Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card/Blister

Transkript

1 Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card/Blister (Jednokrokový imunochromatografický test pro diferenciální detekci Toxinu A a Toxinu B z Clostridium difficile ve stolici) Návod k použití soupravy Výrobce: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č.365, Vestec u Prahy, Jesenice, Česká republika, tel: , fax , web: info@vidia.cz POUŽITÍ: Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card/Blister umožňuje proces kvalitativní detekce Clostridium difficile toxinu A (TcdA) a toxinu B (TcdB) ve dvou oddělených liniích. Pozitivní linie pro jeden nebo druhý toxin je známkou probíhající infekce způsobené C. difficile (ICD), která by měla přivolat pozornost lékaře. Test je určen pro detekci ze vzorků tekuté nebo polotekuté stolice. U pevných vzorků je potřeba mít na paměti, že může jít o asymptomatický průběh a tudíž zdravého jedince. Na rozdíl od jiných testovacích systémů ELISA nebo Rapid, které pouze detekují přítomnost TcdA a TcdB najednou bez diferenciace mezi oběma druhy, tento test umožňuje diferenciaci obou toxinů za použití dvou oddělených linií červená linie, která se objeví pod modrou kontrolní linií, znamená přítomnost toxinu A (TcdA) a jiná červená linie, která se objeví nad kontrolní linií, znamená přítomnost toxinu B (TcdB) ve vzorku (Viz obr.1). Tento test je založen na navázání barevných mikročástic na specifické monoklonální protilátky proti TcdA a TcdB, které byly imobilizovány ve dvou oddělených místech na membráně, během jejich průchodu membránou. ÚVOD: Presumptivní diagnózy infekce C. difficile (ICD) Clostridium difficile produkuje dva různé toxiny, které tvoří základní faktory virulence pro indukci ICD. Výzkumy 1,2 prokázaly, že každý z toxinů samostatně může vyvolat onemocnění u křečků. C. difficile je zodpovědné za přibližně 25% průjmových onemocnění spjatých s podáváním antibiotik jako je clindamycin, druhá a třetí generace cefalosporinů, inhibitorů gyrázy, ampicilinu, nebo amoxicilinu. Kromě průjmu, může onemocnění vést k pseudomembranózní kolitidě (PMC), která vyžaduje okamžité léčení antibitotiky účinnými proti C. difficile a která může vést bez léčení k ohrožení života pacienta. ICD mortalita může být od 6% až do 30%, zejména když pacient trpí pseudomembranózní kolitidou. Pacient trpící infekcí C. difficile souvicející s předcházející léčbou antibitotiky může být hospitalizován déle o 6-10 dní, což přinese vícenáklady 6-8 tisíc EUR. 3 1

2 C. difficile popis bakterie Clostridium difficile je anaerobní, gram-pozitivní sporulující bakterie. Asi 5% zdravé populace mohou být přenašeči. V průběhu hospitalizace může procento přenašečů narůst až na 30%, což vede k rozvoji nosokomiální infekce. Děti jsou kolonizovány C. difficile brzy po narození, ale neprojevuje se to i přes intenzivní vyšetřování žádnými klinickými symptomy. Současné diskuze poukazují na nedostatek střevních receptorů pro toxiny, nebo na rozdíly v ph stolice u dětí, které brání aktivitě toxinů. Jak bylo výše zmíněno, C. difficile může produkovat různé toxiny 4. Toxin A (TcdA) (308kDa) je enterotoxin, který může vyvolávat mnoho symptomů ve zvířecím modelu. TcdA také vykazuje vysokou cytotoxicitu, ale pouze na specifických TcdA citlivých buňkách, jako je HT Toxin B (TcdB) (279kDa) je klasifikován jako cytotoxin. Ve většině buněčných kultur v laboratořích (např. Vero, CHO nebo HELA) je tento toxin 1000x silnější než Toxin A. Aminokyselinová sekvence TcdB se pohybuje v určitém rozmezí v