Molecular Biology of the Cell Fifth Edition

Transkript

1 Membránový princip organizace buňky (kompartmenty). Třídění proteinů. doc. Mgr. Jiří Drábek, PhD. Laboratoř experimentální medicíny při Dětské klinice LF UP a FN Olomouc jiri_drabek@seznam.cz Alberts Johnson Lewis Raff Roberts Walter Molecular Biology of the Cell Fifth Edition Chapter 12 Intracellular Compartments and Protein Sorting Copyright Garland Science

2 Název Přednášející Termín Membránový princip organizace buňky. Jiří Drábek Úvod. Buněčná teorie. Marián Hajdúch Plazmatická membrána, buněčná stěna a mezibuněčná hmota. Petr Džubák Membránový transport. Petr Džubák Vezikulární transport. Jiří Drábek Energetické zajištění života buněk. Jiří Drábek Buněčná signalizace. Josef Srovnal Organizace a dynamika cytoskeletu. Marta Dziechciarková Buněčné jádro. Josef Srovnal Buněčný cyklus. Radek Trojanec Mitóza, meióza. Radek Trojanec Chromozómy a jejich alterace. Radek Trojanec Diferenciace buněk, stárnutí, apoptóza, nekróza. Petr Džubák Buněčný stres, adaptace. Závěr. Marián Hajdúch Dnešní přednáška Kompartmentalizace buněk Transport molekul mezi jádrem a cytosolem Transport proteinů do mitochondrií (mt) a chloroplastů (ct) Peroxizómy Endoplazmatické retikulum (ER) 3 4

3 Vlastnosti buňky Hlavní intracelulární kompartmenty živočišné buňky 1. Informace, dědičnost 2. Vnitřní prostředí 3. Aktivita, odpověď, pohyb 4. Energie (pro předchozí) Figure 12-1 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Kompartmenty organely (enzymy, specializované mlk, distribuční systém) Proteiny strukturální a funkční vlastnosti, druhů, 10na10 mlk Biochemické procesy na mb (lipidovvý metabolismus, oxidativní fosforylace, fotosyntéza Přes lipidovou dvouvrstvu neprojdou hydrofilní Cytoplazma cytosol + organely 5 6

4 Na topologické vztahy membránových organel můžeme pohlížet z evolučního hlediska Jaterní buňka velektronovém mikroskopu Figure 12-2 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-3a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Lokalizace ER a Golgi závisí na neporušených mikrotubulích Eukaryotická buňka a podíl povrch objem (1000 krát větší než E.coli) Specializace mb funkce Vnitřní mb mt a plastidů odpovídá původní plazmatické mb bct Proplastidy se dědí spolu s cytoplazmou rostlinného vajíčka Brambora, tuková semínka, okvětní lístek 7 8

5 Vývoj thylakoidu Evoluce jádra a endoplazmatického retikula (ER) Figure 12-3b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-4a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Invaginace, thylakoidy rostou a dělí se autonomně Připojení, invaginace, obálka, komunikační kanály nuclear pore complex Jaderný kompartment je ekvivalentní cytosolu 4 intracelulární kompartmenty: - jádro a cytosol - Sekretorní a endocytické (ER, Golgi, lyzo) -Mt - plastidy 9 10

6 Evoluce mitochondrií (mt) a plastidů Sekretorní a endocytická dráha eukaryontní buňky Figure 12-4b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-5 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Pohlcení bct, autonomie Proteiny procházejí kompartmenty různými způsoby Topologicky ekvivalentní kompartmenty červeně Modré šipky transportní cesty 11 12

7 Cestování proteinů Pučení a fůze vezikulů během vezikulárního transportu Figure 12-6 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-7 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Skoro všechny proteiny jsou syntetizovány na ribozomech v cytosolu výjimka mt a plastidy Sorting signal obsažen v sekvenci, pokud není cytosol Gated mezi topologicky ekvivalentními (aktivně přes jaderné póry, také pasívně) Transmb mb translokátory, unfolded Vezikulární mezi tpologicky ekvivalentními, mb intermediáty ER-Golgi Červeně rozpustné látky z lumenu do lumenu Přenáší se také mb, proto je zachována asymetrická orientace proteinů a lipidů 13 14

8 Signální sekvence a signální štítky fungují jako adresy Table 12-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Page 704 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Štítek (patch) - 3D (degradace do lyzosomu) Signální sekvence 15 až 60 ak, štěpení signální peptidázou Signály: Běž do ER: N konec hydrofobní ak Zůstaň v ER: 4 ak na C konci Mt střídání pozitivní a hydrofobní Peroxizomy 3 ak na C konci Rozpoznání pomocí sortovacích receptorů, které jsou katalytické (po použití recyklace) a rozpoznávají celou třídu proteinů Mb organely se vytvářejí z mb organel (epigenetická info) 15 16

