Tvorba biofilmu a produkce biosurfaktantů u probiotických kmenů bakterií

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Tvorba biofilmu a produkce biosurfaktantů u probiotických kmenů bakterií Diplomová práce Iva Třísková VEDOUCÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE: Ing. VERONIKA HOLÁ, Ph.D. BRNO 2011

2 Bibliografický záznam Autor: Bc. Iva Třísková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav Experimentální biologie Název práce: Tvorba biofilmu a produkce biosurfaktantů u probiotických kmenů bakterií Studijní program: Biologie Studijní obor: Obecná biologie Vedoucí práce: Ing. Veronika Holá, Ph.D. Rok obhajoby: 2011 Klíčová slova: biofilm, biosurfaktanty, Lactobacillus, probiotika, povrchové napětí

3 Bibliographic entry Author: Bc. Iva Třísková Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Title of thesis: Biofilm formation and biosurfactants production in probiotic strains of bacteria Degree programme: Biology Field of study: General Biology Supervisor: Ing. Veronika Holá, Ph.D. Year of defence: 2011 Keywords: biofilm, biosurfactants, Lactobacillus, probiotics, surface tension

4 Poděkování Chtěla bych tímto poděkovat vedoucí mojí diplomové práce Ing. Veronice Holé, Ph.D. za odborné vedení. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Danielu Vlkovi, CSc. a Mgr. Naděždě Vaškovicové z Biofyzikálního ústavu Lékařské fakulty MU za věnovaný čas a pomoc při měření. Děkuji i paní Ing. Marii Horké, CSc. a všem ostatním spolupracovníkům z Ústavu analytické chemie AV ČR. Velký dík patří i zaměstnancům Oddělení mikrobiologie Přírodovědecké fakulty MU jmenovitě pak především doc. RNDr. Aleně Španové, Mgr. Andrei Teshim a Ing. Martinu Krskovi, CSc. Z Mikrobiologického ústavu Lékařské fakulty a Fakultní nemocnice u svaté Anny bych ráda poděkovala laborantkám Zuzaně Krškové a Ivaně Psotové, které mi pomohly vždy, když jsem něco potřebovala a všem ostatním ochotným zaměstnancům. Diplomová práce byla podpořena z grantových projektů IGA MZ ČR 9678 a MŠMT 1M0528.

5 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem předloženou práci vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v seznamu literatury. V Brně 16. května Bc. Iva Třísková

6 Abstrakt Na probiotika se v poslední době soustřeďuje značná pozornost. Pro jejich využití je důležité znát vlastnosti jednotlivých kmenů. Mezi tyto vlastnosti se může řadit tvorba biofilmu a produkce biosurfaktantů. Biosurfaktanty probiotických kmenů můžou redukovat tvorbu biofilmu u patogenních mikroorganismů. Cílem diplomové práce bylo zjistit, jestli vybrané probiotické kmeny tvoří biofilm a zvolenými metodami, pomocí testu šíření oleje a přímého měření povrchového napětí, se pokusit detekovat produkci biosurfaktantů. Abstract Considerable attention concentrates on probiotics in last few years. For their use it is important to know the characteristics of individual strains. Such characteritics are e.g. biofilm formation and production of biosurfactants. Biosurfactants of probiotic strains can reduce the formation of biofilms of pathogenic microorganisms. The aim of this thesis was to determine whether selected probiotic strains form biofilms and by means of the oil spreading test and direct measurement of surface tension to try to detect the production biosurfactants.

7 OBSAH 1. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ÚVOD Probiotika Probiotické kmeny Lactobacillus Bifidobacterium Požadavky na probiotika Využití Biofilm Vznik biofilmu Quorum sensing systém Výskyt Biofilm u probiotických bakterií Průkaz tvorby biofilmu Biosurfaktanty Chemická struktura a dělení Syntéza biosurfaktantů Mechanismus působení Produkce biosurfaktantů Produkce biosurfaktantů probiotickými bakteriemi Využití v medicíně Detekce biosurfaktantů Přímé měření povrchového napětí Některé další metody CÍL PRÁCE MATERIÁL A METODY

8 4. 1. Použité mikroorganismy Kultivační média a roztoky Přístroje a pomůcky Uchovávání kmenů Metody Mikroskopie probiotických kmenů Určování patogenních mikroorganismů Test fermentace na Hajnově půdě a Endově agaru Enterotest 16 (PLIVA Lachema) Tvorba biofilmu Oil spreading test Příprava vzorku Provedení testu Měření povrchového napětí Příprava vzorku Stalagmometrická metoda Wilhelmyho destičková metoda Vliv biosurfaktantů na biofilm střevních patogenů VÝSLEDKY Mikroskopie Určování patogenních mikroorganismů Tvorba biofilmu Vliv kultivačního média na tvorbu biofilmu u probiotických Vliv přístupu ke kyslíku na tvorbu biofilmu u probiotických bakterií Vliv délky kultivace na tvorbu biofilmu u probiotických bakterií Vliv statické a dynamické kultivace na tvorbu biofilmu u probiotických bakterií Produkce biosurfaktantů Oil spreading test Měření povrchového napětí

9 Vliv supernatantu na biofilm Tvorba biofilmu střevních patogenů Test ovlivnění biofilmu střevních patogenů DISKUZE Biofilm Biosurfaktanty Ovlivnění biofilmu střevních patogenních bakterií ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY PŘÍLOHY

10 1. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ADSAP AI ANOVA BHI BMK CCM CCDM CMC CTAB EPS FAO GRAS McF MRS NaCl OD ODc TSB WHO analýza profilu kapky (Axisymmetric Drop Shape Analysis by Profile) autoinduktor analýza rozptylu (Analysis of Variance) mozkosrdcová infúze (Brain Heart Infusion Broth) bakterie mléčného kvašení Česká sbírka mikroorganismů (Czech Collection of Microorganisms) Sbírka mlékařských mikroorganismů (Culture Collection of Dairy Microorganisms) kritická micelární koncentrace (Critical Micelle Concentration) cetyltrimethylammonium bromid exopolysacharidy Organizace pro potraviny a zemědělství (Food and Agricultural Organization) obecně považováno za bezpečné (Generally Recognised As Safe) McFarland MRS médium (Mann, Rogosa, Sharpe Medium) chlorid sodný optická denzita hraniční hodnota optické denzity (Cut-Off Value) tryptózo-sojový bujón (Tryptic Soy Broth) Světová zdravotnická organizace (World Health Organization) 4

11 2. ÚVOD Probiotika Využívání fermentovaných mléčných produktů sahá až do starověku. Průmyslová výroba se ale datuje jen od 20. století. Ke konci 19. století přišel ukrajinský vědec Eli Metchnikoff s tím, že konzumace fermentovaných mléčných výrobků vede k dlouhověkosti bulharských rolníků. Izoloval bakterii Bulgarian bacillus, dnes známou jako Lactobacillus bulgaricus (Luquet a Corrieu 2005). Probiotické bakterie se uplatnily také během druhé světové války, kdy německý lékař A. Nissle objevil pozitivní účinky určitého kmene E. coli. Tento kmen, pojmenovaný po svém objeviteli E. coli Nissle 1917, se stal základem přípravku Mutaflor, který se používá při střevních obtížích (Maczulak 2010). Samotný termín probiotikum byl poprvé použit až v 60. letech 20. století vědci Lillym a Stillwellem. Podle jejich definice byla probiotika substance sekretované jedním mikroorganismem, které stimulují růst jiných mikroorganismů (Gupta a Garg 2009). Podle současné definice FAO/WHO (2002) jsou probiotika živé mikroorganismy, které v adekvátním množství působí prospěšně na zdraví člověka Probiotické kmeny Mezi probiotika zahrnujeme jak kmeny bakterií, jako jsou například bakterie mléčného kvašení a Escherichia coli, tak i kmeny kvasinek Saccharomyces boulardii a Saccharomyces cerevisiae viz tabulka 1. Lactobacillus Bifidobacterium jiné BMK ostatní L. acidophilus B. adolescentis Enterococcus faecalis Bacillus cereus var. toyoi L. amylovorus B. animalis Enterococcus faecium Escherichia coli L. casei B. bifidum Lactococcus lactis Saccharomyces boulardii L. crispatus B. breve Saccharomyces erevisiae L. delbrueckii B. longum L. johnsonii L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus Tab. 1: Přehled některých probiotických druhů; upraveno dle Holzapfel a kol

