Jaroslav Hrabák, Radka Walková, Helena Žemličková, Tamara Bergerova, Pavla Urbášková. Skupina dle klasifikace Označení karbapenemáz Bakteriální druhy

Transkript

1 Detekce karbapenemáz u enterobakterií pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie (MS), fenotypových inhibičních testů a molekulárně-mikrobiologickými technikami Detection of carbapenemases in enterobacteria by MALDI-TOF mass spectrometry, inhibitor-based phenotypic tests, and molecular microbiology techniques Jaroslav Hrabák, Radka Walková, Helena Žemličková, Tamara Bergerova, Pavla Urbášková Souhrn Summary Nalezení spolehlivé metody detekce karbapenemáz u enterobakterií a některých gramnegativních nefermentujících tyček je velkou výzvou současné klinicko-mikrobiologické diagnostiky. Tento článek shrnuje možnosti detekce karbapenemáz u enterobakterií inhibičními fenotypovými testy, pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie a molekulárně-mikrobiologickými metodami. Finding a reliable method for the detection of carbapenemases in enterobacteria and some Gram-negative nonfermenting rods is a big challenge for current clinical microbiological diagnosis. This article summarizes the possibilities for carbapenemase detection in enterobacteria provided by inhibitor-based phenotypic tests, MAL- DI-TOF mass spectrometry, and molecular microbiology techniques. Zprávy EM (SZÚ, Praha) 2012; 21(4): Klíčová slova: Enterobacteriaceae, KPC, MBL, meropenem, DDST Keywords: Enterobacteriaceae, KPC, MBL, meropenem, DDST 1. ÚVOD Z epidemiologického hlediska nejzávažnějším typem rezistence u gramnegativních bakterií je produkce karbapenemáz enzymů hydrolyzujících amidovou vazbu čtyřčlenného β-laktamového kruhu. V klinické praxi se lze nejčastěji setkat s karbapenemázami u gramnegativních nefermentujících tyček (pseudomonády, acinetobaktery) a v poslední době také u enterobakterií [9, 11, 14]. K šíření těchto enzymů dochází horizontálním přenosem genetické informace, obvykle prostřednictvím epidemicky úspěšných konjugativních plazmidů. Významné je i šíření epidemicky úspěšných klonů, které mohou v některých případech dominovat celosvětově [21]. Karbapenemázy jsou členěny, stejně jako ostatní β-laktamázy, dle klasifikace navržené K. Bush a spolupracovníky, případně dle Amblera. V těchto klasifikačních systémech, jenž se vzájemně překrývají, jsou zařazeny ve třech skupinách (viz tabulka I.). Detekce karbapenemáz je nezbytně nutnou podmínkou pro provádění efektivních preventivních opatření pro zabránění šíření tohoto typu rezistence [9]. Základní fenotypové metody využívají schopnost některých látek (EDTA, Tabulka I. KLINICKY VÝZNAMNÉ TRANSFERABILNÍ KARBAPENEMÁZY Skupina dle klasifikace Označení karbapenemáz Bakteriální druhy podle Bush/Amblera, označení u nichž byly tyto enzymy nalezeny Skupina 2f / A KPC, Enterobacteriaceae GES, SME, IMI, NMC (Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens atd.), Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii Skupina 3 / B, VIM, IMP, GIM, SIM, NDM, Enterobacteriaceae, metalo-β-laktamázy SPM, AIM, KMH, DIM, TMB Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii Skupina 2d / D OXA-48, OXA-162, OXA-181 Klebsiella pneumoniae, OXA Enterobacter cloacae, Escherichia coli; Skupiny OXA-23, -58, -40 Acinetobacter baumannii 148

