Analýza protein SDS PAGE elektroforézou

Transkript

1 Analýza protein SDS PAGE elektroforézou

2 Molekulárn biologická diagnostika Diagnostika na úrovni DNA, RNA a protein Analýza genomu, transkriptomu, proteomu, p íp. metabolomu Analýza kvalitativní i kvantitativní

3 Nejpoužívan jší techniky - proteiny Dvoudimenzionální ELFO Rentgenová krystalografie NMR Hmotnostní spektroskopie Chromatografie (HPLC) ELISA

4 Metody využívané sou asnou proteomikou pro studium protein 1. Dvoudimenzionální elektroforéza Nejd íve je vzorek protein rozd len izoelektrickou fokusací zleva doprava a pak elektroforézou podle své hmotnosti shora dol.

5 2. Rentgenová krystalografie Rentgenové zá ení, stejn jako sv tlo, je druh elektromagnetického zá ení o velmi malé vlnové délce. Jestliže zam íme svazek paralelních rentgenových paprsk na dob e vyvinutý krystal istého proteinu, n které paprsky budou rozptýleny ur itým zp sobem atomy v krystalu a projeví se jakour itý obrazec difrak ních skvrn na vhodném detektoru. Poloha a intenzita skvrn v obrazci obsahuje informaci o poloze atom v krystalu proteinu, ze kterého obrazec vznikl.

6 3. NMR - spektroskopie Roztok proteinu se umístí do silného magnetického pole, kde je vystaven pulz m rádiové frekvence. Signály, v tomto p ípad z atomových jader vodíku v r zných aminokyselinách lze identifikovat a ur it tak vzdálenosti mezi r znými ástmi proteinové molekuly. V ásti (A) je nazna eno dvourozm rné NMR-spektrum odvozené z karboxylového konce enzymu celulázy. Skvrny p edstavují interakce mezi sousedními atomy H. Výsledná struktura odpovídající rozmíst ní skvrn je v ásti (B).

7 4. Hmotnostní spektroskopie Intensity [%] Mass/Charge Hmotnostní spektroskopie je fyzikáln -chemická metoda pro ur ování hmotnosti molekul a jejich ástí. Hmotností spektrometr je iontov optické za ízení, které ze sm si molekul a iont separuje nabité ástice podle jejich efektivní hmotnosti m/z (m je hmotnost, z je náboj) a umož uje je stanovit. Dále poskytuje údaje o relativním zastoupení iont stejné hmotnosti v celkovém množství iont ve sm si. Záznam molekulárních a fragmentových iont je charakteristický pro danou látku a dává cenné informace o její struktu e a na jeho základ lze v tšinou strukturu látky odvodit nebo potvrdit. Hmotností spektrometrie je metoda citlivá a umož uje analyzovat látky v množství kolem 10 9 g.

8 SDS-PAGE (= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) -metoda pro separaci protein dle jejich velikosti

9 Pro používat akrylamidový gel k separaci protein? Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix Ideální pro separaci protein Menší velikost pór než u agarosy Proteiny jsou menší než intaktní chromoz. DNA Gel je vytvo en polymerací aktylamidu a N,N methylenbisakrylamidu zahájenou volnýmí radikály vzniklými i rozkladu persíranu amonného.

10 Jednotlivé kroky experimentu *P íprava polyakrylamidových gel * íprava vzork pro SDS-PAGE *Pova ení vzork p i 95 C po dobu 4 min. *Aplikace vzork na gel *Vlastní elektroforesa probíhá p i konstantním nap tí 200 V po min *Barvení gelu pomocí Coomassie Blue *Odbarvení gelu MetOH/HOAc

11 Diskontinuální elektroforéza v PAGE 2 r zné gely a n kolik odlišných pufr o r zném ph Porozitu lze volit podle o ekávaného spektra látek licí gel (s pufrem o hodnot ph 8,8) se p ekrývá cca 1 cm vrstvou tzv. startovacího (zaost ovacího) gelu s velkými póry (pufr o hodnot ph 6,8) Tris-glycinový elektrodový pufr (ph 8,3-8,6) po zapnutí proudu ionty tohoto pufru putují z nádoby do startovacího gelu a p ed nimi postupují ionty z tohoto gelu Ionty s elektrod. pufru se setkávají s ph, které je daleko nižší než jejich pk a vytvá ejí proto nenabité (u glycinu obojetné) formy nepohyblivé v el. poli Tím je zp soben lokální nedostatek nabitých ástic, vzniká velký odpor musí být kompenzován (místním zvýšením intenzity el. pole). Anionty se pohybují rychleji, dokud nevstoupí do d licího gelu rychlost je zpomalena p ítomností velkého množství iont v pufru ionty makromolekul vstupují do d licího gelu v podob velmi úzkých, na sebe navrstvených proužk se azených dle své pohyblivosti Ve vyšším ph d licího gelu nabudou makromolekuly znovu svou pln nabitou formu a dále probíhá normální elektroforetické d lení (získaná hustota zón p i vstupu makromolekul do d lícího gelu zvyšuje stupe rozlišení jednotlivých molekul).

12 Praktické zhotovení gelu ipravíme ELFO skla Složíme elektroforetické kom rky pro nalití gel ipravíme základní roztok pro d licí gel, p idáme k n mu TEMED a APS pro zahájení polymerace Naneseme gel do elektroforetické kom rky, zarovnáme hladinu redestilovanou vodou a necháme tuhnout (min. 45 min). ipravíme roztok pro zaost ovací gel, p idáme k n mu TEMED a APS Nanášíme jej do elfo kom rky na povrch d licího gelu a vsadíme eben pro vytvo ení jamek a necháme jej tuhnout (min. 45 min) Odstraníme h eben, uvolníme elfo kom rky s gelem

13 Do elektroforetické nádoby nalejeme elfo pufr Stojan s elfo kom rkami s p ipravenými gely vložíme do elfo nádoby, doplníme elektroforetický pufr Naneseme vzorky (p ed nanášením se musí pova it se vzorkovým pufrem p i C po dobu 5 min) Doplníme elfo pufr a zapneme zdroj (80V po 0,5-1hod, 120 V po 1-1,5 hod) Ukon ení elektroforézy po dob hnutí elfo barviva na konec d licího gelu Rozd láme elfo kom rky, vyndáme gely a: - barvíme - p eneseme proteiny na nitrocelulózovou membránu a blotujeme

14 Akrylamidový gel akrylamid N,N - methylenbisakrylamid

15 Akrylamidový gel Zdroj volných radikál APS amonium persulfát (NH 4 ) 2 S 2 O 8 (peroxodisíran amonný) CAS Katalyzátor TEMED N,N,N,N -tetramethylethylendiamin CAS

16 Akrylamidový gel

17 SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) CH 3 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) aniontový detergent solubilizuje a denaturuje proteiny dodává protein m negativní náboj tšina protein váže SDS ve stejném pom ru, asi 1,4 g SDS/g proteinu Zvýšená teplota denaturuje proteiny O CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O S O - O SDS

18 -proteiny jsou tepeln denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura -denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS migrace tedy závisí pouze na jejich molekulové hmotnosti

19 Pohyb takto upravených protein v elektrickém poli: -proteiny mající negativní náboj se pohybují sm rem ke kladn nabité elektrod

20 SDS-PAGE standardy Protein Kalibrované MW v Tris-HCl gelu Myosin 201,179 β-galactosidáza 120,284 Bovinní sérový albumin 100,236 Ovalbumin 55,925 Anhydráza 38,289 Soyben trypsin inhibitor 29,678 Lysozym 20,669 Aprotinin 6,969

21 Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE? *Tris pufr utvá í vhodné ph *SDS (dodecyl sulfát sodný) detergent poskytující protein m negativní náboj *Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajiš uje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení * Bromophenol Blue barvivo umož ující sledovat pr h elektroforézy (pohyb ela v gelu)

22 Separace protein v akrylamidovém gelu

23 íprava gelu

24 Denaturované vzorky jsou naneseny na gel

25 Podmínky pro elektroforézu: 15 min, 50 V 15 min, 100 V 1 1,5 hod 150 V

26 K vizualizaci protein dochází v roztoku Coomasie blue.

27 Jak funguje SDS-PAGE? Negativn nabité proteiny se pohybují ke kladné elektrod s-s SDS, zah átí Proteiny s SDS Menší proteiny se pohybují rychleji Proteiny se rozd lují podle velikosti (molekulové hmotnosti) - +

28 Molekulová hmotnost protein velikost m ena v daltonech (Da) i kilodaltonech (kda) Dalton = jednotka atomové hmotnosti = p ibližn se rovná hmotnosti atomu vodíku (1,66 x g) = definován také jako 1/16 hmotnosti atomu kyslíku Pr rná aminokyselina = 110 Da Pr rný nukleotidový pár = 649 Da

