Real Time PCR Carbapenemases Pracovní postup Real Time PCR analýza pro detekci karbapenemáz typu VIM KPC, NDM a IMP

Transkript

1 Real Time PCR Carbapenemases Pracovní postup Real Time PCR analýza pro detekci karbapenemáz typu VIM KPC, NDM a IMP In vitro diagnostikum -80 až -20 C Viz. obal RT-REZ1-025 Viz. obal Popis: Epidemiologicky nejzávažnější rezistence ke karbapenemům u enterobakterií, pseudomonád a acinetobakterů je způsobena karbapenemázami, enzymy schopnými účinně hydrolyzovat většinu -laktamů včetně karbapenemů. Jejich geny jsou kódovány na mobilních genetických elementech (plazmidy, transpozony) schopných horizontálního přenosu mezi bakteriemi. Na těchto mobilních genetických elementech jsou obvykle neseny další geny zodpovědné za rezistenci k ostatním skupinám antibiotik (např. geny pro aminoglykosidové acetyltransferázy, geny zodpovědné za rezistenci k chinolonům, atp.). Bakteriální kmeny exprimující karbapenemázy jsou tak obvykle rezistentní k většině antibiotik použitelných v klinické praxi. Léčba infekcí způsobených těmito izoláty je významně omezena (účinný zůstává obvykle pouze kolistin), avšak nejsou výjimkou ani izoláty rezistentní ke dostupným antibiotikům. Tato situace může významně limitovat rozvoj medicíny, především v chirurgii a intenzivní péči. Karbapenemázy jsou řazeny do několika skupin dle jejich molekulární struktury a možnosti inhibice (viz Tabulka 1.). Mezi nejrozšířenější enzymy tohoto typu patří tzv. metalo- -laktamázy se dvěma zinkovými kationty v aktivním místě. Nejčastěji jsou nalézány enzymy ze skupiny VIM (enterobakterie, pseudomonády) a IMP (pseudomonády).dalším typem běžných karbapenemáz jsou enzymy skupiny 2f dle K. Bush a kolektivu, resp. skupiny A podle Amblera. Tyto karbapenemázy jsou nejčastěji nalézány u enterobakterií, především u Klebsiella pneumoniae. Tabulka 1. Klinicky významné karbapenemázy. Skupina dle klasifikace podle Bush/Amblera, označení Skupina 2f / A Skupina 3 / B, metalo- -laktamázy Skupina 2d / D OXA Označení karbapenemáz KPC, GES, SME, IMI, NMC VIM, IMP, GIM, SIM, NDM, SPM, AIM, KMH, DIM, TMB OXA-48 Skupiny OXA-23, -58, -40 Bakteriální druhy u nichž byly tyto enzymy nalezeny Enterobacteriaceae (Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens), Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Escherichia coli; Epidemiologie karbapenemáz Geny kódující karbapenemázy jsou obvykle součástí větších genetických elementů, kódujících rezistenci k ostatním skupinám antibiotik (aminoglykosidy, fluorochinolony, sulfonamidy, atp.). Podávání kteréhokoliv antibiotika z těchto skupin vede k selekci rezistence k ostatním antibiotikům. Rezistence se zároveň mezidruhově šíří horizontálním přenosem genů (viz obrázek 1). Zároveň dochází k šíření epidemicky úspěšných klonů (např. Klebsiella pneumoniae ST258 produkující KPC, ). Závažný problém přináší cetsování do zemí s vysokou prevalencí výskytu producentů karbapenemáz (např. Řecko, Izrael, USA, Indie). Cestováním dochází k šíření karbapenemáz do dalších států. Prevence šíření rezistence