závislosti na různých kmenech 6. TcdA/TcdB detekční systémy Na základě produkce toxinů mohou být detekovány následující kmeny Clostridium difficile: Kmeny neprodukojící toxin jsou nepatogenní kmeny, které neprodukují TcdA a TcdB, i produkující binární toxin CdtA/B. A+B+ kmeny jsou nejběžnějšími kmeny, které vyvolávají ICD. Nejvyšší prevalenci v Evropě mají ribotypy 001; 014 a A-B+ kmeny byly poprvé identifikovány v Belgii Delmée et.al 8. Jsou považovány za patogenní, i když neprodukují toxin A. 9 Ribotypy kmene 017 patří k této skupině a jsou zodpovědné za ohniska infekce v severní Americe. A+B- kmeny mohou být identifikovány ze vzorku stolice přímo tímto testem, který umožňuje jednoduchou a rychlou diferenciaci a detekci toxinu A a toxinu B v jednom testu. Doposud je známo jen několik izolátů těchto kmenů. Výsledky provedených studií ukazují, že TcB mutantní kmeny C. difficile vyvolávají IDC u křečků v důsledku produkce toxinu A 2. Tyto výsledky odrážejí přítomnost těchto kmenů v klinických vzorcích. Kmeny často klasifikované jako TcdA+/ TcdB- jsou ve skutečnosti TcdA+/ Tcd B+, protože produkce toxinu B je pouze třetinová nebo čtvrtinová ve srovnání s toxinem A. Toxin B je pak v některých případech pod detekčním limitem testu. PRINCIP TESTU: Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card/Blister využívá kombinace: 1) Červených latexových částic konjugovaných se specifickou protilátkou proti toxinu A, která reaguje s protilátkou jiného typu, která je umístěna na membráně pod kontrolní linií. 2) Jiné červené latexové částice konjugované se specifickou protilátkou proti toxinu B, která reaguje s protilátkou jiného typu, která je umístěna na membráně nad kontrolní linií. 3) Modré latexové částice konjugované s antigenem, který je rozpoznáván protilátkou specifickou pro tento antigen a je vázán na membráně a slouží jako kontrolní linie testu. Při provedení testu je vzorek nejprve naředěn v ředicím roztoku pro vzorek (součást soupravy), toxin je extrahován ze vzorku stolice. Po extrakci toxinu je část supernatantu aplikována na testovací strip a 15 minut se nechá působit. 2

3 Extrakt prochází testovací membránou, dochází k migraci barevných částic. V případě, že je vzorek pozitivní, specifické protilátky na membráně budou reagovat s antigenem navázaným na barevné částice. Po 15 minutách inkubace při laboratorní teplotě získáme linie, které slouží k interpretaci výsledku (viz obr. 1) OBSAH SOUPRAVY: Souprava je k dispozici ve dvou různých formátech: - Blister : reakční strip balený v hliníkové folii. Souprava obsahuje testovací zkumavku, která je pro ředění a extrakci toxinu ze vzorku. Lze použít i ELISA destičku. Strip se ponoří do zkumavky, nebo jamky destičky - Kazeta : reakční strip je uzavřen uvnitř plastové kazety. Extrakt se aplikuje přímo do okénka testovací kazety. Oba formáty vykazují stejné charakteristiky, i když jsou zde určité rozdíly v pracovním postupu (viz Pracovní postup) Souprava obsahuje: - testovací kazety/blistery - ředicí roztok pro vzorky - jednorázové plastové pipety s vyznačeným objemem - jednorázové plastové pipety bez vyznačeného objemu (žluté) - dřevěnou odběrovou tyčinku pro odběr a aplikaci vzorku stolice - 1,5 ml mikrozkumavky s uzávěrem - Testovací zkumavky - Stojánek na zkumavky - návod k použití - certifikát kontroly balení POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU - centrifuga na 1,5 ml zkumavky - jednorázové rukavice - stopky - míchačka (vortex) SBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ: Vzorky: Tento test je určen pro analýzu tekutých a polotekutých vzorků stolice. Můžete analyzovat i pevné vzorky, není to však obvyklé vzhledem k tomu, že hlavním symptomem infekce C. difficile je průjem. Nepoužívejte vzorky, které jsou v transportním médiu, nebo jsou odebrány do média obohaceného různými konzervačními látkami (např. formalin, SAF, PVA apod.), které mohou interferovat v tomto testu. Je doporučena analýza nezpracovaných čerstvě odebraných vzorků. Jestliže je potřeba vzorky skladovat déle, uchovávejte je po dobu 1-2 dnů v lednici při teplotě +2 až +8 C. Pro delší skladování vzorky zamražte (-20 C), vezměte ale na vědomí, že některé vzorky mohou zamražením ztratit reaktivitu 3

4 Před zpracováním zajistěte, aby byly zmražené vzorky kompletně rozmraženy a temperovány při pokojové teplotě před zpracováním. Vyvarujte se opakovaného zmrazování a rozmrazování vzorků, může být poškozena celistvost toxinů Příprava vzorků stolice: Obecná doporučení: Po celou dobu zpracování vzorků a testování používejte jednorázové rukavice, se vzorkem zacházejte jako s potenciálně infekčním materiálem. Po ukončení testu proveďte opatření uvedená v bodě: Bezpečnostní opatření. Protokol přípravy vzorku je stejný pro oba formáty testu (kazeta a blister) a je následující: 1. Pro tekuté a polotekuté vzorky přeneste 4 kapky (asi 100 ul) pomocí žluté negraduované jednorázové pipety do mikrozkumavky o objemu 1,5ml. Je-li vzorek tuhý, odeberte cca 75 mg (malá kulička o průměru 4 mm) pomocí dřevěné odběrové tyčinky a vložte do 1,5 ml mikrozkumavky. Důležité : Pro zajištění homogenity vzorku odeberte 3 různé vzorky ze 3 míst, je to metoda, jak získat co nejvíce representativní vzorek. 2. Přidejte 1 ml ředicího roztoku k odebranému vzorku do 1,5ml zkumavky (v případě, že vzorek má větší objem, zachovejte poměr mezi množstvím ředicího roztoku a vzorku tj 100ul (75mg)vzorku /1 ml ředicího roztoku 3. Vortexujte mikrozkumavku po dobu 30 sekund, abyste dobře resuspendovali vzorek v ředicím roztoku. 4. Centrifugujte 1,5ml mikrozkumavku po dobu 5 minut při 700g (přibližně 3000 rpm) ve stolní centrifuze pro odstranění pevných částic. Pokud nemáte k dispozici centrifugu, nechte zkumavku 3-5 minut po vortexování na stole a poté odeberte supernatant. Nejlepších charakteristik testu je dosaženo, pokud je supernatant čirý a pokud po extrakci vzorek centrifugujeme. Příprava kultivačních vzorků Pro testování kolonií po kultivaci na agarových plotnách je doporučen následující postup: Přidejte 0,5-1 ml ředicího roztoku do předem označené 1,5 ml mikrozkumavky Odeberte kolonie z agarové plotny inokulační kličkou a přeneste je do mikrozkumavky s ředicím roztokem Uzavřete zkumavku a obsah promíchejte na vortexu Centrifugujte 1,5ml mikrozkumavku po dobu 5 minut při 700g (přibližně 3000 rpm) ve stolní centrifuze pro odstranění pevných částic. Pokud nemáte k dispozici centrifugu, nechte zkumavku 3-5 minut po vortexování na stole a poté odeberte supernatant Pro test by měl být použit čirý supernatant 4

5 PRACOVNÍ POSTUP: Před testováním nechte kazetu, vzorek stolice a kontroly vytemperovat na laboratorní teplotu (+15 až +30 C). Neotvírejte sáček, dokud nejste připraveni provést test. Postup pro KAZETU (Card): 1. Těsně před použitím vyjměte kazetu Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B Card z obalové folie a položte ji na vodorovnou podložku. Nedotýkejte se membrány v místě testovací zóny a zóny pro aplikaci vzorku. Pro každý vzorek a kontrolu použijte samostatnou odběrovou zkumavku a kazetu. Desikant zlikvidujte, slouží pouze k odstranění nežádoucí vlhkosti. 2. Pipetujte 4 kapky (cca 100ul) vzorku upraveného podle odstavce Příprava vzorků pomocí žluté pipety do kruhového okénka pro vzorek. 3. Po 15 minutách odečtěte výsledek. Postup pro Blister test: 1. Po vytemperování blisteru otevřete obalovou folii v označeném místě. 2. Pokud je součástí soupravy zkumavka, vložte zkumavku do stojánku na zkumavky 3. Odeberte alikvotu ze vzorku po centrifugaci (viz odstavec Příprava vzorků ) přibližně 265 ul (čtvrtá značka na plastové graduované pipetě) a přeneste tento objem do testovací zkumavky 4. Pokud používáte 96-jamkovou mikrotitrační destičku, dostatečné množství vzorku je přibližně 150 ul (třetí značka na plastové graduované pipetě) 5. Ponořte strip do zkumavky nebo jamky mikrotitrační destičky tak, že šipka ukazuje směrem do kapaliny 6. Inkubujte ponořený strip při pokojové teplotě 15 minut, poté odečtěte výsledek (viz obr.1) INTERPRETACE VÝSLEDKU: Na Obr.1 je 5 stripů, kde jsou demonstrovány různé výsledky, které mohou být získány testem Rapid-VIDITEST toxin A+B. Jsou zde tři různé barevné linie: Modrá linie: kontrolní linie, která indikuje správné provedení testu Vrchní červená linie: vzorek pozitivní na TcB Spodní červená linie: vzorek pozitivní na TcA Modrá linie (kontrolní) by se měla při testu objevit vždy. Pokud se objeví navíc některá z červených linií, indikuje to přítomnost C. difficile, která produkuje TcdA a/nebo TcdB v analyzovaném vzorku. 5

6 Obr.1: Strip 1: NEGATIVNÍ výsledek : vzorek neobsahuje C.dificille, nebo obsahuje kmen, který neprodukuje TcdA/TcdB. Na stripu v centrální části se objeví jedna vodorovná MODRÁ linie, pokud pužíváte formát kazet, objeví se modrá linie v části označené písmenem C. Tato kontrolní linie by se měla objevit při každém testu a indikuje, že chromatografie proběhla bez problémů. Stripy 2-4 POZITIVNÍ výsledky: Strip 2: Detekce TcdA: Pod kontrolní MODROU linií se objeví ČERVENÁ. Používáte li formát kazety, červená linie se objeví v místě označeném písmenem T1. Intenzita červené linie závisí na koncentraci toxinu A ve vzorku. Strip 3: Detekce TcdB: Nad kontrolní MODROU linií se objeví ČERVENÁ. Používáte li formát kazety, červená linie se objeví v místě označeném písmenem T2. Intenzita červené linie závisí na koncentraci toxinu B ve vzorku. Strip 4: Detekce obou toxinů TcdB i TcdA: Nad i pod kontrolní MODROU linií se objeví ČERVENÁ. Používáte li formát kazety, červená linie se objeví v místě označeném písmenem T2 i T1. Strip 5: NEPLATNÝ výsledek: Neobjeví se MODRÁ linie. Indikuje to anomální test. Příčiny mohou být následující: Některé reagencie mohou být nestabilní a hůře funkční, test je proexpirovaný Vzorek nebyl připraven a zpracován podle Návodu k použití Byly použity jiné ředicí roztoky než ty, které byly dodány se soupravou V případě, že dostanete neplatný výsledek, je doporučeno test opakovat a striktně dodržet pracovní postup. Pokud se objeví jakákoli linie po době delší než 15 minut, nemá tato linie žádný diagnostický význam. 6

7 Poznámka: Konečná diagnóza CD/PMC musí být stanovena klinikem. Tento test pouze detekuje toxin A+B ve vzorku pacienta, ale nelze jím jednoznačně potvrdit, zda pacient má nebo nemá ICD. OMEZENÍ TESTU: 1. Tento test analyzuje tekuté a polotekuté vzorky stolice, tuhé vzorky mohou být použity, ale test pro ně není optimalizován. Zřídka se objevují případy, kdy sekvestrace toxinu byla pozorována u takovýchto tuhých vzorků. 2. Tento test je kvalitativní, ne kvantitativní, ačkoli intenzita červených linií souvisí s množstvím toxinu ve vzorku. 3. Byla provedena studie funkční způsobilosti na více než 200 vzorcích stolice k zajištění správných charakteristik testu. Srovnání výsledků tohoto testu s jinými technikami (ELISA, stanovení cytotoxicity) byla velmi dobrá. Ačkoliv, není vyloučena interference u jiných vzorků. 4. Slabý signál může být způsoben malým množstvím použitého vzorku. Pokud nastane tento případ, je doporučeno test opakovat s větším množstvím vzorku, poměr mezi ředicím roztokem a množstvím vzorku musí být zachován (viz kapitola Příprava vzorků) 5. Přebytek vzorku může způsobit špatné vzlínání vzorku (kontrolní linie zůstává neviditelná). Pro zabránění tohoto jevu je doporučeno opakovat test s menším množstvím vzorku. To je důležité zejména u tuhých vzorků stolice. 6. Negativní výsledek zcela nevylučuje možnost infekce Clostridium difficile (ICD). Výsledek testu musí být interpretován ve vztahu ke klinickým symptomům pacienta. Navíc je potřeba mít na paměti, že toxin není stabilní molekula, může být snadno degradována např. zahřátím při nevhodném skladování vzorků, nebo přítomností inhibitorů. Za těchto podmínek pak může být koncentrace nižší, než je detekční limit testu. (viz kapitola Analytická citlivost) 7. Pozitivní výsledek získaný z tuhých vzorků musí být interpretován s velkou opatrností. V principu je průjem hlavním příznakem infekce Clostridium difficile a tuhé vzorky vylučují přítomnost průjmu. Osoba provádějící test musí o této skutečnosti informovat lékaře. Tato informace společně s klinickým obrazem pacienta, umožní lékaři stanovit správnou diagnózu. 8. Předpokládali jsme, že se mohou vyskytnout křížové reaktivity s dvěma dalšími mikroorganismy: * Clostridium sordellii, který produkuje letální toxin (TcsL), který je homologní s TcdB bakterie Clostridium difficile 10.K hodnocení možné křížové reaktivity s TcsL byly kultivovány ve vhodném médiu 2 kmeny Clostridium sordelii (IP82 a RE1522). Supernatant ze 3 dny staré kultury byl použit pro test Rapid-VIDITEST C.dificille toxin A+B. Neobjevily se žádné pozitivní červené linie. Také předpodkládáme, že se neobjeví žádná křížová reaktivita v testu pro jiné kmeny Clostridium sordelii, které produkují TcsL. Entamoeba histolytica: Byl pozorován určitý stupeň křížové reaktivity s tímto parazitem u vzorků, které obsahovaly jeho vysokou koncentraci. Výsledek testu byl negativní v případě, že se použil izolát (bez matrice vzorku stolice). Výsledky různých ELISA a Rapid testů dávají podobné výsledky pro takovéto vzorky. Bylo prokázáno, že všechny takovéto křížově reagující vzorky stolice se prezentují stejným výsledkem v testu Rapid-VIDITEST C. difficile toxin A+B: toxin je negativní, zatímco toxin B je slabě pozitivní. Proto doporučujeme použít test E.histolytica jako konfirmační test pro vyloučení přítomnosti tohoto parazita ve vzorku stolice. 7

8 9. Osídlení bakterií Clostridium difficile u kojenců udávané v literatuře je až 50%. Vysoká promořenost se udává také u pacientů s cystickou fibrózou. Obvykle tyto dvě skupiny bývají asymptomatické a nevyžadují žádné specifické léčení. Takovéto pozitivní výsledky, které nemají klinický význam, je potřeba zpracovávat opatrně, protože v tomto případě pacienti nevyžadují léčení této infekce. ANALYTICKÁ CITLIVOST: Abychom mohli stanovit citlivost testu z různých zdrojů, byly použity různé kontrolní vzorky jiných výrobců, ředěné v ředicím roztoku tohoto testu: List Biological Laboratories: připravili jsme interní standard v koncentraci 1μg/ml smícháním stejného množství toxinu A (ref: 152) a toxinu B (ref.155). Všechny šarže testu Rapid- VIDITEST C. difficile toxin A+B musí detekovat tento standard ředěný nejméně do koncentrace 12ng/ml, ačkoli většina šarží jsou schopny detekovat toxin v koncentraci až 6ng/ml. Tgc BIOMICs: na tomto testu byl testován standard toxin A (ref: 01A01-1) a toxin B (ref.01a02-1) od výrobce tgc BIOMICs. Určité šarže tohoto testu detekovaly koncentraci 1,5ng/ml toxinu A a koncentraci 5 ng/ml toxinu B. DIAGNOSTICKÁ CITLIVOST A SPECIFICITA: A.