UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 2. LÉKAŘSKÁ FAKULTA Oddělení krevní banky ve FN Motol Martina Šámalová Analýza autotransfuzí provedených ve FN Motol Bakalářská práce Praha 2012

2 Autor práce: Martina Šámalová Vedoucí práce: MUDr. Eva Linhartová Oponent práce: MUDr. Žaneta Závadová Datum obhajoby:

3 Bibliografický záznam Šámalová, Martina.. Praha: Karlova univerzita, 2. Lékařská fakulta, Oddělení krevní banky ve FN Motol, s. Vedoucí bakalářské práce MUDr. Eva Linhartová

4 Anotace Teoretická část této bakalářské práce zahrnuje informace spojené s autologními odběry, výrobou autologních transfuzních přípravků a jištění jakosti u autotransfuzí, také základní informace o krevních skupinách, které jsou nedílnou součástí transfuzní medicíny. Praktická část je rozčleněna do tří hlavních bodů. První část se podrobněji zabývá problematikou krevních odběrů pro autotransfuzi a vyšetřením spojených s autologní krví. Druhá část obsahuje statistické údaje o autotransfuzích provedených v Oddělení krevní banky ve FN Motol. Zkoumá množství odebraných a expirovaných transfuzních přípravků u pacientů indikovaných k odběru autologní krve z oddělení ortopedie a to u operací: totální endoprotéza kyčelního a kolenního kloubu a z oddělení urologie před operacemi prostaty a přeměny pohlaví z mužského na ženské. Třetí část je tvořena kontrolou kvality a jištěním jakosti autologních transfuzních přípravků. Praktická část vychází ze statistických podkladů poskytnutých Oddělením krevní banky ve FN Motol za rok 2011 Klíčová slova autotransfuze, transfuze, erytrocyty, trombocyty, leukocyty, plazma, krevní skupiny

5 Annotation The theoretical part of the bachelor s thesis includes information connected with the autologous taking, the production of the autologous transfusion preparations and the protection of quality of the autotransfusion, also basic information about blood groups, which are the integral part of the transfusion medicine. The practical part is divided into three main parts. The first part deals in more detail with the issue of blood taking for autotransfusion and with the examination connected to autologous blood. The second part contains the statistical figures about the autotransfusions carried out in the Blood Bank Department of FN Motol. It examines the quantity of taken and expired transfusion preparations of patients indicated for the autologous blood taking from the orthopaedics department in total knee and hip joint endoprosthesis and from the urology department of pacients before prostate operations and transformation of gender from male to female. The third part consists of the quality control and the protection of quality of the autologous transfusion preparations. The practical part is based on statistical materials provided by the Blood Bank Department of FN Motol of the year Keywords autotransfusion, transfusion, erythrocytes, trombocytes, leukocytes, plasma, blood groups

6 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci zpracovala samostatně pod vedením MUDr. Evy Linhartové, uvedla všechny použité literární a odborné zdroje a dodržovala zásady vědecké etiky. Dále prohlašuji, že stejná práce nebyla použita pro k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze Martina Šámalová

7 Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat MUDr. Evě Linhartové za cenné rady a připomínky. Dále bych chtěla poděkovat prim. MUDr. Květoslavě Petrtýlové a personálu z Oddělení krevní banky ve FN Motol.

8 Obsah SEZNAM ZKRATEK... 5 SEZNAM OBRÁZKŮ... 6 SEZNAM TABULEK... 7 ÚVOD... 8 TEORETICKÁ ČÁST DEFINICE AUTOTRANSFUZE HISTORIE AUTOTRANSFUZE VÝHODY AUTOTRANSFUZE NEVÝHODY AUTOTRANSFUZE METODY AUTOTRANSFUZE Předoperační autologní odběr (PAO) Akutní normovolemická hemodiluce (ANH) Perioperační sběr krve (PSK) PODMÍNKY PRO AUTOTRANSFUZI Indikace autotransfuze Relativní kontraindikace autotransfuze Nutnost zvýšené pozornosti u autotransfuzí Absolutní kontraindikace autotransfuze Věk pacienta Hodnota hemoglobinu Krevní tlak Tělesná teplota VYŠETŘENÍ KRVE KREVNÍ SKUPINY A SKUPINOVÉ SYSTÉMY AB0 systém Význam AB0 systému Rh systém Význam Rh systému ODBĚR AUTOTRANSFUZNÍHO PŘÍPRAVKU Pomůcky potřebné při odběru plné krve, nebo jejích složek Odběr plné krve Odběr a výroba jednotlivých složek krve Výhody aferézy Nevýhody aferézy ERYTROPOETIN U AUTOTRANSFUZÍ Význam erytropoetinu SUBSTITUCE ŽELEZA U AUTOTRANSFUZÍ ZPRACOVÁNÍ TRANSFUZNÍCH PŘÍPRAVKŮ Zabránění koagulace Konzervační roztoky Stabilizační roztoky Kryokonzervace ZPRACOVÁNÍ PLNÉ KRVE Centrifugace plné krve Separace plné krve na jednotlivé složky Deleukotizace Kryoprecipitace Promytí buněčných složek krve Zmrazování plazmy... 32

9 1.14 KONTROLA JAKOSTI PLNÁ KREV (PK) Mikroagregátové filtry CÍLE PRÁCE PRAKTICKÁ ČÁST POSTUP PŘED ODBĚREM AUTOTRANSFUZE Vyšetření transfuzním lékařem ODBĚR PLNÉ KRVE PRO AUTOTRANSFUZI Ošetření místa venepunkce Provedení odběru Ukončení odběru plné krve VYŠETŘENÍ KRVE Vyšetření krevní skupiny AB0 Rh/D zkumavkovou metodou Screening antierytrocytárních protilátek ANALÝZA AUTOTRANSFUZÍ Analýza odběrů autotransfuzí k plánovaným ortopedickým operacím Analýza odběrů autotransfuzí k plánovaným urologickým operacím JIŠTĚNÍ JAKOSTI A KONTROLA KVALITY VE FN MOTOL Zajištění infekčních markerů Vyšetření volného hemoglobinu Vyšetření celkového hemoglobinu Vyšetření sterility autologních transfuzních přípravků Bakteriologické vyšetření stěrů z kůže Stěry z prostředí k bakteriologickému vyšetření Dokumentace výsledků vyšetření ZÁVĚR REFERENČNÍ SEZNAM... 57

10 Seznam zkratek 2,3 DPG 2,3 difosfoglycerát NAT nepřímý antiglobulinový test PAT přímý antiglobulinový test TEP totální endoprotéza AB0/RhD AB0 systém a Rh systém

11 Seznam obrázků Obrázek 1. Graf procentuálního rozdělení odběrů u mužů, žen a dětí str. 45 Obrázek 2. Graf znázorňující rozložení počtu odběrů podle oddělení str. 45 Obrázek 3. Graf znázorňující druhy ortopedických operací s rozdělením podle pohlaví str. 48 Obrázek 4. Graf odebraných a expirovaných transfuzních přípravků u urologických operací str. 52 Obrázek 5. Graf odebraných a expirovaných transfuzních přípravků u vybraných diagnóz str. 53

12 Seznam tabulek Tabulka 1. Příklady nejběžnějších genotypů a fenotypů v systému AB0 str. 21 Tabulka 2. Krevní skupiny, jejich aglutinogeny a aglutininy str. 21 Tabulka 3. Charakteristika plné krve str. 34 Tabulka 4. Požadované parametry plné krve str. 34 Tabulka 5. Antierytrocytární protilátky- přehled nejdůležitějších vlastností str. 43 Tabulka 6. Rozdělení počtu dárců dle pohlaví a oddělení str. 44 Tabulka 7. Počty použitých vaků podle jejich objemů str. 46 Tabulka 8. Rozdělení 1. a 2. odběru podle druhu operace a pohlaví str. 47 Tabulka 9. Výčet odběrů pro ortopedické oddělení v procentech dle druhu operace a pohlaví str. 48 Tabulka 10. Rozdělení expirovaných transfuzních přípravků z 1. a 2. odběru podle druhu operace a pohlaví str. 49 Tabulka 11. Výčet expirovaných transfuzních přípravků v procentech dle druhu operace a pohlaví str. 50 Tabulka 12. Rozdělení odběru podle druhu operace str. 51 Tabulka 13. Rozdělení expirace odběru podle druhu operace str. 51 Tabulka 14. Výčet odebraných a expirovaných transfuzních přípravků v procentech podle druhu operace str. 52

13 Úvod Důležitou součástí léčebných postupů je účelná hemoterapie, která v současné době disponuje celou řadou transfuzních přípravků a krevních derivátů. Cílem účelné hemoterapie je dosáhnout co největšího léčebného účinku a co nejméně poškodit příjemce. [1, s. 7] Transfuzní přípravky jsou vyráběny na transfuzních odděleních. K jejich přípravě se využívá lidská krev získaná od dobrovolných dárců a patří mezi ně například erytrocyty bez buffy-coatu (EB), erytrocyty deleukotizované (ED), erytrocyty resuspendované bez buffy-coatu (EBR), erytrocyty resuspendované deleukotizované (ERD, EBRD), erytrocyty kryokonzervované (EK), mražená plazma, trombocytární přípravky a granulocytární přípravky. U těchto přípravků, i přes všechna bezpečnostní opatření, hrozí riziko přenosu infekčního onemocnění nebo potransfuzní reakce. Do této skupiny patří také plná krev, která se využívá pouze pro autotransfuze. Autologní transfuze jsou pro pacienta velmi výhodné, protože nehrozí přenos infekčních chorob, není zde riziko aloimunizace a imunosuprese. [1, s. 7] Dalšími využívanými léčebnými přípravky jsou krevní deriváty, které jsou vyrobené z plazmy technologiemi farmaceutického průmyslu a procházejí během zpracování různými postupy například inaktivací virů. Tyto přípravky zahrnují například fibrinogen, albumin, koncentráty faktorů VIII a IX, koncentrát faktorů protrombinového komplexu, AT III a další. [1, s. 7] To, že je krev velmi důležitá, si lidé uvědomovali již ve starověku. V této době bylo oblíbenou léčebnou metodou pouštění žilou, které mělo odstranit z těla všechny škodlivé látky. [3, s. 2] V roce 1616 objevil Angličan William Harvey krevní oběh, což bylo velkým přínosem pro budoucnost krevních transfuzí. Od tohoto objevu proběhlo mnoho pokusů o transfuzi krve například mezi psy, nebo z berana na člověka, ale kvůli nevalným výsledkům byly další pokusy zakázány v Anglii, Francii i v Itálii. [3, s. 2] V roce 1818 se krevní transfuze vrátily do nemocnic a zasloužil se o to anglický profesor fyziologie a porodnictví James Blundell, který jako první provedl úspěšnou transfuzi krve. [3, s. 2] Podle dokumentace bylo během následujících 200 let referováno o 129 transfuzích, z nichž úspěšných byla přibližně jen jedna třetina. [3, s. 2; 12, s. 194] 8