2 Nástup rezistence ke karbapenemům lze zpomalit aktivně prováděnou surveillance v nemocničních zařízeních. Pacienti musí být izolováni a musí být dodržována přísná hygienická opatření. V této oblasti je nutné používat rychlé metody pro vyhledávání karbapenemáz. Optimální skríningovou metodou je metoda PCR. Vzhledem k epidemiologické situaci v České republice je nutné zaměřit PCR diagnostiku především na karbapenemázy VIM, IMP a KPC. Účel použití: Produkt je určen ke stanovení přítomnosti VIM, KPC, IMP a NDM ve vzorku. Doporučené skladování výrobku: Doporučená teplota skladování je od -20 C. Souprava obsahuje: - Amplifikační reagencie pro stanovení 4 typů karbapenemáz - Návod k použití K provedení testu je dále potřeba (souprava neobsahuje): - Izolační souprava pro purifikaci DNA ze vzorku (doporučená souprava DNA-Sorb-B, Sacace, REF K-1-1/B či obdobná) - Spotřební materiál a drobné přístroje pro provedení izolace DNA a přípravu PCR - Ochranné pomůcky (Jednorázové vyšetřovací rukavice, lab. plášť) Potřebný materiál, který není součástí soupravy: Zóna 1: příprava vzorku Biologický box Mikrocentrifuga pro zkumavky typu Eppendorf Vyhřívaný suchý blok 60 o C ± 2 o C Třepačka Vortex Pipety (kapacita 5-40 μl, μl, μl) s aerosolovým filtrem 1,5 ml polypropylénové sterilní zkumavky (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Kontejner na nebezpečný odpad Lednička, mraznička Zóna 2: RT a amplifikace Real Time Thermal cycler SmartCycler (Cepheid) Reakční zkumavky SmartCycler (25μl) Pracovní stanice (PCR box) Pipety (kapacita 0,5-10 μl l, 5-40 μl) a špičky s aerosolovým filtrem Stojan na zkumavky Stolní centrifuga s rotorem na zkumavky objemu 1,5ml a 2ml, Smart Centrifuga Princip testu: Real-TM PCR kit je in vitro test pro amplifikaci a kvalitativní detekci karbapenemáz VIM, KPC, IMP a NDM v klinickém materiálu (bakteriální kultury, výtěry) a detekci prostřednictvím hybridizace s fluorescenčními sondami typu TaqMan. Princip testu je založen na 3 krocích: 1. Izolace DNA, 2. Amplifikace specifických sekvencí, 3. Real Time PCR hybridizace a detekce fluorescence. VIM, IMP, KPC a NDM specifické sekvence jsou detekovány v 1. kanále FAM, interní kontrola je detekována v 2.kanále Cy3. Varování a doporučení: 1. Diagnostikum pro in vitro použití. 2. S komponentami lidského původu je nutno zacházet jako s potenciálně infekčním materiálem. 3. Nepoužívejte reagencie po uplynutí doby expirace. 4. Při práci se vzorky a činidly používejte ochranné rukavice, laboratorní plášť a ochranu očí. Po práci si pečlivě umyjte ruce. 5. Nepipetujte ústy.

3 6. Nejezte, nepijte, nekuřte, neaplikujte kosmetiku ani kontaktní čočky v laboratoři. 7. Odstraňte všechny vzorky a nepoužitá činidla v souladu s místními předpisy. 8. Biosafety Level2 by měl být použit pro materiály obsahující infekční a chemické látky nebo materiály, u nichž existuje podezření, že je obsahují. 9. Vyvarujte se kontaktu vzorků nebo reagencií s kůží, očima a sliznicema. Pokud se s těmito sloučeninami dostanete do kontaktu, okamžitě opláchněte vodou a ihned vyhledejte lékaře. 10. Používání tohoto produktu by mělo být limitováno zaměstnanci, kteří byli vyškoleni v dané problematice. 11. Práce v laboratoři musí být organizována v jednom směru, začínat v extrakční místnosti/prostoru a pokračovat do amplifikační místnosti/prostoru. Nevracejte zpět vzorky, vybavení nebo reagencie do místnosti, kde jste dělali předchozí krok. Doporučený biologický materiál: Pro analýzy je doporučeno používat bakteriální kultury, alternativně lze použít výtěry či stěry. Vzorky mohou být skladovány v +2 až +8 C maximálně jeden týden, pokud jsou uloženy tak, aby nedocházelo k vypařování či kontaminaci. Pro dlouhodobé skladování je doporučeno vzorky zamrazit. Vyhněte se opakovanému zamrazování a rozmrazování. Izolace biologické materiálu: Pro izolaci je doporučena izolační souprava DNA-sorb-B. Při izolaci dbejte pokynů výrobce soupravy. Příprava reagencií a vzorků: Vzorky i reagencie před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu ( room temperature dále jen RT ). Před zpracováním vzorky a veškeré reagencie homogenizovat (vortex). Příprava mastermixu: Souprava obsahuje reagencie pro 80 analýz (4 x 20 testů pro každý typ Karbapenemázy VIM, IMP, KPC, NDM) Komponenty shodné pro všechny typy karbapenemáz: - MM1(750µl), 7,5µl/rx - MM2 (500 µl), 5µl/rx Komponenty specifické pro jednotlivé karbapenemázy: - VIMoligo (188 µl), 7,5µl/rx - IMPoligo (188 µl), 7,5µl/rx - KPColigo (188 µl), 7,5µl/rx - NDMoligo (188 µl), 7,5µl/rx - 4x Pozitivní kontroly pro jednotlivé karbapenemázy (50 µl), 5 µl/rx Tab. Příprava mastermixů: Komponenta 1reakce/µl MM1 7,5 MM2 5 VIM/IMP/KPC/NDMoligo 7,5 Templat /izolát DNA/NK/PK 5 CEKLOVÝ OBJEM REAKCE 25 Pro každý typ karbapenemázy je nutné připravit samostatný mastermix z komponent MM1, MM2 a příslušného oligo mixu (VIM/IMP/KPC/NDMoligo) dle výše uvedené tabulky a počtu testovaných vzorku (N) navýšeného o 2 kontroly (N+2, pozitivní kontrola a negativní kontrola). Směs důkladně vortexovat a pipetovat po 20µl do označených reakčních zkumavek. Následně pipetovat 5 µl negativní kontroly, 5 µl příslušné pozitivní kontroly a 5 µl izolátů vzorků do příslušných označených reakční zkumavek. Reakční zkumavky stočit v centrifuze a vložit do přístroje. Vlastní analýza: 1. Spustit real time PCR cykler a příslušný SW. 2. Zadat nový teplotně-časový profil v okně define protocol (pouze při prvním nastavení) Define Protocol:

4 3. Následně přes ikonu creat run zadat parametry konkrétní analýzy: 4. Zvolit odpovídající počet pozic a definovat příslušný teplotně-časový profil a následně definovat vzorky a příslušné použité mastermixy. 5. Popsat jednotlivé vzorky v příslušných pozicích v SW. 6. Spustit analýzu ikonou start run v levém dolním rohu. 7. V tabulce View results vyhodnotit výsledky analýzy po jejím dokončení. Výsledky analýzy: 1. Stiskněte Analysis setting a ve sloupci Manual Thresh Fluor Units zkontrolujte hodnotu prahové křivky (treshold line) 30 pro kanál Fam a 30 pro kanál Cy3. Klikněte na Update Analysis. 2. Klikněte na Save Run v menu Results Table. 3. Vzorek je pozitivní pokud ve sloupci FAM Std/Res je výsledek označen jako POS (hodnota FAM Ct je >0). 4. Vzorek je negativní pokud ve sloupci FAM Std/Res je výsledek označen jako NEG (hodnota FAM Ct je rovna nule) a ve sloupci CY3 Std/Res je výsledek označen jako POS. Negativní Ct hodnoty vzorků na Cy3 kanálu v rozsahu cyklů vypovídají o nedostatečné extrakci DNA (pokud je Ct hodnota vyšší než 40, požaduje se opakování testu). 5. Výsledek je neplatný, pokud ve sloupci FAM Std/Res a ve sloupci CY3 Std/Res je výsledek označen jako NEG (Ct je rovno nule). Opakujte celý test včetně přípravy vzorků a amplifikace. 6. Výsledek je považován za platný, pouze pokud pozitivní a negativní kontroly amplifikace a izolace DNA jsou platné.

5 Tabulka 2: Výsledky pro kontroly Kontrola Kontrola úkonu Ct kanál Fam Ct kanál CY3 Interpretace Negativní kontrola Amplifikace NEG POS Platný výsledek Pozitivní kontrola Amplifikace POS POS/NEG Platný výsledek Řešení problémů 1. Výskyt jakékoli hodnoty Ct v tabulce výsledků pro vzorek negativní kontroly v kanálu Fam a svědčí o kontaminaci. V takovém případě jsou výsledky analýzy všech testů považovány za neplatné. Je třeba opakovat analýzu všech testů a také učinit opatření k detekci a eliminaci zdroje kontaminace. 2. Žádný signál s Pozitivní kontrolou ve Fam kanálu ukazuje na nesprávné naprogramování Real-Time přístroje či nesprávnou přípravu mastermixu: zopakujte amplifikaci Příklad výsledků: Fam kanál detekce NDM DNA (NDM pozitivní vzorky, různá ředění) Cy3 kanál Interní kontrola detekce DNA *PCR: polymerázová řetězová reakce (PCR) je v některých zemích patentována firmou Hoffmann La Roche. Sacace nedoporučuje neautorizované nebo nelicencované použití procesu PCR. Tato souprava je určena osobám, které buď vlastní licenci pro provádění PCR nebo u nich není licence požadována. SmartCycler je registrovanou známkou společnosti Cepheid Sídlo: Praha 1, Nové Město, Vodičkova 791/41, , Česká republika Provozovna: Lidická 977, Buštěhrad, , Česká republika Tel ; mail: office@dynex.cz; web: