MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2014 Bc. Dagmar Hyblerová

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Chemie a technologie potravin Vliv PUFA n-3 na expresi genů kódujících proteiny řídící homeostázu cholesterolu Diplomová práce Vedoucí práce: Prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CSc. Vypracoval: Bc. Dagmar Hyblerová Brno 2014

3

4 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: Vliv PUFA n-3 na expresi genů kódujících proteiny řídící homeostázu cholesterolu vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

5 PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala vedoucímu mé diplomové práce pro. MVDr. Ing. Tomášovi Komprovi, CSc. za cenné rady, konzultace a poskytnutí materiálů při zpracování diplomové práce.

6 ABSTRAKT Cílem této práce bylo potvrdit to, že polynenasycené mastné kyseliny n-3 (PUFA n-3) mají pozitivní vliv na hladinu plazmatických lipidů. Tyto kyseliny mohou snižovat cholesterol díky zvýšení exprese genu Insig-1 a zároveň snížení exprese genů kódujících Hmgcr a Ldlr. To jsme testovali na pokusných potkanech, kterým bylo do krmné směsi přidáno 6% oleje světlice barvířské, 6% rybího oleje či 6% oleje z řasy Schizochytrium. Relativní exprese genu Insig-1 byla u pokusné skupiny s přídavkem rybího oleje 120% kontroly (P<0,05) a u skupiny s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium byla relativní exprese 170% kontroly (P<0,05). Tyto výsledky potvrzují pouze část naši hypotézy, neboť relativní exprese genu Hmgcr a Ldlr byla u pokusné skupiny s přídavkem rybího oleje 103% (P>0,05) a 101% kontroly (P>0,05) a u skupiny s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium byla relativní exprese 117% (P>0,05) a 156% (P>0,05) oproti kontrole. Tedy ke snížení relativní exprese těchto genů nedošlo. Nicméně jsme prokázali, že PUFA n-3 přispívají ke snížení plazmatického cholesterolu a to v našem případě až o 20% kontroly. Koncentrace cholesterolu u skupiny s přídavkem oleje ze světlice barvířské byla 1,35 mmol.l -1, u skupiny s přídavkem rybího oleje 0,98 mmol.l -1. Klíčová slova Dokosahexaénová kyselina, Eikosahexaénová kyselina, Cholesterol, Real-time PCR, Genová exprese ABSTRACT The aim of this study was to confirm that the polyunsaturated fatty acids n-3 (n-3 PUFA) have a positive effect on plasma lipids. These acids can reduce cholesterol by increasing gene expression Insig-1 while decreasing the expression of genes encoding Hmgcr and Ldlr. We tested in experimental rats, which were added to the feed mixture of 6 % safflower oil, 6 % fish oil or 6 % of the oil from the algae Schizochytrium. Relative gene expression was Insig-1 in the test group with addition of fish oil to 120% of controls (P<0.05) and in the group with addition of oils from algae Schizochytrium

7 the relative expression of 170 % of control (P<0.05). These results confirm our hypothesis, only a part, as the relative expression of the gene and Hmgcr and Ldlr was in the test group with addition of fish oil 103% (P>0.05) and 101 % of control (P>0.05) and in the group with addition of oils from algae Schizochytrium the relative expression of 117% (P>0.05) and 156 % (P>0.05) compared to control. Thus, to reduce the relative expression of these genes did not. However, we have shown that n-3 PUFA contribute to a reduction in plasma cholesterol and in this case up to 20 % of control. The concentration of cholesterol in the group with addition of safflower oil was 1.35 mmol.l - 1, the group with the addition of fish oil 0.98 mmol.l -1. Keywords Docosahexaenoic acid, eicosahexaenoic acid, Cholesterol, Real-time PCR, Gene expression

8 OBSAH 1 ÚVOD 11 2 CÍL DIPLOMOVÉ PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Lipidy Struktura a klasifikace Mastné kyseliny Polynenasycené mastné kyseliny n-3 (PUFA n-3) Fosfolipidy Sfingolipidy Cholesterol Homeostáza cholesterolu Metabolismus lipidů a mastných kyselin Genová exprese PPAR SREBP EPA a DHA ovlivňující plazmatické lipidy přes signální dráhy PPAR a SREBP Vliv transkripčních faktorů na homeostázu cholesterolu Měření genové exprese metodou qrt-pcr Real-time PCR (RT-PCR) EXPERIMENT Materiál a metodika Stanovení mastných kyselin Stanovení cholesterolu Odběry vzorků krve pro stanovení cholesterolu. 37

9 4.3.2 Stanovení cholesterolu Oběr vzorků tkání pro analýzu genové exprese Kvantifikace genové exprese VÝSLEDKY EXPERIMENTU A DISKUSE Příjem krmiva a hmotnost pokusných zvířat Koncentrace celkového cholesterolu, HDL-cholesterlu, LDL-cholesterolu a TAG Vyhodnocení relativní exprese Relativní kvantifikace genu PPARα Relativní kvantifikace genu SREBP Relativní kvantifikace genu Insig Relativní kvantifikace genu Hmgcr Relativní kvantifikace genu Ldlr Shrnutí výsledků ZÁVĚR LITERÁRNÍ ZROJE.. 52

10 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Stavba glycerolipidů Obr. 2 Struktura triacylglycerolů Obr. 3 Cis a Trans konfigurace dvojné vazby mastných kyselin a jejich vliv na tvar řetězce 15 Obr. 4 Metabolismus polynenasycených mastných kyselin n-3 a n Obr. 5 Strukturní vzorec DHA a EPA. 18 Obr. 6 Struktura fosfatidylcholinu 20 Obr. 7 Schéma homeostázy cholesterolu u člověka.. 22 Obr. 8 Enterohepatální cyklus žlučových kyselin. 24 Obr. 9 Plastové boxy pro potkany s krmítkem a nádržkou na vodu. 34 Obr. 10 Inhalace anestetika Isofluran 37 Obr. 11 Odběr vzorku krve pro stanovení celkového cholesterolu, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu a TAG Obr. 12 Hodnoty TC, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu a TAG. 42 Obr. 13 Relativní exprese genu PPARα v %. 44 Obr. 14 Relativní exprese genu SREBP-2 v %.. 46 Obr. 15 Relativní exprese genu Insig-1 v %.. 47 Obr. 16 Relativní exprese genu Hmgcr v %.. 48 Obr. 17 Relativní exprese genu Ldlr v %.. 49

11 1. ÚVOD Signální dráhy mohou být ovlivněny některými geny, faktory nebo receptory. Významný vliv mohou mít právě i polynenasycené mastné kyseliny n-3 (PUFA n-3), jako je zejména kyselina eiskosapentaénová (EPA) nebo kyselina dokosahexaénová (DHA) (Žák et al., 2011). EPA a DHA působí jako ligandy pro izoformy receptorem aktivovaného PPAR (Peroxisome proliferator-activated receptor) a na modulaci signální dráhy transkripčního faktoru SREBP (Sterol Regulatory Element-Binding Protein) a tím ovlivňují biochemické a molekulární mechanismy (Jump, 2008). Tyto kyseliny mají antiarytmické, protizánětlivé působení, snižují agregaci krevních destiček, aktivitu zánětu a výrazně zlepšují vlastnosti cévní stěny (Breslow, 2006). Podání PUFA n-3 snižuje koncentraci lipidů v plazmě. Koncentrace HDLcholesterolu se většinou nemění a koncentrace LDL cholesterolu mírně stoupají. Tyto LDL frakce jsou zodpovědné za usazování cholesterolu v subendoteliálním prostoru cév a tím dochází k rozvoji aterosklerotických změn (Suzukawa, 1995). PUFA n-3 jsou součástí lipidových složek membrán a významně ovlivňují jejich vlastnosti, jako je např. permeabilita, fluidita, deformabilita a jiné (Stilwell, 1997). Mohou regulovat expresi genů prostřednictvím specifických či nespecifických interakcí s ligandy, které aktivují transkripční faktory, které se váží k cis-regulačním oblastem genu. Vazba transkripčních faktorů na regulační oblasti genu ovlivňuje transkripci příslušného genu (Klusáčková, 2012). 11

12 2. CÍL DIPLOMOVÉ PRÁCE Cílem diplomové práce bylo: 1. Prostudovat dostupnou recentní literaturu shrnující poznatky o kyselině eikosapentaenové (EPA) a dokosahexaénová (DHA) jak modulátorech signálních dráh transkripčních faktorů PPARalfa a SREBP-2 ve vztahu k homeostáze cholesterolu. 2. Seznámit se s měřením genové exprese metodou qrt-pcr. 3. Podílet se na zajištění pokusného chovu vybraných modelových zvířat, na odběru vzorků jejich tkání k analýze a na vlastním měření exprese vybraných genů metodou qrt-pcr. 4. Spolupráce na měření plazmatického cholesterolu a EPA + DHA ve vybraných tkáních pokusných zvířat. 5. Získané výsledky vyhodnotit pomocí vhodných statistických metod a zpracovat obvyklou formou diplomové práce. 12

13 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Lipidy Lipidy jsou organické sloučeniny, které jsou velmi málo rozpustné ve vodě. Plní především funkci zásobních energetických jednotek a jsou stavební součástí buněčných membrán (Svačina et al., 2008). Mají zásadní význam pro termoregulaci, neboť jsou špatným vodičem tepla, jsou snadno neformovatelné, a proto představují účinnou mechanickou ochranu (Mourek, 2012). Pro jejich energetickou denzitu, která činí 9 kcal v 1g (Grofová, 2007), přispívají k podstatnému zvyšování celkově přijaté energie (Svačina et al., 2008) Struktura a klasifikace Lipidy jsou estery trojsytného alkoholu glycerolu se třemi mastnými kyselinami. Pokud je ke glycerolu připojená jediná mastná kyselina, mluvíme o monoacylglycerolu. Esterifikací s dalšími kyselinami získáme diacylglyceroly a konečně triacylglyceroly, které označujeme též jako nepolární tuky (Koolman et al., 2012). Dále rozlišujeme lipidy polární, kam řadíme fosfolipidy, sfingolipidy a cholesterol. Obr. 1 Stavba glycerolipidů (Koolman et al., 2012) Struktura triacylglycerolů vyplívá z jejich názvu, tedy na glycerolu jsou navázány 3 zbytky mastných kyselin (acyly). Fosfolipidy jsou součástí biologických membrán a podobně jako sfingolipidy a cholesterol se vyskytují v nervové tkáni (Holeček, 2006). 13

14 Obr. 2 Struktura triacylglycerolu (Holeček, 2006) Mastné kyseliny Mastné kyseliny se vyskytují jako volné, tzv. neesterifikované, nebo estericky vázané. Většina vyšších mastných kyselin má přímý řetězec o sudém počtu atomu uhlíků a amfipatickou strukturu, což znamená, že mají hydrofobní řetězec i hydrofilní část. Čím je mastná kyselina delší, tím se více projevují její hydrofobní vlastnosti a mastná kyselina je rozpustná ve vodě (Holeček, 2006). Složení mastných kyselin v nepolárních lipidech má zásadní význam pro jejich funkce v organismu. Dle původu se mastné kyseliny dělí na živočišné a rostlinné, podle chemické stavby se dělí na nasycené, které mají jednoduché vazby, jsou živočišného původu a kyseliny nenasycené s jednou nebo více dvojnými vazbami. Jsou původu rostlinného. Výjimky představují polynenasycené mastné kyseliny omega-3 původem z ryb a naopak kyseliny nasycené obsažené v kokosovém a palmovém oleji (Grofová, 2007). Pokud je přítomná dvojná vazba, může se mastná kyselina vyskytovat ve dvou stereoizomerech a to cis a trans. V cis-kyselinách jsou oba atomy vodíku na dvojné vazbě v poloze sobě bližší a v trans-kyselinách se nachází na opačných polohách, Tento rozdíl se projeví ve fyzikálně-chemických vlastnostech a funkci struktur, ve kterých se mastné kyseliny vyskytují. Nejčastěji se vyšší nenasycené mastné kyseliny přirozeně vyskytují v konformaci cis. Trans-kyseliny se vyskytují v mikroorganismech, v semenech některých rostlin a v tuku a mléce přežvýkavců, v lidském organismu vznikají v malém množství v mitochondriích při β-oxidaci. Velké množství transizomerů vzniká při hydrogenaci používané pro ztužování tuků (Holeček, 2006). 14

15 Obr. 3 Cis a Trans konfigurace dvojné vazby mastných kyselin a jejich vliv na tvar řetězce (Holeček, 2006). Tab. 1 Výskyt a funkce vyšších mastných kyselin (Holeček, 2006). Nasycené mastné kyseliny představují zdroj energie, ale jsou důležitou strukturální součástí buněčných membrán. Tyto kyseliny působí nepříznivě a to tím, že zvyšují hladinu cholesterolu v krvi. Většinou jsou obsaženy v živočišných tucích, jako je např. máslo, sádlo nebo hovězí tuk. Nejvýznamnější nasycené mastné kyseliny jsou kyselina kaprylová, kapronová, laurylová, kristová, palmitová, stearová (Svačina et al., 2008). Nenasycené mastné kyseliny se dále rozdělují na mononenasycené, které působí příznivě, přestože hladinu cholesterolu nemění, snižuje jeho nebezpečnou frakci, tzv. LDL. LDL-částice jsou částečně metabolizovány játry za pomocí apoe-receptoru a částečně přecházejí na LDL- částice, které přenášejí téměř ¾ celkového cholesterolu (Svačina et al., 2008). Zároveň zvyšuje prospěšnou frakci, tzv. HDL (Kunová, 2004). Tyto frakce se tvoří v játrech, střevních buňkách a makrofázích. Přeměňují se na různě 15

16 velké frakce a cestou apolipoproteinu A1 se váží na jaterní receptory. Transportují nadbytečný cholesterol, aktivují plazmatický enzym LCAT (lecitincholesterolacyltransferázu). Ta způsobí esterifikaci cholesterolu, který je předáván do jater a žláz tvořících steroidy. (Svačina et al., 2008). Zdrojem těchto kyselin je např. olivový olej, avokádo nebo ořechy. (Kunová, 2004). Rozhodující část příjmu v potravě představuje z těchto mastných kyselin až 92% kyselina olejová. Mononenasycené mastné kyseliny jsou důležité z hlediska správné struktury buněčných membrán, zejména myelinu v nervových tkáních. Nejvýznamnější zástupci těchto kyselin je kyselina olejová, myristolejová, palmitolejová, eikosanová, eruková. Polynenasycené mastné kyseliny musíme přijímat stravou. Naše tělo si je totiž nedokáže vytvořit. Hladinu cholesterolu v krvi většina z nich snižuje. Některé brání vzniku krevních sraženin, tzv. trombů. Zdroje těchto kyselin jsou rostlinné oleje, jako je řepkový, slunečnicový nebo sójový. Dalším zdrojem jsou kvalitní margaríny vyrobené z těchto olejů a tuk obsažený v rybím mase (Kunová, 2004). Existují dvě skupiny polynenasycených mastných kyselin. Jedná se o n-3 a n-6. Takzvané omega 3 kyseliny (PUFA n-3) jsou důležitou složkou prevence srdečněcévních onemocnění. Mají schopnost bránit tvorbě krevních sraženin, které mohou být příčinou vzniku infarktu myokardu nebo cévní mozkové příhody. Dále brání vzniku mikrozánětů, snižují krevní tlak, tako hladinu krevních tuků a přitom zachovávají vyšší hladinu HDL cholesterolu (Kunová, 2004). Mezi n-3 polynenasycené mastné kyseliny řadíme kyselinu α-linolenovou, eikosapentaenovou, dokosapentaenovou a kyselinu dokosohexaenovou. Lidské tělo není schopno syntetizovat kyselinu α-linolenovou. Její nedostatek, zejména během období růstu, je často spojován s poruchami vývoje a neurologickými onemocněními. Kyselina α-linolenová je prekurzorem pro syntézu kyseliny eikosapentaenové (EPA) a dokosahexaenové (DHA), které se nachází převážně v tučných mořských rybách (Svačina et al., 2008). Těmto kyselinám, zejména kyselině eikosapentaenové a kyselině dokosahexaenové se budu ve své práci podrobněji věnovat později. Mateřskou kyselinou polynenasycených mastných kyselin n-6 (PUFA n-6) je kyselina linolová, jejími hlavními produkty jsou kyselina γ-linolenová, dihomo-γlinolenová a kyselina arachidová. Vysoký obsah těchto kyselin má olej sójový, slunečnicový, saflorový, olej z hroznových semen, z máku setého a jiné. 16

17 Obr. 4 Metabolismus polynenasycených mastných kyselin n-3 a n-6 (Komprda, 2012) PUFA n-6 patří také do skupiny aktivátorů receptorů aktivovaných proliferátory peroxizomu. Jejich metabolický účinek zahrnuje zvýšenou syntézu cholesterolu, zvýšenou aktivitu LDL-receptorů, zvýšenou aktivitu cholesterol-7α-hydroxylázy a sníženou konverzi VLDL na LDL. Suplementace PUFA n-6 vede ke snížení celkového, 17

18 LDL a HDL cholesterolu a ke zvýšené oxidaci a oxidabilitě částic LDL (Žák et al., 2011) Polynenasycené mastné kyseliny řady n-3 (PUFA n-3) Jedná se tzv. omega - 3 polynenasycené mastné kyseliny (Russell et al., 2012). Tyto mastné kyseliny jsou nezbytné a lidský organismus je zcela závislý na jejich příjmu v potravě, především z chloroplastů zelených rostlin a tuku vodních živočichů (Zeman et al., 2006). Hlavními představiteli PUFA n-3 jsou kyselina eikosapentaenová (EPA) a kyselina dokosahexaenová (DHA), jejichž prekurzorem je kyselina α- linolenová, která se hojně vyskytuje v rostlinných olejích, zejména v řepkovém a lněném oleji (Žák et al., 2005). Obr. 5 Strukturní vzorec DHA a EPA Potrava obohacená o n-3 LC-PUFA příznivě ovlivňuje všechny patologické stavy řazené do tzv. metabolického syndromu a souvisí s jejich prevencí. Míra ovlivnění jednotlivých složek syndromu je různá a účinek těchto kyselin závisí především na dávce (Kopecký et al., 2009). Zvýšená spotřeba kyseliny eikosapentaenové (EPA) a dokosahexaenová (DHA) se ze zdravotního hlediska doporučuje pro léčbu chronických onemocnění v množství 1 g/den u ischemické choroby srdeční a 1,2-4 g/ den u zvýšené hladiny triacylglycerolů. Pro dietní příjem LC n-3 PUFA jsou často kombinovány s kyselinou α linolenovou. Nicméně, mnoho studií hlásí rozdílné účinky právě těchto kyselin a jejich metabolitů (Russell et al., 2012). PUFA n-3 jsou vhodné i pro léčbu pacientů s revmatoidní artritidou nebo pro léčbu demence a deprese. 18

19 Podání PUFA n-3 snižuje koncentraci triglyceridů v plazmě a v závislosti na dávce a výchozích hladinách triglyceridy klesají v průměru o % (Knopp, 1999). Koncentrace HDL-cholesterolu se většinou nemění a koncentrace LDL cholesterolu mírně stoupají, současně však podání PUFA n-3 zvětšuje průměrnou velikost LDL částic (Suzukawa, 1995). Vyšší dávky EPA a DHA snižují agregaci krevních destiček, aktivitu zánětu a výrazně zlepšují vlastnosti cévní stěny (Breslow, 2006). Nevyvážený poměr n-6/n-3 PUFA zvyšuje riziko vzniku výše zmíněných onemocnění (Komprda, 2012). Polynenasycené mastné kyseliny n-3 mají řadu dalších účinků. Jsou součástí lipidových složek membrán a významně ovlivňují jejich vlastnosti, jako je např. permeabilita, fluidita, deformabilita a jiné (Stilwell, 1997). Tyto kyseliny mají antiarytmické, protizánětlivé působení, dále ovlivňují trombózu a imunitní reakce. Působí preventivně proti atopickému ekzému, astmatu, také příznivě ovlivňují zánětlivou aktivitu u revmatoidní artritidy (Calder, 2003). Obecně platí, že příznivé účinky n-3 polynenasycených mastných kyselin je možné vysvětlit jejich ovlivněním buněčných metabolických funkcí, zabudováním do membránových fosfolipidů, modulací enzymů a signálních molekul i přímým dopadem na genovou expresi (Zeman et al., 2006). Významné je také ovlivnění genové exprese genů. PUFA mohou regulovat expresi genů prostřednictvím specifických či nespecifických interakcí s ligandy, které aktivují transkripční faktory, které se váží k cis-regulačním oblastem genu. Vazba transkripčních faktorů na regulační oblasti genu ovlivňuje transkripci příslušného genu. V kontrole genové exprese mastnými kyselinami je zahrnuta např. steroidní/thyroidní/retinoidní receptorová nadrodina. Jedná se o nukleární receptory fungující jako ligandem aktivované transkripční faktory. Donedávna se předpokládalo, že vliv PUFA na genovou expresi je primárně zprostředkován PPAR (receptory aktivované proliferátory peroxizomu), nyní je zřejmé, že PUFA mohou regulovat geny i pomocí dalších transkripčních faktorů včetně HNF-4α (hepatic nuclear factor-4α), NF-κβ (nuclear factor κβ), RXRα (retinoid X receptor α), LXRα a LXRβ (liver X receptors) a SREBP-1c (sterol regulatory element binding protein1c) (Klusáčková, 2012). 19

20 Fosfolipidy Fosfolipidy představují skupinu sloučenin kyseliny fosforečné s glycerolem a dalšími látkami (Holeček, 2006). Jsou důležité pro řadu životně důležitých funkcí. Jednak jsou složkou buněčných membrán, dále působí preventivně proti některým onemocněním a také zpomalují stárnutí (Pitha et al., 2009). Fosfátová skupina vytváří hydrofilní část, která umožňuje vazbu s bílkovinami a rozpustnost fosfolipidů ve vodném prostředí. Hydrofóbní část umožňuje vytvářet komplexy s apolárními sloučeninami. Díky této struktuře mají fosfolipidy nezastupitelnou úlohu právě při stavbě buněčných membrán a lipoproteinů. Mezi nejvýznamnější fosfolipidy se řadí fosfatidylcholiny, fosfatidylinositoly, sfingomyeliny, plazmalogeny, fosfatidylserin a fosfatidyletanolamin (Holeček, 2006). Zdrojem fosfolipidů je např. vaječný žloutek, mozeček nebo podmáslí (Pitha et al., 2009). Obr. 6 Struktura fosfatidylcholinu (Holeček, 2006) Sfingolipidy Důležité lipidy membrán, které se se svou strukturou od popisovaných membránových lipidů liší v úloze glycerolu a jednoho zbytku mastné kyseliny přebírá sfingozin, tzv. aminodialkohol s dlouhým nenasyceným postranním řetězcem (Koolman, 2012) 20

21 Cholesterol Jedná se o látku, která má pro organismus mimořádný význam. Cholesterol je základní látkou, ze které vznikají hormony v nadledvinkách a v pohlavních žlázách (Sovová et. al., 2005), je hlavní konstituent plazmatické membrány v eukaryotických buňkách. Reguluje fyzický stav fosfolipidové dvojvrstvy a zásadním způsobem se podílí na formování blány mikrodomén. Cholesterol také ovlivňuje aktivitu několika membránových proteinů, a je prekurzorem steroidních hormonů a žlučových kyselin. (Harris, 2010). Z cholesterolu vzniká vitamín D, který je velice důležitý pro stavbu kostí (Sovová et al., 2005). Podle hustoty tuku, který je navázán na bílkovinu, dělíme cholesterol na LDL (Lipoproteiny o nízké hustotě) a HDL (lipoproteiny o vysoké hustotě) (Dýrová et al., 2008). LDL cholesterol - špatný cholesterol se usazuje v cévách a HDL cholesterol - dobrý cholesterol je přenášen do jater a tam odbouráván (Sovová et al., 2005). Tab. 2 Normální hodnoty lipidů (Sovová et al., 2005) LIPIDY NORMÁLNÍ HLADINY V KRVI Celkový cholesterol 3,87 5,2 mmol/l HDL cholesterol 1,25 2,59 mmol/l LDL cholesterol 0 3,40 mmol/ l Triacylglycerol (TAG) 0,20 1,80 mmol/l Aterogenní index (celk.chol./hdl) Do 3,5 Při poruše metabolismu tuků dochází ke snížení hladiny LDL a zvýšení hladiny HDL cholesterolu. Při léčbě se tedy snažíme hladinu LDL snížit a hladinu HDL naopak zvýšit. Hlavní zásady při poruše metabolismu, které je nutné dodržovat: dieta zvýšit fyzickou aktivitu zákaz kouření zákaz alkoholu (Dýrová et al., 2008) 21

22 Poruchy metabolismu tuků mohou vznikat z genetických příčin, neboť je známo několik onemocnění, kde jako důsledek genetické poruchy se objevují vysoké hladiny tuků v krvi. Také porucha metabolismu může být součástí některých onemocnění, jsou to choroby jater, ledvin, štítné žlázy, cukrovka nebo i nadměrná spotřeba alkoholu (Sovová et al., 2005) Homeostáza cholesterolu Centrálním orgánem homeostázy cholesterolu jsou játra. Jeho denní obrat v játrech činí zhruba 1,8 g. Předpokládá se, že se cholesterol nachází v hepatocytech, jaterních buňkách, ve dvou kompartmentech a to jak aktivní frakce neesterifikovaného cholesterolu a jednak jako zásobní frakce esterů cholesterolu. Za fyziologických podmínek je homeostáza zajištěna syntézou cholesterolu de novo a cholesterolem transportovaným do jater. Hlavními protagonisty jsou remontní chylomikry, které transportují cholesterol resorbovaný ve střevě v množství asi 0,6 g/ den. Téměř stejné množství přináší do jater lipoproteiny. LDL lipoproteiny se podílí na transportu cholesterolu ze tkání do jater a to v množství 0,3 g / den. Lipoproteiny se váží na specifické receptory. HDL se váží na SR-B1, CMr na LRP a LDL se váží na apob/e-receptory. Obr. 7 Schéma homeostázy cholesterolu u člověka (Žák et al., 2011) 22

23 U lidí je sekrece cholesterolu do žluče a jeho přeměna na žlučové kyseliny jediným významným způsobem eliminace cholesterolu z organismu. Denně se vyloučí zhruba 1 g cholesterolu a 0,3 0,6 g žlučových kyselin. Většina žlučových kyselin má původ v cholesterolu transportovaného lipoproteiny LDL, CMr a HDL. Menším dílem pochází z cholesterolu syntetizovaného de novo. Dlouhodobý pokles syntézy cholesterolu indukuje homeostatické mechanismy, které udrží syntézu žlučových kyselin ve fyziologických mezích. K poklesu dochází až za situace, kdy je kompenzatorně maximálně zvýšená syntéza žlučových kyselin a inhibuje se syntéza cholesterolu. Zdrojem cholesterolu vyloučeného do žluče je cholesterol transportovaný v HDL, zatímco z cholesterolu transportovaného v LDL se tvoří žlučové kyseliny. Cholesterol transportovaný v HDL se objevuje ve žluči rychleji jak cholesterol transportovaný v LDL. Pokles LDL cholesterolu indukovaný LDL-aferézou vede ke snížení syntézy žlučových kyselin. Hlavním katabolickým produktem přeměny cholesterolu jsou žlučové kyseliny. Aktivní resorpci těch kyselin do enterocytů zajišťuje specifický transportér SLC10A2. Syntéza žlučových kyselin a velikosti jejich poolu je zpětnovazebně regulována, přičemž žlučové kyseliny jsou signální molekulou farnezoidního receptoru X (FXR), který je exprimován v buňkách tenkého střeva a jater. Nukleární receptor FXR heterodimerizuje retinoidním X-receptorem (RXR) a váže se na DNA. Zpětnou vazbu zaručí 2 mechanismy: 1. V enterocytu komplex FXR/RXR up-reguluje FGF-19, který via vena portae (vrátnicová žíla) dosahuje jater a po vazbě na specifický receptor, v tomto případě FGRR-4, v játrech aktivuje c-jun terminální kinázu, která inhibuje CYP7A1. 2. V hepatocytu komplex FXR/RXR indukuje transkripci SHP, který dimenzuje s jaterním receptorem X a LRH-1 s následným snížením exprese. Současně žlučové kyseliny zvyšují expresi transportérů pro žlučové kyseliny ve střevě i kanalikulárního pólu hepatocytu, a tím potencují enterohepatální cirkulaci žlučových kyselin (Žák et al., 2011). 23

24 Obr. 8 Enterohepatální cyklus žlučových kyselin (Žák et al., 2011) 24

25 3.2 Metabolismus lipidů a mastných kyselin Mastné kyseliny, zejména nenasycené mastné kyseliny, významně ovlivňují genovou transkripci a to tím, že regulují aktivitu řady transkripčních faktorů, včetně jaderných receptorů jako jsou PPAR (receptory aktivované proliferátory peroxizomu) nebo skupina transkripčních faktorů SREBP (Afman et al., 2012). Mastné kyseliny a jejich metabolity se vážou přímo na specifické transkripční faktory, které regulují genovou expresi, která je důležitá pro řízení metabolismu lipidů (Jump, 2004) Genová exprese Genová exprese je konverze genetické informace z DNA do RNA a odtud do proteinu. Genová exprese zahrnuje tyto procesy: vznik molekul primárního transkriptu transkripcí DNA, dále vyštěpení intronů, transport výsledné mrna z jater do cytoplazmy a translaci. Konečné množství proteinu závisí na účinnosti všech kroků a na rychlosti degradace mrna a proteinu samotného. Pro zahájení transkripce jsou nutné transkripční faktory, regulační proteiny, které se vážou na regulační oblasti promotoru nebo zesilovače transkripce a navozují zahájení transkripce. Většina těchto faktorů reguluje transkripci pozitivně. Lze je dělit na obecné transkripční faktory a na speciální, které se vyskytují v určitých buňkách v určitém období, zvyšují základní úroveň transkripce a označují se jako indukovatelné transkripční faktory, které jsou na DNA rozpoznávány tzv. elementy odezvy (responzivními elementy). Indukce aktivity transkripčních faktorů se uskutečňuje přes foforylaci a desfosforylaci, vazbu specifického ligandu nebo uvolnění navázaného inhibitoru (Fišar, 2009) PPAR PPAR, receptory aktivované peroxizomovými proliferátory, patří do rodiny nukleárních receptorů. První práce s PPAR, vedoucí k identifikaci PPAR, byly zaměřeny na hledání cílových genů látek aktivujících proliferaci peroxizomů u hlodavců. Nejúčinnější aktivátory PPAR u člověka nevedou k proliferaci peroxizomů, mají však významné metabolické účinky. Název PPAR z hlediska účinků u člověka není 25

26 zcela známý. Peroxizomy, organely vyskytující se ve všech buňkách vyšších organismů, se skládají z peroxizomální membrány a vnitřní matrix. Mají zásadní význam při β- oxidaci delších a rozvětvených mastných kyselin, syntéze cholesterolu, žlučových kyselin, strukturálních lipidů a v řadě dalších procesů. PPAR působí jako transkripční faktor ovlivňující expresi kódujících celou řadu působků, jako jsou např. enzymy, zapojených nejen v metabolismu lipidů a sacharidů, ale také v regulaci zánětu, nádorového bujení, imunitních dějů, diferenciace buněk apod. PPAR-γ se hojně vyskytuje v tukové tkáni a patří mezi nejvýznamnější regulátory její diferenciace. Mechanismus působení PPAR ukazuje obr. 8, kde transkripční faktory reagují s odpovídajícími vazebnými sekvencemi DNA, které kódují geny metabolicky významných bílkovin např. enzymů, inhibitorů a aktivátorů lipidové a glukózové homeostázy, homeostázy tukové tkáně a dalších. Může se vyskytovat i v jiných orgánech, např. v trávicím ústrojí, kde mohou ovlivňovat sklon tkání k nádorovému bujení a k rozvoji autoimunitně podmíněných zánětlivých onemocnění. PPAR-α jsou naopak nalézány v jaterní a svalové tkáni, kde regulují oxidaci volných mastných kyselin a ovlivňují i citlivost tkání na inzulin. PPARβ/δ se nachází prakticky ve všech tkání a zásadním způsobem ovlivňuje myelinizaci centrálního nervového systému a podílí se na regulaci implantace embrya v průběhu nitroděložního vývoje. 26

27 Tab. 3 Funkce, lokalizace a ligandy jednotlivých PPAR (Kraml, 2008) Nukleární TF PPAR-α Lokalizace Játra, kosterní sval, myokard, ledvina, monocyty/makrofágy (v cévní stěně) Přirozené ligandy Mastné kyseliny PPAR-β/δ Většina tkání Mastné kyseliny PPAR-γ Tuková tkáň, kosterní sval, monocyty/makrofágy (v cévní stěně), kolon Mastné kyseliny Syntetické ligandy fibráty Thiazolidindiony Funkce Zyýšení vychytávání MK a oxidace MK, snížení hladiny TAG, zvýšení hladiny HDL, snížení tvorby malých LDL Zvýšení oxidace MK, Snížení hladiny TAG? Zvýšení hladiny HDL? Snížení tvorby malých LDL? Zvýšení ukládání MK v tukové tkáni, zvýšení diferenciace adipocytů, snížení glykémie, zvýšení inzulínové senzitivity, zvýšení hladiny HDL? Snížen hladiny TAG? Strukturálně jsou PPAR tvořeny třemi oblastmi neboli tzv. doménami. V C- terminální části PPAR se nachází ligand-dependentní AF-2 aktivační doména, jejíž funkce jsou přímo ovlivňovány navázáním PPAR aktivátorů nebo inhibitorů. V NHterminální části je AF-2 ligand-independentní aktivační doména. Třetí část je DNAvázající doména, která se váže na úseky DNA nazývané PPRE SREBP SREBP je skupina transkripčních faktorů, který váže na sterol regulační prvek sekvence DNA a reguluje metabolismus lipidů. Dosud byly identifikovány tři izoformy: SREBP-1a, SREBP-1c a SREBP-2 (Müller et al., 2002). SREBP-1 přednostně aktivují geny zapojené do lipogeneze, zatímco SREBP-2 aktivují geny cholesterol biosyntetické dráhy (Joseph et al., 2002). Všechny SREBP jsou syntetizovány jako inaktivní transkripční prekurzory vázané na membránu, které jsou lokalizovány na nukleární obálce a v endoplazmatickém retikulu. Ve sterolu ochuzeném o buňky jsou prekurzory proteolyticky štěpeny za vzniku rozpustných NH 2 terminálních fragmentů, které obsahují kyselou transaktivační doménu a základní helix-loop-helix-leucin zipovou oblast, která zprostředkovává 27

28 protein dimeraci a vazbu DNA. Zralá forma se přemístí do jádra a aktivuje transkripci. Když se steroly hromadí uvnitř buněk, prekurzory jsou již proteolyzovány, ale zůstávají na membránách, což má za následek pokles transkripce sterolu regulovaných genů (Ryuichiro et al., 1996). SREBP se váže na 2 proteiny a to na SCAP (SREBP-cleavage activating protein) a INSING-1 (Insulin-induced gene 1 protein). Jestliže se v buňce nachází dostatek cholesterolu, SREBP zůstává navázaný na proteiny. Pokud cholesterol v buňkách je deficitní, protein INSIG-1 se uvolní z komplexu SREBP-SCAP. Tímto je umožněna přeprava SREBP-SCAP z endoplazmatického retikula do Golgiho komplexu. Zde jsou proteiny štěpeny site-1 a site-2 proteázou (S1P, S2P) a přeměněny na rozpustný transkripční faktor, který stimuluje expresi svých cílových genů. Tyto geny kódují enzymy s důležitými rolemi v syntéze a vychytávání cest cholesterolu a triglyceridů (Qiu XM et al., 2014) EPA a DHA ovlivňující plazmatické lipidy přes signální dráhy PPAR a SREBP Podání EPA nebo DHA působí jako prevence proti onemocněním, mezi které patří diabetes typu II, autoimunitní onemocnění a některé typy rakoviny. Nevyvážený poměr n-6/n-3 PUFA zvyšuje riziko vzniku výše uvedených onemocnění i vzhledem k tomu, že jak kyselina linolová (LA) a kyselina α-linolenová (ALA) jsou metabolizovány stejným souborem enzymů elongáz a desaturáz. Nicméně je třeba zmínit, že k rozdílům v poměrech EPA a DHA v tkáních může dojít také v důsledku genetických variant těchto enzymů (Morales et al., 2011). Kyselina α-linolenová, která patří mezi PUFA n-3, je zpracována cyklooxygenázou (COX-2) nebo lipoxygenázou (5-LOX) metabolickými cestami na eikosanoidy. Tyto eikosanoidy mají pro-zánětlivé účinky, zvyšují tendenci k agregaci krevních destiček a působí většinou jako vazokonstriktory. Eikosanoidy odvozené od EPA mají méně výrazné a v mnoha případech opačné účinky (Das, 2006). Na molekulární úrovni, funkce EPA/DHA jako doplňků výživy je založena mimo jiné na modulaci signálních drah zprostředkovaných transkripčními faktory, nukleárním faktorem kappa B (Kostadinova et al., 2005; Schmitz & Ecker, 2008), PPAR (Arai Kim, Chiba, & Matsumoto, 2009; Jump, 2008; Nakamura, Cheon, Li, & Nara, 2004; Schmitz 28

29 & Ecker, 2008) SREBP (Jump, 2008; Nakamura, Cheon, Li, & Nara, 2004; Schmitz & Ecker, 2008). Účinek EPA/DHA na krevní lipidy, zejména na cholesterol, je založena na působení těchto polynenasycených mastných kyselin n-3 jako ligandů různých izoforem PPAR-α a na modulaci signální dráhy transkripčního faktoru SREBP. Struktura dané mastné kyseliny (MK), může být důležitá pro vazbu a aktivaci PPAR-α. Vazba EPA zahrnuje vložení karboxylového konce do hydrofobní kapsy v doméně vázající ligandu, s methylovým koncem MK vyčnívajícím směrem k povrchu receptoru. Prodloužení EPA k DPA vede k přidání dvou uhlíků na karboxylovém konci se zvýšenou tuhostí a pravděpodobně se sníží vazebné kapacity DPA. Naproti tomu, DHA má podobný stav nenasycenosti jako EPA. V důsledku toho, pouze EPA a DHA, nikoli DPA, aktivují PPAR-α v hepatocytech (Jump, 2004). PPAR-δ je převládající izoforma v kosterním svalu, jeho aktivace stimuluje odbourávání lipidů v této tkáni, což vede k rozptýlení tuku a zvýšení HDL částic. PPAR-γ také řídí geny MK katabolismu ve svalové tkáni. Pokud jde o SREBP, izoformy 1a, 1c a 2 kontrují převážně geny metabolismu mastných kyselin, metabolismus a homeostázu cholesterolu. Izoforma SREBP-1c je považována za hlavní transkripční faktor syntézy MK, PUFA n-3 potlačují její činnost. Mediace prostřednictvím mastných kyselin vazebných proteinů (FABP) je nutná pro úspěšné interakce EPA/DHA-SREBP (Makowski & Hotamisligil, 2004) Vliv transkripčních faktorů na homeostázu cholesterolu Hlavní transkripční faktor, který se váže na promotorové oblasti genů kódujících proteiny, ovládajících homeostázu cholesterolu, je SREBP -2. Tento protein je primárně vytvořen jako prekurzor (psrebp) ukotvený v membráně endoplazmatického retikula, kde se váže na protein SCAP, který slouží jako faktor pro aktivace psrebp (Chatterjee et al., 2009; König et al., 2007). Tato aktivace se provádí po transportu SREBP-SCAP komplexu do membrány Golgiho aparátu, kde je SREBP postupně štěpen na dvou místech pomocí proteáz S1P (site-1 proteázy) a S2P (site-2 proteázy). V druhém případě, N-koncová doména proteinu SREBP se uvolní a přepravuje se jako transkripční faktor do buněčného jádra (Sato, 2010). Zda komplex SREBP-SCAP bude transportován do Golgiho aparátu a SREBP bude aktivován je dáno pevností vazby komplexu SREBP- 29

30 SCAP a dalším proteinem, tzv. INSIG, ukotveným v membráně endoplazmatického retikula. Protein INSIG obsahuje doménu, která reaguje na přítomnost sterolů (včetně cholesterolu a jeho oxidačních produktů) v buňce (Sato, 2010). Když se zvýší obsah sterolů v buňce, komplex SREBP-SCAP je zadržen v membráně ER. Pro syntézu cholesterolu jsou důležité tyto geny: 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl- CoA reduktáza (Hmgcr) a gen regulující transport cholesterolu, kterým je Ldlr (Sato, 2010). Na druhé straně, přítomnosti PPARα v promotoru genu Insig-1 může objasnit vztah mezi DHA, SREBP-2 a cholesterolem a to následovně: po stimulaci EPA/DHA, PPAR-α přímo aktivuje Insig-1 dochází ke zvýšení jeho koncentrace v membráně ER a k udržené komplexu psrebp-scap. To vede ke snížení množství účinného transkripčního faktoru (nsrebp) v buněčném jádře. Vzhledem k nižší expresi Hmgcr a Ldlr, koncentrace cholesterolu v játrech a plazmě se může snížit. Nicméně, protichůdné výsledky jsou také k dispozici. Například, podávání PPAR-α agonistů může zvýšit aktivitu Hmgcr a koncentraci cholesterolu. Složitost vztahu mezi dietními PUFA n-3 a cholesterolem v plazmě je dále potvrzena systematickými přehledy, které prokazují, že EPA a DHA zvyšují hladinu LDL cholesterolu a nemají tak žádný vliv na hladiny celkového cholesterolu. DHA může ovlivnit homeostázu cholesterolu i jiným mechanismem. DHA, případně EPA, obohacují plazmatické membrány, zejména lipidových raftů, mění poměr fosfatidylcholin/cholesterolu v krvi. Cholesterol je čerpán z plazmatické membrány do cytoplazmy, což zvyšuje jeho koncentraci v blízkosti membrány ER. Steroly snímající domény proteinu INSIG a SCAP zakotvených v membráně ER registrují vyšší koncentrace neesterifikovaného volného cholesterolu v důsledku zachování komplexu SCAP-SREBP v membráně ER, snižuje se koncentrace nsrebp a také se snižuje exprese genů kontrolujících syntézu cholesterolu a jeho vstup do buňky (Di Nunzio et al., 2010). 30

31 3.3 Měření genové exprese metodou qrt-pcr Real-time PCR (RT-PCR) Real-time PCR, PCR v reálném čase, je metodika založená na polymerázové řetězové reakci. V klasické PCR je amplifikovaný produkt detekován po skončení reakce elektroforeticky, naproti tomu real-time PCR umožňuje měření zmnoženého produktu v průběhu reakce, tedy v reálném čase. Detekce produktů je umožněna využíváním fluorescenčních molekul, které odpovídají množství amplifikované DNA v každém cyklu. Tyto fluorescenční chemikálie mohou být barviva vázající se na DNA nebo sekvenčně specifické primery nebo sondy. Hledaná sekvence může být stanovena jak kvantitativně tak kvalitativně. Kvantitativní PCR (qpcr) má široký rozsah kvantifikace v řádu 7-8 logaritmických dekád, vysokou senzitivitu a vysokou přesnost. Vysoká specifita je zajištěna třemi oligonukleotidy: dvěma primery a jednou sondou. Ve výzkumu umožňuje tato metoda vysoce citlivé kvantitativní měření genové transkripce, v laboratoři může být využita pro stanovení změn genové exprese určitého genu v čase jako odpověď buněk po podání léku, v diferenciaci buněk nebo jako reakce na změnu podmínek prostředí (Dudová et al., 2008). U qrt-pcr je fluorescence barviva DNA nebo sondy monitorována během každého cyklu PCR. V jistém bodu během cyklování se produkt hromadí natolik, že zvyšuje fluorescenci nad pozadím. Bod, kde fluorescence stoupá nad šumem pozadí, je nejlépe kvantifikovaný jako druhé odvozené maximum křivky a koreluje s množstvím počátečních kopií uvnitř PCR reakce. Jak se počet kopií počátečního templátu zvyšuje, fluorescence se jeví dřív a C T je nižší. Počet relativních kopií mezi vzorkem experimentálním a kontrolním může být určen rozdílem mezi jejich C T hodnotami. PCR je exponenciální proces, proto se počet kopií rovná PCR efektivitě zvednuté do síly/intenzity, ΔC T. Může být obtížné poznat celkové množství DNA v různých vzorcích, a proto výsledky testovaného genu jsou často normalizovány na referenční gen, který je invariantní. Oblasti genomové nezměněné stability pro daný typ nádoru mohou být identifikovány CGH studií a mohou být použity pro DNA kontroly (Lysková, 2008). V současné době jsou pro detekci produktů využívány převážně 4 metody RT- PCR. Nejjednodušší a nejlevnější metoda je založena na interkalaci fluorescenčních látek, které se váží na dvouřetězcovou DNA. Interkalární barvivo SYBR Green I se 31

32 váže do žlábku dvouřetězcové DNA. Během PCR amplifikace se zvyšuje počet dsdna produktů exponenciálně a tím se zvyšuje množství barviva, které se na tyto produkty váže. Fluorescenční signál je nejvyšší na konci každé exponenciání fáze. Detekce PCR produktů pomocí SYBR Green I není sekvenčně specifická, během reakce mohou vznikat nespecifické PCR produkty a produkty vzniklé reakcí samotných primerů. Ostatní metody vychází z vazby fluorescenčně značených oligonukleotidů. Nejvíce rozšířeny jsou hydrolyzací sondy. Krátká oligonukleotidová sonda komplementární k jednomu z řetězců má na jednom konci fluorescenční látku a na druhém zhášeč fluorochromu. Zhášeč je v inaktivní formě v blízkosti flourochromu a proto fluorescence vyzářená reportérem je absorbována zhášečem a není tak měřitelná. Při syntéze komplementárních vláken dochází 5 3 aktivitou Taq DNA polymerázy k hydrolýze sondy, separaci reportérové molekuly a zhášeče a tím k zvýšení fluorescence. Během dalších cyklů se fluorescence dále zvyšuje, v závislosti na počtu cyklů je pak možné stanovit koncentraci mrna studovaného genu v neznámém vzorku. Jsou tu i další typy sond, např. molekulární majáky, škorpiony nebo hybridizační sondy (Dudová et al., 2008) Měření genová exprese pomocí metody qrt-pcr Analýza relativní genové exprese pomocí qrt - PCR vyžaduje normalizaci dat pomocí referenčního genu, který je exprimován na stejné úrovni ve všech hodnocených podmínkách. Určování genu vnitřní kontroly je nezbytné pro studium genové exprese. Analýza produktu transkripce mrna je základem pro pochopení regulačních mechanismů, které řídí expresi genu. Mocný nástroj pro měření obsahu mrna vzorku je kvantitativní reverzní transkripce polymerázové řetězové reakce (qrt-pcr). Mezi hlavní výhody této metody jsou její vysoká citlivost, specificita a přesnost kvantifikace. Kvantifikace mrna metodou qrt-pcr vyžaduje řadu standardizací, tj. normalizace různých parametrů, jako je počáteční množství vzorku, intergrita a množství RNA, enzymatické účinnosti syntézy cdna, PCR amplifikaci a co je nejdůležitější, použití vhodných normalizačních genů. Genová exprese může být měřena pomocí dvou metod: absolutní nebo relativní. U absolutní metody se počet kopií mrna stanoví porovnáním se standardní křivkou. V relativní kvantifikaci, úroveň genové exprese se stanoví za použití relativní exprese cílového genu ve srovnání s normalizovaným genem. Výběr 32

33 vhodného normalizovaného genu je důležitý, aby se zabránilo nesprávné kvantifikaci cílového genu. Běžně používané geny obvykle kódují struktury metabolismu a jedná se například o aktin, tubulin, 18S ribozomální proteiny a 218S, ubiquitin a glyceraldehyd- 3-fosfát-dehydrogenázy (Zampieri, 2014). 33

34 4. EXPERIMENT 4.1 Materiál a metodika Pokus byl prováděn v experimentálním zařízení Ústavu výživy zvířat a pícninářství AF Mendelovy univerzity v Brně. Experiment probíhal v souladu se Zákonem na ochranu zvířat proti týrání č. 246/1992 Sb. Modelovými zvířaty byli potkani, dospělí samci outbredního kmene Wistar albino ve stáří 56 dnů z chovu společnosti BioTest s.r.o., Konárovice. Počáteční hmotnost potkanů se pohybovala kolem 200 g. K experimentu bylo použito 30 potkanů, které jsme rozdělili do 3 skupin po 10 kusech. Při rozdělování zvířat do skupin, byla brána v úvahu hmotnostní vyrovnanost v každém boxu. Jednotlivé skupiny byly uloženy do plastového boxu opatřeného mřížkou, nádržkou na vodu a krmítkem. Tyto boxy jsme jednou týdně čistili, přičemž jsme zároveň vážili a značili jednotlivé potkany. Obr. 9 Plastové boxy pro potkany s krmítkem a nádržkou na vodu 34

35 Výchozím krmivem pro potkany byla kompletní krmná směs Biokron (Blučina) ve formě granulí pro myši a potkany. Kontrolní skupině (SvO) bylo do krmné směsi přimícháno 6% oleje ze světlice barvířské, pokusným skupinám pak bylo přidáváno do krmné směsi 6% rybího oleje (RO) a 6% oleje z řasy Schizochytrium (SchO). Z krmné směsi, oleje a vody jsme vytvořili krmné koule, které jsme si vždy připravili dopředu a uložili do mrazícího boxu. Každý den se příslušné skupině potkanů dala jedna koule, která se předem zvážila, protože při výrobě koulí bylo množství vody u každé koule jiné. Po ukončení pokusu byla zvířata uvedena do narkózy pomocí inhalačního anestetika Isofluran a následně humánně utracena pomocí zvýšené dávky anestetika. U všech pokusných zvířat byt odebírány vzorky krve do heparinových zkumavek, u kterých byly provedeny analýzy na koncentraci celkového plazmatického cholesterolu (TC), HDL cholesterolu (HDLC), LDL cholesterolu (LDLC) a triacylglycerolů (TAG). Dále byly odebírány vzorky jater pro analýzu genové exprese a analytické stanovení obsahu mastných kyselin. 35

36 4.2 Stanovení mastných kyselin Ze vzorků jaterní tkáně byla lyofilizací odstraněna volná i vázaná voda pro zvýšení výtěžnosti lipidů při extrakci. Teplotní program lyofilizace byl nastaven: hlavní sušící program při -45 C/ 24 hodin a konečné dosušení 3 hodiny při 50 C pod tlakem 7-4 Pa. Tuk ze vzorků jaterní tkáně byl vyextrahován metodou dle autorů Hara a Radin (1978) a následně byla provedena esterifikace v alkalickém prostředí. Stanovení mastných kyselin se provádělo na plynovém chromatografu Fisons GC 8000 series na kapilární koloně Db-23 (60 m x 0,25 mm x 0,25 μm, Agilent Technologies J&W Scientific, USA). Injektor byl vyhříván na 260 C a detektor (FID) na teplotu 260 C. Použitý teplotní program měl tyto parametry: 140 C/1 min, gradient 5 C/min do 200 C, gradient 3 C/min do 240 C se zádrží 15 minut. Nosným plynem byl dusík s průtokem 1,5 ml/min., tlakem 200kPa a split pomět 20:1. Vyhodnocení výsledků ze stanovení mastných kyselin v tkáních a ze stanovení krevních lipidů bylo provedeno v programu Statistica 10 (StatSoft Inc., Tulsa, USA). Rozdíly byly posuzovány pomocí jednostupňového třídění analýzy rozptylu včetně zjištění kontrastů Tukeyovým testem. 36

37 4.3 Stanovení cholesterolu Odběry vzorků krve pro stanovení cholesterolu Pokusná zvířata byla uvedena do narkózy pomocí inhalačního anestetika Isofluran a následně utracena pomocí zvýšené dávky anestetika. Zvířatům byl odebrán vzorek krve do heparinových zkumavek punkcí ze srdce a z těchto vzorků byla stanovena koncentrace celkového cholesterolu, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu a TAG. Obr. 10 Inhalace anestetika Isofluran 37

38 Obr. 11 Odběr vzorku krve pro stanovení celkového cholesterolu, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu a triacylglycerolů (TAG) Stanovení cholesterolu Krevní vzorek pro stanovení cholesterolu byl odebírán do heparinem potažených zkumavek (Dispolab), které byly do analýzy uchovány v termoboxech s ledem pro přepravu a pro okamžité stanovení. Pro biochemické vyšetření bylo použito 1 ml krve. Veškerá biochemická vyšetření byla prováděna na Ústavu chemie a biochemie Mendelovy univerzity v Brně. Spektrofotometrická měření byla prováděna na automatickém chemickém analyzátoru BS-200 (Mindray), kde reakční roztoky a vzorky jsou umístěny na chlazeném disku (4 C) a automaticky pipetovány do plastikových kyvet s optickou dráhou 0,5 cm. Směs byla následně promíchána. Inkubace probíhá v kyvetovém prostoru temperovaném na 37 C. Promývání dávkovacích jehel destilovanou vodou je prováděno mezi jednotlivými pipetováními. 38

39 4.4 Odběr vzorků tkání pro analýzu genové exprese Pro analýzu genové exprese byly odebírány vzorky jater o velikosti max. 0,5cm, které byly ihned po odběru ponořeny do zkumavek s 1 ml reagentu. Poté byly vzorky zmraženy při teplotě -20 C. Před samotnou izolací byly vzorky tkání vyjmuty z reagentu a zbaveny přebytečného roztoku Kvantifikace genové exprese Celková RNA byla izolována z alikvotu jater (1 g) s použitím RNasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen). Kvalita izolace byla kontrolována na 1,2 % RNA gelu po vizualizaci ethidium bromidem. Koncentrace izolované RNA byla měřena na spektrofotometru Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Izolovaná RNA byla skladována při -80 C. Jeden µg izolované RNA byl reverzně transkribován s použitím RT Omniscript Kit (Qiagen) a oligo-dt primerů. Získaná cdna byla použita pro kvantitativní PCR se specifickými primery pro geny: PPARα, SREBP-2, Insig-1, Hmgcr, Ldlr a housekeepingový gen β-aktin. Reakční směs byla následující: 1 µl cdna, 0,2 µl AmpErase Uracyl N- glykosylázy (Applied Biosystems), 10 µl Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,2 µl každého primeru (mol.µl -1 ), 8,4 µl H 2 O. Všechny analýzy byly provedeny na 7500 Real- Time PCR System (Applied Biosystems) za následujících podmínek: 2 min inkubace při 50 C, 10 min při 95 C, 40 cyklů 15 s při 95 C, 30 s při konkrétní žíhací teplotě, která byla buď 65 C (výraz INSIG 1 a LDLR genu) nebo 60 C (exprese obou zbývajících genů) a 30 s při 60 C. Účinnost každé reakce reverzní transkripce byla vypočtena na základě standardní metody za použití křivky desetinásobné ředění vstupní cdna. Specifičnost každého fragmentu PCR byla ověřena sekvenováním pomocí BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit a ABI PRISM 310-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Změny v genové expresi byly vypočteny na základě relativního vztahu úrovně exprese cílového genu v játrech pokusných zvířat, která byla normalizována na úroveň housekeepingového genu. Housekeepingovým genem byl β-aktin, který je exprimován stále stejně. 39

40 Genová exprese byla vypočítána dle následujícího vzorce: Použité zkratky: R relativní exprese (%) E cílový gen E referenční gen C T (kalibrator-vzorek) efektivita reakce pro cílový gen efektivita reakce pro housekeepingový gen rozdíl C T hodnot Jako E jsme uvažovali efektivitu optimální, tedy 1. Tab. 4 Průměrné hodnoty C T pro referenční gen a cílové geny jednotlivých pokusných skupin SKUPINA C T β-aktin C T PPARα C T SREBP-2 C T Insig-1 C T Hmgcr C T Ldlr SvO 12,2 ± 0,4 25,1 ± 1 25,8 ± 0,6 20 ± 0,8 23,8 ± 0,7 25,8 ± 0,7 RO 12,3 ± 0,4 24,8 ± 0,7 25,6 ± 0,4 19,9 ± 0,6 24,1 ± 0,6 25,5 ± 0,4 SchO 12,5 ± 0,4 25,2 ± 0,9 25,6 ± 0,3 19,6 ± 0,5 23,4 ± 4 25,4 ± 0,3 Vyhodnocení výsledků bylo provedeno pomocí programu Statistica 10 (StatSoft Inc., Tulsa, USA). Rozdíly byly posuzovány pomocí jednostupňového třídění analýzy rozptylu včetně zjištění kontrastů Tukeyovým testem. Dále analýzy genové exprese byly zpracovány v programu Excel 2010 (Microsoft). 40

41 5. VÝSLEDKY EXPERIMENTU A DISKUSE 5.1 Příjem krmiva a hmotnost pokusných zvířat Příjem krmiva u kontrolní skupiny (SO), které byl do krmiva přidáván olej ze světlice barvířské činil 126 ± 13 g.den -1, u skupiny s přídavkem rybího oleje (RO) to činilo 124 ± 10 g.den -1 a u skupiny s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium (SchO) to bylo 124 ± 25 g.den -1. Rozdílné složení krmných směsí nemělo průkazný vliv na konečnou živou hmotnost pokusných zvířat. Konečná hmotnost u kontrolní skupiny (SO) byla 430 ± 32 g u skupiny RO 420 ± 35 g a u skupiny SchO to bylo 430 ± 34 g. Průměrný denní přírůstek byl u všech skupin stejný. Je to dáno tím, že všechny krmné směsi měli stejný obsah metabolizované energie. Tab. 5 Průměrná počáteční a konečná hmotnost jednotlivých skupin pokusných potkanů, průměrný příjem krmiva na den Skupina Počáteční hmotnost (g) Konečná hmotnost (g) Průměrný příjem krmiva na den (g.den -1 ) SvO 211 ± ± ± 13 RO 207 ± ± ± 10 Scho 210 ± ± ± 25 41

42 5.2 Koncentrace celkového cholesterolu, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu a TAG Na obr. 12 jsou znázorněny koncentrace celkového cholesterolu (TC), HDL cholesterolu, LDL cholesterolu a triacylglycerolů (TAG). U pokusné skupiny RO došlo ke snížení hladiny celkového cholesterolu o 20% a ke snížení HDL cholesterolu o 20% oproti kontrolní skupině (SO). U skupiny SchO se hladina plazmatického cholesterolu snížila taktéž o 20% oproti kontrole. Hladina LDL cholesterolu a TAG u této skupiny klesla v případě LDL cholesterolu o 24% a v případě TAG o 2% oproti kontrolní skupině. U skupiny SchO došlo ke snížení LDL cholesterolu o 25% a hladina TAG se snížila o 54% oproti kontrolní skupině A A B B B A B B A B B B SO RO SchO TC HDL cholesterol LDL cholesterol TAG Obr. 12 Koncentrace TC, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu a TAG v mmol.l -1, Průměry označené různými písmeny se statisticky lišily (P<0,05), SO kontrolní skupina krmená směsí s přídavkem 6% oleje ze světlice barvířské, RO pokusná skupina potkanů krmená směsí s přídavkem 6% rybího oleje, SchO pokusná skupina krmená s přídavkem 6% oleje z řasy Schizochytrium, TC celkový cholesterol, TAG triacylglyceroly, HDL cholesterol cholesterol obsažený v krvi v lipoproteinech o vysoké hustotě, LDL cholesterol - cholesterol obsažený v krvi v lipoproteinech o nízké hustotě Pozn. Průměr ± střední chyba průměru 42

43 Předpokládali jsme, že přídavek rybího oleje i oleje z řasy Schizochytrium do krmné směsi, bude mít pozitivní vliv na koncentraci celkového cholesterolu, LDL cholesterolu a hladiny TAG. To se nám také potvrdilo. U hladiny HDL cholesterolu jsme předpokládali zvýšení, ale k tomu nedošlo, naopak se koncentrace HDL cholesterolu snížila. Tyto odchylky mohou být způsobeny podáním nízké dávky EPA a DHA nebo tím, že metabolismus lipidů je ovlivnění jiným způsobem, než jsem přepokládali. V našem pokusu byla průměrná hodnota celkového cholesterolu u pokusné skupiny RO 0,98 ± 0,068 mmol.l -1. Koncentrace cholesterolu, které jsme během našeho experimentu naměřili, nevybočovaly z rozsahu hodnot naměřených jinými autory. Přehled různých experimentů, podobných našemu experimentu, při kterých se měřily hodnoty celkového cholesterolu: Ferramosca et al. (2012) 2,45 mmol.l -1 Xiao et al. (2012) 2,36 mmol.l -1 Hosomi et al. (2013) 1,61 mmol.l -1 Park et al. (2009) 1,34 mmol.l -1 Popovi c et al. (2012) 0,54 mmol.l -1 Koncentrace HDL cholesterolu u pokusné skupiny byla 0,32 ± 0,026 mmol.l -1, v porovnání s jinými experimenty je tato hodnota průměrná, ikdyž koncentrace HDL cholesterolu v těchto pracích byly velmi rozdílné. Přehled koncentrací HDL cholesterolu neměřených u jiných prací: Hosomi et al. (2013) 1,08 mmo.l -1 Balasubramanian (2010) 0,94 mmo.l -1 Park et al. (2009) 0,36 mmo.l -1 Popovi c et al. (2012) 0,23 mmo.l -1 Naměřená koncentrace LDL cholesterol v našem pokusu byla 0,64 ± 0,045 mmol.l -1. Hodnoty LDL cholesterolu se nesrovnávaly s jinými autory, protože z prací není jasné, zda se LDL cholesterol měřil přímo nebo byl dopočítáván a také není jasné, jestli došlo k rekalibraci přístrojů. 43

44 Relativní exprese (%) 5.3 Vyhodnocení relativní exprese Relativní kvantifikace genu PPARα Relativní exprese pro gen PPARα u potkanů krmených směsí s přídavkem rybího oleje (RO) byla 122% (P>0,05), u skupiny s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium (SchO) byla relativní exprese 105% (P>0,05) oproti expresi tohoto genu v játrech u kontrolní skupiny (SO). V našem experimentu došlo ke zvýšení exprese genu PPARα o 22% u pokusné skupiny krmené směsí s přídavkem rybího oleje. Rozdíly však nejsou průkazné. Mírné zvýšení exprese potvrzuje i Botelho et al. (2013), který ve své práci uvádí zvýšení exprese genu PPARα asi o 8%, naopak Lu et al. (2011) ve svém experimentu zjistil, že exprese genu PPARα nebyla významně regulována v závislosti na stravě obohacené o PUFA n A PPARα A A SO RO SchO Obr. 13 Relativní exprese genu PPARα v %, průměry označené stejnými písmeny se statisticky nelišily (P>0,05), SO kontrolní skupina krmená směsí s přídavkem 6% oleje ze světlice barvířské, RO pokusná skupina potkanů krmená směsí s přídavkem 6% rybího oleje, SchO pokusná skupina krmená s přídavkem 6% oleje z řasy Schizochytrium Pozn. Průměr ± střední chyba průměru 44

45 5.3.2 Relativní kvantifikace genu SREBP-2 Relativní exprese pro gen SREBP-2 u potkanů krmených směsí s přídavkem rybího oleje (RO) byla 122% (P>0,05) a u skupiny krmených směsí s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium (SchO) 119% (P>0,05) oproti expresi tohoto genu v játrech u kontrolní skupiny (SO). V našem pokusu jsme dosáhli zvýšení exprese genu SREBP-2 o 22% u pokusné skupiny oproti skupině kontrolní. Rozdíly nejsou průkazné. Naše výsledky se liší s výsledky autora Nakatani et al. (2003), který uvádí, že rybí tuk přidávaný do krmení snižuje množství aktivního SREBP-1 a to dvěma mechanismy při nízké koncentraci rybího oleje dochází k inhibici SREBP-1 proteolytické kaskády, zatímco při vysokých koncentracích, při 30% koncentraci rybího oleje v krmení, dochází jak k inhibici SREBP-1 proteolytické kaskády, tak i ke snížení SREBP-1 mrna. Tento autor navíc také uvádí, že snížení SREBP-1 není zprostředkováno aktivací PPARα. Na druhé straně Fernandez-Alvarez et al. (2011) tvrdí, že aktivace PPARα výrazně zvyšuje expresi genu SREBP v játrech potkanů. Deckelbaum et al. (2006) ve svém experimentu uvádí, že polynenasycené mastné kyseliny s delším řetězcem, např. DHA nebo EPA, mají větší inhibiční kapacitu na zpracování SREBP než PUFA s kratšími řetězci, které nemají žádný nebo téměř žádný vliv expresi genu SREBP. Někteří autoři pokusů podobných našemu, jako je např. Lu et al. (2011) vliv DHA na expresi genu SREBP-2 u myší neprokazují. 45

46 Relativní exprese (%) SREBP A A A SO RO SchO Obr. 14 Relativní exprese genu SREBP-2 v %, průměry označené stejnými písmeny se statisticky nelišily (P>0,05), SO kontrolní skupina krmená směsí s přídavkem 6% oleje ze světlice barvířské, RO pokusná skupina potkanů krmená směsí s přídavkem 6% rybího oleje, SchO pokusná skupina krmená s přídavkem 6% oleje z řasy Schizochytrium Pozn. Průměr ± střední chyba průměru Relativní kvantifikace genu Insig-1 Relativní exprese pro gen Insig-1 u potkanů krmených směsí s přídavkem rybího oleje (RO) byla 120% (P<0,05) a u skupiny krmené směsí s přídavkem oleje z řasy Schizochytrium (SchO) byla relativní exprese 170% (P<0,05) oproti expresi tohoto genu v játrech u kontrolní skupiny s přídavkem oleje ze světlice barvířské (SO). Valová et al. (2013) ve své práci uvádí zvýšení exprese genu Insig-1 v játrech pokusných zvířat krmených směsí s přídavkem oleje. Exprese genu se v této studii zvýšila o 730%. To jestli zvýšení exprese vlivem EPA a DHA vede k potlačení genu Hmg-cr a Ldl-r, není potvrzeno. Potvrdilo se pouze snížení cholesterolu v krevní plasmě. Taktéž Botolin et al. (2006) ve své práci zjistil, že PUFA n-3 mohou zvýšit expresi genu Insig-1. Nicméně účinek PUFA n-3 je mírný a přechodný. 46

47 Relativní exprese (%) Existuje studie (Arai et al., 2009), u které se testoval vliv rybího oleje na genovou expresi a tato studie uvádí, že exprese genu Insig-1 se vlivem přídavku rybího oleje do krmné směsi snížila. Stejného výsledku také docílila studie autorů Hirako et al., 2010, kteří sledovali totéž u potkanů, krmených směsí s přídavkem rybího oleje. 250 Insig C A B 50 0 SO RO SchO Obr. 15 Relativní exprese genu Insig-1 v %, průměry označené různými písmeny se statisticky lišily (P<0,05), SO kontrolní skupina krmená směsí s přídavkem 6% oleje ze světlice barvířské, RO pokusná skupina potkanů krmená směsí s přídavkem 6% rybího oleje, SchO pokusná skupina krmená s přídavkem 6% oleje z řasy Schizochytrium Pozn. Průměr ± střední chyba průměru Relativní kvantifikace genu Hmgcr Relativní exprese pro gen Hmgcr u potkanů krmených směsí s přídavkem rybího oleje (RO) byla 103% (P>0,05) a u potkanů, kterým byl přidán olej z řasy Schizochytrium (SchO), byla relativní exprese 117% (P>0,05) oproti expresi tohoto genu v játrech u kontrolní skupiny (SO). Naše výsledky nesouhlasí s výsledky experimentu Arai et al. (2009), kde byl zjištěn pokles relativní exprese genu Hmgcr, naopak zvýšení exprese genu Hmgcr ve své práci také uvádí Valová et al. (2013), kde relativní exprese genu je 165% oproti 47

48 Relativní exprese (%) kontrole. Stejné výsledky, tedy zvýšení exprese genu Hmgcr, také uvádí studie Notarnicola et al. (2010). Hmgcr A A A SO RO SchO Obr. 16 Relativní exprese genu Hmgcr v %, průměry označené stejnými písmeny se statisticky nelišily (P>0,05), SO kontrolní skupina krmená směsí s přídavkem 6% oleje ze světlice barvířské, RO pokusná skupina potkanů krmená směsí s přídavkem 6% rybího oleje, SchO pokusná skupina krmená s přídavkem 6% oleje z řasy Schizochytrium Pozn. Průměr ± střední chyba průměru Relativní kvantifikace genu Ldlr Relativní exprese pro gen Ldlr u potkanů krmených směsí s přídavkem rybího oleje (RO) byla 101% (P>0,05), u skupiny potkanů krmených přídavkem oleje z řasy Schizochytrium (SchO) byla exprese 156% (P<0,05) oproti expresi tohoto genu v játrech u kontrolní skupiny (SO). Stejných výsledků docílili i věci Arai et al. (2009), kterým se taktéž nepodařilo snížit relativní expresi genu Ldlr u potkanů krmených směsí s přídavkem oleje z ryby Brevoortia tyrannus, naopak po přídavku tuňákového oleje do krmiva, došlo v této práci ke snížení exprese genu Ldlr. 48