14 Rozhodujícím přelomem v transfuzní medicíně bylo objevení krevních skupin v roce 1900 Karlem Landsteinerem. Tento mladý vídeňský patolog identifikoval 3 krevní skupiny A, B, C. Nezávisle na Karlu Landsteinerovi učinil stejný objev roku 1907 český lékař a psychiatr Jan Janský, který se od počátku své praxe na psychiatrii zabýval vztahem mezi aglutinací krve a duševními chorobami. Žádnou spojitost mezi nimi neprokázal, ale díky poznatkům při výzkumu objevil čtyři krevní skupiny I, II, III, IV, které byly později přejmenovány na A, B, AB a 0. Přestože už byly krevní skupiny známy, objevovaly se komplikace spojené s transfuzí krve, tento problém vyřešil opět Karl Landsteiner společně s Alexanderem Wienerem objevem Rh-systému. V pozdějších letech byly postupně popsány další skupinové systémy například Kell systém, Duffy systém, Kidd systém, MNSs a mnoho dalších. [3, s. 2-3] Autotransfuze jsou důležitou součástí používaných léčebných postupů. Pro pacienty mají mnoho výhod a jsou pro jejich organismus méně zatěžující než alogenní transfuze. Také je důležité, aby se tento léčebný postup dostal do povědomí pacientů, právě kvůli jeho výhodám. Teoretické část bakalářské práce se bude věnovat historii autotransfuzí, jejím výhodám i nevýhodám, výčtem druhů autotransfuzí, indikacemi a kontraindikacemi k tomuto léčebnému postupu, také se zaměří na způsob odběru, výrobu, skladování plné krve a jejích složek určených k autotransfuzím. Praktické části bakalářské práce se bude zabývat statistickými údaji o autotransfuzích, které byly provedeny ve Fakultní nemocnici Motol za rok Součástí práce bude průzkum odebraných a podaných autotransfuzí v závislosti na pohlaví druhu operace (urologické, ortopedické), součástí také bude výčet nepodaných autotransfuzí a autotransfuzí s pozitivními infekčními markery. 9

15 Teoretická část 1.1 Definice autotransfuze Autotransfuze neboli autologní transfuze znamená odběr pacientovi krve, nebo jejích složek před operací, nebo během operace a jejich zpětné navrácení do krevního oběhu. Tímto procesem se nahradí krevní ztráty během operace. 1.2 Historie autotransfuze V historii proběhlo mnoho pokusů o krevní transfuzi, ale většinou byly neúspěšné. Až od roku 1616 je možno hovořit o transfuzi v dnešním slova smyslu, a to právě díky objevu krevního oběhu. První historicky doložený převod krve provedl v roce 1665 anglický fyziolog Richard Lower mezi dvěma psy. Za otce transfuzí se považuje James Blundell, který léčil pomocí heterologní krve ženy umírající na masivní poporodní krvácení. Jako první provedl transfuzi krve dvěma rodičkám a jedna z nich přežila, datoval rok Na téma transfuze krve napsal v roce 1824 knihu, ve které zdůrazňuje, že člověku je možné podat pouze lidskou krev, také se zabýval technikou transfuze a vyrobil několik aparátů sloužících k tomuto účelu. [2, s. 9-10; 11, s. 71; 12, s. 194] Velký zlom v transfuzní medicíně přinesl rok 1886, a to provedením první historicky podložené autotransfuze Johnem Duncanem z Edinburgu, který nasbíral tři unce krve z amputované nohy pacienty, smísil je s fyziologickým roztokem a fosforečnanem sodným, tím zvětšil objem směsi, kterou po té retransfundoval pacientovi přes stehenní žílu. [12, s. 194] V roce 1914 v Německu M. J. Theissem byla úspěšně provedena transfuze krve během operace pacientky s rupturou mimoděložního těhotenství. V této době začal v Americe aplikovat lékař Lockwood autologní krve pacientům s Bantiho syndromem během splenektomie. [12, s ; 13, s. 296] Velmi důležitým rokem se stal rok 1921 díky prvnímu použití skladované autologní krve. [5, s. 7] V dalších letech byla tato metoda pro svou náročnost a také rozvojem krevních bank po celém světě (30. léta 19. století), které zajišťovaly dostatečné množství alogenní krve, téměř zapomenuta. Ale právě kvůli nedostatku autologní krve se tato metoda časem opět navrátila do nemocnic. [2, s ; 11, s. 71] 10

16 Vývoj v použití konzervované krve byl urychlen počátkem druhé světové války a snahou zajistit dostatečné zásoby krve pro raněné. [2, s. 13] Další úspěch s autologní krví slavil v 60. letech 20. století kardiochirurg Denton Cooley z Texasu, který provedl jako první operaci srdce bez podání alogenní krve. [11, s. 71] Velký rozvoj využití autologní krve byl zaznamenán v době války ve Vietnamu, kdy byl sestrojen první přístroj na autotransfuze Gerardem Klebanoffem, který tak započal rokem 1968 novou éru výrobou první komerčně dostupné autotransfuzní jednotky. Jeho přístroj zvaný Bentley Autotransfusion System odsával, shromažďoval a filtroval krev přímo z operačního pole, takto upravená krev byla po té retransfundována pacientovi. I přes všechna opatření byli pacienti vystaveni riziku vzduchové embolie či nadměrné zátěži ledvin, zaviněné nedostatečným profiltrováním krve. Z tohoto důvodu se o několik let později, tedy v roce 1976, objevil na trhu nový přístroj z dílny Wilson a kolektiv. Tato novinka byla představena pod příhodným názvem Cell Saver společností Haemonetics Corporation. Přístroj fungoval na principu přerušované průtokové cytometrie za součastného promývání erytrocytů ve fyziologickém roztoku. [1, s. 9; 11, s. 71; 13, s. 296,] Také objev onemocnění HIV, které je přenosné hlavně krevní cestou, zapříčinil nárůst poptávky po autotransfuzích. V České republice se začaly rozvíjet autotransfuze v 70. letech 20. století. [5, s. 7; 21] Časem byl přehodnocen význam autotransfuzí a byla snaha o zajištění větší kvality a bezpečnosti alogenní krve, přesto však dosud zůstávají autotransfuze lékaři uznávanou a hojně využívanou metodou. [5, s. 7; 21] 1.3 Výhody autotransfuze Díky autotransfuzím je možno se vyvarovat některým komplikacím spojených s podáním alogenní krve. Její použití nese mnoho výhod pro pacienta a patří mezi ně: - autotransfuze vylučuje možnost přenosu závažných infekčních onemocnění, která s sebou jinak nese podání alogenního transfuzního přípravku Mezi tato onemocnění patří především AIDS, hepatitida typu B a C, Syfilis a další. - okamžité použití při operaci 11

17 - je možností pro pacienty, kteří mají vzácnou krevní skupiny nebo nepravidelné protilátky proti erytrocytům - možnost pro pacienty, kteří odmítají alogenní transfuzi z náboženských, či jiných osobních důvodů Příkladem této skupiny jsou například Svědkové Jehovovi. Jejich náboženské přesvědčení jim brání v alogenních krevních transfuzích. Mnoho Svědků Jehovových také odmítá autologní krevní dárcovství, pokud je transfuzní přípravek oddělen delší dobu od těla, proto také možnou variantou pro pacienty tohoto vyznání je akutní normovolemická hemodiluce, nebo také rekombinantní lidský erytropoetin (EPO) může být přijatelnou variantou pro některé tyto pacienty, ačkoliv tento léčebný produkt obsahuje malé množství lidského albuminu. [4, s. 38] - bez rizika aloimunizace Podáním autologní krve se zabraňuje aloimunizaci a následným potransfuzním reakcím, protože příčinou může být inkompatibilita, erytrocytových, trombocytových, leukocytových, ale i bílkovinných antigenů dárce a příjemce. Použití autologní krve také vylučuje reakci štěpu proti hostiteli. [5, s ] - bez imunosupresivního účinku Byl prokázán imunosupresivní účinek při použití alogenního transfuzního přípravku na jejího příjemce. Také bylo dokázáno, že alogenní krev má nepříznivý dopad na délku přežití a na dobu remise u některých maligních nádorů. Další důvodem je průkazně vyšší riziko pooperačních infekčních komplikací a zrychlení progrese onemocnění AIDS. Prevencí imunosuprese je podávání deleukotizovaných transfuzních přípravků. Ale bylo také zjištěno, že autologní transfuze může mít imunosupresivní účinek. Například u autologního erytrocytárního přípravku mohou lyzované erytrocyty a citronan potlačovat funkci monocytomakrofágového systému, a tím mohou být blokovány některé funkce lymfocytů. Samozřejmě také záleží na množství podaného transfuzního přípravku. [5, s. 11] - stimulace hematopóezy - díky autotransfuzím je možné snížit požadavky na alogenní transfuzní přípravky v době jejich nedostatku 12

18 - autotransfuze mají také ekonomický přínos, který vychází z předpokladu, že by došlo k snížení podávání alogenních přípravků a tím pádem k eliminaci chyb, které jsou spojené s odběry a transporty vzorků [5, s. 12] 1.4 Nevýhody autotransfuze I autotransfuze přináší jisté nevýhody: - existuje zde možné riziko záměny transfuzního přípravku - také se musí brát ohled na indikační omezení Autologní transfuze je vhodná jen pro některé typy operací a také velmi záleží na zdravotním stavu pacienta. - riziko odběru Odběrem se může způsobit iatrogenní anémie a další celková onemocnění například kardiovaskulární a koagulační komplikace. - rizika transfuze I podání autologní transfuzí je spojené s potransfuzními reakcemi, které jsou podobné jako při použití alogenního transfuzního přípravku. - vysoká organizační náročnost Plánovaní odběrů ve správných časových intervalech. Úzká spolupráce odborníků (operatér, transfuzní lékař, ). Speciální přístrojové vybavení. Při odložení termínu operace je možná expirace transfuzního přípravku. Problém s využitelností. Autotransfuze má smysl, pokud je pravděpodobnost podání vyšší jak 50%. - podání autotransfuze bez ohledu na její potřebu dle pooperačních hodnot hematokritu. [5, s. 12] 13

19 1.5 Metody autotransfuze Metody autotransfuze je možno rozdělit do dvou skupin: předoperační období a perioperační období. Do předoperačního období se řadí předoperační autologní odběry a ty jsou řízeny transfuzním oddělením. Do perioperčního období se řadí akutní normovolemická hemodiluce a perioperační sběr krve, tyto metody ovšem zahrnuje obor anesteziologie Předoperační autologní odběr (PAO) Jsou pilířem autotransfuzí. Jejich podstatou jsou předoperační plánované odběry, které provádíme podle určitého schématu ve formě plné krve, nebo některé její složky a její retransfuze pacientovi v případě potřeby. [6, s. 1] Tento druh autotransfuze je velmi výhodný zejména u plánovaných operačních výkonů, kde se dá vcelku odhadnout průběh operace, a u kterých máme empirickou znalost o výši krevních ztrát. Příkladem těchto výkonů jsou především ortopedické operace, ale tuto metodu mohou využít například i pacienti urologie a jiných oddělení. Do autotransfuzního programu jsou zařazováni pacienti, u kterých je plánovaná operace s očekávanou krevní ztrátou ml. [6, s. 1] Transfuzní lékař nese odpovědnost za to, že pacientův stav umožňuje autologní odběr. Vlastní odběry se provádí podle stejných postupů jako u alogenního dárcovství. Minimální interval mezi dvěma odběry a posledním odběrem a operací je 5-7 dní, termín prvního odběru záleží na počtu požadovaných odběrů plné krve. Před každým odběrem se provádí laboratorní vyšetření krve, které zahrnuje vyšetření krevního obrazu a také vyšetření moči. Hemoglobin před druhým a eventuelně třetím odběrem nesmí klesnout pod 100 g/l. Zpravidla se odebírá 10-13% objemu krve obvykle tedy 450 ml krve. Samotný odběr trvá 5-10 minut. Odebranou transfusní jednotku je třeba řádně označit identifikačními údaji tedy jménem, příjmením a rodným číslem pacienta, dále krevní skupinou v systémech AB0/RhD, číslem a názvem transfuzního přípravku, množstvím odebrané krve, datem odběru a expiraci transfuzního přípravku, druhem a množstvím konzervačního roztoku a označením autotransfuze. Před podáním autotransfuze se ověří identifikační údaje transfuzního přípravku a pacienta a provede se určení krevní skupiny v systému AB0/RhD. [5, s ; 6, s. 1-2] Předoperační autologní odběr může být také teoreticky prováděn u dětských pacientů, ale prakticky se tato metoda moc nevyužívá. Uvádí se, že odběr je možný již 14

20 od 1 roku a hmotnosti 8-10 kg. U dětí do 25 kg se odebírá ml krve na kilogram. Objem tekutin, který je odebrán, nahrazujeme koloidními nebo krystaloidními roztoky. Během odběru je velmi důležité monitorovat pulz a krevní tlak dítěte. Odběr by měl být prováděn pod dohledem anesteziologa. Ke starším dětem přistupujeme obdobně, jako u dospělých pacientů a množství odebírané krve opět vypočítáme z hmotnosti pacienta. [5, s. 31] Autotransfuze se podává pacientovi stejným způsobem jako alogenní transfuze. Transfuzní přípravky určené k autotransfuzi se v žádném případě nesmí podat při alogenním převodu jinému pacientovi. [6, s. 2] Akutní normovolemická hemodiluce (ANH) Tato metoda zahrnuje odběr předem určeného množství krve krátce před operací za současné náhrady krevních ztrát vhodnými koloidní nebo krystaloidními roztoky (nebo jejich kombinací), aby nastal pokles krevního hematokritu, tedy poměru mezi objemem červených krvinek a plné krve, na hodnoty 0,28 0,30 (běžná hemodiluce). Po zastavení velkého krvácení se provádí retransfuze předem odebrané krve, která se může uchovávat na operačním sále, tedy při pokojové teplotě, maximálně 8 hodin, pro delší dobu uchování musí být teplota 2-6 ⁰C v chladícím zařízení, u takto skladované krve je možnost použití maximálně do 24 hodin. [5, s. 34, 36-37, 40; 6, s. 2-3] Indikaci pro tento léčebný postup určuje operatér a anesteziolog. Provádí se u zákroků, kde je očekávaná ztráta krve nad 1000 ml například ortopedické a kardiovaskulární zákroky a je využívána hlavně u pacientů s nižším věkem a s rizikem tromboembolie. [5, s. 37] Popisovány jsou také kontraindikace k tomuto léčebnému postupu a patří mezi ně: anémie, poruchy koagulace, ischemická choroba srdeční, těžká hypertenze, plicní choroby, aortální stenóza a jiné další onemocnění. [5, s. 37] Výhodou tohoto postupu je, že i při stejném objemu krevních ztrát, přichází pacient o menší podíl erytrocytů. Dalšími výhodami této metody je časová nenáročnost a relativní bezpečnost při retransfuzi, protože nehrozí riziko záměny transfuzního přípravku, snížení viskozity krve a tím snížené množství hrozících tromboembolických příhod, ke kterým může během operací docházet. [5, s. 41] Akutní normovolemická hemodiluce má i své nevýhody a těmi jsou například tkáňová hypoxie, hypokalémie, akutní srdeční nedostatečnost, diluční koagulopatie, alergická reakce na použité koloidní roztoky. [5, s. 41] 15

21 1.5.3 Perioperační sběr krve (PSK) Tento odběr se provádí pomocí určitých systémů, které zachytávají krevní ztráty přímo z operačního pole. Takto zachycená krev po té putuje do přístroje, který krev shromažďuje, obohacuje ji o antikoagulační přísadu, kterou obvykle bývá roztok heparinu, a také krev filtruje. Po naplnění tohoto zásobníku je krev pomocí pumpy přečerpána do centrifugy, kde je odstřeďována a promývána fyziologickým roztokem. Těmito postupy se získá suspenze promytých erytrocytů ve fyziologickém roztoku téměř bez příměsí leukocytů a trombocytů a také bez koagulačních faktorů. Hematokrit této suspenze se pohybuje kolem 0,45 0,65. Připravená suspenze je opět pumpou přečerpána do transfuzního vaku a retransfundována pacientovi. [6, s. 3] Také u této metody se musí dodržovat určité zásady, kterými jsou: bezpečná a aseptická aplikace transfuzního přípravku, také dodržení doby expirace, která je 24 hodin a samozřejmě takto odebraná krev nesmí být podána jinému pacientovi. [5, s. 45] Indikací k tomuto postupu jsou operace srdce a cév, neurochirurgické operace, ortopedické operace, akutní trauma a také ruptury sleziny a jater. [5, s. 45] Kontraindikace perioperačního sběru krve jsou například: pozitivní infekční markery (anti-hiv, anti-hcv, anti-hbsag) z důvodu ochrany personálu, těžká kontaminace operačního pole, perforace v gastrointestinálním traktu, malignity a další. [5, s. 46] Výhody této metody jsou: využití v akutních případech, možnost okamžitého podání při operaci, menší nároky na organizaci než při plánovaném autologním odběru. [5, s. 46] Nevýhody k tomuto postupu jsou: riziko embolizace tuku, mikroagregáty z buněčné drtě (možno odstranit využitím mikroagregačních filtrů a dokonalým promytím), vzduchová embolie, hemolýza (způsobena poškozením červených krvinek při odsávání krve z operačního pole), koagulopatie, trombocytopenie (následkem promytí krve), bakteriální kontaminace (př. stafylokoky) a další. [5, s ] Další psaný text se týká předoperačních autologních odběrů, protože akutní normovolemická hemodiluce a perioperační sběr krve nespadá do kompetencí transfuzního oddělení. 16

22 1.6 Podmínky pro autotransfuzi Na dárce autologní krve se vztahují kritéria dle platné vyhlášky č. 143/2008 Sb. Vyhláška o lidské krvi, proto se musí dodržovat určité podmínky pro autologní dárcovství. [17.] Indikace autotransfuze Autotransfuze se doporučují: - u pacientů, kde se plánují vybrané zákroky a patří mezi ně například chirurgické, ortopedické, gynekologicko-porodnické, urologické a další možné operace - také u pacientů, u kterých jsou v krvi přítomny aloimunní protilátky. - u pacientů, kteří mají krev se vzácným genotypem - pokud pacient prodělal při předchozích transfuzích některou z potransfuzních reakcí - u pacientů s kongenitální izolovanou imunodeficiencí IgA - také u pacientů s náboženskými či osobními důvody [5, s ] Relativní kontraindikace autotransfuze U pacientů s některými onemocněními se nedoporučuje provést autologní odběr a patří mezi ně: - A-V blok - respirační insuficience - epilepsie - příznaky ischemické choroby srdeční v den odběru - primární a sekundární poruchy krvetvorby a srážení krve - akutní hemoragické cévní a mozkové příhody - vážná onemocnění srdce, plic, ledvin a jater - špatný zdravotní stav [5, s. 16; 7, s. 93] 17

23 1.6.3 Nutnost zvýšené pozornosti u autotransfuzí Opatrný přístup a zvláštní pozornost se musí věnovat jedincům: - léčeným beta-blokátory nebo ACE inhibitory - léčeným léky, které prokazatelně působí toxicky na kostní dřeň - pracujících s průmyslovými jedy, které poškozují hematopoézu - vystavených ionizujícímu záření - u příjemců transplantátů a u častých reoperací [5, s. 16; 7, s. 93] Absolutní kontraindikace autotransfuze Jsou důvody, při kterých nelze tento léčebný postup použít. Mezi tyto důvody patří například: - probíhající infekční onemocnění (potenciální bakteriémie) - prodělaný infarkt myokardu nebo mrtvice do 6 měsíců před odběrem - při nedostatečné srdeční funkci - u pacientů s vysokým krevním tlakem - nestabilní angina pectoris - u významné stenózy aorty a hlavního kmene koronárních tepen - pozitivita testů na hepatitidu B, C a HIV (z důvodu ochrany zdravotního personálu) [4, s. 36; 7, s. 93] Věk pacienta Výhodou autotransfuze je, že zde není jasná věková hranicí jako u autologního dárcovství krve, kde je věková hranice let. Autologní odběr mohou podstoupit i děti, u kterých se odebírá množství krve, odpovídající jejich tělesné hmotnosti. Ale je zde prokazatelné riziko spojené s odběrem u vzrůstajícího věku pacienta. [5, s. 16] 18

24 1.6.6 Hodnota hemoglobinu Tato hodnota se během celého cyklu odběru autotransfuzí musí pečlivě kontrolovat. Před prvním odběrem by měla být hodnota hemoglobinu vyšší než 110g/l a před druhým eventuelně třetím odběrem by měla být hladina hemoglobinu minimálně 100g/l. [5, s. 17] Prevencí anemie během odběrů je substituce železa a vitamínů B12 a kyseliny listové, které jsou velmi důležité pro fyziologickou krvetvorbu. [5, s. 15] Krevní tlak Před každým plánovaným odběrem se musí změřit pacientův krevní tlak a hodnota systolického tlaku by měla být u dospělých pacientů vyšší nebo rovna 100 mmhg. [5, s. 17] Tělesná teplota Transfuzní lékař také měří před každým odběrem tělesnou teplotu. Zvýšená teplota vypovídá o probíhajícím zánětlivém procesu. Při zvýšené teplotě pacienta odběr autologní krve nesmí být proveden. 1.7 Vyšetření krve Přestože se jedná o transfuzní přípravek určený k autotransfuzi, musí se krev povinně otestovat na určitá, krví přenosná onemocnění. Pokud je pacientova krev pozitivní na některý z dále jmenovaných markerů, je vhodné pacienta vyloučit z programu autotransfuze. V krvi pacienta se zjišťují: - protilátky proti viru HIV 1/2 - protilátky proti viru hepatitidy C (anti-hcv) - vyšetření Australského antigenu, který je přítomný u onemocnění virovou hepatitidou B (HBsAg) - přítomnost protilátek proti Treponema pallidum, což je patogen způsobující onemocnění syfilis Dále také je nutno provést vyšetření krevní skupiny v systému ABO/RhD a také screening na antierytrocytární protilátky. U 1% odebraných transfuzních přípravků se provádí mikrobiologické vyšetření, jedná se o vyšetření sterility transfuzního přípravku. [5, s. 18] 19

25 1.8 Krevní skupiny a skupinové systémy Mají největší význam pro transfuzní medicínu. Transfuzní přípravek se podává, jen v případě, že je kompatibilní s krví příjemce. Své skupinové systémy mají erytrocyty, leukocyty, trombocyty i lidské bílkoviny. Mezi skupinové systémy erytrocytů patří: AB0/Rh a ostatní skupinové systémy: Kell, Lewis, Duffy, Kidd, Lutheran, MNSs, P a další. Skupinovým systémem leukocytů je HLA systém, který je velmi významný v transplantační medicíně. Antigeny v systému AB0 lze prokázat i na leukocytech. Nejvýznamnějšími systémy v transfuzní medicíně jsou systémy AB0/Rh a Kell. [7, s. 19, 22, 27-31, 37, 39; 8, s. 227] AB0 systém Krevní skupinu v systému AB0 určuje přítomnost aglutinogenu a aglutininu. Aglutinogen je antigen (oligosacharid), který součástí membrány erytrocytu a aglutinin je protilátka (imunoglobulin IgM), která se nachází v plazmě. Prekurzor aglutinogenů A, B je H substance, která je receptorem pro cukry. Pokud se na H receptor naváže N-acetyl-galaktosamin, vznikne antigen A, navázáním D-galaktosy na H receptor, vznikne antigen B. Krevní skupina 0 má na membráně erytrocytů pouze prekurzor H. Navázání určitého cukru na H receptor, určuje typ zděděných alel. Potomek vždy dědí jednu alelu od matky a jednu od otce, kombinací těchto alel vznikne výsledná krevní skupina. Alely A, B a 0 se navzájem homozygotně a heterozygotně kombinují a na základě těchto kombinací rozlišujeme 4 krevní skupiny: A, B, AB a 0. Fenotyp skupiny A může být tvořen genotypem AA, A0. Na stejném principu to funguje i u skupiny B, která může být tvořena genotypem BB, B0. Skupina 0 je vždy určována alelami 00 a skupina AB je tvořena vždy alelami A, B. Alela skupiny 0 má recesivní charakter a alely A, B jsou dominantní. Skupina A má několik podskupin nejčastější ve středoevropské populaci je podskupina A 1 (na erytrocytu není přítomen žádný antigen H), další méně častou podskupinou je A 2 (na erytrocytu je přítomen antigen A i část molekul původního antigenu H), dále je popisována podskupina A 3 (na erytrocytu je více antigenu H než antigenu A). [7, s ; 8, s ] 20

26 V následující tabulce jsou popsány příklady nejčastějších genotypů a fenotypů, které jsou jimi tvořeny. Tabulka 1. Příklady nejběžnějších genotypů a fenotypů v systému AB0 [převzato z 7, s. 18] Genotyp (výčet alel) Fenotyp (krevní skupina) A 1 A 1 A 1 A 1 A 2 A 1 A 2 A 2 A 2 A 1 0 A 1 A 2 0 A 2 BB B BO B A 1 B A 1 B A 2 B A 2 B 00 0 Aglutininy jsou protilátky, které se přirozeně vyskytují v séru i plazmě. Jsou charakteristickou součástí krevní skupiny, pravidelně se vyskytují anti-a a anti-b. Skupina B má v plamě vždy přítomnou protilátku anti-a a u skupiny A je v plazmě přítomna protilátka anti-b. Lidé s krevní skupinou AB nemají v plazmě žádné protilátky a krevní skupina 0 má v plazmě přítomny protilátky anti-a i anti-b. [7, s. 19; 8, s. 228] Tabulka 2. Krevní skupiny, jejich aglutinogeny a aglutininy [převzato z 7, s. 19] Krevní skupina Aglutinogen (na membráně erytrocytu) Aglutinin (v plazmě) A 1 A 1 anti-b A 2 A2 anti-b B B anti-a A 1 B A 1, B - A 2 B A 2, B (H) anti-a + anti-b Tabulka číslo 2 obsahuje výčet aglutinogenů a aglutininů, které se vyskytují u jednotlivých krevních skupin. 21

27 Nečastější skupinou ve středoevropské populaci je skupina A (42 %), dále je skupina 0 (33 %), méně častou je skupina B (18 %) a vzácněji vyskytující se je skupina AB (8 %).[7, s. 20; 8, s. 228] Krevní skupina se během života nemění a zůstává vždy stejná, jedinou výjimkou je transplantace kostní dřeně od dárce s jinou krevní skupinou, po té prokazujeme u pacienta krevní skupinu dárce kostní dřeně a značí nám to úspěšnou transplantaci. V některých případech může dojít k oslabení antigenů a to u novorozenců a u pacientů s hematoonkologickým onemocněním. [7, s. 20] Univerzální dárce erytrocytárního transfuzního přípravku je skupina 0 negativní a univerzálním dárcem plazmy je skupina AB. [8, s. 229] Význam AB0 systému Jak už bylo výše zmíněno, systém AB0 je velmi důležitý při transfuzích krve, dále v transplantační medicíně (transplantace kostní dřeně a orgánů), inkompatibilita v tomto systému mezi matkou a nenarozeným dítětem se může vyvinout v hemolytické onemocnění novorozenců, dále se využívá také při genetických studiích a v soudním lékařství. [7, s. 21; 8, s. 229] Rh systém Jedná se o velice polymorfní a polyalelický systém. Hlavním antigenem tohoto systému je antigen D. V případě, že je antigen D přítomen na erytrocytární membráně je krev Rh (D) pozitivní, pokud antigen D na membráně chybí, je tato krev Rh (D) negativní. Tento systém má 6 možných alel D, d, C, c, E, e a rozeznáváme 8 možných genotypových kombinací (CDe, cde, cde, CDE, cde, Cde, cde, CdE). V současné době bylo popsáno již 48 dalších různých antigenů tohoto systému. V tomto systému nejsou přirozené protilátky, ale imunní typu IgG, jejich vznik je podmíněn kontaktem s příslušným antigenem. K tomuto kontaktu může dojít například při opakovaných krevních transfuzích, v těhotenství a při transplantacích. Tyto protilátky pronikají přes placentu, jsou příčinou hemolytického onemocnění novorozenců a mohou způsobit také hemolytické potransfuzní reakce. [7, s. 22, 24-25; 8, s. 230] 22

28 1.8.4 Význam Rh systému Tento systém se uplatňuje v těhotenství při vzniku hemolytického onemocnění novorozenců a je způsoben Rh inkompatibilitou mezi matkou a nenarozeným dítětem. (matka Rh (D) negativní, dítě Rh (D) pozitivní). A samozřejmě se také tento systém významně uplatňuje v transfuzní medicíně. Všechny krevní přípravky určené k alogenní transfuzi a k autotransfuzi se musí v tomto systému testovat. Pacient s Rh (D) pozitivní krví může dostat od dárce krev Rh (D) pozitivní i Rh (D) negativní, avšak pacientovi s Rh (D) negativní krví je možno podat pouze krev Rh (D) negativní. [7, s. 26; 8, s. 230] 1.9 Odběr autotransfuzního přípravku Pomůcky potřebné při odběru plné krve, nebo jejích složek K odběru krve určené pro autotransfuze slouží speciální místnosti, které by měly být vybavené speciálním odběrovým polohovacím lehátkem, elektronickou váhou, na které je možno nastavit požadovanou hmotnost plné krve, dále nám tato speciální váha sleduje délku a rychlost odběru, zatavovací kleště používané k uzavření odběrových vaků, popřípadě také přístroje zvané separátory. Nezbytnou součástí je také počítač a čtečky čárových kódů, provozní deníky a také záznamy o validaci a servisu. [7, s. 64] Všeobecně pro samotný odběr jsou potřeba dva různé dezinfekční roztoky (př. alkoholový, jodový) pro sterilizaci paže dárce a odběrový set. Odběrový set je vytvořen z uzavřené sterilní soupravy, skládající se z plastového vaku s antikoagulačními činidly (CPD, CPDA, ACD, ACD A), z vaku se stabilizačními roztoky (SAG-M, ADSOL) a ze satelitového vaku. Součástí odběrové soustavy je také venepunkční jehla a koncovka k odběru vzorků krve. Je velmi důležité, aby odběr byl proveden na první pokus a aby byla zkontrolována celistvost a neporušenost odběrové soupravy před a po odběru. Plastové vaky se vyrábějí z PVC s vhodnými změkčovadly. Pro odběr a skladování trombocytů se používají speciální vaky propustné pro plyny, které jsou vyrobené z polyolefínu nebo PVC se speciálními změkčovadly. [1, s. 16; 7, s. 64; 8, s. 222; 16, s. 8] Plastové vaky přinesly mnoho výhod pro odběry transfuzních přípravků oproti skleněným nádobám. Mezi výhody nesporně patří: - jejich snazší a prodloužená doba skladování, díky přijatelnějšímu materiálu pro buňky - na jejich nesmáčivý povrch neadherují trombocyty 23

29 - také umožňují uzavřený systém separace jednotlivých složek krve - snížení rizika bakteriální kontaminace - jednorázové použití transfuzního setu [1, s. 17; 16, s. 8] Odběr plné krve Všeobecně se odběr plné krve provádí do plastového jednovaku, který slouží k výrobě plné krve a je k němu připojen malý váček, pro odběru prvních asi 30 ml krve, tím se snižuje riziko bakteriální kontaminace. Z plné krve odebrané do dvojvaku je možno vyrobit erytrocytární koncentrát a plazmu. Další možností je odebrat plnou krev do trojvaku nebo čtyřvaku, díky kterému je možno plnou krev manuálně separovat na erytrocyty, trombocyty a plazmu. [1, s 17; 8, s. 223] Transfuzní přípravky z plné krve je možno připravit buď pomocí již výše popsaného předoperačního autologního odběru, nebo pomocí speciální Ascariho přeskokové techniky (Ascari piggyback technique). Její výhodou je možnost pacientovi odebrat až 8 jednotek plné krve během 22 dní. [5, s. 26] Tato speciální metoda se ovšem v dnešní době prakticky nepoužívá, protože nese určité nevýhody: časová náročnost pro pacienta i pro personál z důvodu velmi časté venepunkce, také častější retransfundace pacientovy krve může způsobit některé nežádoucí reakce. [5, s. 26] Odběr a výroba jednotlivých složek krve Odběr jednotlivých složek plné krve také se může provést pomocí takzvaných separátorů krevních elementů. Aferézy je možno rozdělit do dvou základních skupin: cytaferézy (erytrocytaferézy, lekocytaferézy, trombocytaferézy) a plazmaferézy, která slouží k separaci plazmy. [7, s. 88; 8, s. 221] Principem těchto separačních metod je oddělení určitých složek krve pomocí diferenciální centrifugace. Pacientova odebraná krev putuje do přístroje, kde probíhá centrifugace jednotlivých složek pomocí Lathamova zvonu. Kapacita Lathamova zvonu je ml, po překročení jeho maximálního objemu se přelije jako první plazma do sběrného plastového vaku, po té těžší krevní elementy (trombocyty, leukocyty, erytrocyty). Také u toho typu odběru platí, že je všechen materiál dodáván jako sterilní set určen k jednomu odběru, včetně Lathamova zvonu. [7, s. 88] 24

30 Význam aferézy není jen příprava transfuzních přípravků, ale také léčebný používaný například u onemocnění polycytemia vera. Pomocí separátoru tak odstraňujeme přebytečné krvinky. [9.] Před začátkem aferézy se zvolí program a vybere se určitá odběrová souprava podle požadované složky. Separátory mohou mít různou konstrukci, podle které záleží na technice odběru. [7, s. 89] Kontinuální typ odběru probíhá tak, že se pacientovi nebo dárci provede venepunkce na obou pažích. Z jedné paže potom probíhá odběr krve a do druhé paže se navrací krev již bez požadované složky krve. Výhodou této metody je rychlejší a intenzivnější separace. [7, s. 89] U diskontinuální typu aferézy je pacientovi napíchnuta žíla pouze na jedné paži. Tento typ se používá hlavně u plazmaferézy a probíhá v cyklech. V každém cyklu jsou odebrány přibližně 2 decilitry krve, ty jsou pomocí centrifugace, nebo membránového filtru (záleží na typu přístroje) rozděleny na plazmu a krvinky. Krvinky putují zpět do pacientova krevního řečiště a plazma je shromažďována do sběrného vaku. Celková doba cyklů je závislá na požadovaném množství plazmy. [7, s. 89; 9] Výhody aferézy Použití této techniky výroby transfuzních přípravků zaznamenalo prudký rozvoj v kvalitě i kvantitě a tyto přístroje přinášejí do účelné hemoterapie mnoho výhod: - časová úspora pro odborný personál i pro pacienta vzhledem k možnosti odběru požadovaného množství transfuzního přípravku při jednom sezení - možnost nastavit vstupní a cílové hodnoty hematokritu - díky kompenzaci krevních ztrát náhradními roztoky má aferetický odběr méně nežádoucích účinků [5, s. 26] Nevýhody aferézy - nákladné přístroje a odběrové sety - nepostradatelnost školeného personálu - potřebný dobrý žilní přístup [5, s. 27] 25

31 1.10 Erytropoetin u autotransfuzí Jedná se o glykoprotein, který se tvoří v ledvinách, a jeho funkcí je stimulace proliferace a diferenciace prekurzorů červené řady. Nejčastěji je uplatňován u předoperačních autologních odběrů a u akutní normovolemické hemodiluce. Značným omezením je jeho vysoká cena a možné nežádoucí účinky (nevolnost, zvracení, průjem, zácpa, zvýšený sklon pacientů k arteriální hypertenzi, či trombóze). [5, s. 58, 61] Význam erytropoetinu - stabilizuje hladiny hemoglobinu, a umožňuje tak odběr více transfuzních jednotek krve v předoperačním období - podporuje hematopoézu po ztrátách během operace - umožní snížit intervaly mezi jednotlivými odběry - možností pro anemické pacienty, kterým ledviny produkují jen malé množství erytropoetinu [5, s. 58] 1.11 Substituce železa u autotransfuzí Erytropoetin účinkuje jen v přítomnosti dostatečného množství železa. Důležité je také dodávání vitamínu B12, nepostradatelného pro fyziologickou krvetvorbu. Doporučeným postupem je podávání přípravků železa u předoperačních autologních odběrů. Nejčastěji se podává perorálně v kombinaci s kyselinou askorbovou, která podporuje jeho vstřebání ve střevě. Pomocí těchto preparátů je možno zabránit v průběhu odběrů tvorbě siderodeficientních červených krvinek. [5, s ] 1.12 Zpracování transfuzních přípravků Jedná se o řadu postupů, které se provádí mezi odběrem plné krvi a aferetickým odběrem, po vznik hotového transfuzního přípravku. Za výchozí surovinu se považuje stabilizovaná tedy nesrážlivá plná krev, která obsahuje veškeré krevní složky tedy trombocyty, erytrocyty, leukocyty a plazmu. Plnou krev určenou k autotransfuzi již v dnešní době nahrazují autologní transfuzní přípravky připravené z jejich složek. [7, s. 65] 26

32 Zabránění koagulace Fyziologickou funkcí krve je koagulace, pro výrobu transfuzních přípravků je tato schopnost krve nežádoucí, jejímu srážení zabráníme pomocí antikoagulačních roztoků, které inaktivují kaskádu koagulačních faktorů vedoucí ke vzniku sraženiny. Mezi běžně používaná antikoagulancia patří: citronan sodný a K 2 EDTA. Ty se využívají i při běžných odběrech nesrážlivé krve. V transfuziologii byla tato antikoagulační činidla nahrazena konzervačními roztoky, které jsou pro naše účely vhodnější. [1, s. 18; 7, s. 85] Konzervační roztoky Jsou složeny z více látek s různou funkcí. Jejich účelem je udržení životnosti erytrocytů k čemuž slouží citronan sodný, kyselina citronová a glukosa, dále stabilizace buněčných membrán a tím zabránění rozpadu buněk pomocí adenosinu a manitolu. V současnosti jsou používány hlavně ACD, ACD A, CPD, CPDA. [16, s. 9] Citronan sodný svou vazbou ionizovaného vápenatého kationtu zabraňuje aktivaci koagulačních faktorů a tím zůstává krev stabilizovaná. Pro organismus je ve větším množství toxický na to musíme brát zřetel u polytransfundovaných pacientů. [7, s. 85] Kyselina citronová udržuje krev v slabě kyselém ph, a tím snižuje glykolýzu. Když se ph pohybuje mezi 6,8-7,2, je hladina ATP v erytrocytech stabilní. Při skladovací teplotě 4 ⁰ C se zvýší ph, a tím začne klesat hladina ATP. Během skladování vlivem uvolňované kyseliny mléčné ph klesá. [7, s. 85] Glukóza, která se přemění na ATP, je jediným zdrojem energie pro erytrocyty. ATP je nezbytný pro flexibilitu membrány, transport iontů a schopnost erytrocytů vázat kyslík. Během těchto biochemických pochodů se spotřebovává energie a ATP je převáděno na ADP. [7, s. 85] Purinová báze adenin je účinný při syntéze ATP a 2,3 DPG (2,3 difosfoglycerát). Přidáním adeninu jsou erytrocyty schopny samy syntetizovat adenosinnukleotidy (ATP, ADP, AMP) a tím snižovat ztráty způsobené skladováním. [1, s. 19; 7, s. 85] ACD je jedním z prvních používaných konzervačních roztoků. Díky objevu ACD bylo možno prodloužit dobu skladování erytrocytů na 21 dní při teplotě 2 až 6 ⁰C. Na 450 ± 50 ml odebrané krve bylo použito 100 ml ACD. Jeho složení je kyselina citronová, citronan sodný a glukóza. Kolem roku 1960 byl nahrazen roztoky CPD 27

33 a CPDA. [7, s 85; 8, s. 222; 14; 16, s. 9] ACD A liší se od ACD zvýšeným obsahem citrátu ostatní složky jsou stejné jako u ACD a je používán při aferézách. [16, s. 9] CPD je to modifikovaný roztok ACD, který obsahuje navíc fosforečnan sodný. Na 450 ml krve se používá 63 ml CPD. Takto konzervovanou krev je možno skladovat opět 21 dní při teplotě 2 až 6 ⁰C. [8, s. 222; 16, s. 9] CPDA je v současné době asi nejpoužívanějším konzervačním roztokem. Je složen z kyseliny citrónové, citronanu sodného, fosforečnanu sodného, glukózy a adeninu. Odebraných 450 ml krve se opět mísí s 63 ml CPDA. Jeho používáním se prodloužila doba skladovatelnosti plné krve až na 35 dní opět při 2 až 6 ⁰C. [14; 16, s. 9] Stabilizační roztoky Při dalším zpracování plné krve na jednotlivé komponenty se po centrifugaci odsaje většina glukózy a adeninu. Proto se častěji využívají resuspenzní roztoky. Z plné krve odebrané do konzervačního roztoku bez adeninu se po centrifugaci odstraní plazma, k takto připraveným erytrocytům se přidá resuspenzní roztok s vysokým obsahem adeninu a manitolu. Tyto roztoky mohou obsahovat manitol, který stabilizuje buněčné membrány, adenin, chlorid sodný, glukózu a fosforečnany pro zajištění optimálního ph. Díky jejich použití nepodléhají erytrocyty hemolýze a zůstávají bez výrazných morfologických změn. [8, s. 222; 10; 16, s. 9] Mezi nejpoužívanější roztoky patří SAG-M a ADSOL. Obvykle se přidává 100 ml stabilizačního roztoku k jedné jednotce erytrocytů. Jejich složení je: chlorid sodný, glukóza, adenin a manitol. Výhodou je, že i po 42 dnech uskladnění přežívá přibližně 73 % erytrocytů. [7, s. 86; 16, s. 9] Kryokonzervace Jedná se o techniku skladování, při které se uchovávají buňky na prakticky neomezenou dobu. Podstatou je udržení stálé teploty hluboko pod bodem mrazu, díky tomu je možné transfuzní přípravek uchovávat měsíce i roky, ale po rozmrazení je nutná rychlá aplikace. K buňkám určeným zamrazení je nutné přidat kryoprotektivum, které chrání buňky před hemolýzou a cytolýzou. Jako kryoprotektivum se používají nízkomolekulární látky, například glycerin a dimethylsulfid, nebo vysokomolekulární látky jako je hydroxyethylškrob, polyetylenglykol, dextran či želatina. Principem je 28

34 vniknutí protektiva do buňky, ze které přes membránu vystoupí voda do vnějšího hypertonického prostředí. Tam se vytvoří ledové krystaly, které už ovšem nepoškodí buňky. Plynulým poklesem teploty až k -85 ⁰C zabráníme tvorbě velkých ledových krystalů. [7, s ] Možnosti skladování takto zmrazeného materiálu jsou různé, například v elektrickém zařízení při teplotě -65 až -80 ⁰C nebo v párách tekutého dusíku při -140 až -150 ⁰C. [7, s. 91] Rozmrazení transfuzního přípravku také musí být pozvolné, nejčastěji se provádí v průtokových centrifugách. V průtokové centrifuze se k zamrazeným buňkám přidává hypertonický roztok z glukózy nebo fyziologický. Buňky se postupně propírají ve snižujících se koncentracích roztoku, a tím je odstraňováno kryoprotektivum. Rozmražené erytrocyty resuspendované ve fyziologickém roztoku je nutno podat pacientovi do 24 hodin. Novější metodou je použití roztoku Nutricel nebo SAG-M k závěrečné resuspenzi, a to nám umožní skladovat rozmražené erytrocyty ještě další 1-3 týdny. [7, s. 91] Možností použití této konzervace je hlavně pro erytrocyty, které nám zajišťují rezervu krví s univerzální krevní skupinou tedy 0 RhD negativní, pro dlouhodobé uchování erytrocytů určených k autotransfuzím pro pacienty se vzácným genotypem, nebo také v bance vzácných krevních skupin, jejich příkladem je Bombay typ. Takto je možné uchovávat i kmenové buňky pro alogenní nebo autologní transplantace. [7, s. 91] 1.13 Zpracování plné krve Plná krev se v dnešní době používá pouze pro účely autotransfuze, některé transfuzní stanice plnou krev separují na jednotlivé její části, tím zvýší její využitelnost. Výhodou je také podání pouze složky krve, kterou pacient potřebuje. Jejich využití je jak v oblasti autotransfuzí, tak při alogenním dárcovství. Jednotlivé složky také mají různou dobu expirace a skladují se při rozličných podmínkách. Plná krev se nejprve rozdělí na jednotlivé složky (erytrocytární masu, plazmu a případně trombocyty), a ty jsou pak podle daných výrobních postupů upraveny na předepsané transfuzní přípravky. Jejich oddělení nám usnadňují plastové vaky, které mají velký vliv na kvalitu výsledného přípravku. Bezpečnost je dána odběrem i zpracováním v uzavřeném systému (bez kontaktu vnějšího prostředí), ten je tvořen odběrovým vakem, na který jsou připojeny hadičkami další vaky na oddělené složky. [19.] 29

35 Centrifugace plné krve Sedimentaci jednotlivých částí krve se urychlí odstředěním plné krve takzvanou diferenciální centrifugací (rychlost až 4000 otáček za minutu, doba trvání minut). Rychlost otáček a doba centrifugace se nastavuje přímo na centrifuze. Tyto velkoobjemové chlazené centrifugy mají přizpůsobené kyvety přímo na plastové vaky a pojmou jich až 12 najednou. Jednotlivé složky během centrifugace vytvářejí plynule na sebe navazující vrstvy na základě jejich rozdílné specifické hmotnosti: - plazma 1026 g/l - trombocyty 1058 g/l - leukocyty g/l - erytrocyty 1100 g/l Po vyjmutí vaků z centrifugy je možno na dně pozorovat sedimentované erytrocyty, nad nimi vrstvu leukocytů a trombocytů, které společně tvoří buffy-coat a vrchní vrstva je tvořena plazmou. [19; 20, s. 26] Separace plné krve na jednotlivé složky Po centrifugaci se vloží vak do speciálních krevních lisů, ty slouží k oddělení jednotlivých krevních složek. Principem lisu je tlak dvou ploch, mezi které je vložen vak s krví. Tlakem těchto dvou ploch se separují uzavřeným systémem jednotlivé vrstvy krevních složek do satelitních vaků. Existují dva druhy lisů manuální (ruční) lis či lis, který je plně automatizovaný. [19; 16, s. 11] Deleukotizace Již po jednom týdnu se ve skladované krvi významně zvyšují hladiny bioaktivních substancí, které se uvolňují z leukocytů a trombocytů. Deleukotizací je možno se vyvarovat jimi způsobenými nežádoucími reakcemi. Kyselá fosfatáza, laktátdehydrogenáza, elastáza a β-trombomodulin mohou způsobit hemolýzu. Serotonin a histamin mohou být příčinou anafylaktické reakce. Cytokiny IL-1, IL-6, IL-8 (interleukiny), TNF (tumor nekrotizující faktor) alfa mohou zapříčinit febrilní reakce. Oddělením buffy-coatu se jejich hladiny snižují, zvýšena zůstává pouze hladina IL-8. Mezi bioaktvní substance také patří hydroláza, PAI-1 (inhibitor aktivátoru plazminogenu) a myeloperoxidáza. [5, s. 29] 30

36 Možné způsoby odstranění leukocytů a trombocytů: deleukotizace u lůžka neboli bed-side deleukotizace, deleukotizace během výroby otevřeným způsobem (filtr se napojí s přenosným vakem), uzavřeným způsobem (takzvanými on-line filtry, které jsou již součástí sestavy vaků určené k filtrování plné krve. Deleukotizace přípravků z erytrocytů nebo z trombocytů je možno provádět v laboratoři po připojení vaku s transfuzním přípravkem k deleukotizačnímu filtru, vše probíhá sterilně uzavřeným způsobem. [5, s. 29; 16, s. 11] Provedením filtrace před uskladněním krve se zlepší biochemické (př. ph, hodnoty LDH a 2,3-DPG) a reologické (viskozita) vlastnosti krve, a tím se sníží nežádoucí reakce způsobené látkami uvolněnými z leukocytů a trombocytů. [5, s. 29] Kryoprecipitace Tento postup vede k přípravě dalšího z řady transfuzních přípravků takzvaného kryoproteinu, ten obsahuje většinu Von Willebrandova faktoru, faktoru VIII (antihemomofilický globulin), faktoru XIII (faktor stabilizující fibrin), faktoru I (fibrinogen) a fibronektinu. Postupem k získání těchto plazmatických bílkovin je: rozmrazení plazmy po dobu centrifugace, která probíhá při 4 ⁰C, po té se odsaje plazmasupernatant (k-plazma) a sediment, který představuje kryoprecipitát, se rozpustí v malém množství plazmy a opět se šokem zamrazí. Při výrobě kryoproteinu je využita snížená rozpustnost proteinů při nízké teplotě. [8, s. 226; 16, s. 12] Promytí buněčných složek krve Promytím erytrocytárního koncentrátu ve fyziologickém roztoku se odstraní zbytky plazmy, která obsahuje protilátky a složky komplementu. Promytí se opakuje 2-4x, následuje centrifugace, odstranění supernatantu a přidání resuspenzního roztoku. [16, s. 12] 31

37 Zmrazování plazmy Jedná se o speciální postup, kterým musí projít plazma co nejdříve po odběru a jejím oddělení od krevních buněk. Tímto zamrazením zabráníme ztrátám aktivity labilních koagulačních faktorů (například faktor VIII). Postup je následující: - vaky s plazmou se vloží do šokového zmrazovače, kde je plazma zamrazena v kapalné lázni (př. lihobenzin) nebo cirkulujícím vzduchem při teplotě nižší jak - 45 ⁰C během několika desítek minut zmražena na méně jak - 30 ⁰C - takto zamražená plazma se uchovává při - 25 ⁰C - pokud by došlo k pomalému ochlazování plazmy, vytvořil by se v ní led a časem by došlo k zvýšení koncentrace zbylé plazmy bílkovinami a k tvorbě krystalů a při tomto ději se inaktivuje již zmíněný faktor VIII - je velmi důležitá opatrná manipulace při rozmrazování vaků, to probíhá při teplotě + 37 ⁰C - po rozmrazení se přípravek kontroluje, zda neobsahuje kryoprecipitát, po té může být transfuzní přípravek ihned podán [ 1, s. 25; 19] 1.14 Kontrola jakosti V České republice je zaveden právní systém, který zahrnuje oblast regulace výroby léčiv od roku [7, s. 74] Systém zahrnuje organizační strukturu, povinnosti, postupy, procesy a zdroje k provádění řízení jakosti. [7, s. 74] Pod tento systém patří všechny postupy od odběru krve, přes výrobu a distribuci transfuzního přípravku. Zabezpečení jakosti zajišťuje požadovanou jakost krve a jejích složek během všech fází výroby. V každé transfuzní stanici jsou k dispozici standardní operační postupy (SOP), ty nám udávají způsob a četnost kontrol jakosti transfuzních přípravků, program auditů, a také sledují chyby a neshody a způsob jejich odstraňování. Všechny pracovní postupy, použité materiály a transfuzní přípravky jsou dokumentovány, stejně jako záznamy o počtu dárců a odběrů, o jednotlivých provedených vyšetření také počet vyrobených a aplikovaných transfuzních přípravků a velmi důležité je zaznamenávat nežádoucí reakce spojené s podáním transfuzního přípravku. Tyto záznamy se uchovávají let. [7, s. 74] 32

38 Odpovědnost za výrobu a kontrolu přípravků v souladu se všemi předpisy a předepsanými požadavky nese kvalifikovaná osoba, tedy vysokoškolský pracovník. Kontrola jakosti zahrnuje například kontrolu objemu a hmotnosti, sterilitu transfuzního přípravku a mnoho dalších parametrů, které se u jednotlivých přípravků liší. [7, s ] Další kapitola je zaměřena na kontrolu jakosti u plné krve Plná krev (PK) Použití plné krve je velmi omezené, v současné době je odebírána jen pro účely autotransfuze, nebo pro výrobu transfuzních přípravků, které obsahují pouze jednotlivé složky krve. Pro účely autotransfuze ve FN Motol odebírá pouze plná krev, která již dále nepodléhá dalšímu zpracování. [7, s. 68] Většinou je objem vaku na 450 ml ± 10%, ale může být i na 350 ml a 250 ml (u pacientů s nižší tělesnou hmotností). Standardní objem je 450 ml ± 10 % bez protisrážlivého roztoku. Plná krev je konzervována pomocí CPD nebo CDPA. Minimální hodnota hemoglobinu se pohybuje kolem 45 g/ TU a hematokritu 0,3, pokud se tedy jedná o standardní objem krve 450 ml ± 10 %. Může být uchovávána 21 při použití CPD nebo maximálně 35 dní při použití CPDA při teplotě 2 6 ⁰C, odděleně od ostatních transfuzních přípravků v monitorovaných chladicích zařízeních. [7, s. 68; 8, s. 224; 18, s ] Aplikace plné krve probíhá po provedení kontroly krevní skupiny transfuzního přípravku a příjemce krátce před podáním transfuze mikroagregátovým transfuzním setem s filtrem o velikosti pórů přibližně 40 µm, protože během skladování se tvoří mikroagregáty. [18, s. 29] Do transfuzního vaku s plnou krví je zakázáno přidávat roztoky s obsahem vápenatých iontů, glukózy či léčiv. [18, s. 29] Možné nežádoucí účinky jsou: oběhové přetížení, sepse způsobená bakteriální kontaminací, alergické reakce a další. [18, s. 29] Plná krev nesmí být podána, pokud jeví známky hemolýzy a obsahuje viditelné agregáty. [ 1, s. 37] 33

39 Tabulka 3. Charakteristika plné krve [7, s. 68; 8, s. 224] hemoglobin min. 45 g/tu hematokrit 0,3 antikoagulant CPD, CPDA objem cca 450 ml, (350ml, 250 ml) expirace 21dní (CDP), 35 dní (CPDA) teplota 2-6 ⁰C Plná krev také podléhá kontrolám jakosti, základní sledované parametry jsou uvedeny v kapitole 1.7, další kontrolované parametry jsou uvedeny v následující tabulce. Tabulka 4. Požadované parametry plné krve [17. s. 1829; 1, s. 37] Kontrolované parametry Požadavky jakosti Frekvence kontroly objem určen způsobem odběru a skladování, aby byly dodrženy specifikace pro hemoglobin a hemolýzu 1 % všech jednotek, minimálně 4 jednotky měsíčně hemoglobin *nejméně 45 g/tu 4 jednotky měsíčně hemolýza méně než 0,8 % erytrocytární masy na konci expirace 4 jednotky měsíčně *pro tento parametr jsou kontroly u autotransfuzních přípravků nezávazné Mikroagregátové filtry Používají se k odstranění mikroagregátů, které vznikají během skladování ze shluků agregujících krevních destiček, fibrinu, nonviabilních leukocytů, lipoproteinů, precipitátů denaturovaného albuminu a zřejmě i z částí erytrocytů. Jejich množství přímo úměrně stoupá s dobou skladování krve, už den od odběru je velmi zřetelná tvorba mikroagregátů. Mikroagregáty mohou běžné filtry o velikosti pórů 170 µm propustit a způsobit tak nežádoucí reakce: mikroembolizaci plic s uvolněním bronchodistrikčních a vazoaktivních látek hlavně z trombocytů. Klinickými projevy plicní insuficience z důvodu mechanické obstrukce je krvácení a intersticiální plicní edému. Mikroagregáty také mohou být vychytávány monocyto-makrofágovým 34

40 systémem, a to může mít za následek přechodnou sekvestraci trombocytů a snížení jejich hodnot v periferní krvi. Z bazofilních granulocytů se může vyplavit histamin. Dále může dojít k poklesu fibronektinu, důsledkem toho je snížená obranyschopnost organismu. [5, s. 28] Nežádoucím reakcím, které mohou mikroagregáty způsobit se předejde filtrací krve před skladováním či podáním transfundované krve přes mikroagregátový filtr o velikosti pórů v rozmezí µm. [5, s. 28] Odstraněním buffy-coatu z erytrocytárních přípravků snížíme tvorbu mikroagregátů přibližně o 75 %. [5, s. 28] 35

41 2 Cíle práce 1. Zhodnotit statisticky spektrum operací, u kterých se provádí autotransfuze 2. Porovnat četnost odběrů u mužů, žen a u dětí 3. Porovnat četnost odběrů mezi jednotlivými sledovanými diagnózami 4. Zhodnotit a porovnat množství expirovaných transfuzních přípravků a sledovaných diagnóz 36

42 3 Praktická část V praktické části mé bakalářské práce jsou popisovány postupy vedoucí k přípravě transfuzního přípravku, tedy plné krve k autotransfuzi tak, jak jsem mohla pozorovat během své praxe v Oddělení krevní banky ve FN Motol. Dále obsahuje statistické údaje o autotransfuzích provedených ve FN Motol za rok 2011, jištění jakosti a kontrolu kvality. 3.1 Postup před odběrem autotransfuze Ve FN Motol je postup před odběrem plné krve následující: pacient se v den odběru dostaví s průkazem zdravotní pojišťovny, s výsledky předoperačních vyšetření a žádankou o odběr krve na autotransfuzi, tyto materiály si převezme odběrová sestra. Pacient je předem poučen o zásadách pitného a stravovacího režimu, podle kterých by se měl řídit 12 hodin před odběrem. Pacient by neměl jíst tučná, těžce stravitelná jídla a nepít alkohol. V den odběru se doporučuje posnídat například rohlík s džemem a čajem a vypít půl litru tekutin. Léky, které pacient pravidelně užívá, si ráno v den odběru vzít smí, výjimkou jsou léky na tlak, ty pacient užije v případě potřeby až po odběru, protože odběr krve sníží krevní tlak. Pacient může podstoupit plánovaný autologní odběr pouze na žádost ošetřujícího lékaře, který nejprve zhodnotí zdravotní stav pacienta, zda je pacient schopen podstoupit odběr krve. Na základě tohoto vyšetření lékař vystaví písemný požadavek, který by měl obsahovat identifikační údaje pacienta a také místo a datum operace, množství a druh požadovaného transfuzního přípravku. Pacient by měl být poučen o plánovaném autologním odběru a jeho postupu, o prováděných testech spojených s odběrem krve a také o výhodách a možných rizicích, které odběr autotransfuze nese. Pokud se jedná o nezletilého pacienta, informovaný souhlas k odběru krve podepisuje jeho rodič nebo zákonný zástupce. Také se pacientům doporučuje přijít s doprovodem, u mladistvých do 18 let je to povinné. 37