29 Blotting protein a nukleových kyselin Pro další charakterizaci nebo p i mikropreparaci je nutné extrahovat proteiny i nukleové kyseliny z gelu, kteý je nevhodný pro manipulaci i pro provád ní detek ních chemických reakcí. Je p itom nutné zabránit smísení separovaných biomakromolekul. Nej ast ji se používají techniky tzv. blottingu (angl. blot = skvrna, ka ka, esky p enos). P i blottingu se pásy separované elektroforézou p enášejí na ur itou membránu, kde jsou uchyceny adsorpcí nebo kovalentní vazbou. Po vazb na membránu je pak možné provád t analýzu znými zp soby. DNA analýza (Southern blotting, Southern 1975) RNA analýza (Northern blotting, Alwine et al., 1977) PROT analýza (Western blotting, Towbin et al., 1979)

30 Southern blotting DNA je z gelu p enesena na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu. ítomnost ur ité jedno et zcové DNA je pak potvrzena hybridizací - vazbou komplementárního DNA et zce (sonda i proba), který je zna en radioaktivn, biotinylací nebo vazbou antigenu pro imunodetekci. Použití nap. pro azení fragment restrik ního št pení genomové DNA jednotlivým gen m. Northern blotting Separovaná RNA je p enesena na membránu. Specifická detekce se d je hybridizací s komplementární DNA sondou, která je zna ena. Ob metody mají velký význam pro molekulární biologii, ale v sou asné dob jsou ast ji zastupovány PCR technikami.

31

32 Western blotting Proteiny jsou separovány SDS-PAGE a následn p eneseny na nitrocelulózovou nebo polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu. Barvení na membrán se provádí pomocí Ponceau S, Fast Green nebo Amido erni10 B. Specifická detekce protein se provádí použitím primárních protilátek; vzniklý imunokomplex se visualizuje vazbou zna ené sekundární protilátky nebo zna eného proteinu A i G (zna ení nej ast ji vazbou enzymu - nap. alkalické fosfatasy a peroxidasy, ale i koloidním zlatem, radioaktivn, luminiscen i fluorescen. Detekce glykoprotein se d je modifikovanou Schiffovou reakcí, alcianovou mod í, vazbou lektin. N které enzymy lze prokázat b žnou reak ní sm sí nebo p i blottingu asto dochází k renaturaci již denaturovaných bílkovin.

33

34 Blokování Vzhledem k tomu, že v tšina používaných detek ních systém po blottingu obsahuje jako indika ní složky proteiny, je nutné po vlastním p enosu blokovat zbývající vazebná místa na membrán, aby zde nedocházelo k nespecifické vazb t chto bílkovin. Nesmí však dojít k vyt sn ní vzorku, jeho modifikaci nebo k interferenci s detek ní reakcí. Používají se: inertní proteiny BSA, kasein, hemoglobin, želatina p íp. nízkotu né mléko. Nespecifické vazb protein na membránu p i detekci brání v n kterých aplikacích použití neionogenních detergent. Obdobn je nutné inaktivovat volné reaktivní skupiny diazotovaných membrán a membrán aktivovaných CNBr. To se d lá použitím 10% roztoku ethanolaminu.

35 Rozd lení metod blottingu podle provedení Difuzní blotting - prostá difuze v tanku s p enosovým pufrem, dlouhá doba hodin, velkou nevýhodou difuze do stran - zhoršení rozlišení vlastní elektroforetické separace. Kapilární blotting - blotovací membrána umíst na na povrchu gelu, který leží na porézní podložce v nádob s p enosovým pufrem, na ní pak vrstva vlhkého filtra ního papíru a ada vrstev suchých filtra ních papír. Celá jednotka je zatížena. Suchý papír nasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu. Trvá zhruba 12 hodin. Vakuový blotting - obdobné uspo ádání jako u kapilárního blottingu, místo kapilárních sil vzorek tažen vakuem. Podstatn rychlejší (30 min). Výhodou též ost ejší pásy (potla ení difuze).

36 Kapilární blotting

37 Rozd lení metod blottingu podle provedení Elektroblotting - nejrychlejší a nejú inn jší metoda. Hnací silou je v tomto p ípad síla elektrického pole. Podle provedení se rozlišuje tzv. tankový (tank, wet) blotting a polosuchý (semidry) blotting. Jediný pro vysokomolekulární biopolymery. Hlavními výhodami polosuchého blottingu v porovnání s tankovým jsou: 1) homogenní elektrické pole, 2) možnost vyššího nap ového gradientu, 3) menší spot eba p enosového pufru, 4) možnost simultánního p enosu z n kolika gel Volba p enosového pufru je podmínkou pro úsp šný blotting. ležitý pro výb r složení je zejména typ použité membrány, u elektroblottingu p istupuje ješt ph pufru a iontová síla.

38 Elektroblotting

39 Difuzní blotting a tankový elektroblotting

40 Polosuchý elektroblotting