Původ syfilis: hypotézy ve světle nových molekulárních dat

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie Původ syfilis: hypotézy ve světle nových molekulárních dat (Bakalářská práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie - směr Mikrobiologie) Lukáš Nechvátal Brno 2009

2 Poděkování: Děkuji mému školiteli doc. MUDr. Davidu Šmajsovi, Ph.D. a Mgr. Petře Matějkové za ochotu, se kterou mi poskytovali cenné rady a připomínky. Tato práce byla realizována na Biologickém ústavu Lékařské fakulty MU.

3 Obsah Úvod... 4 Cíl práce Historie rozšíření syfilis Původce syfilis Treponema pallidum Treponema pallidum subsp. pallidum Primární syfilis Sekundární syfilis Období latence Terciární syfilis Vrozená syfilis Treponema pallidum subsp. endemicum Treponema pallidum subsp. pertenue Treponema paraluiscuniculi Teorie o původu syfilis Kolumbovská teorie Pre-kolumbovská teorie Unitární teorie Alternativní teorie Molekulárně biologické výzkumy posledních let Kompletní sekvence genomu Treponema pallidum Detekce a typizace Treponema pallidum Molekulárně-evoluční výzkumy Vlastní fylogenetická analýza T. pallidum Diskuse Závěr Seznam literatury

4 Úvod Na konci 15. století se v Evropě objevila nová, nebezpečná a často smrtelná choroba. Tehdejší lidé ji považovali za Boží trest, dnes však víme, že se jednalo o bakteriální onemocnění způsobované bakterií Treponema pallidum. Tato nemoc se šířila Evropou obrovskou rychlostí. Dostalo se jí nejrůznějších pojmenování (např. galská nemoc, francouzská nemoc či neapolská nemoc), většinou podle toho, odkud se do toho či onoho místa choroba dostala. Název syfilis vznikl roku 1530, kdy Girolamo Fracastoro vydal báseň Syphilis sive morbus gallicus (v překladu: Syfilis nebo francouzská nemoc). Dnes je tato choroba označována také jako lues či příjice (Hubschmann 1970). Syfilis je ovšem vážným zdravotním problémem i dnes. Přestože existuje efektivní léčba penicilinovými antibiotiky, nebývá nemoc ve svém počátku vždy odhalena. Může to být způsobeno absencí efektivní detekční metody, či zpožděnou identifikací příznaků primární fáze onemocnění. Světová zdravotnická organizace odhaduje, že každý rok přibude 12 milionů nových případů nákazy syfilis. Tato choroba je ovšem nebezpečná také proto, že vytváří vředy na genitálu, a tím usnadňuje přenos HIV. Často se tedy (především u gayů) vyskytuje syfilis v koinfekci s HIV (Šmajs et al. 2006). Již od první epidemie syfilis na konci 15. století si lidé lámali hlavu, odkud toto onemocnění přišlo. Teorie i přístupy se v průběhu staletí měnily. Vědecké přístupy se opíraly především o historická data a kosterní nálezy, na nichž zanechala syfilis charakteristické změny. Tyto přístupy ovšem problematiku původu syfilis zatím neobjasnily. Proto se v současnosti někteří autoři pokouší využít rozvoje molekulárně-biologických metod. Zmapování historie vývoje syfilis ovšem není motivováno pouze lidskou zvědavostí, ale zodpovězení této otázky by nám poskytnulo i nový pohled na epidemiologii tohoto onemocnění. 4

5 Cíl práce Současný výzkum původce syfilis, Treponema pallidum subsp. pallidum, prináší velké množství molekulárně-genetických dat o bakteriálních kmenech způsobujících syfilis. Současně se hromadí data o původcích chorob, kteří jsou původci syfilis velmi podobní (Treponema pallidum subsp. pertenue a Treponema pallidum subsp. endemicum). Molekulárně-genetická data o těchto bakteriálních patogenech (a také o dalších příbuzných kmenech) umožňují kriticky posoudit některé z obvyklejších hypotéz o původu syfilis a dalších příbuzných onemocnění. Cílem bakalářské práce je utřídit dostupné informace o původu syfilis a konfrontovat je s nově získanými molekulárními daty. 5

6 1. Historie rozšíření syfilis Ačkoli se názory na původ syfilis různí, je všeobecně uznávaným a historicky doloženým faktem, že se nemoc rozšířila po Evropě ve formě epidemie díky vojskům Karla VIII. na konci 15. století. Karel VIII. byl 23-letý francouzský král, který se rozhodl dobýt neapolské království, na něž si dělal nárok jako dědic rodu Anjou z Provence. Začal tedy koncem roku 1493 shromažďovat vojsko čítající asi mužů z nejrůznějších koutů Evropy. V 15. století bylo ovšem samozřejmostí, že se samotnou armádou táhl také početný doprovod prostitutek (Hubschmann 1970). S tímto vojskem vytáhl koncem srpna 1494 k italským hranicím. V té době v Itálii začínala rozkvétat renesance, která měla na svět a život úplně jiný pohled než středověk. Člověk byl považován za střed vesmíru, přítomnost byla nejdůležitější hodnotou, nikoliv posmrtný život. Mimo to se Itálie stává jednou z nejbohatších obchodnických zemí. Není proto divu, že když francouzská armáda postupovala italským územím, byli vojáci překvapeni bohatstvím a životním stylem místního obyvatelstva. Ve většině měst, do nichž vojska dorazila, se pořádaly bouřlivé oslavy na jejich počest. Koncem ledna 1495 konečně stanula vojska před Neapolí. Ta byla bráněna pouze slabou posádkou, která se po třech týdnech obléhání vzdala a Karel VIII. 22. února vstoupil do Neapole. Strávil tam se svým vojskem 80 dní plných bouřlivých oslav. Ovšem místo toho, aby Karel VIII. položil základy pro svou vládu, staral se spíš o svou vlastní zábavu a o to, jak velkou kořist si odveze do své vlasti. Proto netrvalo dlouho a králi hrozilo v Neapoli povstání místního obyvatelstva (Hubschmann 1970). 20. května tedy Karel VIII. opustil Neapol. Ovšem odpor vůči Francouzům rostl. V údolí řeky Taro se Karel střetl s vojsky Svaté ligy. Z bitvy se mu sice podařilo probít, ale přišel o veškerou svou kořist. Avšak u Novary jej obklíčil vévoda z Orleansu. Po několika měsících se Karel VIII. vzdal a byl mu povolen svobodný odchod. Král se do Francie vrátil jen s hrstkou původní armády, většina jeho vojsk se rozprchla, ještě než opustili Itálii (Hubschmann 1970). Vojáci, kteří se vraceli z neapolského tažení, tedy roznesli syfilis po celé Evropě. Nemůžeme s určitostí říci, zda se syfilis vyskytovala v Itálii před invazí Karla VIII., či zda tam byla Francouzi zavlečena. Prameny sice neuvádějí hromadný výskyt syfilis před příchodem francouzských vojsk, nicméně ojedinělé případy se vyskytnout mohly. Mezi Španělskem a Itálií probíhal na konci 15. století živý styk. Je tedy velmi pravděpodobné, že se mezi lety syfilis objevila ve Španělsku a Německé říši, s níž bylo Španělsko v kontaktu. Ve Francii klade většina pramenů počátek syfilis mezi roky

7 Z Českých zemí je zajímavý záznam ze z Ústí nad Labem, ve kterém můžeme najít důkaz o tom, že již byla známá vrozená forma syfilis. V Polsku a Rusku byla nemoc popsána v roce Na britských ostrovech ji záznamy datují od let V Dánsku se choroba šířila skoro epidemicky v letech (Hubschmann 1970, Vlček 1996). Příjice se šířila rychle nejen po Evropě, ale brzy se začala objevovat i jinde ve světě. Do Afriky ji pravděpodobně zavlekli v roce 1520 Španělé. Cestovatel Ludovico di Barthena uvádí, že v Kalkatě roku 1505 zemřel otrok na příjici. V Číně se syfilis patrně vyskytovala už před rokem 1500, nicméně v roce 1504 přistála v Kantonu evropská obchodní loď a příznaky syfilis se brzy potom objevily mezi domorodým obyvatelstvem (Hubschmann 1970). Syfilis na konci 15. století ovšem měla daleko závažnější průběh, než jak ji známe dnes. Mezi příznaky sekundární fáze onemocnění patřila horečka, bolest hlavy, bolest v krku či příšerné bolesti v kostech. Sekundární fáze většinou končila smrtí. Protože se nemoc plně nerozvinula do terciární fáze, nemáme z tohoto období nálezy s kosterními projevy syfilis. Později ovšem došlo ke zmírnění průběhu onemocnění. R. J. Knell toto zmírnění datuje na 5 7 let od propuknutí epidemie. Podle něj se nepřizpůsobil člověk jako hostitelský organismus, ale samotný původce onemocnění. Ty kmeny bakterií, které způsobovaly prudší průběh onemocnění, si znemožnily šíření, protože jejich hostitel pravděpodobně nebyl přitahován potenciálními sexuálními partnery. Naproti tomu E. Tognotti, se domnívá, že k poklesu virulence došlo v průběhu několika desetiletí. K tomuto závěru došla na základě zkoumání mnoha primárních historických zdrojů (Knell 2004, Tognotti 2009, Vlček 1996). 7

8 2. Původce syfilis Treponema pallidum Syfilis a jí podobná onemocnění jsou způsobována gramnegativní bakterií Treponema pallidum. Ta je mikroaerofilní a má chemoorganotrofní metabolismus. Svou stavbou připomíná G- bakterii. Její délka se pohybuje v rozmezí od 6 do 15 µm a šířka je asi 0,2 µm. Patří do čeledi Spirochetaceae, ta náleží do kmene Spirochaetes. Jedná se o helikální bakterii, na jejímž povrchu se nachází vnější membrána. Uvnitř této vnější membrány se nachází protoplazmatický válec (nukleoid a cytoplazma, které jsou ohraničeny cytoplazmatickou membránou a buněčnou stěnou z peptidoglykanu). Bakterie se pohybují zvláštním vývrtkovitým pohybem, který zajišťují bičíky uložené v periplazmatickém prostoru vždy tak, že kořen bičíku je umístěn poblíž pólu protoplazmatického válce a bičík se táhne směrem ke středu buňky. Druhý konec bičíku je tedy volný (Fraser et al. 1998, LaFond a Lukehart 2006, Sedláček 2007). T. pallidum je obligátní parazit člověka. Neexistuje pro něj vhodné kultivační medium a nedá se tedy kontinuálně pěstovat in vitro. Nicméně je možné treponemata pomnožit ve varlatech králíků, tímto způsobem kultivace si udrží virulenci pro člověka (Fraser et al. 1998, Obrtel et al. 1971). Skupina bakterií T. pallidum může být rozdělena do několika poddruhů (subsp. pallidum, subsp. endemicum, subsp. pertenue), které způsobují různá onemocnění. Sérologicky lze sice prokázat treponemální onemocnění, nicméně tato metoda již nedokáže zařadit původce nemoci do poddruhu. Z tohoto důvodu se zdravotní pracovníci musí často spoléhat pouze na klinické příznaky onemocnění a populační data. Může tedy docházet ke špatnému určení diagnózy a nasazení nevhodné léčby (Harper et al. 2008a). Studie za pomoci elektronového mikroskopu prokázaly, že se jednotlivé poddruhy vzájemně morfologicky neliší. Imunizace králíka inaktivovanými T. pallidum subsp. pallidum poskytne kompletní ochranu proti následné infekci stejným kmenem, ale poskytuje pouze minimální nebo žádnou ochranu před nevenerickými treponematy. Tato skutečnost naznačuje, že mezi poddruhy existují rozdíly ve složení antigenů. Žádné takové antigeny však nebyly doposud objeveny (Antal et al. 2002). Existuje několik teorií, proč se nevenerické treponematózy liší svými příznaky od venerické syfilis. E. H. Hudson tvrdí, že rozdílné příznaky jsou pouze různé projevy jednoho patogenního organismu v závislosti na klimatických a sociálních podmínkách. 8

9 Pravděpodobnější je však teorie C. J. Hacketta, která říká, že organismy způsobující onemocnění jsou blízce příbuzné, ale geneticky odlišné. Tato teorie vysvětluje také to, proč infekce jedním poddruhem nevyvolá imunitu proti ostatním poddruhům. Je podložena také srovnávacími genetickými studiemi z posledních let (Antal et al. 2002) Treponema pallidum subsp. pallidum Tento poddruh způsobuje sexuálně přenosnou syfilis, jako jediný z poddruhů napadá nervový systém a je přenosný z matky na plod. Syfilis je chronické onemocnění, které z hlediska způsobu přenosu můžeme rozdělit na vrozenou a získanou. Projevy získané syfilis se dále dělí do několika stadií: primární, sekundární, latentní a pozdní syfilis (Votava et al. 2003). Průběh neléčené syfilis je schematicky znázorněn na Obrázku Primární syfilis Pravděpodobnost infekce při pohlavním styku s nakaženou osobou, která se nachází v primární nebo sekundární fázi onemocnění je asi %. Prvním příznakem nemoci je tvrdý vřed (tzv. šankr), který se objevuje do 3 týdnů v místě vstupu infekce do těla, nejčastěji v oblasti genitálu. Tento vřed je nebolestivý, tvrdý a jasně ohraničený. Spontánně se hojí během tří až šesti týdnů. Zůstává po něm atrofická jizva. V průběhu primární fáze onemocnění se většinou zvětší lokální lymfatické uzliny, ty jsou ale nebolestivé (Votava et al. 2003, Zeltser a Kurban 2004) Sekundární syfilis Sekundární syfilis se začíná projevovat mezi 4. až 10. týdnem od propuknutí onemocnění. Během tohoto období dochází k šíření bakterií organismem. Jsou napadeny veškeré orgánové systémy, potenciálně i veškeré tělní tekutiny. Velmi často se objevuje kožní exantém. Většinou se jedná o velké množství zarudlých skvrnek na tvářích, hrudníku, dlaních, chodidlech a oblasti genitálu. Později se mohou objevit mokvající léze na dlaních a chodidlech. Tyto léze jsou vysoce infekční. Dalším příznakem mohou být výrůstky zvané condylomata lata. Jedná se o vlhké bradavičnaté výrůstky. Často také dochází k zarudnutí horního patra a hltanu. Onemocnění může způsobovat ztrátu vlasů a vypadávání obočí. Sekundární fáze může být doprovázena nespecifickými příznaky podobnými chřipkovému onemocnění, jako jsou bolest hlavy, bolest v krku a horečka. Projevy sekundární syfilis spontánně vymizí během 4 let (Votava et al. 2003, Zeltser a Kurban 2004). 9

10 Období latence Po odeznění příznaků sekundární fáze se dostavuje časná latentní syfilis, která trvá přibližně jeden rok. Jedná se o stádium, v němž nejsou pozorovatelné klinické příznaky. Mohou se ovšem objevit relapsy příznaků sekundárního stadia (Obrtel et al. 1971, Votava et al. 2003). Za latentní syfilis je označováno bezpříznakové období po uplynutí časné latentní syfilis. V této fázi onemocnění již pacient není infekční, přesto může dojít ke kongenitálnímu přenosu. Přibližně u třetiny neléčených pacientů se během 3 15 let vyskytnou příznaky pozdní (terciární) syfilis, k propuknutí pozdní fáze onemocnění však může dojít kdykoliv v období latence (Votava et al. 2003, Zeltser a Kurban 2004) Terciární syfilis Pozdní syfilis se může projevovat ve třech formách: benigní forma, kardiovaskulární syfilis a neurosyfilis. Benigní forma se může projevovat širokou paletou kožních lézí včetně gummat. Gummata jsou tvrdé nebolestivé tmavě rudé výrůstky, které jsou nejasně ohraničené a mohou připomínat tuberkulózní granulomy. Nacházejí se v širokém množství orgánů, v kůži, kostech, sliznicích, svalech, ale i v oku. Kardiovaskulární syfilis je charakteristická tvorbou zánětu v proximální aortě. Ten může vyústit až v syfilitickou anginu pectoris. Tato forma onemocnění se většinou vleče roky a může vést k vytvoření aortální výduti. Neurosyfilis se může projevovat různě. Nejčastější formy jsou tabes dorsalis a progresivní paralýza. Ve všech formách dochází k chronické meningitidě s cévními nebo parenchymatózními lézemi v míše a v mozku. To vede k atrofii mozku, demyelinizaci a ztluštění mozkových plen (Obrtel et al. 1971, Votava et al. 2003, Zeltser a Kurban 2004). Terciární fáze syfilis zanechává na kostech charakteristické změny. Mezi nejvíce postižené patří kosti lebky, na kterých se vyskytuje tzv. caries sicca. Jedná se o zjizvení kostní tkáně, které napadá nejdříve vnější vrstvu kostí, v pozdějších fázích dochází i k poškození diploe. Často se také vyskytuje periostitida tibie. Díky těmto změnám můžeme usuzovat na přítomnost treponemálních onemocnění v minulosti (Meyer et al. 2002) Vrozená syfilis Bakterie Treponema pallidum subsp. pallidum je schopná projít placentou a infikovat plod. Pokud se tak stane, dochází téměř ve 40 % případů k potratu. Pravděpodobnost, že bude plod nakažen od infikované matky, závisí na tom, v jaké fázi onemocnění se matka nachází. Jestliže je žena infikována během 4 let před těhotenstvím, může to asi v 70 % případů vést 10

11 k nákaze plodu. Oproti tomu 40 % těhotných žen, které se nachází v časné fázi latence a 6 14 % těch, které se nachází v pozdní fázi, porodí dítě s projevy kongenitální syfilis. Vzhledem ke způsobu přenosu (přímo do krevního oběhu plodu) chybí u vrozené syfilis primární fáze onemocnění. Podle období, ve kterém můžeme pozorovat klinické příznaky, rozdělujeme vrozenou syfilis na brzkou kongenitální syfilis a pozdní kongenitální syfilis (Hollier a Cox 1998, Zeltser a Kurban 2004). Za brzkou kongenitální syfilis se označuje onemocnění, které se projevuje přibližně v prvních dvou letech života. U infikovaných novorozenců bez příznaků se projevy syfilis objeví většinou mezi třetím a osmým týdnem života. Klinické projevy jsou podobné sekundární získané syfilis. Mezi hlavní příznaky patří hematosplenomegalie, kožní léze, osteochondritis či periostitis. Léze obsahují vysoké koncentrace T. pallidum, jsou tedy infekční (Hollier a Cox 1998, Votava et al. 2003). Pozdní kongenitální syfilis se projevuje po druhém roce života. Většinou jsou příznaky pozorovatelné dříve, než nadejde období puberty. Mezi charakteristická stigmata patří soudkovité (Hutchinsonovy) řezáky, perforace horního patra, intersticiální keratitis a oboustranná hluchota (Hollier a Cox 1998, Votava et al. 2003). Obr. 1: Průběh neléčené syfilis (upraveno dle Zeltser a Kurban 2004). * Bez léčby asi 95 % pacientů ztrácí infekčnost přibližně po 6 měsících. Po 5 letech je přímý přenos nesmírně vzácný, nicméně byly popsány případy infekce kontaktem s gummaty. 11

12 2.2. Treponema pallidum subsp. endemicum Je původcem endemické syfilis, která bývá také označována jako bejel. Ta je přenosná nevenericky, většinou přes kožní léze, či společně používané nádobí a pomůcky. Nejvíce nakažených je ve věku 2 15 let. Vyskytuje se převážně v suchých, teplých a mírných klimatech, většinou ve vesnických podmínkách s nízkou úrovní hygieny (Antal et al. 2002). V raných stádiích se nemoc projevuje lézemi v ústech, na rtech či bradavkách kojících žen. Sekundární fáze se projevuje mukózními skvrnami na rtech a ústní sliznici. V pozdějších stadiích se objevují léze na nosohltanu, kůži a kostech. Charakteristický je také rozvoj chronického zánětu kostní dřeně, který může vést k šavlovitému zakřivení holení (Antal et al. 2002) Treponema pallidum subsp. pertenue Způsobuje onemocnění zvané frambézie (anglicky yaws). Je přenášena přímým kožním kontaktem s výpotkem, či kožní lézí nakaženého. Největší výskyt této nemoci je ve vlhkých oblastech s vysokým množstvím srážek, jako jsou například deštné pralesy a zvláště v chudých oblastech s nízkou úrovní osobní hygieny a stravovacích návyků (Antal et al. 2002). Klinické projevy frambézie se liší v závislosti na klimatu. Během období sucha se výsevy papilomů vyskytují méně často. Ve velmi suchých oblastech může frambézie svými projevy připomínat endemickou syfilis. Inkubační doba trvá 10 dní až 3 měsíce. Po jejím uběhnutí se na místě infekce (většinou na nohou a chodidlech) objevuje malá zarudlá léze, která se vyvine v papilom. Sekundární léze se objevují během 1 2 let. Jsou to velké zarudlé skvrny či papilom. Frambézie také nápadně postihuje kostru. Rané léze se vyskytují jako bolestivá osteoperiostitida na holeních či předloktích. Sekundární léze samovolně vymizí po několika týdnech až měsících. Léze pozdní fáze se vyskytují na kůži, sliznicích, kostech a kloubech. Často se také vyskytuje šavlovité zakřivení holení (Antal et al. 2002). Tomuto poddruhu je velice podobný nezařazený opičí izolát označený Fribourg-Blanc, který způsobuje u afrických primátů onemocnění podobné frambézii (Fribourg-Blanc a Mollaret 1969) Treponema paraluiscuniculi Tato bakterie se neřadí do druhu T. pallidum a ani není infekční pro člověka. Nicméně je morfologicky, fyziologicky či na základě obsahu proteinů neodlišitelná od T. pallidum, 12

13 z čehož se dá usuzovat, že jsou tyto dva druhy blízce příbuzné. T. paraluiscuniculi způsobuje u králíků onemocnění podobné lidské syfilis (Strouhal et al. 2007). 13

14 3. Teorie o původu syfilis O původu příjice existuje několik teorií. Pro každou z nich existuje mnoho důkazů, ovšem žádná z nich nepodává nevyvratitelné vysvětlení původu a vývoje syfilis. V této práci jsou uvedeny 4 hlavní teorie (Meyer et al. 2002) Kolumbovská teorie Tato teorie tvrdí, že syfilis se do Evropy dostala spolu s Kolumbovými námořníky. Když Kryštof Kolumbus přistál u břehů Ameriky, byl on i jeho muži tamními obyvateli považován za bohy. Z tohoto faktu a také z historických pramenů vyplývá, že indiánské ženy byly námořníkům po vůli a mohlo tedy dojít k případné nákaze. Zpět do mateřského přístavu Palosu se lodi vrátily , na palubě vezly také 10 Indiánů. Odtud pokračovaly do Sevilly, kde zakotvily Zdrželi se zde jak námořníci, tak i oněch 10 Indiánů. Do Barcelony dorazil Kolumbus začátkem května Druhou cestu Kolumbus nastoupil se 17 loděmi a 1500 muži. Již 2. února 1494 posílá zpět 12 lodí plných bohatého nákladu, ale také domorodého obyvatelstva (Hubschmann 1970). Důležitá jsou patrně tvrzení Kolumbových současníků. Ruy Diaz de Isla byl lékař, který se okolo roku 1493 vyskytoval v Barceloně, Seville a Lisabonu. Tvrdí, že původem syfilis je Amerika, protože tato nemoc nebyla před rokem 1493 v Evropě známá a rozšířila se až po příchodu Kolumba do Barcelony. Odtud se s vojskem Karla VIII. dostala do celé Evropy. Dále prohlašuje, že domorodí američtí Indiáni chorobu znali od pradávna. Podobná tvrzení sepsal Gonzalo Fernandez De Oviedo y Valdés, který působil okolo roku 1500 na neapolském dvoře. Dalším svědkem je Fray Bartolomé de las Casas, jehož otec se zúčastnil Kolumbovy druhé cesty. Las Casas se v roce 1498 dostal na ostrov Espaňola, v roce 1502 na ostrov Santo Domingo a v roce 1510 se stal knězem na Kubě, ovšem později se vrátil na Espaňolu. Měl tedy příležitost poznat místní obyvatelstvo i jeho poměry. Tvrdí, že příjice se do Evropy dostala s Kolumbovými námořníky. Indiáni mu prý také sdělili, že je tato nemoc u nich od pradávna. (Hubschmann 1970). Pokud ovšem v Americe existovala příjice před Kolumbovým příjezdem, měly by existovat kosterní pozůstatky, které by vykazovaly typické změny způsobené syfilis. Je známa celá řada kosterních nálezů, které nesou znaky treponemálního onemocnění. Některé z nich jsou přisuzovány frambézii, jiné ovšem venerické syfilis. V Louisianě byly objeveny kosterní pozůstatky 58 jedinců datované mezi lety 500 před Kristem 300 našeho letopočtu. Kosterní 14

15 změny byly pravděpodobně způsobeny endemickou syfilis. Při zkoumání sedmi kostnic v Severní Karolíně byly nalezeny kosti poznamenané treponemální infekcí. Tyto nálezy jsou datované od roku 350 našeho letopočtu po příjezd Evropanů. Ve Virginii byly nalezeny kosterní pozůstatky dvou jedinců, pravděpodobně postižené treponematózami datované do let Jednalo se o dospělého člověka a 3 4 roky staré dítě. To nese známky kongenitální syfilis. Jedním z významných důkazů kolumbovské teorie je vyšetření kosterních nálezů v Dominikánské republice, tedy v místech, kde přistál Kolumbus. B. M. Rothschild označil na základě kosterních změn a populačních dat tyto nálezy jako postižené příjicí (Meyer et al. 2002). Přítomnost treponemálních onemocnění v Americe před Kolumbovým příjezdem je tedy poměrně dobře prokázaná. Ovšem relativně nízké procento objevů označených za venerickou či kongenitální syfilis naznačuje, že pokud byla venerická syfilis v Americe přítomna, tak se vyskytovala daleko méně než nevenerické treponematózy (Meyer et al. 2002). Z tohoto faktu Baker a Armelagos usuzují, že Kolumbus do Evropy dovezl nevenerickou formu treponematózy, která se v důsledku urbanizovaných podmínek vyvinula v sexuálně přenosnou (Baker a Armelagos 1988). B. M. Rothschild se domnívá, že prapůvodem treponemálních onemocnění je východní Afrika, a že se tato onemocnění vyvíjela od dob prvních moderních lidí. Z Afriky se nemoc mohla dostat na Britské ostrovy, ale také se šířila přes Asii do Severní Ameriky, kde zmutovala v syfilis (Rothschild 2005) Pre-kolumbovská teorie Zastánci této teorie jsou přesvědčeni, že venerická syfilis stejně jako ostatní treponematózy existovaly ve starém světě dlouho před návratem Kolumba z Ameriky. Medicína v té době nebyla na vysoké úrovni, proto mohly být syfilitické příznaky přisuzované jiným chorobám, především lepře (Meyer et al. 2002). Lékařská literatura z let popisuje velice nakažlivou formu lepry, která je přenosná jak pohlavně, tak z matky na dítě (Sefton 2001). Ve starém světě byly také nalezeny kosterní pozůstatky, které nesou známky poškození treponemálním onemocněním. Není ovšem s určitostí prokázané, zda některé z nich patří venericky přenosné syfilis. V Italském Metapontu byly odkryty kosterní pozůstatky 47 jedinců z řecké kolonie datované do let před. n. l., které nesly známky treponemálního onemocnění. 8 případů bylo postiženo caries sicca, 2 nesly známky kongenitální syfilis. Nicméně B. M. Rothschild se domnívá, že tyto změny nezpůsobila 15

16 syfilis. Ostatky objevené v Lisieux ve Francii datované mezi 3. a 4. století byly také poškozeny caries sicca. B. M. Rothschild ale namítá, že tyto pozůstatky postrádaly charakteristické znaky pro syfilis a změny připisuje traumatu (Meyer et al. 2002, Rothschild 2005). Německý rytíř Gottfried von Cappenberg ( ), jehož kosterní pozůstatky byly prozkoumány makroskopicky, rentgenologicky i histologicky pravděpodobně trpěl endemickou syfilis. Z Polska jsou také hlášeny nálezy koster datovaných do století nesoucí známky treponematózy (Meyer et al. 2002). Zajímavé jsou kosterní pozůstatky mnichů z kláštera v Hull Magistrate s Court v Anglii datované mezi roky , byly histologicky prozkoumány a ukázalo se, že tito jedinci byli pravděpodobně postižené venerickou syfilis (von Hunnis et al. 2006) Unitární teorie Tato teorie předpokládá, že všechny treponematózy jsou různými projevy jediného původce, který byl přítomný ve starém i novém světě a vyvíjel se společně s člověkem. Příznaky se liší v závislosti na sociálních a klimatických podmínkách (Baker a Armelagos 1988). Zastánci této teorie se domnívají, že treponematózy vznikly v paleolitu ve formě frambézie. Jak člověk začal obsazovat sušší oblasti Afriky, přeměnila se tato treponematóza v endemickou syfilis. V této formě byla společně s člověkem přenesena do nového světa. Při osídlování tropických oblastí Ameriky zpět transformovala ve frambézii. S nástupem urbanizace a používáním oděvů se omezil přímý kožní kontakt a došlo k rozvinutí venerické formy syfilis (Baker a Armelagos 1988). Ve stejných klimatických podmínkách tedy mohou vedle sebe existovat venerická syfilis (ve vyspělých městech, kde je pohlavní přenos nejpříhodnější cestou) a frambézie (v chudém venkovském prostředí, kde je mezi dětmi dostatek přímého kožního kontaktu). Pokud by tedy došlo k přeměně urbanizovaného života ve vesnický, mohlo by podle této teorie dojít k přeměně venerické syfilis v nevenerickou formu treponematózy (Baker a Armelagos 1988) Alternativní teorie Tato teorie považuje za původ syfilis Afriku. Tvrdí, že paleopatologické změny na kosterních nálezech z Ameriky mohly způsobit jiná onemocnění. Parazitické organismy se vyvíjejí velmi rychle, ovšem některé vymizí stejně tak rychle, jako se objevily. A právě 16