2 INFORMACE Z NRL A ODBORNÝCH PRACOVIŠŤ SZÚ fenylboritá kyselina atd.) tyto enzymy inhibovat [10]. Metody synergie s inhibitory však nemají dostatečnou specificitu a jejich použití je závislé na konkrétní epidemiologické situaci v regionu [15]. Karbapenemázy typu OXA nejsou těmito metodami detekovatelné. Přímou metodou průkazu je Hodge test, který byl pokládán za spolehlivou techniku identifikace karbapenemázové aktivity. Specificita tohoto testu je však limitována [7] a v Evropě není považován za vhodnou diagnostickou metodu [9]. Molekulárně-genetické techniky jsou omezeny pouze na známé β-laktamázy, vyžadující použití více PCR reakcí. V některých případech pozitivity PCR reakce by specificita produktu měla být ověřena jeho sekvenováním. Metody založené na mikročipech mají zatím omezenou reprodukovatelnost a jsou závislé na kvalitě izolované DNA [Hrabák, nepublikovaná data]. Molekulárně-genetické metody jsou aplikovatelné tam, kde je nutná rychlá identifikace producenta karbapenemázy na základě znalosti epidemiologické situace. Negativní výsledek vyšetření ovšem nesmí být považován za vyloučení produkce karbapenemázy. Referenční metodou je spektrofotometrické stanovení hydrolytické aktivity karbapenemázy v bakteriálním extraktu [4]. Tato metoda však není spolehlivá pro detekci karbapenemáz u Acinetobacter baumannii, pro rutinní praxi kvůli technické náročnosti nevhodná a její použití je obvykle omezeno pouze na specializovanou referenční laboratoř. V roce 2011 byly publikovány přímé metody založené na detekci karbapenemáz pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie (MS) analýzou karbapenemů a jejich degradačních produktů [2, 12]. Tyto metody mají potenciál stát se rychlou, levnou a spolehlivou diagnostikou karbapenemáz v rutinní mikrobiologické laboratoři. Následující text shrnuje metodická doporučení pro detekci karbapenemáz u enterobakterií MALDI-TOF MS analýzou, inhibiční metodou pro průkaz metalo-β-laktamáz a serinových karbapenemáz (především KPC) a molekulárně-genetickými technikami. Reaguje na v současnosti připravované oficiální dokumenty EUCAST ( eucast.org/organization/subcommittees/eucast_subcommittee_ on_resistance_mechanisms/) a European Network on Carbapenemases (ENC) pod záštitou ESCMID. Toto metodické doporučení může být diagnostickými laboratořemi využito jako základ standardního operačního postupu. 2. VYHLEDÁVÁNÍ SUSPEKTNÍCH PRODUCENTŮ KARBAPENEMÁZY Základním kritériem pro vyslovení podezření na produkci karbapenemázy je snížená citlivost k alespoň jednomu z karbapenemů. Precizní volbou by bylo srovnání zjištěné minimální inhibiční koncentrace (MIC), případně průměru inhibiční zóny (IZ), s epidemiologickým cut-off u konkrétního druhu. Z hlediska praktické aplikace však tento přístup není v rutinní diagnostice proveditelný. Proto se lze řídit dle současných break-pointů EUCAST nebo CLSI (viz tabulka II). Jako indikátorové antibiotikum lze použít ertapenem [10]. Podezřelý kmen je hodnocen jako necitlivý k alespoň jednomu z testovaných karbapenemů. Tabulka II. KLINICKÉ BREAK-POINTY KARBAPENEMŮ PRO ENTEROBAKTERIE [3, 5]. Antibiotikum EUCAST CLSI (2010) C R C R C R C R Imipenem 2 > 8 21 < Meropenem 2 > 8 22 < Ertapenem 0,5 > 1 25 < 22 0, Pro skríningové vyhledávání producentů karbapenemáz lze použít některé z komerčně dostupných selektivních kultivačních médií pro záchyt karbapenemáz, případně médií pro záchyt producentů ESBL. Média pro záchyt ESBL produkujících bakterií jsou výhodnější v případě detekce producentů KPC a metalo-β-laktamáz. Tato média však selhávají u producentů OXA DETEKCE KARBAPENEMÁZ POMOCÍ MALDI-TOF MS 3.1. Princip metody MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie umožňuje zobrazení látek o velmi malé molekulové hmotnosti. Tuto vlastnost využívají metody vyvinuté k detekci aktivity β-laktamáz [2, 12, 16]. Metody byly navrženy co nejjednodušeji, aby je bylo možné využít v rutinní mikrobiologické diagnostice. MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie umožňuje detekci molekuly karbapenemu a různých variant (degradační produkty, sodná sůl atd.). Z praktického hlediska se jedná o metodu, která, na rozdíl od molekulárněgenetických metod, poskytuje reálné informace o produkci karbapenemáz. Pracovní postup modifikované metodiky je uveden níže Meropenem a jeho štěpné produkty Relativní molekulová hmotnost meropenemu činí 383,5. Při MALDI-TOF MS analýze je detekován jeho iont [meropenem+h] + o m/z 384,5. Během zpracování vzorku vznikají ještě sodné soli meropenemu o m/z 406,5 a 428,5. Degradace meropenemu β-laktamázami probíhá v první fázi hydrolýzou amidové vazby čtyřčlenného β-laktamového kruhu. Následně dochází k dekarboxylaci molekuly. Molekula meropenemu, jeho degradačních produktů a sodných solí je zobrazena na obrázku 1; velikosti jednotlivých iontů nejčastěji detekovatelných při MALDI-TOF MS analýze jsou uvedeny v tabulce III Pracovní postup 1. 18hodinová bakteriální kultura z Mueller-Hintonova agaru se resuspenduje v pufru TRIS-HCl s NaCl, do výsledné denzity zákalu 3,0 McFarlanda; 2. 1 ml inokula se přenese do zkumavky typu eppendorf a centrifuguje po dobu 3 minut při g. 3. Pipetou se odstraní supernatant a peleta se resuspenduje v 50 μl reakčního pufru. 4. Po 2hodinové inkubaci při 35 C je směs centrifugována při g po dobu 2 minut μl supernatantu se okamžitě po centrifugaci nanese 149

3 Obrázek 1. MEROPENEM, JEHO DEGRADAČNÍ PRODUKTY A SODNÉ SOLI A B C D E A meropenem B sodná sůl meropenemu C hydrolyzovaný produkt D sodná sůl hydrolyzovaného produktu E dekarboxylovaný degradační produkt Tabulka III. MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI MEROPENEMU A JEHO DEGRADAČNÍCH PRODUKTŮ NEJČASTĚJI DETEKOVATELNÉ PŘI MALDI-TOF MS. Meropenem hydr hydrolyzovaná molekula meropenemu, Meropenem decarbox dekarboxylovaný degradační produkt Molekula m/z Meropenem MW 383,5 [Meropenem+H] + 384,5 [Meropenem+Na] + 406,5 [Meropenem+2Na] + 428,5 [Meropenem hydr +H] + 402,5 [Meropenem hydr +Na] + 424,5 [Meropenem hydr +2Na] + 446,5 [Meropenem hydr +3Na] + 468,5 [Meropenem decarbox +H] + 358,5 [Meropenem decarbox +Na] + 380,5 [Meropenem decarbox +2Na] + 402,5 na MALDI-TOF destičku a ihned smíchá s 1 μl roztoku matrice. 6. Při každém měření se na jednu pozici nanese samotný roztok meropenemu pro verifikaci správnosti stanovení molekulové hmotnosti. Pokud se změřená hodnota liší o více než 0,3 Da, musí být provedena rekalibrace. 7. Po zaschnutí se vzorek změří na několika místech, intenzita laseru se nastaví individuálně tak, aby se intenzita získaných spekter pohybovala v hodnotách 0,2x10 4 2,0x10 4. Měření musí probíhat okamžitě po zaschnutí vzorku. 8. Naměřená spektra se uloží do příslušného adresáře pod kódovým označením vzorku. 9. Analýza spekter se provede pomocí software flexanalysis Vyhodnocení a interpretace Výsledná spektra jsou analyzována pomocí programu flex- Analysis v rozmezí hodnot m/z V případě kmene produkujícího karbapenemázu jsou v získaném spektru přítomny peaky reprezentující degradační produkty meropenemu (dekarboxylovaný produkt 385,5; sodná sůl dekarboxylovaného meropenemu 380,5), zatímco meropenem (384,5) a jeho sodné soli (406,5, 428,5) nejsou přítomny. Jestliže testovaný kmen není producentem karbapenemázy, je ve výsledném spektru zastoupen meropenem a jeho sodné soli, a nejsou přítomny žádné degradační produkty. Interpretační kritéria pro vyhodnocení testu (viz obrázek 2): 150