- Analýzy vzorků stolice Bylo provedeno externí hodnocení funkční způsobilosti na oddělení mikrobiologie nemocnice Bellvitge (Barcelona) po dobu 7 měsíců od března do září Studie zahrnuje analýzu 242 vzorků stolice (30 pozitivních a 212 negativních podle testu cytotoxicity). Výsledky tohoto testu byly porovnány s výsledky získanými s technikou zlatého standardu, kterou je test cytotoxicity a která je běžně v nemocnici používána pro diagnostiku infekcí Clostridium difficile. 242 vzorků Test cytotoxicity pozitivní negativní Rapid-VIDITEST pozitivní C.difficile toxin A+B negativní Shoda = 92,6% Citlivost = 76,7% Specificita = 94,8% PVP = 67,6% PVN = 96,6% Rapid-VIDITEST vykazuje vysokou specificitu srovnatelnou se zlatým standardem. Co se týče citlivosti, hodnota 76,7% souhlasí s faktem, že cytotoxicita je velmi senzitivní technika (detekce toxinu B na hladině pg/ml). Někdy je tato metoda citlivá až příliš, což vede k falešně pozitivním výsledkům (nízká hladina detekovaných toxinů nemá za následek rozvoj onemocnění a proto není potřeba pacienta léčit) 8

9 B. Analýza kultivačních vzorků : referenční kmeny Clostridium difficile. Tímto testem byly testovány různé sbírky perfektně charakterizovaných kmenů Clostridium difficile ve třech různých externích studiích : * Dale Gerding panel: Clostridium difficile kmeny jako je Y-1; BK-6; K-12; G-1; B-1; BI- 17; J-7 a CF-1 * Panel běžných PFGE typů Clostridium difficile: PFGE typy jako např. NAP1; NAP2; NAP3; NAP4; NAP5; NAP6; NAP7, NAP8; NAP9; NAP10; NAP11 a NAP12. * Kmeny patřící k nejhojnějším evropským ribotypům podle studie publikované skupinou Barbut et.al. v roce : ribotypy 001; 002; 005; 012; 014; 015; 017 (hypervirulentní); 020; 0,23; 027 (hypervirulentní); 048; 077; 078; 081; 087. Ve výsledku bylo analyzováno až 100 kmenů ve třech různých studiích. Rapid-VIDITEST detekoval správně všechny zmíněné kromě kmenu CF-1 a jednoho kmenu patřícího k typu NAP9. PŘESNOST: INTRA-ASSAY: Purifikovaný toxin A a toxin B byly použity k sestavení křivky pro stanovení citlivosti testu za různých podmínek. Ředění byla dvojnásobná a vzorky byly v tripletech testovány jedním pracovníkem v jednom testu.výsledky z testu Rapid-VIDITEST se lišily o míň než faktor 2, což indikovalo, že test je vysoce přesný. INTER-ASSAY Jedna šarže testu byla použita k měření citlivosti po dobu čtyř dnů za sebou. Výsledky ukazují vysokou reprodukovatelnost testu s purifikovanými toxiny (byla získána stejná hladina citlivosti ve všech po sobě jdoucích testech) Pět různých laboratorních pracovníků provádělo měření citlivosti tímto testem s oběma purifikovanými toxiny. Rozdíly, které byly získány při větším ředění (slabší signál) nepřesáhly faktor 2. Byly měřeny rozdíly mezi jednotlivými šaržemi testu pomocí stanovení citlivosti pro oba toxiny. Analýza byla provedena jedním pracovníkem v jeden den. Rozdíly mezi jednotlivými šaržemi byly přijatelné a očekávané, nepřesáhly faktor 2. Rozdíly zjištěné při testování jsou akceptovatelné pro kvalitativní imunochromatografické techniky, berou v úvahu přirozenou variabilitu testu. HOOK EFFECT Ve všech experimentech, které probíhaly s tímto testem, nebylo pozorováno snížení nebo ztráta signálu s vyšší koncentrací jednoho nebo obou toxinů detekovaných testem. Nejvyšší koncentrace toxinu A a B z List Biological Laboratories byla ng/ml (koncentrace, která je přirozeně přítomna v klinických vzorcích). Limit testu pro tyto toxiny je asi 12,5ng/ml, což je 400x více než je limit tohoto testu. INTERFERENCE: Substance uvedené v tabulce v určitých koncentracích neinterferují s výsledkem tohoto testu. Loperamide 2% (p/v) Neomicyn 35% (p/v) Atropine 2% (p/v) Ampicilin 50% (p/v) Metronidazol 10% (p/v) Saccharine 50% (p/v) Omeprazole 10% (p/v) Saccharose 1 mg/ml Racecadotril 5% (p/v) Palmitic acid 40% (p/v) Cimetidine 10% (p/v) Plná krev 40% (p/v) Aspirin 30% (p/v) Ibuprofen 30% (p/v) 9

10 KŘÍŽOVÁ REAKTIVITA S JINÝMI MIKROORGANISMY: Rapid-VIDITEST C.difficile toxin A+B test byl testován s různými bakteriemi, které jsou přítomny v trávicím traktu v hojném množství a vysoké koncentraci. Test byl proveden s bakteriální suspenzí o koncentraci 10 8 organismů na ml. Test neukázal žádnou křížovou reaktivitu s bakteriemi uvedenými níže: Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Bacillus spp., Campylobacter jejuni, Candida albicans, Clostridium perfringens (ATCC 13124), Clostridium sordellii (ATCC 9714), Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli 1, Escherichia coli 2, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocitogenes, Preteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia liquefaciens, Shigella dysenterie, Shigella flexnerii, Shigella sonneii, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis SKLADOVÁNÍ A STABILITA: Skladujte v originálním obalu při teplotě +2 až +30 C. Test je stabilní do data expirace uvedeného na obalu. Nezmrazujte. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ: 1. Se vzorky stolice pacienta zacházejte jako s potenciálně infekčním materiálem. Používejte při práci se vzorky jednorázové rukavice. 2. Ředicí roztok pro vzorky obsahuje azid sodný jako antimikrobiální činidlo. Vyvarujte se přímého kontaktu roztoku s kůží a sliznicemi. Roztok by neměl být používán, pokud jeví známky kontaminace nebo precipitace. 3. Nejezte, nepijte a nekuřte při práci se soupravou. Pracujte ve vhodných prostorách, které neslouží ke skladování a přípravě potravin a jídla. 4. Po dokončení práce se soupravou vyhoďte jednorázové rukavice, dezinfikujte pokožku rukou alkoholovou desinfekcí. Výlevku nebo umyvadlo, které při práci používáte, dekontaminujte vhodným prostředkem proti sporám. Spory Clostridium difficile nejsou alkoholem eliminovány. 5. Nezaměňujete reagencie mezi jednotlivými šaržemi souprav 6. Nechte reagencie a vzorky vytemperovat na pokojovou teplotu před použitím. Nedostatečně vytemperované reagencie nebo vzorky mohou snížit účinnost testu. Vhodná doba je obvykle minut při pokojové teplotě 7. Všechny reagencie jsou pouze pro účely in vitro. 8. Nepoužívejte soupravu po uplynutí data expirace. 9. Jestliže je poškozený obal soupravy, souprava může být použita pouze, pokud nejsou poškozené obaly jednotlivých reagencií. 10. V případě, že používáte formát Kazety, je velmi důležité aplikovat správný objem extrahovaného vzorku. Pokud aplikujete menší objem, než je doporučen v návodu, vzorek se nemusí dostat vzlínáním do reakční zóny a neobjeví se linie. Pokud aplikujete nadměrné množství vzorku, můžou se objevit místo červené a modré linie, linie hnědé. 11. Test je určen na jedno použití a musí být likvidován v souladu s platnou legislativou. 12. Nepoužívejte test v případě, že se objeví jakákoli barevná linie ještě před provedením testu 13. Kritický je správný odběr pacientského vzorku: přibližně 75mg pevného vzorku (malá kulička o průměru 4 mm), nebo 100 μl kapalného nebo suspenzního vzorku. Toto množství je extrahováno v 1 ml ředicího roztoku, který je součástí soupravy. Pokud odeberete větší vzorek, zachovejte poměr mezi množstvím vzorku a ředicího roztoku. Nadměrné množství vzorku v poměru k přidanému množství ředicího roztoku zabraňuje 10

11 správnému průběhu chromatografie. Toto je kritické zejména při extrakci pevného vzorku, protože je obtížné odměřit správné množství. Protože mějte na paměti, že tento test je určen pro analýzu tekutého nebo suspenzního vzorku. 14. Abychom zajistili adekvátní průběh chromatografie, je velmi důležité centrifugovat 1,5ml mikrozkumavky se vzorkem. Správný výsledek nelze zaručit, pokud jsou nerozpuštěné partikule ponechány v roztoku a nejsou odstraněny centrifugací. Toto se týká zejména pevných vzorků, kde suspendované částice mohou interferovat při chromatografii. 15. Je velmi důležité dobře uzavřít obal testu, pokud test nepoužijete, může dojít ke zvlhnutí stripu a tím k jeho poškození. REFERENCE: 1. Lyras D., O Connor J. R., Howard P. M., Sambol S. P., Carter G.P., Phumoonna T., Poon R., Adams V., Vedantam G., Johnson S., Gerding D. N., Rood J. I. Toxin B in essential for virulence of Clostridium dififcile. Nature Apr 30; 458 (7242): Kuehne S. A., Cartman S. T., Heap J. T., Kelly M. L., Cockayne A., Mintn N. P. The role of toxin A and toxin B in Clostridium difficille infection. Nature in press Sep Vonberg RP, Reichardt C, Behnke M, Schwab F, Zindler S, Gastmeier P. Costs of nosocomial Clostridium difficille-associated diarrhoea. J. Hosp. Infect Sep; 70 (1): Rupnik M., Dupuy B., Fairweather N. F., Gerding D. N., Johnson S., Just I., Lyerly D. M., Popoff M. R., Rood J. I., Sonnenshein A. L., Thelestam M., Wren B. W., Wilkins T. D., von Eichel Streiber C. Revised nomenclature of Clostridium difficille toxins and associated genes. J. Med. Microbiol Feb; (Pt 2): Tucker K. D., Carrig P. E., Wilkins T. D. Toxin A of Clostridium difficille is a potent cytotoxin. J. Clin. Microbiol May; 28 (5): Soehn F., Wagenknecht-Wiesner A., Leukel P., Kohl M., Weidman M., von Eichel-Streiber C., Braun V. Genetic rearrangements in the pathogenicity locus of Clostridium difficille strain implications for transcription, expression and enzymatic activity of toxin A and B. Mol. Gen. Genet May; 258 (3): Barbut F., Mastrantonio P., Delmée M., Brazier J., Kuijper E., Poxton I., European Study Group on Clostridium difficille (ESGCD). Prospective study of Clostridium difficille infections in Europe with phenotypic and genotypic characterisation of the isolates. Clin. Microbiol. Infect Nov; 13 (11): Depitre C., Delmee M., Avesani V., L Haridon R., Roels A., Popoff M., Corthier G. Serogroup F strains of Clostridium difficille produce toxin B but not toxin A. J. Med. Microbiol Jun; 38 (6): Drudy D., Harnedy N., Fanning S., Hannan M., Kyne L. Emergence and control of fluoroquinolone-resistant, toxin A-negative, toxin B-positive Clostridium difficille. Infect Control Hosp. Epidemiol Aug; 28 (8): von Eichel Streiber C., Boquet P., Sauerborn M., Thelestam M. Large clostridial cytotoxins--a family of glycosyltransferases modifying small GTP-binding proteins. Trends Microbiol Oct; 4 (10): POUŽITÉ SYMBOLY: In vitro diagnostický prostředek Expirace Datum poslední revize návodu: květen Šarže Výrobce

12 12