9 Jaderná membrána (schránka, obálka) Póry v jaderné membráně Figure 12-8 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-9 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Jaderná mb (obálka) 2 koncentrické mb penetrované póry Vnitřní mb vazba k chromatinu Vnější propojená s ER Perinukleární prostor mezi nimi (propojený s lumenem ER) Histony, polymerázy, gene regulační proteiny, proteiny RNA sestřihu - do jádra z cytosolu trna a mrna ven Ribozomální proteiny z cytosolu do jádra a zpět Jaderné pórové komplexy (125 mil Da, 50 různých proteinů nukleoporinů, oktagonální symetrie) Průměr 4000 pórů na jaderné mb, při aktivní transkripci více Každý pór přenese 100 histonů a 6 ribozomálních podjednotek za minutu Annular - prstencový 17 18

10 Průchod (difúze) jaderným pórem Funkce jaderné signální sekvence Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Zdánlivý rozpor: 26 nm protein, na mikroskopu jen 9 nm otvor Malý protein 5 kda volná difúze Jaderné proteiny procházejí pórem folded T antigen viru SV

11 Aktivní transport jadernými póry Receptory jaderného importu Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Koloidní zlaté kuličky (šipky) A) 10 min B) 30 min C) 40 min D) 50 min Jaderný lokalizační signál musí být rozpoznaný jadernými importními receptory (rozpustné, v cytosolu, váží se zároveň k proteinu a k fibrilám nukleoporinu) Receptory se váží na FG repetice (F fenylalanin G glycin) na fibrilách vazba odpojení posun vazba, někdy vazba zprostředkována dalším adaptorovým proteinem (strukturně podobný receptoru) Nukleární export opak importu (signály exportu patřící spolu se signály importu do skupiny karyoferinů) 21 22

12 Kompartmentalizace Ran-GDP a Ran-GTP Jak GTP hydrolýza směruje transport přes jadernou mb? Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Energie přenosu je dodávána hydrolýzou GTP pomocí GTPázy Ran GAP - GTPáza aktivační protein (GTP na GDP) GEF guanin exchange factor (RanGDP na RanGTP) Posun podél FG repetic Kompartmentalizací RanGTP a RanGDP 23 24

13 Nalodit v cytosolu, vylodit v jádře Kontrola vývoje muší larvy pomocí jaderného transportu Protein dorsal je v embryu uniformně exprimovaný, ale aktivní je jen pokud se nachází v jádře (spodní část embrya) Figure 12-16b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Proteiny, které mají zároveň signál pro jádro a signál pro export z jádra (např.receptory exportu a importu) pendlovky, shuttle, steady state fosforylace může zapnout nebo vypnout signál, další regulace přes inhibiční cytosolické proteiny (exprese proteinů cholesterolového metabolismu) 25 26

14 Kontrola jaderného importu během aktivace lymfocytů T Jaderná lamina oocytu Xenopus Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Signál Ca2+ spustí defosforylaci NF-AT pomocí kalcineurinu (exponuje importní signály, blokuje exportní signály) Aktivace transkripce cytokinů Málo Ca2+ - uvolnění kalcineurinu, refosforylace Imunosupresiva cyklosporin A a FK506 inhibují kalcineurinovou defosforylaci Jaderná lamina je tvořena proteinovými podjednotkami, intermediárními filamenty, které dávají jaderné mb tvar a interagují s chromatinem 27 28

15 Jaderná mb za mitózy Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Page 713 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Depolymerizace pomocí fosforylace cyklindependentními kinázami Prolomení bariéry mezi cytosolem a jádrem Anafáze jaderná obálka se znovu vytváří na povrchu chromozomů, ER mb zabalí část, fúzuje s další částí, jaderné póry začínají přenášet dovnitř specifické proteiny Jaderné lokalizační signály nejsou odštěpeny protože jsou potřebné při každém dělení buňky 29 30

16 Sub-kompartmenty mt a ct Signální sekvence pro import do mt Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Dvojitá mb Většina proteinů je jaderných Mt matrix a mezimb prostor, vnitřní mb tvoří kristy Ct navíc mají thylakoidní prostor jako další kompartment (není spojený s vnitřní mb) Mt přenos proteinů do mt posttranslačním mechanismem Amfipatický alfa helix- kladně nabitý na jedné straně, bez náboje na druhé 31 32