12 Lactobacillus Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Lactobacillales Čeleď: Lactobacillaceae Rod: Lactobacillus Bakterie rodu Lactobacillus jsou grampozitivní nesporulující tyčky. Řadí se mezi bakterie mléčného kvašení. Vyznačují se nízkým procentuálním obsahem bází G + C. Jsou chemoorganotrofní a mají fermentatorní typ metabolismu. Rostou optimálně mezi C (Sedláček 2007). Řada z nich je součástí přirozené mikroflóry člověka. Nalézáme je v trávicím traktu a jako hlavní část vaginální mikroflóry. Mají důležitou roli ve snižování adheze patogenních druhů mikrobů ke sliznici trávicího i urogenitálního traktu (Holá 2003). Dominantními bakteriemi v urogenitálním traktu žen jsou právě laktobacily, které mohou působit proti případným infekcím různými patogeny. Jsou totiž schopné produkce řady látek včetně látek s antimikrobiálním účinkem (Velraeds a kol. 1996b). Laktobacily dělíme do následujících skupin: 1, obligátně homofermentativní: Konečným produktem fermentace hexóz je kyselina mléčná. Mezi zástupce této skupiny patří např. L. acidophilus a L. helveticus. 2, fakultativně heterofermentativní: Konečným produktem fermentace hexóz je kyselina mléčná nebo směs kyselina mléčná + mravenčí + octová + etanol. Konečným produktem fermentace pentóz je pak kyselina mléčná + octová. Mezi zástupce této skupiny patří např. L. fermentum. 3, obligátně heterofermentativní: Konečným produktem fermentace hexóz je kyselina mléčná, octová, etanol a CO 2. Konečným produktem fermentace pentóz je pak kyselina mléčná + octová. Mezi zástupce této skupiny patří např. L. casei a L. plantarum (Sedláček 2007). 6

13 Bifidobacterium Doména: Bacteria Kmen: Actinobacteria Třída: Actinobacteria Řád: Bifidobacteriales Čeleď: Bifidobacteriaceae Rod: Bifidobacterium Bifidobakterie jsou součástí přirozené mikroflóry trávicího traktu člověka. Řadí se do skupiny bakterií označované jako GRAS. Jsou součástí řady fermentovaných mléčných výrobků (Picard a kol. 2005). Bakterie rodu Bifidobacterium jsou tvarově různorodé, nesporulující, nepohyblivé tyčky. Ve vztahu ke kyslíku jsou anaerobní, jsou chemoorganotrofní s fermentatorním typem metabolismu (Sedláček 2007) Požadavky na probiotika Na kmeny, které se využívají jak probiotika, jsou kladeny určité požadavky. Probiotické účinky se nevztahují na celý druh, ale jsou kmenově specifické. Pro zjištění vlastností jednotlivých probiotických kmenů, jako je jejich bezpečnost, mechanismus účinku a dalších, je důležité provádění in vitro testování. Tabulka 2 uvádí nejpoužívanější in vitro testy. Je nutné si ale uvědomit, že chování určitého probiotického kmene in vitro nemusí zcela odpovídat chování v lidském těle (FAO/WHO 2002). Rezistence k žaludečním kyselinám Rezistence ke žlučovým kyselinám Antimikrobiální aktivita proti potenciálně patogenním bakteriím Adherence na tkáně a/nebo lidské epiteliální buňky a buněčné linie Schopnost redukce adheze patogenů na povrchy Hydrolázová aktivita žlučových solí Resistence ke spermicidům Tab. 2: Používané in vitro testy; upraveno podle FAO/WHO

14 Využití S probiotiky se můžeme setkat v potravinách stejně jako ve formě potravinových doplňků. Co se týká probiotik v potravinách, jsou součástí řady mléčných výrobků, ať už jogurtů nebo kysaných mlék. V rámci potravinových doplňků jsou to různé kapsle, prášky, nebo tablety. Mikroorganismy gastrointestinálního traktu jsou v relativní rovnováze, která však může být narušena různými faktory. Mezi takové faktory se řadí strava, věk, léky (zejména antibiotika), stres, různé nemoci. Pro udržení této rovnováhy jsou nejbezpečnějším a nejúčinnějším prostředkem právě probiotika. Bariéra tvořená laktobacily a bifidobakteriemi pak může chránit před kolonizací patogenními mikroorganismy (Narayan a kol. 2010). Schopnost adheze je u laktobacilů kmenově specifická. Mezi schopností adherovat a schopností kompetitivní inhibice jiných mikroorganismů je přímá úměra, kmen s vyšší schopností adherence také lépe působí v kompetitivní inhibici (Li a kol. 2008). Probiotika mají důležitou roli v prevenci průjmů (de Vrese a Marteau 2007), modulaci hostitelského imunitního systému (Delcenserie a kol. 2008) a celkově udržení zdravého gastrointestinálního traktu. Využití probiotik v medicíně je tedy značně široké. Bylo zdokumentováno použití u průjmových onemocnění vzniklých z různých příčin, ať už v důsledku užívání antibiotik, rotavirových infekcí, chemoterapie nebo u tzv. cestovatelských průjmů (de Vrese a Marteau 2007). Probiotika mají také schopnost snižovat množství nežádoucích metabolitů, např. amonných iontů a prokancerogeních enzymů, v tlustém střevě. Dále se diskutuje o působení probiotik na patogenní bakterii Helicobacter pylori, snížení alergických projevů, příznivého vlivu u syndromu dráždivého tračníku, účincích na metabolismus minerálů, prevenci rakoviny a redukci cholesterolu (Schrezenmeir a de Vrese 2001). Mezi významné vlastnosti probiotik patří také produkce antimikrobiálních látek, jako jsou peroxid vodíku a biosurfaktanty (Velraeds a kol. 1996a). Mezi antimikrobiální látky se řadí také bakteriociny. Nejznámější bakteriocin, produkovaný bakterií mléčného kvašení Lactococcus lactis subsp. lactis, je nisin. Tento peptid působí antibakteriálně na široké spektrum mikroorganismů (Arauz a kol. 2009). Také další BMK, využívající se jako probiotika např. různé kmeny laktobacilů, jsou schopné produkovat řadu bakteriocinů (Corr a kol. 2007, Arakawa a kol. 2008, Boris a kol 2001). 8

15 2. 2. Biofilm Historie prvního pozorování biofilmu sahá až ke konci 19. století, kdy Holanďan Antony von Leuwenhook pozoroval ve svém mikroskopu biofilm z povrchu zubů (MacEachran a O Toole 2007). Řada mikrobiálních druhů je schopná tvořit biofilm (Kolter a Greenberg 2006). Biofilm je shromáždění povrchově sdružených mikrobiálních buněk, které je obaleno v extracelulární polymerní matrix. Kromě samotných buněk může matrix biofilmu obsahovat i materiál z prostředí, ve kterém se nachází, jako jsou minerální krystaly, korozní částice, částice jílu nebo bahna a krevní komponenty (Donlan 2002) Vznik biofilmu Postupný vznik biofilmu je ukázán na obrázku 1. Formování biofilmu začíná přichycením bakterií k povrchu. Tento proces je ovlivněn řadou faktorů. Mezi tyto faktory patří např. charakter povrchu (Stepanović a kol. 2007). Když jednotlivé bakteriální buňky nasednou na povrch za podmínek, které jsou příznivé pro jejich růst, procházejí zásadní změnou životního stylu (Kolter a Greenberg 2006). Buňky biofilmu se liší od volných buněk tvorbou exopolysacharidové matrix, snížením tempa růstu, a up/down regulací specifických genů. Přichycení je složitý proces regulovaný charakteristikou růstového média, substrátu a povrchu buněk (Donlan 2002). Obr. 1: Formování biofilmu; upraveno podle Monroe 2007 Vyzrálý biofilm se skládá z mikrobiálních buněk a exopolysacharidů (EPS). Poskytuje optimální prostředí pro výměnu genetického materiálu mezi buňkami. Buňky 9

16 mezi sebou komunikují prostřednictvím systému quorum sensing, což může mít vliv na různé procesy, jako je následné oddělení buněk (Donlan 2002). Adheze Rozhraní mezi povrchem a kapalným médiem (voda, krev) poskytuje ideální prostředí pro přichycení a růst mikroorganismů. Přichycení planktonních buněk na povrch substrátu je závislé na jeho fyzikálně-chemických vlastnostech. Přichycení a formaci biofilmu ovlivňují vlastnosti substrátu, média a buněk. Co se týká vlastností substrátu, je to především jeho textura, drsnost a hydrofobicita. Co se týká vlastností buněk, zde hraje roli taktéž hydrofobicita, dále pak přítomnost fimbrií, bičíku či produkce EPS (Donlan 2002). Kromě toho formování biofilmu závisí také na rychlosti proudění kapaliny, na jejím ph, teplotě, přítomnosti antimikrobiálních agens nebo výskytu případných kationtů. S rostoucím nepolárním charakterem zúčastněných povrchů, povrchu substrátu a povrchu mikrobiální buňky se zvyšují hydrofobní interakce buněk (Donlan 2002). Dozrávání Po určité době se z mikrokolonií tvoří biofilm, který se vyznačuje produkcí exopolysacharidů (Davey a O toole 2000). EPS mohou představovat značnou část z celkového organického uhlíku biofilmu a mohou být považovány za primární matrix biofilmu. EPS jsou primárně složeny z polysacharidů, mohou se však lišit ve svých fyzikálních a chemických vlastnostech (Donlan 2002). Fáze maturace může být v závislosti na různých systémech různě dlouhá. Může trvat od několika hodin jak je tomu u Pseudomonas aeruginosa (Waszczuk a kol. 2010), až po několik týdnů v případě systémů odpadních vod (Fernandéz a kol. 2007). Vyzrálý biofilm má charakteristickou houbovitou strukturu (Kolter a Greenberg 2006). Odtržení Buňky obsažené ve vyzrálém biofilmu se mohou následně oddělit a kolonizovat nová místa. Tento proces je dán souhrnem genetických faktorů a regulačních procesů (Webb 2007). K disperzi biofilmu může dojít třemi možnými způsoby: aktivním pohybem buněk pomocí bičíků, tzv. clumping disperzí a povrchovou disperzí. V prvním případě dochází 10

17 k oddělování jednotlivých buněk z biofilmové vrstvy do tekutého média. Tento způsob je typický např. pro Pseudomonas aeruginosa. Při clumping disperzi nejsou uvolňovány pouze samostatné buňky ale celé jejich shluky i s EPS, tedy mikrokolonie. Tento způsob je znám např. u Staphylococcus aureus. V posledním případě pak dochází k uvolnění částí biofilmu s buňkami, které se následně pohybují po povrchu (Hall-Stoodley a kol. 2004) Quorum sensing systém Bakterie mezi sebou komunikují pomocí signálních molekul zvaných autoinduktory. Koncentrace těchto molekul je závislá na hustotě buněčné populace (Waters a Bassler 2005). Pomocí signálů quorum sensing je řízena řada procesů jako bioluminiscence, sporulace, exprese genů virulence, produkce antibiotik a také ovlivňování tvorby biofilmu (Camilli a Bassler 2006). Vliv tohoto systému na tvorbu biofilmu byl prostudován u řady grampozitivních i gramnegativních bakterií. U mnoha bakteriálních kmenů je znám gen luxs, podílející se na řízení syntézy AI-2 (autoinduktor 2), jedním z nich je i Listeria monocytogenes. Mutace v genu luxs potlačuje tvorbu biofilmu (Sela a kol. 2006). Také u jednoho kmene Lactobacillus rhamnosus byla prokázána přítomnost tohoto genu. Nebylo však dokázáno, že by za potlačení formování biofilmu zodpovídaly právě AI-2 (Lebeer a kol. 2007a) Výskyt Biofilm, jak ukazuje obrázek 2, se může tvořit na zcela různých druzích povrchů, jako jsou tkáně, vnitřní zdravotnické materiály, průmyslové nebo pitné vodovodní potrubí nebo přírodní vodní systémy (Donlan 2002). Obr. 2: Biofilmy různého prostředí; upraveno podle Nett a kol. 2007, Biosurface Technologies Corp. 2004, Ruby a Gerencser

18 Biofilm může být tvořen jedním bakteriálním druhem, ale může být i vícedruhový. Příkladem takového vícedruhového biofilmu je biofilm v přírodě, který je často tvořen z různých organismů, jako jsou bakterie, řasy, houby i protozoa (Sauer a kol. 2007). Mezi lidským tělem a jeho mikroorganismy je intimní vztah. Biofilmy, které jsou součástí lidského těla, mají význam jako primární linie obrany proti invazi patogenů. Příkladem může být kolonizace povrchu kůže, zubů, sliznic. Co se týká lidského těla, biofilm můžeme najít například ve střevech (Lebeer a kol. 2007b). Biofilmy nám mohou na druhé straně také škodit. Kolonizují katétry, protézy a výsledný biofilm pak může zodpovídat za případné systémové infekce. Velké nebezpečí se skrývá v jejich vyšší rezistenci k antimikrobiálním látkám a s tím související obtížnější léčitelností (Kolter a Greenberg 2006) Biofilm u probiotických bakterií Řada probiotických kmenů je schopna tvorby biofilmu, jak ukazuje tabulka 3. Mikroorganismus Lactobacillus reuteri ATCC Lactobacillus reuteri CF48-3A Lactobacillus plantarum DSM1055 Lactobacillus casei DSM20011 Lactobacillus curvatus DSM20019 Lactobacillus paracasei DSM20207 Lactobacillus reuteri Lactobacillus plantarum Zdroj Jones a Versalovic 2009 Speranza a kol Ortu a kol Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) Lebeer a kol. 2007b Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JCM Kubota a kol Lactobacillus acidophilus ATCC 832 Muli a Struthers 1998 Tab. 3: Tvorba biofilmu u rodu Lactobacillus 12

19 Tvorba biofilmu může být ovlivněna řadou faktorů a je závislá na podmínkách prostředí. Je ovlivněna použitým médiem, ph a dalšími látkami. Ve studii Lebeer a kol. (2007b) byla prokázána schopnost tvorby biofilmu u probiotické bakterie Lactobacillus rhamnosus GG jak za anaerobních, tak mikroaerofilních podmínek. Dále bylo zjištěno, že nízké ph potlačuje tvorbu biofilmu, kdežto 0,3 M NaCl působí inhibičně jen nepatrně. Na zvyšování tvorby biofilmu se podílí např. přídavek 0,05 0,2 % žlučových kyselin, 20g/l inulinu popř. jeho derivátu Synergilu, stejně jako mucin. Z výše uvedených faktů vyplývá, že volba média je velmi důležitá Průkaz tvorby biofilmu Pro studium biofilmu se využívá řada metod jako skenovací elektronová mikroskopie, standardní kultivační techniky, ale i v posledních letech stále více používaná konfokální laserová skenovací mikroskopie a techniky zaměřující se na výzkum genů zapojených do buněčné adheze a tvorby biofilmu (Donlan 2002). Ke kultivačním technikám patří Christensenova zkumavková metoda a její modifikace v mikrotitračních destičkách popsaná v kapitole Metody. 13

20 2. 3. Biosurfaktanty Biosurfaktanty jsou povrchově aktivní látky, které jsou produkovány širokým spektrem mikroorganismů. Shromažďují se na rozhraní fází a snižují povrchové napětí. Některé biosurfaktanty působí antimikrobiálně, a to proti bakteriím, kvasinkám a virům (Nitschke a Costa 2007). Výhodou biosurfaktantů produkovaných mikroorganismy, na rozdíl od chemických surfaktantů, je jejich nižší toxicita a vyšší tolerance k nepříznivým podmínkám jako je vysoká teplota či různé ph (Cameotra a Makkar 1998). Biosurfaktanty mají svou úlohu při formování biofilmu. Podílí se na udržování kanálků mezi strukturami biofilmu a jsou schopné zabraňovat kolonizaci těchto kanálků nacházejících se mezi houbovitými strukturami biofilmu. Dále se také podílí na rozptýlení buněk z biofilmu a usnadňují migraci povrchově sdružených bakterií. Bylo zjištěno, že buňky Pseudomonas aeruginosa, které produkují biosurfaktanty, podporují formování mikrokolonií během iniciační fáze tvorby biofilmu, na rozdíl od buněk, které nesly mutaci a nebyly schopny tvořit biosurfaktanty. Tyto mutanty pak netvořily mikrokolonie (Pamp a Tolker-Nielsen 2007) Chemická struktura a dělení Dělení biosurfaktantů produkovaných mikroorganismy se liší od dělení surfaktantů syntetizovaných chemicky. Chemické surfaktanty rozlišujeme převážně podle povahy jejich polárního uskupení, kdežto biosurfaktanty dělíme podle jejich chemického složení (Muthusamy a kol. 2008). Po chemické stránce jsou biosurfaktanty molekuly s hydrofilním a hydrofobním koncem. Společnou charakteristikou je tedy amfifilní povaha, každopádně jinak jsou strukturně odlišné. Mohou to být jak vysokomolekulární tak nízkomolekulární látky (Nitschke a Costa 2007). Ze zástupců nízkomolekulárních látek jsou to např. glykolipidy a lipopeptidy, tyto jsou schopné efektivně snižovat povrchové napětí. Ze zástupců vysokomolekulárních jsou to proteiny, lipoproteiny, polysacharidy, lipopolysacharidy, rhamnolipidy, trehalolipidy a sophorolipidy. Tyto vysokomolekulární látky se těsně vážou na povrch (Ron a Rosenberg 2001). 14

21 Glykolipidy Jsou sacharidy v kombinaci s alifatickými kyselinami s dlouhými řetězci nebo hydroxyalifatickými kyselinami (Muthusamy a kol. 2008). Mezi nejznámější a zároveň nejúčinnější glykolipidy patří rhamnolipidy produkované rodem Pseudomonas sp., trehalolipidy u mykobakterií a sophorolipidy kvasinek (Cameotra a Makkar 2004). Lipopeptidy a lipoproteiny Jsou složeny z lipidů připojených k polypeptidovému řetězci. Na obrázku 3 je příklad chemické struktury lipopeptidu surfaktinu produkovaném bakterií Bacillus subtilis. Obr. 3: Surfaktin; upraveno podle Banat a kol Fosfolipidy a neutrální lipidy Bakterie Nocardia erythropolis produkuje biosurfaktanty během růstu na alkanech. Tyto biosurfaktanty jsou nejčastěji (z 90 %) tvořeny právě neutrálními lipidy (Macdonald a kol. 1981). Polymerní látky Mezi polymerní biosurfaktanty se řadí alasan, emulsan, liposan a další látky složené z komplexu polysacharid protein (Muthusamy a kol. 2008). 15

22 Syntéza biosurfaktantů Biosurfaktanty mají hydrofobní a hydrofilní část. Obecně platí, že hydrofobní část je buď mastná kyselina s dlouhým řetězcem, hydroxy-mastná kyselina nebo α- alkyl-ß-hydroxy mastná kyselina. Hydrofilní část molekuly pak např. uhlohydrát, aminokyselina, cyklický peptid, fosfát, karboxylová kyselina, alkohol a další. Do syntézy obou částí je zapojeno několik metabolických drah využívajících řady enzymů. Uplatňují se zde například regulační enzymy (Desai a Desai 1993). Možnosti syntézy biosurfaktantů mohou být následující: 1. De novo syntéza hydrofilní a hydrofobní části dvěma nezávislými cestami a jejich následné spojení do kompletní molekuly biosurfaktantů. 2. De novo syntéza hydrofilní části molekuly a substrát dependentní syntéza hydrofobní části molekuly a jejich spojení 3. De novo syntéza hydrofobní části molekuly a substrát dependentní syntéza hydrofilní části molekuly a jejich spojení (Desai a Desai 1993) Mechanismus působení Biosurfaktanty mohou interagovat s fázovým rozhraním a ovlivňovat adhezi a odtržení bakterií. Interakce surfaktantu s povrchem buňky a pevným substrátem závisí na chemických vlastnostech surfaktantu a povrchové energii buněk a substrátu. Produkce surfaktantů vede ke změně mezifázové volné energie buňky a povrchu pevného substrátu. Mikroorganismy adherují nebo naopak odpojují v závislosti na volné energii adheze. Pokud je volná energie adheze negativní, dochází k adherenci mnoha buněk. Pokud se však volná energie blíží do pozitivních hodnot, k adherenci nedochází (Kosaric 1993). Vliv biosurfaktantů na adhezi patogenů byl prostudován u řady mikroorganismů. Biosurfaktant syntetizovaný kmenem Lactobacillus rhamnosus CCM 1825 byl schopen inhibovat adhezi patogenní bakterie Klebsiella pneumoniae (Golek a kol. 2007). Také další vybrané druhy laktobacilů, Lactobacillus acidophilus a Lactobacillus fermentum, jsou díky produkci biosurfaktantů schopny snižovat adherenci, v tomto případě uropatogenní bakterie Enterococcus faecalis (Velraeds a kol. 1996b). Snížení mikrobiální adheze může mít řadu výhod např. v medicíně a průmyslu, a to pro odtržení mikroorganismů z pevných podkladů. Pro odtržení musí být volná 16

23 energie separace negativní. Volná energie separace může být pak ovlivněna změnami v mezifázové volné energii systému (Kosaric 1993) Produkce biosurfaktantů Biosurfaktanty jsou produkovány jako metabolické koprodukty různými bakteriemi, houbami a kvasinkami viz tabulka 4. Mohou být produkovány extracelulárně nebo jako součást buněčné stěny (Desai a Desai 1993). Mikroorganismus Biosurfaktant Zdroj Bacillus licheniformis lipopeptid (lichenysin G) Grangemard a kol Bacillus subtilis lipopetid (surfaktin) Fernandes a kol Brevibacterium casei glykolipid Kiran a kol Candida bombicola glykolipid (sophorolipid) Daverey a Pakshirajan 2010 Candida sphaerica polymerní látka (lunasan) Luna a kol Lactobacillus acidophilus polymerní látka (surlaktin) Velraeds a kol Lactobacillus casei glykoprotein Golek a kol Pseudomonas aeruginosa glykolipid (rhamnolipid) Reiling a kol Streptococcus thermophilus glykolipid Rodrigues a kol. 2006d Tsukamurella tyrosinosolvens glykolipid Langer a kol Tab. 4: Přehled produkce biosurfaktantů Produkce biosurfaktantů je ovlivněna řadou faktorů, jako je zdroj uhlíku, dusíku či vnějším prostředím. Z faktorů vnějšího prostředí hraje roli převážně teplota, ph či přítomnost kyslíku (Desai a Banat 1997). Produkce biosurfaktantů je také závislá na fázi růstového cyklu. Ve studii Velraeds a kol. (1996b) se autoři zabývali produkcí biosurfaktantů v různých růstových fázích buněk. Kultury obsahující laktobacily byly zpracovány po době kultivace 4 a 24 hodin. Výsledek ukázal výraznější snížení povrchového napětí u 24hodinové kultury, kde se buňky nacházely ve stacionární fázi 17

24 růstu. Růst buněk může být ovlivněn také růstovým médiem. Rodrigues a kol (2006a) studovali vliv jednotlivých složek MRS média, užívaného ke kultivaci laktobacilů, na jejich růst a produkci biosurfaktantů. Došli k závěru, že největší vliv na růst buněk měly pepton a laktóza. Použití laktózy namísto glukózy jako zdroje uhlíku vedlo ke zvýšené tvorbě biosurfaktantů Produkce biosurfaktantů probiotickými bakteriemi Produkce biosurfaktantů byla prokázána u řady mikroorganismů např. i mořského původu (Das a kol. 2009), ale také u probiotických druhů viz tabulka 5. Mikroorganismus Zdroj L. acidophilus (ATCC 4356 (typový kmen), RC14, T13) Velraeds a kol. 1996a L. casei 70 Velraeds a kol. 1996a L. casei subsp. casei ATCC 393 (typový kmen) Velraeds a kol. 1996a L. casei subsp. rhamnosus (ATCC 7469 (typový kmen), Velraeds a kol. 1996a GR1,81,36) L. fermentum (ATCC (typový kmen), ATCC 2371) Velraeds a kol. 1996a L. plantarum (ATCC 149, RC6, RC20) Velraeds a kol. 1996a Lactobacillus acidophilus RC 14 Velraeds a kol L. fermentum RC 14 Reid a kol Lactococcus lactis 53, Streptococcus thermophilus L. casei CECT 5275, L. rhamnosus CECT 288, L. pentosus CECT 4023, L. coryniformis subsp. torquens CECT Rodrigues a kol. 2006a Rodrigues a kol. 2006c L. helveticus 1181 Meylheuc a kol Lactobacillus casei 8/4 Golek a kol Tab. 5: Produkce biosurfaktantů probiotickými bakteriemi Velká část pozornosti výzkumu biosurfaktantů byla věnována např. Pseudomonas aeruginosa a její produkci rhamnolipidu (Reiling a kol. 1986), produkce biosurfaktantů však byla prokázána i u probiotických bakterií. Jedním z nejznámějších biosurfaktantů u 18

25 laktobacilů je surlaktin produkovaný bakterií L. acidophilus RC14. Pomocí naadsorbované vrstvy surlaktinu dochází k inhibici adsorpce vybraných uropatogenů, jako jsou Enterococcus faecalis a E. coli. (Velraeds a kol. 1997). Další z řady zástupců laktobacilů je L. casei produkující glykoprotein, který působí proti některým kmenům Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis a Micrococcus roseus (Golek a kol. 2009). Bioúprava povrchu z nerezu pomocí vrstvy biosurfaktantu bakterie L. helveticus 1181 vedla ke snížení kontaminace patogenní bakterie Listeria monocytogenes (Meylheuc a kol. 2006). Nejenom laktobacily, ale i laktokoky produkují biosurfaktanty. Např. kmen Lactococcus lactis 53 produkuje biosurfaktanty na bázi glykoproteinů (Rodrigues a kol. 2006b) Využití v medicíně Využití biosurfaktantů je značně široké. Zahrnuje potravinářský průmysl, zemědělství či životní prostředí. Co se týká životního prostředí, jsou biosurfaktanty využívány např. ke kontrole úniků ropy či obecně v bioremediacích, ať už se to týká čištění odpadních vod nebo kontaminovaných půd. Pro dobrou kompatibilitu s živými systémy a lehkou stravitelnost jsou využívány v kosmetickém a farmaceutickém průmyslu a jako funkční potravinářská aditiva (Kosaric 1992). Biosurfaktanty mají svou roli samozřejmě také v medicíně. Zde mohou být biosurfaktanty využity jako antimikrobiální agens, imunomodulační molekuly v genové terapii a ve vakcínách (Singh a kol. 2007). Co se týká antimikrobiálního působení, biosurfaktanty mohou působit na biofilm patogenních mikroorganismů. Rivardo a kol. zjistili, že biosurfaktanty bakterií Bacillus licheniformis a Bacillus subtilis jsou schopné potlačit biofilm patogenních bakterií jako je Escherichia coli a Staphylococcus aureus (Rivardo a kol. 2009). Kromě působení na bakteriální biofilm mohou biosurfaktanty působit i na mikroorganismy samotné. Biosurfaktant produkovaný bakterií Bacillus subtilis R14 dokázal inhibovat růst patogenních multirezistentních mikroorganismů. Větší inhibiční účinek byl pozorován u grampozitivních kmenů, především u Enterococcus faecalis, než u kmenů gramnegativních (Fernandes a kol. 2007). Biosurfaktanty se mohou kromě antimikrobiální aktivity vyznačovat i antivirovou aktivitou. V případě biosurfaktantu surfaktinu produkovaném bakterií Bacillus subtilis se ukázalo, že je schopen působit proti herpesvirům a retrovirům. Surfaktin nepůsobil na replikaci viru, ale dokázal 19

26 inaktivovat samotné viry ještě před jejich absorpcí a penetrací do hostitelské buňky (Vollenbroich a kol. 1997). Biosurfaktanty byly dále použity pro genové transfekce, jako ligandy pro vazbu imunoglobulinů, jako pomocné látky pro antigeny a také jako inhibitory tvorby fibrinových sraženin a aktivátory lýzy fibrinových sraženin. Kromě toho mají potenciál být používány jako látky bránící adhezi mikrobů u materiálů, které jsou zavedeny do těla člověka, čímž se může snížit riziko nemocničních infekcí a užívání syntetických preparátů. Mohou být také součástí probiotických přípravků k boji proti infekcím urogenitálního traktu a v plicní imunoterapii (Rodrigues a kol. 2006e) Detekce biosurfaktantů K detekci produkce biosurfaktantů různými mikroorganismy se využívá řada analytických metod, jak ukazuje tabulka 6. Analytické techniky Kvalitativní Kvantitativní Rychlost analýzy Přímé měření povrchového napětí ++ + min Drop collapse assay (test zhroucení kapky) ++ - min Mikrodestičkový test ++ - min Test penetrace ++ - min Oil spreading test (test šíření oleje) ++ - min Test emulgační aktivity + - d Solubilizace krystalického anthracenu + - d Test bakteriální adheze k uhlovodíkům + - min Hydrofóbní interakční chromatografie + - h Replica plate assay (razítkovací test) + - d Test agregace soli (vysolovací test) + - min CTAB agarový test + - d Test hemolýzy + - d Tab. 6: Metody screeningu biosurfaktantů; upraveno podle Walter a kol vysvětlivky: min...minuty, h...hodiny, d...dny 20

27 Cílem screeningu je najít nové biosurfaktanty s žádoucími fyzikálním a chemickými vlastnostmi, jako je silná povrchová aktivita, nízká kritická micelární koncentrace (CMC), vysoká kapacita emulze, dobrá rozpustnost a činnost v širokém rozmezí ph. Kromě toho je kladen důraz i na ekonomickou stránku. Důležité je tedy najít takové kmeny bakterií, které se vyznačují vysokou produkcí biosurfaktantů vysokými výnosy (Walter a kol. 2010) Přímé měření povrchového napětí Definice povrchového napětí říká, že je to síla, která se nachází na povrchu kapaliny a působí kolmo na jednotku délky povrchu fáze. Je to vlastně závislost povrchové energie kapaliny na jejím povrchu. Jednotkou povrchového napětí je N/m (Rosina a kol. 2006). Rovnice povrchového napětí: σ= Fp/l Fp.velikost povrchové síly, l délka okraje povrchové blány Povrchové napětí je ovlivněno řadou faktorů. Jedním z těchto faktorů je teplota. Je známo, že se rostoucí teplotou dochází k poklesu povrchového napětí, jak ukazuje tabulka 7 (Navrátil a kol. 2005). teplota ( C) σ (mn/m) teplota ( C) σ (mn/m) 5 74, , , , , , , , , ,82 Tab. 7: Povrchové napětí vody v závislosti na teplotě; upraveno podle Vargaftik a kol Mezi látky, které dokážou snížit povrchové napětí, řadíme i řadu biosurfaktantů. Dobré biosurfaktanty dokážou snížit povrchové napětí mezi vodou a vzduchem ze 72 na 35 mn/m. Biosurfaktanty se adsorbují na fázovém rozhraní mezi kapalinou a vzduchem. 21

28 Polární část biosurfaktantu je orientována do vodného prostředí a nepolární do plynného, díky tomu se pak povrch roztoku jeví jako nepolární a dochází ke snížení povrchového napětí. Povrchové napětí je tím nižší čím je větší koncentrace biosurfaktantů (Pouchlý a kol. 2008) Kritická micelární koncentrace (CMC) S rostoucí koncentrací surfaktantů dochází k poklesu povrchového napětí, dokud není dosaženo CMC, jak ukazuje obrázek 4. Obr. 4: Vliv závislosti povrchového napětí na koncentraci surfaktantu stanovení CMC Při CMC dochází k tvorbě různých agregátů, jako jsou micely, vesikly a lamely (Soberón-Chávez 2011). Micela je obvykle kulovitý útvar, tvořený obtížně rozpustitelnými částicemi, který je složený z polárních konců směřujících vně a nepolárních směřujících dovnitř (Vokurka a kol. 2009). Vesikly jsou útvary, které jsou obaleny jednou nebo větším množstvím dvouvrstvých membrán. Hydrofilní konce vedou ven z obalu jak z vnější, tak vnitřní strany vesiklu. Hydrofobní konce pak směřují dovnitř obalové membrány (Pouchlý 2008). Všechny tyto agregáty se tvoří v důsledku řady chemických interakcí mezi polární a nepolární částí surfaktantu (Soberón-Chávez 2011). Po dosažení hodnoty CMC již nelze detekovat zvýšení koncentrace biosurfaktantů. Z toho vyplývá, že dvě stejné kultury s odlišnými koncentracemi 22

29 biosurfaktantů, v množství vyšším, než je CMC, vykazují stejné povrchové napětí (Walter a kol. 2010). CMC není u všech surfaktantů stejná, je závislá jak na chemické struktuře surfaktantu, tak na fyzikálních podmínkách jako je teplota, nebo ph (Soberón- Chávez 2011). Co se týká chemické struktury biosurfaktantů, čím je delší uhlovodíkový řetězec tím je CMC nižší. Hodnota CMC je také ovlivněna koncentrací solí ve vodném prostředí. S jejich narůstající koncentrací CMC klesá (Pouchlý a kol. 2008). Pro přímé měření povrchového napětí existuje řada metod jako ADSAP, kroužková metoda, Wilhelmyho destičková metoda a stalagmometrická metoda. Wilhelmyho destičková metoda a stalagmometrická metoda využívané v diplomové práci jsou popsané v kapitole Metody. Kroužková metoda (Du Noüy) Kroužková metoda je založena na interakci platinového prstenu s testovaným povrchem. Prsten je ponořen pod rozhraní testovací kapaliny a následně zvedán nahoru. Se zvedáním prstenu se zvedá i meniskus zkoumané kapaliny až do fáze odtržení menisku a navrácení do výchozí pozice. Maximální povrchová síla nutná pro výpočet povrchového napětí je pak zaznamenána těsně před fází odtržení (Biolin Scientific 2011). Bustos se svými kolegy využil této metody pro stanovení produkce intracelulárního biosurfaktantu u bakterie L. pentosus (Bustos a kol. 2007). ADSA P (Axisymmetric Drop Shape Analysis by Profile) ADSA P je metoda analýzy profilu kapky, která využívá počítače. Výhodou je, že je k samotnému měření potřeba pouze malé množství vzorku, lze ho použít i za extrémních podmínek, jako je zvýšený tlak či teplota a umožňuje stanovení již velmi nízkých hodnot napětí (Bartovská a Šišková 2005). Základem této metody je to, že tvar kapky kapaliny závisí na jejím povrchovém napětí. Nižší povrchové napětí způsobí odchýlení od typického kulovitého tvaru (Walter a kol. 2010). 23

30 Některé další metody K měření povrchové aktivity se kromě přímého měření povrchového napětí využívají i další metody. Mikrodestičkový test Tato metoda umožňuje kvalitativní stanovení povrchové aktivity jednotlivých kmenů. Je založena na změně v optickém zakřivení, kterou způsobují surfaktanty ve vodném roztoku. Využívá se mikrotitrační destičky v jejíchž důlcích má samotná voda rovný povrch. Přítomnost surfaktantu má za následek smáčení na okrajích důlku a povrch již není rovný (Walter a kol. 2010). CTAB (cetyltrimethylammonium bromid) agarový test Tato metoda je vhodná především pro detekci extracelulárních glykolipidů a jiných aniontových sufraktantů. Je založena na kultivaci testovaných kmenů na speciálním agaru světlomodré barvy, obsahujícím kationtový surfaktant CTAB a metylenovou modř. V případě produkce biosurfaktantů se vytvoří tmavě modrý efekt jako výsledek spojení s CTAB a metylenovou modří (Walter a kol. 2008). Test hemolýzy Základem této metody je fakt, že biosurfaktanty mohou lyzovat erytrocyty (Walter a kol. 2010). Na krevní agar je nanesen příslušný vzorek a po následné kultivaci je odečtena vzniklá zóna. Průměr zóny je určen koncentrací biosurfaktantů. Ve studii Rodrigues a kol. (2006c) byly touto metodou testovány jednotlivé kmeny laktobacilů a vytvořené zóny byly hodnoceny následně: žádná hemolýza + nekompletní hemolýza ++ kompletní hemolýza s průměrem lyze <1 cm +++ kompletní hemolýza s průměrem lyze 1 až 3 cm ++++ kompletní hemolýza s průměrem lyze > 3 cm a zelenými koloniemi 24

31 3. CÍL PRÁCE Cíle diplomové práce lze shrnout do následujících bodů: Otestovat, jestli vybrané probiotické kmeny tvoří biofilm a podmínky, které tuto tvorbu ovlivňují. Pomocí vybraných metod zjistit produkci biosurfaktantů u probiotických kmenů. Otestovat vliv supernatantu vybraných kmenů laktobacilů, obsahující biosurfaktanty na tvorbu biofilmu u vybraných střevních patogenních bakterií. 25

32 4. MATERIÁL A METODY Použité mikroorganismy A, probiotické kmeny: Kmeny ze Sbírky mlékařských mikroorganizmů Laktoflora (Tábor): Bifidobacterium lactis CCDM 94 Lactobacillus V-4AP Lactobacillus RL-28-P Lactobacillus acidophilus CCDM 151 Lactobacillus acidophilus CCDM 197 Lactobacillus delbruckei CCDM 707 Lactobacillus fermentum CCDM 190/03 Lactobacillus fermentum RL-23-P Lactobacillus helveticus CCDM 62 (RL-20-P) Lactobacillus paracasei CCDM 211 Lactobacillus paracasei/casei CCDM 50/03 Lactobacillus paracasei/casei CCDM 818/03 Lactobacillus paracasei/casei RL-21-P Lactobacillus plantarum CCDM 182/01 Lactobacillus plantarum CCDM 375 (RL-26-P) Lactobacillus plantarum CCDM 383/01 Lactobacillus plantarum CCDM 391/C1 Lactobacillus rhamnosus CCDM 579/02 Lactobacillus rhamnosus CCDM 150/03 Lactobacillus rhamnosus CCDM 598 T Lactobacillus salivarius CCDM 216 Lactococcus lactis subsp. lactis CCDM 478 Lactococcus lactis subsp. lactis CCDM 642 Streptococcus thermophilus CCDM 150 Streptococcus thermophilus CCDM

33 Kmeny z České sbírky mikroorganismů (Brno): Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088 T Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7089 Lactobacillus fermentum CCM 7192 T Lactobacillus helveticus CCM 7193 T Lactobacillus plantarum CCM 7039 T Lactobacillus rhamnosus CCM 1825 T B, neprobiotický kmen Kmen z České sbírky mikroorganismů (Brno) Lactobacillus acidifarinae CCM 7240 T C, patogenní mikroorganismy Klinické izoláty vybraných střevních patogenních bakterií pacientů Fakultní nemocnice u sv. Anny v letech Kultivační média a roztoky Roztoky pro barvení buněk podle Grama Etanol Gramovo barvivo Lugolův roztok Safranin BHI bujón (HIMEDIA) Telecí mozková infuze Hovězí srdcová infuze Proteosový pepton Chlorid sodný Hydrogenfosforečnan sodný Dextrosa 200 g/l 250 g/l 10 g/l 5 g/l 2,5 g/l 2 g/l 27

