepřímých analytických metod. Nejběžnější jsouu detekce amoniaku reakcí s 1 indofenolem, stanovení 14 CO 2 a řada enzymatických reakcí spojených se spektrofotometrickým měřenímm oxidace NADPH. V této úloze budeme stanovovat aktivitu enzymu ureázy tzv. Bertheletovou reakcí. Princip Bertheletovy reakce spočívá v reakci amonných iontů s chlornanem sodným, které tvoří monochloramin, který dále reaguje s fenolem za vzniku chinonchloriminu. Chinonchlorimin reaguje s další molekulou fenolu. Produktem reakce je indofenol, který je v kyselém prostředí žluté barvy, změnou ph do alkalické oblasti disociuje a přejde do d modréhoo zbarvení. Intenzitu I tohoto zbarvení měříme pomocí spektrometru. Obrázek 2: Ureáza b) Spektrometrická analýza nukleových kyselin Nejčastější a nejjednodušší způsob měření koncentrace nukleových kyselin je založen na skutečnosti, že aromatické struktury bází specificky absorbujíí UV-záření v oblasti určitých vlnových délek. Nukleové kyseliny absorbují UV-záření prostřednictvím konjugovaných elektronů, které se nacházejí nad a pod rovinou heterocyklických bází ve struktuře DNA a RNA. Charakteristické uspořádání elektronů vedee k různé intenzitě i absorbované energie fotonů různých vlnových délek. Pokud změříme absorbanci (A) čistéhoo vodného roztoku nukleových kyselin při různých vlnových délkách pomocí spektrofotometru a výsledek vyneseme do grafu, ve kterém je na osee x vlnová délka v nanometrech a na ose y intenzita i absorpce, získáme charakteristickou křivku s typickým vrcholem při 260nm. Absorbance vzorku přitom přímo závisí na množství nukleových kyselin v roztoku a hodnotu absorbance při 260 nm (A260) můžeme využít k výpočtu koncentrace rozpuštěné r nukleové kyseliny. Pokud má ovšem křivka jiný průběh, znamená to, že roztokk obsahuje kromě nukleových kyselin také jiné příměsi absorbující UV, nejčastěji bílkoviny. Nejsnáze to lze bez proměřování celé křivky posoudit podle poměru absorbancí při 260 a 280nm, protože bílkoviny zvyšují A280 výrazněji než A260. Pokud jsou v roztoku pouze nukleové kyseliny, pak míra specifické absorpce odpovídá koncentraci nukleových kyselin v roztoku. Protože jsou ale nukleové kyseliny izolovány i z buněk, jsou jejich roztoky často kontaminovány bílkovinami. Ty obsahují aromatické aminokyseliny fenylalanin a tyrosin, které také specificky absorbují UV-záření. Intenzita absorpce UV-záření nukleovými kyselinami a

3 bílkovinami se liší při různých vlnových délkách, proto lze čistotu vzorku posoudit z poměru absorbancí při 260nm a 280nm. Poměr absorbancí při 260 a 280nm je pro vzorek nukleových kyselin charakteristický vzhledem k charakteristickému tvaru absorpční křivky. Protože tvar křivky je vždy stejný bez ohledu na koncentraci nukleových kyselin, je také stejný poměr mezi absorbancí při 260nm (A260) a při 280nm (A280). Hodnota A260 je u čistého vzorku nukleových kyselin dvojnásobná oproti A280, takže poměr R (A260/A280) = 2,0. Pokud je vzorek znečištěn bílkovinami, které díky aromatickým aminokyselinám fenylalaninu a tyrosinu více absorbují při 280nm, křivka se při 280nm zvedá a poměr A260/A280 klesá pod 2,0. Pro běžné použití v molekulární genetice postačí, když se čistota vzorku nukleových kyselin, vyjádřená poměrem A260/A280 pohybuje mezi 1,8 a 2,0. Koncentraci DNA a RNA nelze spektrometrickým měřením odlišit, proto je nutné vždy jednu složku roztoku odstranit. Nejčastěji je určována koncentrace DNA, pro jejíž výpočet lze použít různé vzorce podle povahy měřené nukleové kyseliny. Způsoby výpočtu koncentrace nukleových kyselin na základě absorbance vzorku při 260nm se liší podle toho, zda jde o DNA nebo RNA a zda je molekula jednovláknová (ss = angl. single-stranded) nebo dvojvláknová (ds = angl. doublestranded). Pokud neznáme sekvenci, případně molekulovou hmotnost molekuly, můžeme určit pouze hmotnostní koncentraci nukleové kyseliny, obvykle v µg/ml (mikrogramy na mililitr), resp. v ng/µl (nanogramy na mikrolitr): dsdna: C = A 260 /0.02 [g/ml] ssdna: C = A 260 /0.027 [g/ml] RNA: C = A 260 /0.025 [g/ml] Při známé sekvenci, např. při syntéze primeru (ssdna), můžeme vypočítat molekulovou hmotnost a určit přímo molární koncentraci nukleové kyseliny, obvykle v pmol/µl (pikomoly v mikrolitru): C = A /[1.5*A C + 1.2G T]) [pmol/µl] kde A je počet adeninů v sekvenci, C počet cytosinů atd. Pokud je sekvence neznámá, ale molekulovou hmotnost známá (např. u pruhu, izolovaného z gelu, kde jsme srovnáním s markerem molekulové hmotnosti určili alespoň s určitou přesností mol. hmotnost), můžeme také určit přímo molární koncentraci nukleové kyseliny, obvykle v pmol/µl (pikomoly v mikrolitru): dsdna: C = A 260 /13.2*m.w. [pmol/l] ssdna: A 260 /10*m.w. [pmol/l] Předpokladem pro správné určení koncentrace výpočtem na základě absorbance při 260 nm je samozřejmě čistota vzorku - v roztoku musí být při měření přítomna pouze nukleová kyselina. Čistotu lze určit podle průběhu absorpční křivky, příp. zjednodušeně na základě poměru absorbancí při 260 a 280 nm.

4 POSTUP PRÁCE a) Kinetika enzymové reakce a inhibice enzymové aktivity 1) Inhibice enzymu ureázy toxickým kovem Roztoky potřebné pro stanovení: Standardní roztok chloridu amonného: 0,05349 g rozpustíme v destilované vodě a doplníme v odměrné baňce do 10 ml. Získáme 0,1 M roztok, který dále ředíme 100krát tzn. 1 ml 0,1 M zásobního roztoku napipetujeme do 100 ml odměrné baňky a doplníme destilovanou vodou po rysku. Fenolový roztok: 0,017 g nitroprusidu rozpustíme přibližně v 40 ml destilované vody, přidáme 3,5 g fenolu a doplníme v odměrné baňce do 50ml. Chlornanový roztok: na přípravu 50 ml: 0,74 g NaOH rozpustíme v kádince přibližně ve 35 ml destilované vody, po rozpuštění přidáme 5,57 g Na2HPO4 7H2O a 4,15ml 12% NaOCl. Následně upravíme ph na 12 pomocí NaOH (asi 3 pecičky) a doplníme v odměrné baňce na 50 ml. Roztok močoviny: 0,06006 g močoviny rozpustíme v destilované vodě a doplníme do 100 ml. Získáme 0,01M roztok. 10 jednotkový roztok ureázy: do mikrozkumavky navážíme 0,002 g standardu ureázy a přidáme 1 ml destilované vody a pečlivě promíchám na třepačce (získáme tak 100 jednotkový roztok). Tento roztok celý přepipetujeme do 10 ml odměrné baňky a dolijeme destilovanou vodou po rysku. Roztoky kovů: vycházíme z 1mM roztoku, ze kterého připravujeme ostatní koncentrace. Připravíme si řadu o koncentracích kovu 500; 100; 50; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 μm. Roztoky 5; 2,5; 1,25; 0,625 μm připravujeme půlením. Příprava kalibrační křivky: o příprava kalibračních roztoků půlením z roztoku NH 4 Cl v koncentracích 35 0,137 mg N. o analýza kalibračních roztoků Berthelotovou reakcí na automatického analyzátoru. o odečtení naměřených hodnot a sestrojení kalibračního grafu vyjadřující závislost absorbance na obsahu N v mg. o do mikrozkumavek napipetovat 250 μl ureázy (připravujeme pro všechny kovy současně) o přidat 250 μl roztoku kovu (teď pracujeme rychle) o vše hned promíchat o po 30 sekundách přidáme 250 μl 0,01 M močoviny. o stanovit aktivitu enzymu ureázy dle Berthelota. Stanovení dle Berthelota: o připravit reakčními roztoky o nádobka R1 chlornanový roztok zředěný destilovanou vodou v poměru 1:6 o nádobka R2 fenolový roztok o umístit vzorky do reakčního disku analyzátoru o dle instrukcí obsluhy spustit analýzu o odečíst hodnoty absorbance o vyhodnotit pomocí kalibračního grafu. Nastavení automatického analyzátoru (v kolonce parametrs): Priwave: 630 nm Secwave: 670 nm Reac. Time: 0-40 R1: 448 μl R2: 42 μl Sample: 10 μl

5 1. který toxický kov jste použilii 2. kalibrační graf 3. graf inhibice enzymu v závislosti na koncentraci toxického kovuu 2) Stanovení enzymové aktivity o do mikrozkumavek si napipetovat 166 μl různých koncentrací močoviny m o v minutových intervalech přidat 166 μl enzymu o nechat 10 min inkubovat za laboratorní l teploty o přidat v minutových intervalech 166 μl 10 % ZnSO44 a po kapkách 166 μl 0,,2 M NaOH. o vzniklý roztok necháme 10 min stát za laboratorní teploty o vzniklou sraženinu centrifugovat 5 min při 5000 x g. o odebrat do čisté mikrozkumavky čirý roztok nad sraženinou a stanovíme v něm obsah dusíku o zjištěné hodnoty zapsat do tabulky a vyhodnotit dle metody Michaelis-Mentenové a Lineweaver-Burka. Tabulka: 4. kalibrační graf 5. vyhodnocení dle Michaelis-Mentenové a Lineweaver-Burka. b) Spektrometrická analýza nukleových kyselin o do mikrozkumavek si připravte kalibrační řadu standardu dsdna, vyjděte ze zásobní koncentrace roztoku a dále pokračujte půlkovým ředěním o seznamte se s obsluhou automatickéhoo spektrálního analyzátoru AnalytikJena Specord S 600 o při 260 a 280nm změřte absorbanci jednotlivých bodů kalibrační křivky a tří předložených vzorků o na základě poměru absorbancí při 260 a 280nm určete čistotuu vzorků 6. kalibrační graf 7. vyhodnocení čistoty vzorků