4 INFORMACE Z NRL A ODBORNÝCH PRACOVIŠŤ SZÚ Obrázek 2. SPEKTRA ZÍSKANÁ PŘI DETEKCI KARBAPENEMÁZOVÉ AKTIVITY POMOCÍ MALDI-TOF HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE A roztok meropenemu, B negativní kontrola, C producent karbapenemázy (Escherichia coli produkující NDM-1). Kmen je považován za producenta karbapenemázy, jestliže je ve spektru přítomen alespoň jeden degradační produkt meropenemu s m/z 358,5 nebo 380,5 a zároveň není detekovatelná molekula meropenemu (384,5) a/nebo jeho sodné soli (406,5, 428,5). Kmen není považován za producenta karbapenemázy, jestliže je přítomen alespoň jeden peak reprezentující meropenem a/nebo jeho sodné soli (384,5, 406,5, 428,5) a zároveň není přítomen žádný z degradačních produktů (m/z 358,5, 380,5). 4. DETEKCE KARBAPENEMÁZ FENOTYPOVÝMI TESTY NA BÁZI INHIBITORŮ Pro detekci karbapenemáz jsou k dispozici fenotypové testy založené na schopnosti některých látek inhibovat aktivitu těchto enzymů. Obvyklé je uspořádání s umístěním disku s inhibitorem uprostřed plotny a do jeho blízkosti (obvykle ve vzdálenosti středu disků 20 mm) disky s karbapenemy (meropenem, imipenem), případně s ceftazidimem [10]. Další metodou je aproximační diskový test, kdy jsou srovnávány průměry inhibičních zón mezi diskem s indikátorovým antibiotikem (obvykle meropenem) a diskem s antibiotikem a inhibitorem [8, 15]. Obdobné uspořádání může být použito i pro mikrodiluční metodu a s využitím gradientové difúzní metody. V obou případech jsou srovnávány hodnoty MIC Detekce metalo-β-laktamáz (MBL) Donorem molekuly vody pro hydrolýzu amidové vazby β-laktamového kruhu jsou u MBL obvykle dva zinkové kationty v aktivním místě enzymu. Tyto karbapenemázy 151

5 jsou proto inhibovány chelátory kovových iontů, jako např. EDTA, dipikolinová kyselina, fenantrolin atd. Pro rutinní detekci lze využít test synergie, případně srovnání průměru inhibičních zón za použití EDTA nebo dipikolinové kyseliny [8, 10] Detekce serinových karbapenemáz (např. KPC) β-laktamázy typu KPC jsou inhibovatelné fenylboritou kyselinou a jejími deriváty. Tato látka však inhibuje i β-laktamázy AmpC. Proto u kmenů produkujících AmpC rezistentních ke karbapenemům snížením permeability vnější membrány buněčné stěny jsou tyto nesprávně hodnoceny jako producenti karbapenemáz. Ch. Giske a kol. [8] navrhl zařazení disku s kloxacilinem. V případě inhibice aktivity okolo tohoto disku a disku s kyselinou fenylboritou, je kmen hodnocen jako producent AmpC. Pokud není detekovatelná inhibice okolo disku s kloxacilinem, jedná se o producenta KPC. V České republice se však vyskytují kmeny K. pneumoniae současně produkující AmpC typu DHA-1 a β-laktamázu OXA-1. Druhá jmenovaná však efektivně hydrolyzuje kloxacilin. Proto jsou tyto kmeny falešně hodnoceni jako producenti KPC [J. Hrabák, nepublikovaná data]. Pro detekci těchto mechanizmů rezistence (MBL, KPC) lze využít i komerčně dodávané disky meropenemu s inhibitory (např. Rosco Diagnostica) Inhibiční fenotypový test pro průkaz karbapenemáz Provedení: 1. MH agar se inokuluje testovaným kmenem přelitím případně roztěrem. Při očkování přelitím se Pasteurovou pipetou odsaje přebytečný roztok a plotna se ponechá při pokojové teplotě do zaschnutí, ne však déle než 15 minut. Z důvodů možné kontaminace prostředí a infekce personálu nelze akceptovat odstranění přebytečného inokula vylitím! 