43 3.1.1 Vyšetření transfuzním lékařem V den odběru je pacient znovu vyšetřen přímo transfuzním lékařem, který nese odpovědnost za to, že pacientův klinický stav dovoluje odběr krve. Lékař vše zapisuje do evidenčního záznamu dárce a ten obsahuje kromě identifikačních údajů pacienta (jméno, rodné číslo) také číslo pojišťovny, telefonní číslo, adresu bydliště a pracoviště. Dále se do evidenční karty zaznamenává: oddělení, na kterém bude provedena operace, diagnóza, termín operace, výška a váha, aktuální teplota, tlak krve a puls před a po odběru. Velmi důležité jsou také údaje o alergiích (jod), prodělané infekce (žloutenka, borrelióza), také operace, porody a potraty, abychom byli informováni o možném předchozím podání alogenní krve a možnosti vytvoření antierytrocytárních protilátek. [5, s. 18] 3.2 Odběr plné krve pro autotransfuzi Ošetření místa venepunkce Ve FN Motol se postupuje takto: pacient si nejprve důkladně omyje předloktí dezinfekčním mýdlem pod tekoucí vodou, ruce si osuší papírovými ručníky určenými k jednomu použití. Odběrová sestra provede dezinfekci místa vpichu jodovým dezinfekčním roztokem ve spreji, který maximálně třemi tahy setře sterilním tamponem. Po té na místo vpichu použije druhý dezinfekční roztok ve spreji a opět jej setře sterilním tamponem. Nakonec provede třetí nanesení dezinfekčního prostředku, nechá ho působit přibližně 30 sekund na kůži, kde zaschne, a už jej nestírá. Pro provedení dezinfekce se sestra již nesmí dotýkat místa vpichu. Při celém procesu dezinfekce je sestra povinna mít na rukou gumové latexové rukavice Provedení odběru Ve FN Motol se při odběru plné krve postupuje následovně: vpich provádí opět odběrová sestra v gumových latexových rukavicích sterilní odběrovou jehlou, která je součástí odběrové soustavy, po zaškrcení horní končetiny do periferní žíly. Jehlu fixuje náplastí. K odběru se používají sterilní apyrogenní odběrové vaky o objemu 450 ml, 350 ml a 250 ml s antikoagulačním roztokem CPD-A1, expirace takto konzervované plné krve je 35 dní, den odběru se počítá jako nultý. Před odběrem sestra zkontroluje celistvost odběrového vaku a jeho obalu, množství antikoagulačního činidla, šarži, 38

44 expiraci, označí ho sendvičovým štítkem a umístí ho na odběrovou váhu. Během odběru se na odběrové váze krev kontinuálně promíchává s antikoagulačním roztokem. Pokud se nezdaří vpich, musím být na druhý vpich použita nová odběrová souprava a odběr se provede z jiného místa vpichu. Po odběru požadovaného množství krve místo vpichu ošetří hemostyptickým zásypem (Traumacel), pokryje sterilním tamponem a vyjme jehlu. Přes mulový tampon místo vpichu dále stlačí pomocí elastického obinadla. Po celou dobu odběru je pacient v poloze polosedě v polohovatelném křesle pod dohledem odběrové sestry, která kontroluje aktuální zdravotní stav pacienta Ukončení odběru plné krve Ukončení odběru plné krve je opět popsáno dle postupů používaných ve FN Motol. Když je odebráno určené množství plné krve do vaku, váha se automaticky zastaví. Odběrová sestra odebere čtyři vzorky krve. Po ukončení odběru a odběru vzorků, uvolní škrtidlo a vyjme jehlu ze žíly. Dále ošetří místo vpichu, jak je již popsáno výše, pomocí hemostyptického zásypu, přiloží sterilní gázu, vyjme jehlu a stlačí místo po vpichu, které po té obváže elastickým obinadlem. Pokud je pacient bez obtíží, pomalu se posadí a jde znovu k lékaři na kontrolu krevního tlaku. Sestra vytlačí krev z odběrové hadičky, promísí ji s antikoagulačním roztokem a znovu ji naplní. Svářečkou na ni provede 5 svárů, čímž vzniknou oddělené vzorky krve. Znovu zkontroluje plastový vak s odebranou krví, zda nejeví nějaké známky defektu. Pacient po odběru obdrží potvrzení o provedení odběru a je poučen o vhodném stravovacím a fyzickém režimu po odběru. Doporučuje se po odběru vypít dostatečné množství tekutin, jíst stravu bohatou na bílkoviny, eventuelně si vzít přípravky s obsahem železa dle doporučení lékaře. Po odběru by měl pacient odpočívat. Pokud je vše bez komplikací, pacient ještě setrvá alespoň 20 minut v čekárně, kde je kontrolován lékařem nebo sestrou, a pokud ani zde nenastanou nějaké problémy, pacient odchází domů. Sestra odešle vzorky krve společně se žádankami na hematologické, biochemické a mikrobiologické vyšetření. Odebrané autotransfuze, které nejsou zatím propuštěné, se ukládají do chladicího zařízení ve vyšetřovně lékaře. Po vyhotovení laboratorních výsledků a propuštění 39

45 autotransfuze se ukládají autologní plné krve samostatně v chladicím zařízení pro autotransfuze na expedici Krevní banky. Pokud má autotransfuze pozitivní některý z infekčních markerů, je likvidována a znehodnocena jako biologický odpad, stejně jako všechny nepodané autotransfuze. Nastane-li situace, kdy musí být odběr ukončen (například náhlý kolapsový stav pacienta), krevní vak s nedostatečným objemem plné krve musí být znehodnocen dle přepisů. 3.3 Vyšetření krve Vyšetření prováděná u autologních odběrů jsou již popsána v kapitole 1.7. Na transfuzním oddělení se provádí vyšetření krevní skupiny AB0/RhD a screening antierytrocytárních protilátek Vyšetření krevní skupiny AB0 Rh/D zkumavkovou metodou Princip této metody spočívá ve vyšetření neznámých aglutinogenů na erytrocytech známými antiséry a neznámé aglutininy ve vyšetřovaném séru známými aglutinogeny. Sledujeme reakci antigenů A, B, D s monoklonálními diagnostickými séry a v séru testujeme přirozené protilátky reakcí s diagnostickými erytrocyty. [16, s. 37] Pomůcky a chemikálie: laboratorní stojan na zkumavky, plastové aglutinační zkumavky, 0,9 % NaCl (fyziologický roztok), diagnostická séra anti-a, anti-b, diagnostické erytrocyty A 1, B, dva různé klony diagnostických klonů anti-d a kontrolní sérum Postup je následující: - nejprve se centrifuguje vzorek krve při 3000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut - plastové aglutinační zkumavky se popíší rozdílně pro vyšetření přední řady 2 zkumavky (aglutinogeny) A, B a takzvané zadní řady také 2 zkumavky (aglutininy) A 1, B, a na vyšetření antigenu D se připraví 3 zkumavky - do zkumavek pro přední řadu se nakape po kapce anti-a a anti-b a do zadní řady po dvou kapkách séra pacienta - do zkumavek na vyšetření antigenu D se nakape po jedné kapce 2 různých diagnostických klonů anti-d a do poslední zkumavky se nakape kontrolní sérum 40

46 - vyšetřované erytrocyty se jedenkrát promyjí v 0,9 % NaCl a dále se z nich připraví přibližně 3-5 % erytrocytární suspenzi v 0,9 % NaCl - po kapce suspenze erytrocytů se nakape do každé ze zkumavek přední řady a do zkumavek na vyšetření antigenu D a do zkumavek zadní řady se nakape po jedné kapce diagnostických erytrocytů A 1, B - zkumavky se promíchají a nechají inkubovat při pokojové teplotě 15 minut - po té jsou zkumavky centrifugovány po dobu 1 minuty při rychlosti 1000 otáček za minutu - odečítání se provádí makroskopicky po resuspenzaci obsahu zkumavek Interpretace výsledků: - pokud je ve zkumavce i po protřepání viditelná aglutinace jedná se o pozitivní výsledek, průkaz antigenu (protilátky), absence aglutinace značí negativní výsledek, antigen (protilátka) chybí - pokud se jedná o nejednoznačný výsledek, posílá se vzorky k dourčení do referenční laboratoře Ústavu hematologie a krevní transfuze [15, s ] Screening antierytrocytárních protilátek Tento screening slouží k odhalení možných nepravidelných antierytrocytárních protilátek v séru pacienta, provádí se u alogenních i autologních transfuzí. Důvodem screeningu těchto protilátek u pacientů odebíraných k autotransfuzím je možné nedostatečné množství předem odebrané krve na autotransfuzi a potřeba alogenního transfuzního přípravku během operace. Principem těchto testů je sloupcová aglutinace, která je kombinací aglutinace a gelové filtrace. Provedením NAT (nepřímý antiglobulinový test neboli nepřímý Coombsův test) vyhledáme možné nepravidelné protilátky přítomné v séru pacienta. Součastně s NAT se provede enzymatický test (bromelinový), jehož principem je rozrušení povrchu erytrocytů in vitro enzymem, který tak usnadní aglutinaci u některých typů protilátek, i pokud je v séru přítomno jen malé množství protilátky. Po provedení testu na dno ID-karty sedimentují neaglutinované erytrocyty, aglutinované erytrocyty se podle jejich velikosti projeví ve sloupci gelu, jejich umístění určuje sílu reakcí. Pomůcky a chemikálie: centrifuga, ID-karta, diluent příslušný k ID-kartě, inkubátor, automatická pipeta, laboratorní pracovní deska 41

47 Postup je následující: - nejprve se zkontroluje, zda souhlasí údaje (jméno a rodné číslo) na zkumavce se vzorkem krve a na žádance o vyšetření - vzorek krve se centrifuguje 5 minut při 3000 otáčkách za minutu - ID-karta se označí jménem pacienta a typem testu s příslušným číslem screeningového erytrocytu (1, 2, 3) a vloží do laboratorní desky - do každé jamky ID-karty se napipetuje dle čísel 50 µl příslušných screeningových erytrocytů - a dále do všech jamek ID-karty se napipetuje sérum pacienta (25 µl) - na závěr se do všech jamek napipetuje 25 µl diluentu příslušného k ID-kartě - po té se ID-karta vloží do příslušného inkubátoru na 15 minut při 37 ⁰C - po inkubaci se opět provede centrifugace, tentokrát ID-karty ve speciálně upravené centrifuze po dobu 10 minut při 910 otáčkách za minutu Interpretace výsledků: - negativní reakce- na dně mikrozkumavky je jasně zřetelný sediment erytrocytů - slabě pozitivní reakce- aglutináty jsou rozptýleny v gelové suspenzi - silně pozitivní reakce- na povrchu gelové suspenze se objeví červená linka - stupeň pozitivity se hodnotí semikvantitativně od jednoho až po čtyři kříže - pokud se jedná o pozitivní nález, je nutné určit specifitu antierytrocytární protilátky Identifikace možné antrierytrocytární protilátky se vyšetřuje panelem v prostředí shodném s pozitivitou screeningu. Dále se vždy vyšetří PAT (přímý antiglobulinový test neboli přímý Coombsův test), který slouží k průkazu senzibilizace erytrocytů, dále se provede vyšetření na možné autoprotilátky. Pokud se jedná o nejednoznačný nález, jsou vzorky posílány do referenční laboratoře Ústavu hematologie a krevní transfuze k přesnému určení. 42