17 takovýto, v dnešní době neznámý patogen, mohl například zapříčinit tyto kosterní změny (Livingstone 1991). B. M. Rothschild považuje za možného původce treponemálních onemocnění medvěda. Tuto teorii podkládá nálezem kostry medvěda staré přibližně let, u které imunologicky potvrdil přítomnost treponematózy. Nicméně se objevily kritiky, zda nešlo jen o kontaminaci materiálu (Meyer et al. 2002, Rothschild 2005). Oproti tomu Livingstone vidí původ treponemat v paviánech centrální a západní Afriky. V nich byla prokázána treponemata blízce příbuzná těm lidským. Všechny současně známé poddruhy Treponema pallidum jsou velmi podobné organismy, pravděpodobně se tedy vyvinuly nedávno z jednoho společného předka. Můžeme předpokládat, že treponematózy vyskytující se v prostředí, které se dlouhou dobu něměnilo, jsou původnější. Sexuálně přenosná syfilis v Evropě je poměrně nedávná událost, což může znamenat, že šlo o adaptaci původních treponem na mírné podnebí (Livingstone 1991). Propuknutí epidemie syfilis a Kolumbův návrat z Ameriky mohly být pouze souhrou náhod. Ve stejné době sílil evropský kontakt s Afrikou. Portugalci postavili pevnost a obchodní centrum v místech dnešní Ghany 15 let před návratem Kolumba. Z toho se dá usuzovat, že nevenerické treponemy měly delší dobu na adaptaci na urbanizované prostředí než tvrdí teorie navržená Baker a Armelagos (Baker a Armelagos 1988, Livingstone 1991). 17

18 4. Molekulárně biologické výzkumy posledních let Vzhledem k faktu, že pro T. pallidum neexistuje vhodné kultivační médium, jeví se molekulárně-biologické metody výzkumu jako velmi vhodné k prozkoumání hlubší podstaty patogeneze a evoluce této bakterie. Molekulárně-biologické přístupy by také mohly poskytnout spolehlivou a rychlou metodu k detekci a typizaci T. pallidum Kompletní sekvence genomu Treponema pallidum V roce 1998 se podařilo získat sekvenci kompletního genomu Treponema pallidum subsp. pallidum kmene Nichols (Fraser et al. 1998). T. pallidum obsahuje kruhový genom o celkové délce bp, který kóduje 1041 otevřených čtecích rámců. Jedná se tedy o relativně malý genom. Obsah C+G je 52,8 %. Průměrná délka ORF (otevřený čtecí rámec) je 1023 bp. Průměrná velikost proteinů kódovaných těmito ORF je Da, s rozmezím od 3235 do Da. 92,9 % DNA obsahuje kódující úseky. Předpovězenou biologickou funkci má 577 ORF (55 % z celkového počtu) s tím, že 177 ORF (17 %) má srovnatelný protějšek v hypotetických proteinech jiných druhů a 287 ORF (28 %) nemá žádnou shodu v databázi a jedná se tedy pravděpodobně o doposud nepopsané geny. Celkem 90 z těchto neznámých ORF se shoduje s chromozomálně kódovanými ORF bakterie Borrelia burgdorferi (původce lymské boreliózy). Nicméně žádný ORF T. pallidum se neshoduje s proteiny B. burgdorferi kódovanými na plasmidu, což naznačuje, že proteiny kódované na plasmidu jsou specifické pro borelie (Fraser et al. 1998, Weinstock et al. 1998). Celkem 129 otevřených čtecích rámců (12 % z celkového počtu) je řazeno do 42 paralogních genových rodin. Z nich 15 rodin obsahujících 44 genů nemá přiřazenou biologickou funkci. 30 rodin obsahuje pouze 2 členy, zatímco největší rodina má 14 genů a zahrnuje geny kódující proteiny vázající ATP v transportním systému ABC (Fraser et al. 1998, Weinstock et al. 1998). T. pallidum používá všech 61 kodonů s tím, že na 3. pozici jsou umístěny převážně C a G. Oproti B. burgdorferi, kde 3. pozici častěji zaujímají A nebo T. Tato skutečnost se shoduje s faktem, že T. pallidum má skoro dvojnásobný obsah C+G než B. burgdorferi (Fraser et al. 1998, Weinstock et al. 1998). 18

19 T. pallidum má omezené biosyntetické schopnosti a je tedy velmi závislá na hostiteli, od kterého vyžaduje mnoho živin. Tato bakterie není schopná syntetizovat kofaktory, mastné kyseliny a nukleotidy de novo. Kvůli nedostatku biosyntetických drah je tedy logické, že obsahuje velké množství transportních proteinů s širokou substrátovou specificitou. Celkem 57 genů kóduje 18 odlišných transportérů, které mají předpovězenou specificitu pro aminokyseliny, uhlovodíky a kationty (Fraser et al. 1998). Systém transportních proteinů naznačuje, že T. pallidum může využívat jako zdroj energie několik uhlovodíků, mezi něž patří glukosa, galaktosa, maltosa a glycerol. Není jasné, zda má schopnost využívat jako zdroj energie a uhlíku i aminokyseliny, nicméně vzhledem k omezeným biosyntetickým cestám se to nezdá být pravděpodobné. T. pallidum postrádá respirační řetězec, proto je ATP produkován pomocí fosforylace na úrovni substrátu (Fraser et al. 1998). T. pallidum zřejmě postrádá některé ochranné mechanismy. Chybí např. geny kódující superoxid dismutázu, katalázu a peroxidázu. Nemá tedy ochranu před kyslíkem. Jediným identifikovaným enzymem, díky němuž může T. pallidum utilizovat O 2 je NADH oxidáza. Tato bakterie obsahuje základní sadu heat shock proteinů, ale postrádá σ 32 protein, který je zodpovědný za transkripci heat shock genů. Zdá se tedy, že T. pallidum postrádá robustní nástroj, díky němuž by se vyrovnala se vzrůstající teplotou a je tedy velmi citlivá na změnu teploty (Fraser et al. 1998). Geny kódující flagella jsou vysoce konzervovány, což ukazuje na jejich důležitost. Jedná se o 36 genů kódujících proteiny, které se účastní na struktuře a funkci bičíků. Bičík se skládá ze tří proteinů jádra, proteinu pochvy a dvou necharakterizovaných proteinů (Fraser et al. 1998). Při zkoumání genomu byl samozřejmě také kladen důraz na nalezení faktorů virulence a objasnění podstaty patogenity původce syfilis. Zajímavá je přítomnost paralogní rodiny 12 tpr genů (tpra L), které vykazují podobnost s Msp (major surface protein) bakterie Treponema denticola. Msp je vysoce imunogenní, hojně se vyskytující protein, který na povrchu T. denticola tvoří hexagonální strukturu. Funkce tohoto proteinu je vázat fibronektin a laminin, má také porinovou aktivitu. Ačkoli podobná struktura nebyla na povrchu T. pallidum nalezena, předpokládá se, že Tpr proteiny jsou proteiny vnější membrány s funkcí adhezinů a porinů. Vzhledem k tomu, že se vyskytují v několika verzích, je také pravděpodobné, že se jedná o antigenní obměnný systém. Pochody regulující expresi tpr genů ovšem zatím nejsou 19

20 objasněné. T. pallidum není považována za producenta lipopolysacharidů či exotoxinů. Nicméně byla prokázána její vysoká cytotoxicita vůči neuroblastům i některým jiným typům buněk. V genomu T. pallidum byly nalezeny geny podobné těm, které kódují bakteriální hemolyziny. Je ovšem nutné tyto proteiny podrobit důkladnější analýze, aby jim mohla být cytotoxická funkce definitivně přiřknuta. Genom T. pallidum obsahuje relativně málo genů zodpovědných za produkci polysacharidů, které u jiných patogenních bakterií hrají důležitou roli v jejich virulenci. Na povrchu T. pallidum se také nachází poměrně málo membránových proteinů, což může být součástí strategie pomáhající bakterii uniknout před imunitním systémem. Umístění jednotlivých genů, jejichž produkty se pravděpodobně účastní infekce, je znázorněno na Obrázku 2 (Fraser et al. 1998, Weinstock et al. 1998). Obr. 2: Umístění genů, kódujících možné virulentní funkce. Povrchové proteiny naznačené ve vnitřním kruhu jsou nějakým způsobem zapojené do infekce, zatímco ty, co jsou umístěny ve vnějším kruhu, mají v procesu infekce menší význam (upraveno dle Weinstock et al. 1998). 20

21 4.2. Detekce a typizace Treponema pallidum V současné době je možno syfilis diagnostikovat na základě klinických projevů či sérologických testů. Obě tyto metody jsou bohužel problematické. Klinické projevy jsou různé, navíc primární nebolestivý afekt se nemusí vyskytovat pouze na genitálu, ale například i v ústní dutině či v oblasti rekta. Navíc některé příznaky mohou být atypické, či onemocnění může probíhat asymptomaticky, například při koinfekci s HIV. Sérologické testy mají také svá omezení, mezi ně patří například zpožděná protilátková odpověď. Protilátky se totiž většinou objeví až druhý týden od infekce. Sérologické testy také nemohou jednoznačně odlišit infekci, která proběhla v minulosti od právě aktivní infekce. Detekce kongenitální syfilis je komplikována přenosem protilátek z matky na plod (Šmajs et al. 2006). V současné době se proto hledá účinná metoda k detekci syfilis. Polymerázová řetězová reakce je samozřejmě vhodným kandidátem. Tato metoda je teoreticky velmi citlivá, ale bohužel nedokáže rozlišit živé a mrtvé buňky. Jako cílové sekvence se používají např.: TP0117 (tprc), TP0136, TP0319 (tmpc), TP0548, TP (tmpa,b), TP1038 (tpf1), TP1016 (bmp), TP0897 (tprk). Mezi často používané cílové sekvence patří TP0574 (tpp47), která kóduje karboxypeptidázu. Její PCR detekce se ukázala být vysoce specifická. Všechny testované patogeny nervové soustavy, kožní mikroflóry či sexuálně přenosné patogeny nebyly touto metodou detekovány. Další cílovou sekvencí může být TP0105 (pola), jejíž specificita byla testována různými patogeny způsobujícími sexuálně přenosné choroby. Nicméně pozitivní výsledek vykazovaly pouze vzorky patogenních T. pallidum (Šmajs et al. 2006). PCR dokáže prokázat T. pallidum ve všech fázích syfilis. Nejčastější použití PCR je při identifikaci pohlavních vředovitých onemocnění, úspěšnost PCR je 17,5 93 % u séropozitivních pacientů. Testování krve, krevní plasmy a séra přineslo rozdílné výsledky. Ukázalo se, že v krevním séru pacientů s primární nebo sekundární syfilis se podařilo detekovat T. pallidum ve vysoké míře. Naproti tomu testování krve přineslo negativní výsledky. Tyto rozdíly mohou být způsobeny rozdílnými postupy jak při odběru a uchovávání vzorků, tak při provádění samotné PCR. V pozdějších fázích onemocnění je k detekci syfilis také možné použít PCR. Pozitivní výsledky daly vzorky ze sekundárních lézí, tříslových mízních uzlin, gummat či mozkomíšního moku. PCR je také důležitou metodou při detekci kongenitální syfilis, protože sérologie u novorozeňat je poměrně nespolehlivá (Šmajs et al. 2006). 21

22 Jednotlivé poddruhy T. pallidum nelze s použitím známých testů spolehlivě rozlišit, což komplikuje diagnózu i léčbu onemocnění. Někteří autoři se proto snaží přijít s řešením tohoto problému pomocí molekulárně-biologických testů. K. N. Harper v roce 2008 publikovala článek, v němž popisuje použití genu arp (acidic repeat protein) k rozlišení venericky a nevenericky přenosných treponematóz. Arp je protein s tandemovými repeticemi. Takovéto proteiny se často nachází ve vnější membráně, což naznačuje, že pomáhají patogenu při adaptaci na hostitele. 5 a 3 konce arp genu jsou konzervovány, ale centrální region složený z 60 bp dlouhých repetičních motivů je vysoce variabilní co se týče počtu repetičních jednotek i nukleotidového složení jednotlivých repetičních motivů. Funkce Arp proteinu zatím není objasněna, ale má se za to, že se jedná o vysoce imunogenní protein obsahující potenciální fibronektin vázající doménu (Harper et al. 2008a). Tato studie si stanovila tři hlavní cíle. Prvním bylo charakterizovat arp gen ve větším množství klinických a laboratorních izolátů T. pallidum. Druhým úkolem bylo charakterizovat homology arp genu v opičím izolátu Fribourg-Blanc a v králičí T. paraluiscuniculi. Posledním úkolem bylo vyložit sekvenční variace ve světle selektivního tlaku a evoluční vztahy mezi kmeny. Do studie bylo zahrnuto 16 kmenů T. pallidum subsp. pallidum, 8 z nich laboratorních a 8 klinických. Dále bylo použito 9 kmenů subsp. pertenue, 2 kmeny subsp. endemicum a 2 kmeny označené subsp. pertenue, avšak jednalo se pravděpodobně o subsp. pallidum. Opičí kmen byl zastoupen izolátem Fribourg-Blanc a dále byly do studie zahrnuty 2 kmeny T. paraluiscuniculi (Harper et al. 2008a). Výsledky této práce ukázaly, že gen arp bakterie T. pallidum obsahuje celkem 4 repetiční motivy. Nevenerické poddruhy endemicum a pertenue obsahovaly pouze motiv II, zatímco v subsp. pallidum byly identifikovány motivy I III a motiv II/III, který vypadal jako výsledek rekombinace mezi motivy II a III. V opičím izolátu byl nalezen pouze motiv II, oproti tomu T. paraluiscuniculi obsahovala 4 nové motivy. Počet repetičních jednotek v jednotlivých genech arp různých kmenů jevil velkou variabilitu i uvnitř poddruhů. Poddruhy pallidum obsahovaly 4 16 jednotek. Kmen, který měl pouze 4 repetice, ovšem obsahoval 3 nejčastější repetiční motivy I III. Nevenerické kmeny subsp. endemicum a subsp. pertenue měly 3 12 repetičních jednotek, zatímco opičí kmen jich obsahoval 15. Kmen Cuniculi A T. paraluiscuiculi obsahoval 21 repetičních jednotek, kmen Cuniculi H byl odhadnut na 25 jednotek. Specifické bylo také pořadí motivů uvnitř jednotlivých repetičních regionů, např. u 22