2. Po zaschnutí se na povrch plotny aplikují antibiotické disky a okamžitě se pipetuje na střed disku 10 μl ze zásobního roztoku příslušného inhibitoru (viz obrázek 2, tabulka V). 3. Inkubace při 35 C 18 hodin. 4. Odečet je prováděn změřením průměru inhibiční zóny posuvným měřítkem. Průměry IZ jsou zaznamenány do laboratorního informačního systému. Interpretace: Suspektní producent MBL (tabulka 6) vykazuje rozšíření inhibiční zóny od disků s ceftazidimem a karbapenemy směrem k disku s EDTA. Rozšíření nemusí být zřetelné u všech indikátorových antibiotik. Suspektní producent KPC (tabulka 6) nevykazuje rozšíření inhibiční zóny směrem k disku s EDTA. Průměr inhibiční zóny u disku s kyselinou aminofenylboritou je větší o nejméně 4 mm než průměr inhibiční zóny vytvořené okolo disku s meropenemem. Zároveň se průměr inhibiční zóny okolo disku s kloxacilinem neliší od průměru disku s meropenemem (přípustná diference je menší než 5 mm). Suspektní producent AmpC (tabulka 6) vytváří zvětšenou inhibiční zónu okolo disku s kyselinou aminofenylboritou ( 4 mm) a zároveň zvětšenou inhibiční zónu okolo disku s kloxacilinem (( 5 mm). O produkci karbapenemázy nelze rozhodnout, pokud nejsou okolo disků s antibiotiky vytvořeny inhibiční zóny Detekce karbapenemáz skupiny OXA Inhibiční test pro průkaz karbapenemáz ze skupiny OXA není pro rutinní použití k dispozici. Jako indikátor lze použít disk s temocilinem (30 mg). Pokud není vytvořena žádná inhibiční zóna okolo tohoto disku, jedná se o pravděpodobného producenta karbapenemázy ze skupiny OXA-48 (M. Gniadkowski, osobní sdělení). K ověření je však nutné použít jiné metody (např. - MS, detekci genu bla OXA-48 ). 5. MOLEKULÁRNĚ-GENETICKÉ TECHNIKY PRO DETEKCI KARBAPENEMÁZ Molekulárně-genetické techniky detekují geny karbapenemáz. Základní nevýhodou těchto metod je skutečnost, že k amplifikaci známých genů karbapenemáz musí být k dispozici velké množství primerů, případně je nutné použít techniku mikročipů. Nelze však vyloučit přítomnost dosud neznámého typu karbapenemázy, která nebude molekulárně-mikrobiologickým přístupem detekována. Negativní výsledek vyšetření proto nesmí být interpretován jako vyloučení produkce karbapenemázy. Molekulárně-genetické techniky lze využít: 1. při rychlé diagnostice producentů karbapenemáz při outbreaku s již známým typem karbapenemázy, 2. v případě endemické situace, 3. jako doplňkové vyšetření identifikaci typu karbapenemázy detekované fenotypovými inhibičními testy, nebo k identifikaci karbapenemázy u ověřených producentů metodou MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie nebo spektrofotometrickou analýzou hydrolýzy karbapenemů PCR Pro detekci genů karbapenemáz byla vyvinuta řada metod. Některé z těchto metod jsou založeny na klasické end-point PCR s detekcí PCR produktu na gelu. Tyto metody jsou však časově a technicky náročnější. V současnosti rozšířenou technikou je PCR v reálném čase, která umožňuje zkrácení doby provedení na cca 2,5 hodiny [6, 17, 19, 20]. Pokud je vyžadována přesná identifikace karbapenemázy, jsou PCR produkty sekvenovány a jejich sekvence srovnány s referenčními sekvencemi (BLAST; /studies) Mikročipy Při použití DNA mikročipů lze detekovat desítky různých sekvencí. Pro detekci β-laktamáz byly vyvinuty metody pro detekci ESBL, AmpC a karbapenemáz [1, 18]. Pro vlastní reakci však nelze použít DNA izolovanou z klinického materiálu, ale je nutné izolovat DNA z bakteriální kultury. Kvalita izolace DNA významně ovlivňuje výsledek vyšetření. 152

6 INFORMACE Z NRL A ODBORNÝCH PRACOVIŠŤ SZÚ Tabulka IV. MALDI-TOF ANALÝZA KARBAPENEMÁZ Půda Mueller-Hinton agar Pufr pro přípravu suspenze 2 5 ml ve fyziologickém roztoku Příprava suspenze Přímá metoda roztěrem kolonií (z kultury na Mueller-Hinton agaru staré nejvýše 24 hod.) Koncentrace inokula 3 dle McFarlandova zákalu Nastavení hmotnostního ion source 1: 20 kv spektrometru ion source 2: 16,7 kv (Bruker Daltonics) lens: 7 kv pulsed ion extraction: 170 ns detection gain 3.0 electronic gain: regular mode: low range; mass range selection: low range laser frequency: 60 Hz digitiser trigger level: 2500 mv mass range: Pufr pro přípravu suspenze 20mM Tris-HCl, 20mM NaCl, ph 7,0, stabilní po dobu několika měsíců při 4 C Reakční pufr 20mM Tris-HCl, 0.01 % sodium dodecyl sulfate (SDS), ph 7.0 (SDS lze přidat až po úpravě ph), následně přidat meropenem do výsledné koncentrace 0,1 mm. Alikvotovaný roztok meropenemu lze uchovávat při -80 C po dobu 1 měsíce. Nelze opakovaně zmrazit. Roztok matrice 10 mg/ml dihydroxybenzoová kyselina (DHB) v 50% ethanolu Peaky přítomné 384,5 u negativního vzorku 406,5 428,5 Peaky přítomné 358,5 u producenta karbapenemázy 380,5 Kalibrace Kalibrace je prováděna analýzou reakčního pufru s meropenemem, kde je přítomný peak meropenemu a obvykle jeho sodné soli (m/z 384,5 a 406,5) Pozitivní kontrola Klebsiella pneumoniae CNCTC 7413 ST258, KPC-2 Tabulka V. PROVEDENÍ FENOTYPOVÝCH INHIBIČNÍCH TESTŮ PRO PRŮKAZ KARBAPENEMÁZ Půda Objem inokula Příprava inokula Koncentrace inokula Disky Mueller-Hinton agar 2 5 ml ve fyziologickém roztoku Přímá metoda roztěrem kolonií (z kultury na krevním agaru staré nejvýše 24 hod.) 0,5 dle McFarlandova zákalu (případně dále ředit 1:10 nebo 1:100); kolonie se mají okraji dotýkat, avšak nesplývat Ceftazidim* (10 mg), imipenem (10 mg), meropenem (10 mg), sterilní disk vyrobený z filtračního papíru φ 6 mm, případně komerčně dostupný * Cefalosporinové disky s nižší koncentrací doporučované EUCAST lze k detekci β-laktamáz použít (i pro případ ESBL) Zásobní roztoky 0,2 M EDTA, ph upravit pomocí NaOH na hodnotu 7,8, rozpuštěno v destilované sterilní H 2 O; 100 mg/ml dipikolinová kyselina (DPA) rozpuštěno v dimetylsulfoxidu; 60 mg/ml aminofenylboritá kyselina rozpuštěno v destilované sterilní H 2 O; 75 mg/ml kloxacilinu rozpuštěno v destilované sterilní H 2 O; Zásobní roztoky EDTA a DPA lze uchovávat 1 měsíc při 4 C, zásobní roztoky aminofenylborité kyseliny a kloxacilinu lze uchovávat alikvotované při -20 C. Uspořádání disků Viz obrázek 2 Inkubace 35 C ± 2 C v normální atmosféře Pozitivní kontrola Klebsiella pneumoniae CNCTC 7413 ST258, KPC-2 Pseudomonas aeruginosa CNCTC 7393, VIM-2 153

7 Tabulka VI. DETEKCE KARBAPENEMÁZ FENOTYPOVÝMI TESTY Suspektní producent MBL (Escherichia coli produkující NDM-1) Mezi disky s meropenemem a imipenemem je zřejmé rozšíření zóny směrem k disku s EDTA. Suspektní producent KPC (Klebsiella pneumoniae produkující KPC-3) Signifikantní rozdíl mezi průměrem inhibiční zóny u disku s kyselinou aminofenylboritou a kloxacilinem Suspektní producent KPC Mezi diskem s kyselinou aminofenylboritou falešná pozitivita a diskem s kloxacilinem je patrný signifikantní (Klebsiella pneumoniae produkující rozdíl. Kmen je tak hodnocen jako suspektní AmpC typu DHA-1 a enzym OXA-1) producent KPC. Rezistence je však v tomto případě způsobena snížením permeability vnější membrány buněčné stěny a produkcí AmpC. Nesignifikantní inhibice kloxacilinem je způsobena produkcí OXA-1, která hydrolyzuje kloxacilin. Jedná se v ČR o častý případ. 