PROTEIN J. J. Berzelius 1838 Proteios. PROTEOMIKA Marc Wilkins 1994

Transkript

1 Proteomika II

2 PROTEIN J. J. Berzelius 1838 Proteios PROTEOMIKA Marc Wilkins 1994 PROTEOM Kompletní sada bílkovin p ítomných v daném okamžiku v bu ce, nebo tkáni, zahrnující veškeré jejich modifikace, vzájemné interakce, lokalizaci a metabolický obrat. PROTEOMIKA kvantitativní a kvalitativní charakterizace úplné sady bílkovin organely, bun né linie, tkán nebo organismu kvantitativní a kvalitativní porovnání proteomu za r zných podmínek

3 Cíle proteomiky Získat globální a integrovaný pohled na biologii studiem kompletní bílkovinné sít bu ky, spíše než studiem jednotlivých protein. Cílem je nejen identifikovat všechny bílkoviny, ale zárove pochopit jejich funkci a strukturu a vytvo it 3D mapu bu ky (ur it lokalizaci jednotlivých bílkovin).

4 Pro proteomika když máme genomiku? nelze ur it funkci proteinu na základ sekvence DNA nebo mrna nelze popsat molekulární mechanismy pomocí studia genomu 200 typ posttransla ních modifikací existuje alternativní translace!!!! špatná korelace hladin mrna a skute ných hladin bílkovin!!! PRO PROTEOMIKA KDYŽ MÁME GENOMIKU? PROTOŽE PROTEINY A NIKOLIV GENY VYTVÁ EJÍ FENOTYP!

5 Jeden gen, mnoho bílkovin

6 Schéma sou asné proteomiky

7 Základní schéma analýzy užívané v proteomice Sm s 1. Separace protein 2D-PAGE 2. Izolace Št pení trypsinem Jednotlivé proteiny 4. Sekven ní analýza Fragmentace peptid Sekvence peptid Peptidy 5. Porovnání s databází 3. Hmotnostní analýza Hmotnostní spekroskopie Hmotnostní spektra peptid Identifikace protein

8 Metody využívané sou asnou proteomikou pro studium protein 1. Dvoudimenzionální elektroforéza Nejd íve je vzorek protein rozd len izoelektrickou fokusací zleva doprava a pak elektroforézou podle své hmotnosti shora dol.

9 2D gelová elekroforéza Proteiny jsou rozd leny podle náboje (izoelektrický bod) v prvním rozm ru a velikosti (migrace) ve druhém rozm ru 1. Rozd lení podle izoelektrického bodu (pi) v ph gradientu i ph nižším než pi se protein pohybuje k negativn nabitému konci i ph vyšším než pi se protein pohybuje k pozitivn nabitému konci Protein se zastaví p i ph stejném jako jeho pi 2. Rozd lení podle velikosti v polyakrylamidovém gelu (PAGE) Denaturace pomocí sodium dodecyl sulfátu (SDS-PAGE); SDS se naváže na protein, má negativní náboj Aplikace elektrického pole v 90 Polyakrylamid tvo í síto; migrace protein dle velikosti 3. Zviditeln ní Silver nebo Coomassie barvení

10 2D gelová elektroforéza Rozd lí sou asn stovky i tisíce protein Proteiny jsou rozprost eny na ploše

11 2. Rentgenová krystalografie Rentgenové zá ení, stejn jako sv tlo, je druh elektromagnetického zá ení o velmi malé vlnové délce. Jestliže zam íme svazek paralelních rentgenových paprsk na dob e vyvinutý krystal istého proteinu, n které paprsky budou rozptýleny ur itým zp sobem atomy v krystalu a projeví se jako ur itý obrazec difrak ních skvrn na vhodném detektoru. Poloha a intenzita skvrn v obrazci obsahuje informaci o poloze atom v krystalu proteinu, ze kterého obrazec vznikl.

12 Rentgenová krystalografie (X-ray crystallography) je metoda založena na vychýlení rentgenových paprsk po dopadu na krystal proteinu používá se na ur ení trojrozm rné struktury protein

13 Rentgenová krystalografie

14 3. NMR - spektroskopie Roztok proteinu se umístí do silného magnetického pole, kde je vystaven pulz m rádiové frekvence. Signály, v tomto p ípad z atomových jader vodíku v r zných aminokyselinách lze identifikovat a ur it tak vzdálenosti mezi r znými ástmi proteinové molekuly. V ásti (A) je nazna eno dvourozm rné NMR-spektrum odvozené z karboxylového konce enzymu celulázy. Skvrny p edstavují interakce mezi sousedními atomy H. Výsledná struktura odpovídající rozmíst ní skvrn je v ásti (B).

15 4. Hmotnostní spektroskopie Intensity [%] Mass/Charge

16 Hmotnostní spektroskopie je fyzikáln -chemická metoda pro ur ování hmotnosti molekul a jejich ástí. Hmotností spektrometr je iontov optické za ízení, které ze sm si molekul a iont separuje nabité ástice podle jejich efektivní hmotnosti m/z (m je hmotnost, z je náboj) a umož uje je stanovit. Dále poskytuje údaje o relativním zastoupení iont stejné hmotnosti v celkovém množství iont ve sm si. Záznam molekulárních a fragmentových iont je charakteristický pro danou látku a dává cenné informace o její struktu e a na jeho základ lze v tšinou strukturu látky odvodit nebo potvrdit. Hmotností spektrometrie je metoda citlivá a umož uje analyzovat látky v množství kolem 10 9 g.

17 Analýza hmotnosti iont Hmotnostní spektroskopie (MS) Identifikace neznámé slou eniny

18 Hmotnostní spektroskopie protein (MALDI-TOF) Izolované proteiny jsou trypsinem št peny na peptidy Peptidy jsou analyzovány pomocí MALDI-TOF hmotnostního spektroskopu (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight) Princip metody: peptidy jsou umíst ny na matrix; vytvo í krystaly; jsou ionizovány pomocí laseru; nár st nap tí matrix zp sobí vyražení iontu proti detektoru; m í se as, než ion dorazí k detektoru (je závislý na hmotnosti iontu- ím v tší hmotnost tím delší as letu) Hmotnostní spektra neznámých peptid jsou dále analyzovány pomocí metody zvané peptide mass fingerprinting (PMF) Princip metody: zjišt ná hmotnostní spektra jsou in silico porovnány s genomem; po íta ový program p enese informace z genomu do protein, teoreticky je našt pí na peptidy a vypo ítá jejich hmotnostní spektra; pak porovná hmotnostní spektra neznámých peptid se spektry všech peptid, které kóduje genom

19 Aplikace proteomiky v medicín (proteomika nemocí) Úloha protein ve vzniku nemocí Exprese protein u nemocí Biomarkery nemocí Detekce protein vznikajících b hem nemoci je využita k diagnóze Alzheimerova choroba (amyloid ) Srde ní onemocn ní (interleukin-6 a 8, sérový amyloid A, fibrinogen, troponiny) Renální bun ní karcinom (karbonanhydrasa IX) Vývoj nových lék Informace o proteinech zp sobující onemocn ní je využita pro vývoj nových lék 1. Známá 3D struktura proteinu-po íta ová simulace-hledání léku, který inhibuje patologický protein (HIV-1 proteasa) 2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-odlišný proteom-vývoj individuálních lék

20 Úloha protein ve vzniku nemocí Alzheimerova choroba (AD) Neurodegenerativní onemocn ní charakterizované ztrátou neuron a synapsí Neuropatologické znaky jsou amyloid ß v senilních placích a neufibrilární vlákna intracelulárn Oxida ní stres Nerovnováha mezi tvorbou volných radikál a antioxida ním systémem sledky: Oxidace protein, lipid, DNA a cukr Oxidace protein Št pení peptidového et zce (Karbonyly protein ) Oxidace Ak zbytk (Nitrotyrosin) Navázání produkt peroxidace lipid i glykoxidace

21 Schéma pokusu

22 Úloha protein ve vzniku nemocí Výsledek Potvrzení úlohy oxida ního stresu u Alzheimerovy choroby Posttransla ní modifikace protein v mozku navozená oxida ním poškozením ispívá k rozvoji AD Identifikace poškozených protein, které jsou potenciální cíle pro lé bu

23 Biomarkery nemocí Plasmatické biomarkery u AD Diagnóza AD Klinické projevy+post mortem (histologie) Není žádný spolehlivý diagnostický test (cerebrospinální tekutina-csf se špatn získává) Periferní krev Asi 500 ml CSF je absorbováno do krve každý den Plasma by mohla být zdroj biomarker Identifikace diagnostických biomarker v periferní krvi za pomocí proteomiky: Vzorky krve pacient s AD a kontrol byly analyzovány za pomocí 2D gelové elektroforézy Byly identifikovány body, které se lišily u pacient a kontrol Tyto proteiny byly analyzovány pomocí hmotnostní spektroskopie

24 Výsledek 15 bod signifikantn odlišných u nemocných a kontrol Analýza pomocí MS: nap. α2 makroglobulin, komplement faktor H

25 Vývoj nových lék Informace o proteomu vedou k identifikaci protein zp sobující onemocn ní 1. Po íta ový software tyto proteiny využije jako cíle pro vývoj nových lék Nap. protein zp sobující onemocn ní-3d struktura-po íta vyvine látku, která ho inaktivuje (navázání na aktivní místo inaktivuje enzym) 2. Genetické odlišnosti mezi lidmi-po íta vyvine individuální lék, který je efektivn jší Virtual ligand screening HIV 1-proteasa Št pí HIV protein na menší funk ní proteiny; virus nep ežije bez tohoto enzymu (nejvýznamn jší cíl lé by HIV)

26 Alpha-synuclein je 14 kda protein, který je ve velké mí e exprimován v r zných ástech mozku, a který se ú astní patofyziologie n kterých neurodegenerativních onemocn ní. P i t chto onemocn ních postupn zanikají n které populace nervových bun k, což je spojeno s velmi vážnými psychickými a neurologickými p íznaky. Projevují se ztrátou pam ti a rozumových schopností, poruchami chování, asto i halucinacemi, bludy a celkovým úpadkem osobnosti. Neurologické projevy se týkají p edevším správné koordinace a ízení pohybu a e i. B Transverzální ez st edním mozkem, kde je dob e viditelná substantia nigra Substantia nigra Zúžená substantia nigra, jak ji m žeme vid t u Parkinsonovy choroby V nativní form je alpha synuclein nestrukturovaný (angl. unfolded) a svou fibrilární strukturu získává teprve až agregací. E Amfipatická oblast Centrální doména Kyselá oblast

27 Faktory, které urychlují agregaci alpha- synucleinu: P ítomnost mutací - A30P, A53T a E46K mutované proteiny vytvá í fibrilární struktury rychleji než wt protein. Zkrácené verze protein (angl. truncation) - zkrácený alphasynuclein, který obsahuje pouze 120 resp. 108 aminokyselin je mnohem více náchyln jšíktvorb filament in vitro než celý (angl. full-length) protein. Koncentrace proteinu. Interakce s ionty, p ípadn s jinými látkami. P ídavek malého množství agregátu alpha-synucleinu k nativní form tohoto proteinu.

28 Agregace alpha-synucleinu Normální protein (Monomer) A Abnormální protein (Agregát) B Protofibrily Amyloidní fibrily Póry Jak? Neurodegenerace a onemocn ní

29 Avidin je glykoprotein tetramerní struktury o molekulové hmotnosti 66 kda a nachází se ve vaje ném bílku pták, plaz a obojživelník. Jeho neglykosylovaný homolog streptavidin, který je produkován bakterií Streptomyces avidinii, má velice podobnou molekulární hmotnost a stejn jako avidin tvo í tetramer. Narozdíl od avidinu není bazický a neobsahuje žádnou sirnou aminokyselinu (kdežto u avidinu se nachází jedna disulfidická vazba a dva methioniny). Jejich kvarterní strukturu tvo í ty i identické podjednotky, z nichž každá má velmi vysokou afinitu k vitamínu biotinu. Oba dva tyto proteiny nalezly široké uplatn ní v afinitních separacích, diagnostických stanoveních a v celé ad dalších aplikací, které jsou založené na (strept)avidin-biotin technologii Sonda (Strept Strept)avidin Biotin Vazebný ligand Cílový ligand APLIKACE

30 Protein MutS je termostabilní molekula jejíž velikost se pohybuje kolem 90 kda. Je sou ástí tzv. MMR systému (systém oprav chybného párování bází) a hraje velmi významnou úlohu v repara ním systému DNA u prokaryotických i eukaryotických bun k, kde rozpoznává nespárované nebo nesprávn párované báze v dvoušroubovici DNA. Homology proteinu MutS m žeme nalézt tém ve všech organismech. Eukaryotické genomy obsahují n kolikanásobné muts homologní (msh) geny a s výjimkou mitochondriálního proteinu MSH1, tvo í všechny ostatní eukaryotické proteiny MutS heterodimery. Systém m opravy chybného ho párovp rování bází u savc je v mnoha ohledech stejný jako u bakterií.

31 Souhrn Proteomika studuje proteiny, hlavn jejich strukturu, funkci a interakce Genom byl již zmapován, nyní je na ad proteom (miliony protein ) Metod, které proteomika využívá je velké množství, mezi základní pat í 2D gelová elektroforéza a hmotnostní spektroskopie Proteiny ur ují fungování organismu a jejich patologie spouští nemoci; proto je proteomika zásadní pro zjiš ování p in chorob, diagnózu a lé bu

32 Proteinové databáze