34 Endův agar (OXOID) Pepton Fosforečnan draselný Laktosa Siřičitan sodný Agar 10.0 g/l 3.5 g/l 10.0 g/l 2,5 g/l 10 g/l Fyziologický roztok Chlorid sodný Destilovaná voda 0,9 g 100 ml Hajna (IMUNA) Pepton Masový extrakt Kvasničný autolyzát Laktosa Sacharosa Glukosa Chlorid sodný Červeň fenolová Citronan železito-amonný Tiosíran sodný Agar 20 g/l 3 g/l 3 g/l 10 g/l 10 g/l 1 g/l 5 g/l 0,024 g/l 0,3 g/l 0,3 g/l 12 g/l Krevní agar (Oxoid) Speciální pepton Škrob Chlorid sodný Agar 23,0 g/l 1,0 g/l 5,0 g/l 10,0 g/l Lactobacillus MRS broth (HIMEDIA) Proteosový pepton Hovězí extrakt Kvasniční extrakt 10 g/l 10 g/l 5 g/l 28

35 Dextrosa Polysorbát 80 Citran amonný Octan sodný Síran hořečnatý Síran manganatý Hydrogenfosforečnan draselný 20 g/l 1 g/l 2 g/l 5 g/l 0,1 g/l 0,05 g/l 2 g/l MRS BROTH (DE MAN, ROGOSA, SHARPE) (OXOID) Pepton 10 g/l Lab-Lemco prášek 8 g/l Kvasniční extrakt 4 g/l Sorbitan monooleát 1 ml Citrát amonný 2 g/l Acetát sodný 3H2O 5 g/l Síran hořečnatý 7H2O 0,2 g/l Síran manganatý 4H2O 0,05 g/l Hydrogenfosforečnan draselný 2 g/l MRS agar MRS bujon+ agar 1g na 100 ml TSB (OXOID) Chlorid sodný Glukosa Trypton Pepton ze sojových bobů Hydrogenfosforečnan draselný * obsahuje papain 5 g/l 2,5 g/l 17 g/l 3 g/l 2,5 g/l Šikmý agar Columbia Blood Agar Base bez krve 29

36 4. 3. Přístroje a pomůcky Anaerobox (TRIGON PLUS) Biohazard box Clean Air (Schoeller Instruments) Centrifuga MPW-380/380R (MPW Med. Instruments) Centrifuga Genofuge 16M (Techne) Čtečka mikrotitračních desek Labsystems Multiskan RC Inkubátor CO2 SANYO (Schoeller Instruments) Laboratorní váhy Sartorius Excellence (Sartorius AG) Lednice (Calex) Měřič zákalu DENSILAMETER-II (Emo) Světelný mikroskop Olympus BX50 Mrazicí box Sanyo (Schoeller Instruments) Spektrofotometr Stalagmometr Teploměr Tenziometr KRÜSS K9-ES (KRÜSS) Třepačka Heidolph Titramax 101 (Heidolph Instruments GmbH & Co. KG) Skleněné a plastové pomůcky, bakteriologické kličky, pipety, kahan Váha přenosná Ohaus CS200 (Ohaus Corporation) Uchovávání kmenů Kmeny probiotických bakterií byly krátkodobě uchovávány v lednici na MRS agaru, pro dlouhodobé uchovávání byly zamraženy v glycerolserovém bujonu při -70 C. Kmeny patogenních bakterií byly uchovávány v lednici na šikmém agaru. 30

37 4. 5. Metody Mikroskopie probiotických kmenů Bakteriální kmeny byly kultivovány 24h při 37 C na MRS médiu. Následně byl z každého kmene proveden nátěr na podložní sklo a po zaschnutí tepelně fixován. Takto připravené vzorky byly barveny dle Grama, pozorovány mikroskopem a vyfotografovány pomocí softwarového systému pro analýzu obrazu (LUCIA) Určování patogenních mikroorganismů Rozlišení nefermentujících a fermentujících střevních bakterií pomocí Hajnovy a Endovy půdy a následné podrobení fermentujících bakterií Enterotestu Test fermentace na Hajnově půdě a Endově agaru Pro stanovení fermentace glukózy a laktózy, produkce plynu a sirovodíku byla použita Hajnova půda. Pokud bakterie produkuje sirovodík, projeví se to černým zbarvením půdy. Pokud je laktóza či glukóza pozitivní vede to ke změně zabarvení části půdy z červené na žlutou. U laktóza-pozitivních bakterií dochází k zežloutnutí celého sloupce fermentují glukózu i laktózu. Na rozdíl od laktóza-negativních bakterií, kdy vrchní část sloupce je červená nefermentují laktózu a spodní část sloupce žlutá fermentují glukózu. V případě nefermentujících bakterií je celá Hajnova půda červená. Pro stanovení fermentace laktózy byl použit Endův agar. Laktóza-pozitivní mikroorganismy na této půdě rostou tmavě růžově, laktóza-negativní světle. Mikroorganismy byly naočkovány na jednotlivé půdy a byly kultivovány 24 h při 37 C. Následovalo vyhodnocení Enterotest 16 (PLIVA Lachema) Enterotest 16 je test, který se používá k druhovému určení bakterií čeledi Enterobacteriaceae. Patogenní střevní bakterie byly kultivovány 24 hodin na krevním agaru. Z jednotlivých vzorků 24 hodinové kultury byla připravena suspenze buněk o zákalu 1 dle McFarlanda. Suspenze pak byla pipetována do jednotlivých jamek Enterotestu a příslušné jamky zakapány parafínem. Proběhla kultivace 24 h při 37 C. Následovalo přidání činidel a vyhodnocení pomocí identifikačního programu TNW 31

38 Lite-CU verze č. 4.0 (PLIVA Lachema). Protože se práce zaměřovala na tvorbu biofilmu u střevních patogenů, pracovala jsem dále jen s rody Proteus, Citrobacter a Salmonella Tvorba biofilmu Pro detekci tvorby biofilmu byla použita Christensonova metoda v mikrotitračních destičkách. 24hodinová kultura byla naočkována do vybraného média, aby zákal odpovídal stupni 1 dle McFarlanda (McF). Do každého důlku bylo napipetováno 180 µl média a 20 µl média s bakteriemi. Jako negativní kontrola sloužilo 200 µl sterilního média. Následně se destička kultivovala 24 h (příp. 48 h) při 37 C. Po kultivaci byla destička 3x promyta vodou a usušena v termostatu přes noc. Adherovaná vrstva biofilmu byla barvena krystalovou violetí po dobu 15 minut, důkladně promyta vodou a nechala se volně uschnout viz obrázek 5. Obr. 5: Obarvený biofilm v mikrotitrační destičce IT Pro kvantifikaci biofilmu bylo použito měření optické denzity jednotlivých důlků destičky pomocí spektrofotometru při použití dvou filtrů 595 nm a 690 nm. Pro porovnání výsledků schopnosti tvořit biofilm byly použity následující parametry: ODc < OD 2xODc slabý producent (+) 2xODc < OD 4xODc střední producent (++) 4xODc < OD silný producent (+++) ODc= průměrná OD negativních kontrol+ 3x směrodatná odchylka negativních kontrol (Stepanović a kol. 2007). 32