17 Proteinové translokátory v mt Během transportu proteiny procházejí skrz obě mb naráz Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) TOM Translocase of the outer mirochondrial mb TIM23 - prochází dvěma mb TIM22 přenašeče ATP a ADP a fosfátu OXA pro proteiny syntetizované v mt Mt prekurzorové proteiny se přenášejí unfolded hsp 70 chaperony 33 34

18 Import proteinů do mt Energie a import proteinů do mt Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) N terminální sekvence rozeznána TOM, přenos, odštěpení signální peptidázou, signální sekvence degradována ATP hydrolýza (na dvou místech: mimo mt a v matrix mt) a elektrochemický H+ gradient pohánějí proteinový import do mt H+ : přenos signální sekvence do matrix Hsp70 dovnitř vtáhne, hydrolýza ATP uvolní hsp70 Vnější mb obsahuje porinové póry (jako Gram negativní bct), proto se zde nedá udržet gradient H

19 Role chaperonů při proteinovém importu do mt Import z cytosolu do vnitřní mt mb nebo do mezimb prostoru Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Hsp70 předává hsp60 2 signální sekvence, hydrofobní oranžové V mt tvorba ATP, citrátový cyklus transport malých metabolitů vnější mb průchod, vnitřní mb má specifické přenášeče 37 38

20 Přenos prekurzorů do thylakoidů ct 1 Přenos prekurzorů do thylakoidů ct 2 Figure 12-29a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-29b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Ct přenos posttranslační jako u mt Ct nemají elektrochem gradient Ne ATP ale GTP (konvergentní evoluce) v thylakoidech ATPsynthasa a fotosyntetický systém Matrix se nazývá stroma Odštěpením prvního signálu se odmaskuje druhý Sec proteiny homologní bct SRP homolog signal recognition particle 39 40

21 Tři peroxizómy v krysím hepatocytu Page 721 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Peroxizómy mají jen 1 mb, nemají DNA ani ribozómy Obsahují katalázu a urát oxidázu (inkluze) Využití kyslíku Evoluční příchod mt snížil důležitost některých fcí peroxizómů, protože mt dělají totéž a ještě produkují E 41 42

22 Reakce v peroxizomech Peroxizóm v mezofylu tabákového listu RH 2 + O 2 R + H 2 O 2 (oxidativní reakce) H 2 O 2 + R H 2 R + 2H 2 O(kataláza, peroxidativní reakce, játra a ledviny) 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 (kataláza při nadbytku peroxidu) Beta oxidace tuků Tvorba plazmalogenů (v myelinových pochvách neuronů, izolují axony) Fotorespirace v rostlinách Glyoxalátový cyklus v semíncích rostlin Figure 12-32a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Peroxidativní reakce: např. 25% ethanolu na acetaldehyd Beta oxidace zkracování alkylových řetězců až na acetylcoa (ten do cytosolu, kde použit) Adaptace peroxizómů za změněných podmínek Fotorespirace fixace CO2 na polysacharid (spotřeba O2) Glyoxalátový cyklus přeměna tuků na cukry 3 ak na C konci peroxizomový signál Asociace s chloroplastem Peroxiny za účasti ATP se podílejí na transportu foldovaných (poskládaných do konečné konformace) proteinů do peroxizómu Dědičný Zellwegerův syndrom defekt importu do peroxizómů (prázdné peroxizómy) smrt po narození 43 44

23 Peroxizóm v kotyledonové buňce čtyřdenního rajčatového semínka Vznik nových peroxizómů Figure 12-32b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Peroxizóm glyoxyzóm glukoneogeneze Růst a dělení, peroxizóm z peroxizómu 45 46

24 Endoplazmatické retikulum (ER) v savčí a rostlinné buňce Page 723 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-34b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-34a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Zabarvení pomocí protilátky 47 48

25 Transport Drsné ER Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-36a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Rozdíl mezi kotranslační a posttranslační translokací U ER je posttranslační transport výjimečný Pankreatická exokrinní buňka 49 50

26 Hladké ER v Leydigových buňkách testes Hladké a drsné ER v jaterní buňce Figure 12-36b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-36c Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Hladké ER je ve specializovaných buňkách, zvláště lipidového metabolismu Např.: -Leydigovy bb (sekrece testosteronu) -Hepatocyty (tvorba lipoproteinů, detoxifikace převodem na vodu rozpustnou formu pomocí enzymového systému cytochromu P450, ER indukováno podle potřeby a pak autofagocytováno) -Sarkoplastické retikulum ER ve svalech, kde pomocí Ca2+ zabezpečuje signalizaci relaxace a kontrakce; sekvestrace Ca2+ je důležitou fcí ER 3D rekonstrukce 51 52