48 Tabulka 5. Antierytrocytární protilátky- přehled nejdůležitějších vlastností [převzato z 7, s. 16] Pravidelné protilátky Nepravidelné protilátky Synonymum přirozené protilátky imunní protilátky aglutininy Způsob vzniku vrozené získané geneticky podmíněné jako součást krevní skupiny na základě kontaktu s antigenním podnětem ABO Doba vzniku prenatálně, prokazatelné během života od narození Třída IgM IgG, někdy IgA imunoglobulinů Specifita anti-a, anti-b, anti-a, B např. anti-d, anti-k, anti-p aj. Průchod placentou neprocházejí procházejí Význam určení krevní skupiny transfuze krve transfuze krve Hemolytické onemocnění novorozenců (HON) Autoimunní hemolytická anemie (AIHA) Laboratorní průkaz test v solném prostředí Antiglobulinové testy (NAT, PAT) Enzymatické testy V tabulce číslo 5 jsou porovnány vlastnosti pravidelných a nepravidelných antierytrocytárních protilátek. 43

49 3.4 Analýza autotransfuzí Ve FN Motol bylo za rok 2011 celkem 653 dárců a z tohoto počtu byl proveden odběr u 602 dárců. Z toho počtu bylo 312 pacientů odebráno před plánovanou ortopedickou operací tedy totální endoprotézou (dále jen TEP) kyčelního a kolenního kloubu a jinými ortopedickými operacemi (operace páteře, ramenního a loketního kloubu). Dále bylo odebráno 224 mužů indikovaných z urologického oddělení u diagnóz: karcinom prostaty a přeměna pohlaví z mužského na ženské. Ostatní odběry byly provedeny na žádost Nemocnice na Homolce - 61 odběrů, Klinika dětské hematologie a onkologie - 1 odběr a ORL - 4 odběry. Z počtu 602 odebraných pacientů tvořilo: 390 odběrů u mužů, 205 odběrů u žen a 7 u dětí (4 dívky a 3 chlapci do 18 let), tedy celkem 393 u mužů a 209 u žen Tabulka 6. Rozdělení počtu dárců dle pohlaví a oddělení počet množství v procentech celkem dárců 653 proveden odběr ,19 % neproveden odběr 51 7,18 % ortopedické oddělení ,83 % urologické oddělení ,21 % ostatní oddělení 66 10,96 % muži ,28 % ženy ,72 % V tabulce číslo 6 je možné pozorovat, že z celkového počtu odebraných dárců tvořilo 51,83 % odběrů pro ortopedické oddělení, 37,21 % pro urologické oddělení a 10,96 % ostatní oddělení. V počtu odběrů převládali muži a to z 65,28 %, menší část tedy 34,72 % tvořily ženy. Z celkového počtu dárců nebylo z různých důvodů odebráno 7,18 % pacientů. 44

50 počty odběrů Bakalářská práce Obrázek 1. Graf procentuálního rozdělení odběrů u mužů, žen a dětí Procentuální rozdělení odběrů muži ženy děti 1% 34% 65% Z obrázku číslo 1 je možno vyčíst, že odběry plné krve byly provedeny nejčastěji u mužů, což je způsobeno četností autologních odběrů u urologických operací. Obrázek 2. Graf znázorňující rozložení počtu odběrů podle oddělení Graf počtu odběrů podle oddělení ortopedie urologie ostatní oddělení 66 Z obrázku číslo 2 vyplývá, že nejvíce odběrů se provedlo pro oddělení ortopedie, dalším v řadě v počtu odběrů bylo oddělení urologie a nejméně odběrů bylo na žádost 45

51 ostatních oddělení (Nemocnice na Homolce, Klinika dětské hematologie a onkologie, ORL). Pacientům bylo na základě jejich zdravotního stavu a druhu plánované operace každému odebrány 1-3 jednotky plné krve do vaků o objemech 250 ml, 350 ml a 450 ml (v závislosti na hmotnosti a zdravotním stavu pacienta). Tabulka 7. Počty použitých vaků podle jejich objemů objem vaku množství odběrů 250 ml ml ml 106 Z této tabulky číslo 7 vyplývá, že nejčastěji se ve FN Motol odebírá plná krev do vaku o objemu 350 ml. Z celkového množství 653 dárců bylo odebráno 602 dárců a 51 odběrů nebylo možno provést z důvodu: pozitivity infekčních markerů, nízké hodnoty krevního obrazu (hlavně hemoglobin), infekce močových cest a horních cest dýchacích nebo z důvodu špatného žilního přístupu. Při vyšetření infekčních markerů byly dva vzorky reaktivní na anti-hcv, tedy na protilátky proti hepatitidě typu C. Tyto vzorky byly zaslány na testy do referenční laboratoře. Dle referenční laboratoře byly výsledky obou vzorků uzavřeny jako negativní. Pokud je pacientovi odebrána krev na autotransfuzi před plánovanou operací, následují během nebo po operaci tři možnosti: buď s přihlédnutí na krevní obraz není potřeba předem odebranou krev retransfundovat, nebo je podána pacientovi pouze předem odebraná autologní krev a poslední možností je nedostatečnost autologní krve a podání i alogenního transfuzního přípravku. 46

52 3.4.1 Analýza odběrů autotransfuzí k plánovaným ortopedickým operacím K ortopedickým operacím (TEP kyčelního kloubu, TEP kolenního kloubu a jiné) byly provedeny 1-2 plánované odběry plné krve. Celkem bylo provedeno 312 odběrů z toho 169 u žen a 143 u mužů. Tabulka 8. Rozdělení 1. a 2. odběru podle druhu operace a pohlaví druh operace pohlaví 1. odběr 2. odběr celkem TEP ženy kyčelního kloubu muži TEP ženy kolenního kloubu muži jiné operace ženy muži celkem dle druhu operace Z tabulky číslo 8 je možné pozorovat, že na autotransfuzi před plánovanou ortopedickou operací bylo odebráno více žen- 169 nežli mužů Nejvíce autotransfuzí- 234 pro ortopedické oddělení bylo odebráno před operací TEP kyčelního kloubu, při TEP kolenního kloubu bývají menší krevní ztráty, proto bylo provedeno méně odběrů- 62 autotransfuzí a ve velké většině pouze jeden odběr. A jak je možno vidět v následující tabulce číslo 9, tak oba druhé odběry jak u ženy, tak u muže expirovaly. 47

53 množství odběrů Bakalářská práce Tabulka 9. Výčet odběrů pro ortopedické oddělení v procentech dle druhu operace a pohlaví druh operace TEP kyčelního kloubu TEP kolenního kloubu jiné operace pohlaví celkem celkem v procentech ženy ,99 % muži ,01 % ženy 37 59,68 % muži 25 40,32 % ženy 8 50 % muži 8 50 % celkem dle celkem dle druhu operace v druhu operace procentech % 62 19,87 % 16 5,13 % V tabulce číslo 9 je možno pozorovat procentuální rozdělení odběrů dle pohlaví a jednotlivých ortopedických operací. Obrázek 3. Graf znázorňující druhy ortopedických operací s rozdělením podle pohlaví muži ženy TEP kyčelního kloubu TEP kolenního kloubu druh operace Ostatní Obrázek číslo 3 názorně ukazuje množství odběrů u ortopedických operací a porovnává rozdíly v četnosti dle pohlaví. Je zřetelné, že převládaly autologní odběry 48

54 u TEP kyčelního kloubu: U TEP kyčelního a kolenního kloubu byly v četnosti autologních odběrů více zastoupeny ženy. Tabulka 10. Rozdělení expirovaných transfuzních přípravků z 1. a 2. odběru podle druhu operace a pohlaví Celkem druh operace pohlaví 1. expirace 2. expirace celkem dle druhu operace TEP kyčelního ženy kloubu muži TEP kolenního ženy kloubu muži jiné operace ženy muži V tabulce číslo 10 je zřetelné, že expirovalo více transfuzních přípravků u mužů nežli u žen a to u TEP kyčelního i kolenního kloubu. 49

55 Tabulka 11. Výčet expirovaných transfuzních přípravků v procentech dle druhu operace a pohlaví druh operace pohlaví celkem celkem dle celkem dle celkem druhu druhu operace v procentech operace v procentech TEP ženy 18 14,52 % kyčelního 70 29,91 % kloubu muži 52 47,27 % TEP ženy 14 43,75 % kolenního 32 51,61 % kloubu muži 18 56,25 % jiné operace ženy 2 25 % muži 6 75 % 8 50 % V tabulce číslo 11 je možno pozorovat procentuální rozdělení expirovaných transfuzních přípravků dle pohlaví a jednotlivých ortopedických operací Analýza odběrů autotransfuzí k plánovaným urologickým operacím K urologickým operacím (operace prostaty, přeměna pohlaví z mužského na ženské) byly provedeny 1-3 plánované odběry plné krve. Celkem bylo u mužů provedeno 224 odběrů, 216 před operací prostaty a 8 před operací přeměny z mužského pohlaví na ženské. 50

56 Tabulka 12. Rozdělení odběru podle druhu operace druh operace 1. odběr 2. odběr 3. odběr celkem operace prostaty přeměna pohlaví z mužského na ženské V tabulce číslo 12 je možné pozorovat, že při indikaci plánovaného autologního odběru u operací prostaty, byly u všech mužů provedeny 2 odběry a u přibližně 23 % pacientů byl proveden i třetí plánovaný odběr. U operace přeměny pohlaví mužského na ženské byly u všech pacientů provedeny pouze 2 plánované odběry autologní krve. Tabulka 13. Rozdělení expirace odběru podle druhu operace druh operace 1. expirace 2. expirace 3. expirace celkem operace prostaty přeměna pohlaví z mužského na ženské V tabulce číslo 13 je možné si všimnout, že u operace přeměny pohlaví z mužského na ženské byly podány všechny odebrané autologní krve, a proto žádná neexpirovala a u operace prostaty z odběru expirovalo vždy určité množství autologní krve, protože nebyla při operaci retransfundována. 51

57 množství Bakalářská práce Obrázek 4. Graf odebraných a expirovaných transfuzních přípravků u urologických operací odebrané krve expirované krve operace prostaty druh operace 8 přeměna pohlaví z mužského na ženské 0 Obrázek číslo 4 názorně zobrazuje poměr mezi odebranými transfuzními přípravky u operace prostaty a přeměny pohlaví z mužského na ženské a množství expirovaných transfuzních přípravků. Z grafu je patrné, že z odběrů autologní plné krve indikované urologickým oddělením jednoznačně převládaly odběry před operací prostaty. Tabulka 14. Výčet odebraných a expirovaných transfuzních přípravků v procentech podle druhu operace druh operace celkem odběrů odběry v procentech celkem expirace expirace v procentech operace prostaty ,43 % 29 13,43 % přeměna pohlaví z mužského na ženské 8 3,57 % 0 0 V tabulce číslo 14 je procentuální rozdělení odebraných a expirovaných transfuzních přípravků u urologických operací. 52