6. ZÁVĚR Detekce karbapenemáz u enterobakterií, pseudomonád a acinetobakterů je nezbytná z epidemiologických důvodů, jejichž cílem je zabránit šíření tohoto nebezpečného fenoménu vhodnými preventivními opatřeními. Současné metody využitelné v rutinní praxi (fenotypové inhibiční testy, molekulárně-mikrobiologické techniky) nejsou zcela spolehlivé. Rovněž využití dříve doporučovaného Hodgetestu je sporné [7]. Řešením této problematiky může být využití MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie, která je schopná přímo detekovat hydrolýzu karbapenemů včetně jejich degradačních produktů. Zároveň se jedná o velmi rychlou metodu, která umožňuje získání definitivního výsledku během 3 hodin. Metoda byla dosud validována pro detekci karbapenemáz u enterobakterií. Na základě zkušeností autorů tohoto textu a jiných odborných publikací lze očekávat její využití i u pseudomonád a acinetobakterů [13]. Výše popsané metodické postupy pro fenotypové inhibiční testy a pro MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii vychází z validovaných metod publikovaných v prestižních mikrobiologických časopisech. Fenotypé inhibiční testy popsané výše lze velmi dobře využít k detekci metalo-β-laktamáz u pseudomonád, použití těchto testů pro diagnostiku karbapenemáz typu KPC u Enterobacteriaceae je v pod- 154

8 INFORMACE Z NRL A ODBORNÝCH PRACOVIŠŤ SZÚ Obrázek 3. ROZLOŽENÍ DISKŮ PRO DETEKCI KARBAPENEMÁZ FENOTYPOVOU INHIBIČNÍ METODOU mínkách ČR omezené. Molekulárně-genetické techniky, s respektováním zmíněných omezení, jsou využitelné pro jakýkoliv bakteriální druh. PODĚKOVÁNÍ CAZ EDTA IMI MEM+APBA MEM 20 mm MEM+KLOX CAZ ceftazidim, IMI imipenem, MEM meropenem, MEM+APBA meropenem s kyselinou aminofenylboritou, MEM+KLOX meropenem s kloxacilinem. Práce byla podpořena grantem IGA MZ č. NT /2010 a výzkumným záměrem MŠMT č. MSM LITERATURA 1. Bogaerts P, Hujer AM, Naas T, de Castro RR, Endimiani A, Nordmann P, Glupczynski Y, Bonomo RA Multicenter evaluation of a new DNA microarray for rapid detection of clinically relevant bla genes from beta-lactam-resistant gramnegative bacteria. Antimicrob Agents Chemother. 2011; 55(9): Burckhardt I, Zimmermann S. Using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry to detect carbapenem resistance within 1 to 2.5 hours. J Clin Microbiol. 2011; 49: Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twentieth informational supplement. CLSI Document M100-S-20, PA, USA, Cornaglia G, Akova M, Amicosante G, Cantón R, Cauda R, Docquier JD, Edelstein M, Frére JM, Fuzi M, Galleni M, Giamarellou H, Gniadkowski M, Koncan R, Libisch B, Luzzaro F, Miriagou V, Navarro F, Nordmann P, Pagani L, Peixe L, Poirel L, Souli M, Tacconelli E, Vatopoulos A, Rossolini GM. Metallo-b-lactamases as emerging resistance determinants in Gram-negative pathogens: open issues. Int J Antimicrob Agents. 2007; 29: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 1.3 April 2012, 6. Francis RO, Wu F, Della-Latta P, Shi J, Whittier S. Rapid Detection of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Genes in Enterobacteriaceae Directly From Blood Culture Bottles by Real-Time PCR. Am J Clin Pathol. 