27 Centrifugační pokus Drsné ER ve formě mikrozómů po centrifugaci Figure 12-37b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-37a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Izolace mikrozómů, na kterých se testovaly funkce ER 53 54

28 Signální hypotéza SRP: Signal Recognition Particle Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-39a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Vedoucí sekvence proteinu (sled prvních ak proteinu) nese signál pro ER SRP nasměřuje protein k receptoru na drsném ER Kapsa vážící signální sekvenci obsahuje hodně methioninů, které zaručují flexibilitu (plasticitu) 55 56

29 Vazba ribozomů na SRP Směrování ribozomů do ER pomocí signální sekvence a SRP Figure 12-39b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) SRP a jeho receptor jsou synchronizováni: SRP se váže k ER signální sekvenci a k ribozómu a tím zastaví translaci Pak se váže SRP receptor a směruje protein k translokátoru Spotřeba GTP 57 58

30 Cyklus volného a vázaného ribozómu Polyribozóm vmikroskopu Figure 12-41a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 12-41b Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Robozomální podjednotky v cytosolu slouží pro vázaný i volný ribozóm 59 60

31 Šev a zátka Ribozóm navázaný na translokátor Sec61 Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Protein se nedostane do styku s cytosolem uzavření švem a zátkou Uzavření nutné, aby neunikal Ca2+ do cytosolu Translokátor Sec61 vytváří vodou naplněný pór 61 62

32 Strukturálně podobné translokátory Přenos rozpustného proteinu přes mb ER Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) A) kotranslační, Sec61, není potřeba E, jediná cesta pro rostoucí řetězec je skrz mb B) posttranslační, Sec61 a další, E ATP, BiP binding protein vazba a uvolnění (podobnost s hsp70 u mt) C) posttranslační, SecA, ATP, jako pístem po 20 ak (podobnost s thylakoidem ct) Ribozómy nejsou zobrazeny pro zjednodušení ER signální sekvence znamená začni transport Po vazbě ER signální sekvence se otevře pór translokátoru, přenos Po přenosu uzavření póru, signální sekvence difunduje do mb a degraduje se Proteiny, které zůstávají v mb (jednoprůchodové single pass, dvouprůchodové double pass nebo multipass) využívají navíc k ER signální sekvenci také stop transfer sekvence 63 64

33 Inzerce rhodopsinu do ER Připojení prekurzorového oligosacharidu na asparagin proteinu vdrsném ER Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Příklad multipass proteinu Rhodopsin je světločivný protein v fotoreceptorových čípcích v savčí sítnici Vlevo diagram hydrofobicity, který rozpozná 7 hydrofobních úseků Modře vyznačeny oligosacharidy Šipky zobrazují části, vcházející do translokátoru Většina proteinů v drsném ER je glykosylována připojením prekurzorového N- linked oligosacharidu Prekurzorový oligosacharid je - za pomoci enzymu oligosacharyltransferázy připojován vcelku; sestává z Nacetylglukosaminu, manózy a glukózy - vytvářen připojováním cukr po cukru a zaparkován v tukové mlk dolicholu (polyisoprenoid) a přenesen na cílový asparagin 65 66

34 Proteinová glykosylace v drsném ER Role glykosylace ve skládání proteinů ver Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Jakmile polypeptid vstoupí do lumenu ER je gylkosylován na cílových Asn Ribozómy nejsou zobrazeny pro zjednodušení Glykosylace je značkou pro nesložený protein Kalnexin se váže k nesprávně složenému proteinu, označenému terminální glukózou a N-linked oligosacharidem Pokud glukosyltransferáza odstraní koncovou glukózu, tak se kalnexin uvolní 67 68

35 Export a degradace špatně složených proteinů v ER Připojení glykosylfosfatidylinositolové (GPI) kotvy k proteinu v ER Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Návrat špatně složeného proteinu do cytosolu - retrotranslokace, dyslokace Až 80% proteinů je špatně složených Využití Sec61 Deglykosylace, ubikvinace, degradace v proteasomu Některé mb proteiny kovalentně připojují glykosylfosfatidylinositolovou kotvu, která upevňuje protein v mb a může být rychle uvolněna v odpovědi na stimul (Trypanosoma změní kabát při rerakci s imunitním systémem) 69 70

36 Syntéza lecitinu Děkuji vám za pozornost! Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Hlavní fosfolipid fosfatidylcholin (lecitin) je syntetizován z acylkoenzymua, glycerol3fosfátu a cytidinbifosfocholinu Další fosfolipidy (fosfatidylethanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol) syntetizovány obdobně Přenos z vnitřní mb na vnější pomocí translokátoru skramblázy nebo flipázy ER vytváří také cholesterol a ceramid 71 72