23 subsp. pallidum se z počátku střídají motivy I a II a region končí krátkou řadou III nebo II/III motivů (Harper et al. 2008a). Tato zjištění dokazují, že dlouhý repetiční region s repertoárem odlišných repetičních motivů je důležitým znakem venerické infekce způsobované rodem Treponema. Pohlavně přenosné T. pallidum subsp. pallidum a T. paraluiscuniculi obsahují v arp genu více typů (nejméně 3) repetičních motivů, zatímco nevenerické subsp. endemicum, subsp. pertenue a opičí kmen obsahují pouze jeden repetiční motiv. Můžeme tedy předpokládat, že u sexuálně přenosných treponem se na utváření arp genu podílí pozitivní selekční tlak. Stejně jako složením repetičních motivů i délkou repetičního úseku se liší venerické kmeny od nevenerických. Zatímco u pohlavně nepřenosných kmenů odpovídají délky repetičního regionu normálnímu rozložení a tedy neutrální evoluci, u subsp. pallidum mělo 67 % zkoumaných kmenů 14 repetičních jednotek. To může být způsobeno silnou ustalující se selekcí pro repetiční úseky obsahující tento počet jednotek. Nebo naopak ještě neuplynulo dostatek evolučního času k tomu, aby se u kmenů způsobujících syfilis vyskytovalo množství variací původního 14 jednotek dlouhého arp genu (Harper et al. 2008a). A. Centurion-Lara se spolupracovníky se pokusili o rozlišení nejen na poddruhy venericky a nevenericky přenosné, ale o určení do konkrétního poddruhu. Využili k tomu poznatky ze své předchozí studie, v níž rozlišovali poddruhy T. pallidum na venerické a nevenerické na základě záměny 1 páru bází v okolí 5 konce genu tpp15, který obsahuje restrikční místo pro Eco47III a dovoluje tak odlišení subsp. pallidum od ostatních poddruhů prostřednictvím RFLP analýzy produktů amplifikovaných pomocí PCR. K této metodě připojili RFLP analýzu tprc a tpri amplikonů, u nichž objevili druhově specifické genetické znaky (Centurion-Lara et al. 1998, Centurion-Lara et al. 2006). Pro lokus tpri byla použita restriktáza BsrDI, která specificky štěpí 493 bp dlouhý amplikon na dva fragmenty. Takto rozštěpeny byly izoláty T. pallidum subs. endemicum. Pro lokus tprc byly použity restriktázy BsiEI a BsrDI. Restrikční místo pro BsiEI v 707 bp dlouhém amplikon bylo nalezeno u T. pallidum subsp. endemicum, opičího izolátu a některých subsp. pallidum. Restriktáza BsrDI štěpila 707 bp dlouhý amplikon ve vzorcích některých T. pallidum subsp. pallidum. U lokusu tprc byly použity dvě restriktázy z toho důvodu, že ne všechny subsp. pallidum obsahují restrikční místo pro BsrDI, tyto kmeny ovšem mají specifické místo pro BsiEI. Tímto způsobem mohly být odlišeny subsp. pertenue od těch subsp. pallidum, které postrádají restrikční místo pro BsrDI (Centurion-Lara et al. 2006). 23

24 Tab. 1: Restrikční analýza pro rozlišování poddruhů T. pallidum (upraveno dle Centurion-Lara et al. 2006) Treponema Kmen 5 konec tpp15 genu (Eco47III) a tpri (BsrDI) b tprc (BsrDI/ BsiEI) c T. pallidum subsp. pallidum Nichols Chicago Sea Mexico A + - (+) Sea (+) T. pallidum subsp. pertenue Gautier Samoa D Samoa F CDC CDC Pariaman Ghana T. pallidum subsp. endemicum Bosnia A Iraq B Opičí izolát Frigourg-Blanc a analýza 5 konce tpp15 genu: + amplikony rozštěpeny pomocí Eco47III; - amplikony nerozštěpeny b analýza tpri: + amplikony rozštěpeny pomocí BsrDI; - amplikony nerozštěpeny c analýza tprc: + amplikony rozštěpeny BsrDI; (+) amplikony rozštěpeny BsiEI; - amplikony nerozštěpeny Na základě kombinace těchto tří RFLP analýz můžeme vzájemně rozlišit jednotlivé lidské poddruhy T. pallidum, od nichž lze také odlišit opičí izolát, jak je možné vidět v Tabulce 1 (Centurion-Lara et al. 2006). Z epidemiologického hlediska je také potřeba mít účinnou metodu, která by dokázala rozlišit jednotlivé kmeny T. pallidum subsp. pallidum. Syfilis se totiž vyskytuje v některých (zejména rozvojových) zemích endemicky a je běžná v některých vyspělých státech. Objevují se také lokální epidemie této nemoci. Aby bylo možné epidemiologicky mapovat výskyt syfilis navrhl Pillay et al. typizační metodu, která je založena na kombinaci dvou typizačních schémat. První využívá rozdílnosti délky repetičního regionu arp genu. Jedná se v podstatě o počet repetičních jednotek v tomto genu. Druhé schéma je založeno na RFLP analýze tpr genů pomocí MseI. Použitím MseI bylo získáno 7 RFLP vzorů, které byly označeny a g. Rozdíly mezi RFLP vzory jsou založeny na přítomnosti či nepřítomnosti DNA fragmentů o velikosti bp. Kmen Nichols tedy, vzhledem k tomu, že obsahuje 14 repetičních jednotek a RFLP analýza jeho tpr genů pomocí MseI odpovídá vzoru a, můžeme označit jako 14a (Pillay et al. 1998). 24

25 Na základě této typizační metody bylo provedeno několik studií. V roce 2001 bylo provedeno subtypování bakterií T. pallidum jako součást šetření zvýšeného nárůstu syfilis v Maricopa County v Arizoně. K identifikaci přítomnosti T. pallidum bylo použito PCR genu pola. U pozitivních vzorků byla provedena subtypizace podle Pillay et al. Do studie bylo zahrnuto 41 z celkového počtu 44 vzorků stěrů z vředů a 15 z 68 odebraných krevních vzorků. Podařilo se otypovat všech 41 vzorků stěrů z vředů, ale pouze 4 krevní vzorky. Bylo nalezeno celkem 10 subtypů bakterie T. pallidum subsp. pallidum. U více než poloviny vzorků byl nalezen subtyp 14f. Bylo také popsáno 6 subtypů, které nebyly dříve dokumentovány na území USA (Sutton et al. 2001). V v roce 2002 proběhla studie, v níž bylo vyšetřeno 201 T. pallidum pozitivních vzorků získaných od pacientů mužského pohlaví s primární syfilis z Jižní Afriky. 161 vzorků bylo typovatelných a bylo objeveno 35 subtypů. Nejvíce zastoupeným byl subtyp 14d. Unikátní subtypy byly identifikovány v Dubanu, Kapském městě a Carletonville. Výsledky této práce naznačují, že populace kmenů v Jižní Africe jsou velmi různorodé a geograficky se liší (Pillay et al. 2002). V další práci z roku 2005 bylo vyšetřeno za použití stejných metod jako v předchozí studii 154 primárních či sekundárních lézí v pěti klinikách v Severní a Jižní Karolíně. 27 z těchto vzorků mělo pozitivní PCR amplifikaci genu pola. Z nich se podařilo 23 detailněji typovat. Bylo nalezeno celkem 6 subtypů T. pallidum subsp. pallidum. Subtyp 14f byl detekován ve více než polovině vzorků a nacházel se na 4 z 5 klinik. Subtyp 16f byl nalezen ve 22 % byl ovšem přítomen pouze na jedné klinice (Pope et al. 2005) Molekulárně-evoluční výzkumy Prudký rozvoj molekulárně-biologických metod umožňuje použít data takto získaná k odhadování fylogenetických vztahů organismů. Tato možnost je zvláště užitečná u organismů, jako jsou například bakterie, které nevykazují velké množství fenotypových znaků, či jako v případě T. pallidum je ani není možné kontinuálně kultivovat in vitro. R. R. Gray et al. v roce 2006 publikovali svoji práci, v níž se pokusili objasnit molekulární evoluci 6 genů rodiny tpr genů. Jednalo se o geny tprc, D, I, K, G a J, které byly osekvenovány a následně podrobeny analýze. Bylo použito fylogenetických metod, analýzy rekombinací a míry nukleotidové diverzity k osvětlení evoluční historie těchto genů. Do studie byly zahrnuty tpr geny 8 kmenů T. pallidum subsp. pallidum, 2 kmenů T. pallidum subsp. pertenue, 2 kmenů T. pallidum subsp. endemicum, nezařazeného opičího izolátu Fribourg-Blanc a 1 kmene T. paraluiscuniculi (Gray et al. 2006). 25

26 Na základě výsledků této studie se zdá, že hlavní hybnou silou evoluce tpr genů byla intragenomová homologní rekombinace. Z vysokých hodnot homologie mezi jednotlivými studovanými lokusy je možné usuzovat, že během jejich vývoje došlo k četným genovým konverzím (intragenomová událost, jejímž výsledkem je nereciproký přenos genetické informace z donorového lokusu na recipientní lokus) uvnitř i mezi tpr geny. Takovéto změny mohly být způsobeny i horizontálním přenosem, tento jev však zatím nebyl u T. pallidum popsán, nicméně úplně vyloučit se nedá. Autoři se pokusili ze získaných dat také odhadnout evoluci jednotlivých kmenů. Z jejich výsledků vyplývá, že 3 poddruhy T. pallidum jsou legitimně řazeny jako poddruhy a vzájemně se geneticky liší. Rekombinace hrála důležitou roli nejen při vývoji tpr genů, ale pravděpodobně i při evoluci jednotlivých treponemat. Proto studie, které by byly založeny pouze na analýze SNP, by postrádaly důležité informace o rekombinacích, které mohou být poddruhově specifické. Na základě některých genových konverzí uvnitř podskupiny T. pallidum subsp. pallidum z této studie jasně nevyplývá, že subsp. pallidum je fylogeneticky nejmladším poddruhem. Výsledky této práce také vyvracejí teorii B. M. Rothschilda, podle níž jsou nevenerické treponematózy výrazně starší než syfilis. Sekvence T. pallidum subsp. pallidum nesou příliš variací, než aby mohly podporovat teorii, která tvrdí, že z nového světa byla dovezena nevenerická treponematóza, která v evropských podmínkách zmutovala v syfilis (Gray et al. 2006). V roce 2008 uveřejnili K. N. Harper et al. studii, jejímž cílem bylo identifikovat variabilní místa v genomu T. pallidum a charakterizovat je v co největším množství nevenerických kmenů za účelem ověření hypotézy, že syfilis se objevila v nedávné lidské historii a vyvinula se ze kmenů T. pallidum existujících v novém světě. Protože rekombinační události mohou ovlivnit fylogenetickou analýzu, byly provedeny pečlivé testy pro odhalení rekombinací. Fylogeneze byla následně vybudována na základě nerekombinovaných SNP a inzercí/delecí (Harper et al. 2008b). Ke studii bylo použito celkem 26 kmenů, z nichž bylo 22 lidských, 1 opičí izolát Fribourg- Blanc a 3 kmeny T. paraluiscuniculi. Lidské kmeny zahrnovaly 11 kmenů T. pallidum subsp. pertenue. Dva z těchto kmenů byly získány při humanitární misi ve vnitrozemí Guyany a měly představovat původní americké nevenerické kmeny. Do studie bylo dále zahrnuto 9 kmenů T. pallidum subsp. pallidum a 2 kmeny T. pallidum subsp. endemicum. Ze všech těchto kmenů, vyjma 2 izolovaných v Guyaně, bylo osekvenováno 21 genetických oblastí. Tyto úseky byly vybírány na základě dříve prokázaných polymorfismů, účasti na patogenezi či proto, že obsahují repetiční sekvence. Kvůli velkému množství značně degradované DNA 26

27 bylo možné ze vzorků izolovaných v Guyaně získat pouze 7 polymorfních míst, které zahrnovaly 17 SNP (Harper et al. 2008b). Jeden úsek DNA musel být z důvodu jeho nepřítomnosti v některých kmenech z analýzy vyloučen. V analyzované části genomu bylo objeveno celkem 70 SNP a 12 inzercí/delecí. Celkem 26 substitucí se vyskytlo mezi kmeny T. pallidum, což odpovídá přibližně jedné substituci na 275 bp. Tato zjištění je ale nadhodnocené v důsledku toho, že ke studii byly vybrány polymorfní úseky. Přibližně 2/3 substitucí představovaly specifické rozdíly mezi T. pallidum a T. paraluiscuniculi. Tři jedinečné události odlišovaly opičí izolát od subsp. pertenue kmenů. Analýza dvou kmenů subsp. pertenue izolovaných od Guyanských domorodců ukázala, že tyto kmeny jsou nejbližšími příbuznými kmenů subsp. pallidum identifikované v této studii. Ze 17 SNP, kterými se lišily nevenerické kmeny starého světa od kmenů subsp. pallidum, se 4 SNP kmenů subsp. pallidum shodovaly s kmeny subsp. pertenue izolovanými v Guyaně. Fylogenetický strom (Obr. 3) byl sestrojen pomocí metody maximální pravděpodobnosti. Byl zakořeněn třemi kmeny T. paraluiscuniculi. Strom ukazuje, že všechny kmeny T. pallidum spadají do jedné větve. Je z něj patrné, že kmeny subsp. pertenue jsou fylogeneticky nejstarší. Toto zjištění je podporováno tím, že subsp. pertenue jsou podobné opičímu izolátu, a také že mezi subsp. pertenue a T. paraluiscuniculi jsou nízké průměrné rozdíly nukleotidovém složení. Kmeny subsp. endemicum se objevily později a kmeny subsp. pallidum jsou fylogeneticky nejmladší. Topologie stromu se shoduje s teorií, že treponemální onemocnění jsou velmi stará a vyvíjela se společně s lidmi, kteří postupně osidlovali nová území. Autoři se přiklání k teorii, podle níž vznikla T. pallidum ve starém světě v nevenerické formě. Ta se jako endemická syfilis rozšířila na střední východ a do Ameriky ve formě frambézie objevené v novém světě. Odtud se tento typ frambézie patrně s Kolumbovými námořníky dostal do Evropy, kde se z ní vyvinula pohlavně přenosná syfilis (Harper et al. 2008b). 27