39 U probiotických bakterií byl stanoven vliv různých kultivačních podmínek na tvorbu biofilmu. Byla porovnávána délka kultivace, závislost na kultivačním médiu a závislost na kyslíku. Při aerobní kultivaci byla mikrotitrační destička kultivována v komorovém termostatu. Pro anaerobní kultivaci byl použit anaerobní box (TRIGON PLUS) a pro kultivaci v 5% CO2 byl použit inkubátor CO2 SANYO (Schoeller Instruments) Oil spreading test Princip této metody je založen na schopnosti biosurfaktantů měnit kontaktní úhel na rozhraní voda - olej (Morikawa a kol. 1993). K měření povrchové aktivity lze použít např. motorový olej. Tento olej je nalit na povrch destilované vody v Petriho misce tak, aby vznikla tenká membrána. Do středu se pak kápne supernatant bakteriální kultury. Pokud je v supernatantu přítomný biosurfaktant dojde, v olejové vrstvě k vytvoření pročištěné zóny (viz obrázek 6), která je následně změřena (Rivardo a kol. 2009). Obr. 6: Vytvořená zóna IT Příprava vzorku Jednotlivé probiotické kmeny byly naočkovány do 10 ml MRS bujonu, tak aby zákal jednotlivých vzorků byl stejný. Následovala kultivace 24 h aerobně při 37 C. Buněčná kultura byla podrobena oil spreading testu. Následně byla kultura centrifugována ( otáček, 5 minut). Vzniklý supernatant byl podroben oil spreading testu. Buňky byly promyty v PBS a rozpuštěny v PBS a znovu změřeny oil spreading metodou. Poté byly buňky v PBS mírně třepány po dobu 2 hodin. Po 2 hodinách byl vzorek znovu změřen a centrifugován a supernatant byl podroben testu. 33

40 Provedení testu Samotný test vychází z Morikawa a kol. (1993). Petriho misky byly naplněny 30 ml destilované vody. Na vodní hladinu bylo naneseno 10 µl motorového oleje, tak aby vznikla tenká vrstva. Následovalo přikápnutí 10 µl testovaného vzorku a měření vzniklé zóny. Testování každého vzorku bylo prováděno ve 2 opakováních Měření povrchového napětí Probiotické bakterie mohou produkovat biosurfaktanty, které se vyznačují snížením povrchového napětí. K měření povrchového napětí se užívá řada metod využívající například tenziometry a stalagmometry Příprava vzorku Pro stanovení extracelulární produkce biosurfaktantů bylo 350 ml MRS bujonu naočkováno 15 ml 24 hodinové kultury. Následovala kultivace při 37 C, 24 h za třepání (cca 120 rpm). Po kultivaci byla buněčná kultura centrifugována ( otáček, 5 minut, 15 C) a vzniklý supernatant byl použit pro měření povrchového napětí. Počet buněk byl stanoven plotnovou metodou. Jednotlivé kmeny byly kultivovány v MRS médiu, jak je popsané výše. Po kultivaci následovalo odebrání vzorku 100 µl kultury, který byl zředěn v 900 µl fyziologického roztoku. Byla připravena ředící řada 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 a Ředění 10-4, 10-5 a 10-6 byla pomocí hokejky rozetřena na misky s MRS agarem. Každému ředění odpovídalo troje opakování. Proběhla kultivace při 37 C. Po 48 (příp. 24) hodinách byly odečteny vzniklé kolonie Stalagmometrická metoda Stalagmometrická metoda je metodou srovnávací, která je založena na určení hmotnosti kapky, která vytéká ze stalagmometrické trubice (viz obrázek 7). Využívá se jako srovnávací metoda. Jako srovnávací kapalina se používá voda. Pokud známe hodnoty hmotnosti a povrchového napětí srovnávací kapaliny (r), lze pak vypočítat povrchové napětí námi zkoumaného vzorku pomocí následující rovnice: σ / σ r = m / m r 34

41 Před začátkem samotného měření je nutné ověřit teplotu vzorku i srovnávací kapaliny, aby rozdíl teplot nebyl větší než 0,5 C. Zkoumaný vzorek je naléván do stalagmometrické trubice a vznikající kapky jsou odchytávány do předem zvážené váženky. Po odkapání 50 kapek následuje zvážení váženky a stanovení skutečné hmotnosti 50 kapek tak, že se od hmotnosti váženky s 50 kapkami odečte hmotnost prázdné váženky. Pro výpočet povrchového napětí použijeme hodnoty získané měřením srovnávací kapaliny sterilní destilované vody (r). Jako kontrola slouží MRS médium. Obr. 7: Stalagmometr IT Wilhelmyho destičková metoda Tato metoda využívá přístroje tenziometru (viz obrázek 8). Je založena na kontaktu testovaného vzorku s platinovou destičkou o délce l, přičemž je měřena maximální síla (F max ), která působí na destičku při jejím odtržení od vodní hladiny. Povrchové napětí je pak dáno: σ= F max /2l Při samotné měření je namočena celá destička v testovaném vzorku a poté se pomocí motoru pomalu sjíždí dolů a je odečtena nejvyšší hodnota odpovídající povrchovému napětí. 35

42 Obr. 8: Tenziometr IT Vliv biosurfaktantů na biofilm střevních patogenů Probiotický kmen Lactobacillus rhamnosus CCDM 598 T byl kultivován v 15 ml MRS bujonu a následně byla kultura tohoto vzorku přelita a inkubována v 350 ml MRS bujonu. Počet buněk byl stanoven plotnovou metodou. Vzorek byl centrifugován (10 000, 5 minut, 15 C), část supernatantu byla ponechána a zbylá část byla zředěna BHI bujonem s 4 % glukózy v poměru 60:40 a 80:20. Střevní patogenní bakterie rodu Citrobacter, Proteus a Salmonella byly kultivovány 24 hodin při 37 C na krevním agaru. K testování vlivu biosurfaktantů na biofilm střevních patogenů byl využit test v mikrotitračních destičkách. Testování bylo provedeno 2 různými způsoby: 1. Jednotlivé kmeny byly naočkovány do BHI bujónu s 4 % glukózy, tak aby zákal odpovídal 1 McF. Jednotlivé důlky mikrotitrační destičky byly naplněny 180 µl zředěného supernatantu z laktobacilů a 20 µl střevních patogenních kmenů v BHI s 4 % glukózy. 2. Jednotlivé důlky mikrotitračních destiček byly naplněny 300 µl 100% supernatantu a nechány v ledničce přes noc. Supernatant byl vylit a následně byly jednotlivé důlky naplněny 180µl BHI s 4 % glukózy a 20 µl kultury střevních patogenních kmenů v BHI s glukózou o zákalu 1 McF. Vyhodnocení probíhalo stejným způsobem jako v kapitole Tvorba biofilmu. 36

43 5. VÝSLEDKY Mikroskopie Bakterie rodu Lactobacillus se barví grampozitivně. Výsledné zbarvení odpovídá modrofialové. Všechny kmeny byly pozorovány pod imerzním olejem při zvětšení 1000x. Ukázkové fotografie vybraných kmenů laktobacilů jsou zobrazeny níže ( IT), zbytek fotografií je možno nalézt v kapitole Přílohy. Lactobacillus rhamnosus CCDM 150 Lactobacillus rhamnosus CCM 1825 T Lactobacillus plantarum CCM 7039 T Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088 T Lactobacillus fermentum CCM 7192 T Lactobacillus acidifarinae CCM 7240 T 37

44 5. 2. Určování patogenních mikroorganismů Celkem bylo otestováno 83 kmenů střevních patogenních bakterií, z toho 7 kmenů byly nefermentující pseudomonády, které byly pro další testy vyloučeny. Podíl jednotlivých fermentujících bakterií identifikovaných Enterotestem 16 ukazuje graf 1. Nejčastějším zástupcem rodu Proteus byl Proteus vulgaris (87 % kmenů) a v menší míře pak Proteus mirabilis (17 % kmenů). Z rodu Citrobacter byl nejčastěji identifikovaným kmenem Citrobacter freundii (5 5%) a ze zástupců salmonel pak Salmonella serovar 1 (72 %). Kromě zmíněných 3 rodů bakterií Salmonella, Citrobacter a Proteus, byly identifikovány i zástupci druhů Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakei, Yersinia enterolytica a další, které jsou v grafu shrnuty pod termínem Ostatní. Graf 1: Zastoupení jednotlivých mikroorganismů ze vzorků stolice Tvorba biofilmu Při stanovování vlivu různých faktorů na tvorbu biofilmu byl pro statistické vyhodnocení používán program STATISTICA (verze Statistica 9.1 cz). Testy byly posuzovány na hladině významnosti P = 0,05. 38