2012; 137(4): Girlich D, Poirel L, Nordmann P. Value of the modified Hodge test for detection of emerging carbapenemases in Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 2012; 50: Giske CG, Gezelius L, Samuelsen O/, Warner M, Sundsfjord A, Woodford N. A sensitive and specific phenotypic assay for detection of metallo-β-lactamases and KPC in Klebsiella pneumoniae with the use of meropenem disks supplemented with aminophenylboronic acid, dipicolinic acid and cloxacillin. Clin Microbiol Infect. 2011; 17: Grundmann H, Livermore DM, Giske CG, Canton R, Rossolini GM, Campos J, Vatopoulos A, Gniadkowski M, Toth A, Pfeifer Y, Jarlier V, Carmeli Y, CNSE Working Group. Carbapenem-non-susceptible Enterobacteriaceae in Europe: conclusions from a meeting of national experts. Euro Surveillance. 2010; 15(46): pii= Hrabák J, Bergerová T, Žemličková H, Urbášková P. Detekce širokospektrých β-laktamáz (ESBL), β-laktamáz AmpC, metalo-β-laktamáz (MBL) a karbapenemáz KPC u gramnegativních tyček. Zprávy CEM (SZÚ, Praha). 2009; 18(3): Hrabák J, Chudáčková E. Rezistence enterobakterií ke karbapenemům. Epidemiologie, mikrobiologie, imunologie. 2008; 57: Hrabák J, Walková R, Študentová V, Chudáčková E, Bergerová T. Carbapenemase activity detection by matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Journal of Clinical Microbiology 2011; 49: Kempf M, Bakour S, Flaudrops Ch, Berrazeg M, Brunel JM, Drissi M, Mesli E, Touati A, Rolain JM. Rapid detection of carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. 2012; PLoS One 7:e Livermore DM, Woodford N. The β-lactamase threat in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter. TRENDS in Microbiology. 2006; 14(9): Miriagou V, Cornaglia G, Edelstein M, Galani I, Giske CG, Gniadkowski M, Malamou-Lada E, Martinez-Martinez L, Navarro F, Nordmann P, Peixe L, Pournaras S, Rossolini GM, Tsakris A, Vatopoulos A, Cantón R. Acquired carbapenemases in Gram-negative bacterial pathogens: detection and surveillance issues. Clin Microbiol Infect. 2010; 16: Sparbier K, Schubert S, Weller U, Boogen Ch, Kostrzewa M MALDI-TOF MS based functional assay for the rapid detection of resistance against β-lactam antibiotics. Journal of Clinical Microbiology. 2012; 50: Monteiro J, Widen RH, Pignatari AC, Kubasek C, Silbert S Rapid detection of carbapenemase genes by multiplex real-time PCR. J Antimicrob Chemother. 2012; 67(4): Naas T, Cuzon G, Bogaerts P, Glupczynski Y, Nordmann P. Evaluation of a DNA microarray (Check-MDR CT102) for rapid detection of TEM, SHV, and CTX-M extended-spectrum β-lactamases and of KPC, OXA-48, VIM, IMP, and NDM-1 carbapenemases. J Clin Microbiol. 2011; 49(4): Naas T, Ergani A, Carrër A, Nordmann P Real-time PCR for detection of NDM-1 carbapenemase genes from spiked stool samples. Antimicrob Agents Chemother. 2011; 55(9): Swayne RL, Ludlam HA, Shet VG, Woodford N, Curran MD Real-time TaqMan PCR for rapid detection of genes encoding five types of non-metallo- (class A and D) carbapenemases in Enterobacteriaceae. Int J Antimicrob Agents 2011; 38(1):

9 21. Woodford N, Turton JF, Livermore DM Multiresistant Gram-negative bacteria: the role of high-risk clones in the dissemination of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 2011; 35: Jaroslav Hrabák Radka Walková Tamara Bergerová Ústav mikrobiologie, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice v Plzni, Universita Karlova v Praze, Plzeň Helena Žemličková Pavla Urbášková Národní referenční laboratoř pro antibiotika, Státní zdravotní ústav, Praha Kontakt: Jaroslav Hrabák, Ph.D. Ústav mikrobiologie Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice v Plzni Alej Svobody 80, Plzeň Jaroslav.Hrabak@lfp.cuni.cz 156