Elektromigrační metody

Transkript

1 Elektromigrační metody Princip: molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém Arne Tiselius rozdělil proteiny krevního séra na základě jejich rozdílných rychlostí pohybu v elektrickém poli (Nobelova cena 1948)

2 molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém rychlost pohybu dána: celkovým nábojem na molekule tvarem hmotností odporem okolního prostředí Rychlost částice kulového tvaru nesoucí náboj q je v elektrickém poli E dána rovnicí: v = qe/6πrη V praxi se častěji používá výrazu pohyblivost (rychlost částice v jednotkovém elektrickém poli) m = q/6πrη

3

4 Typy elektromigračních metod Elektroforéza Izotachoforéza Izoelektrická fokusace

5 Prostředí elektromigračních metod Elektromigrační metody ve volném roztoku Elektromigrační metody na nosičích zabránění zpětnému míchání dělených látek difuzí menší technická náročnost současné separace více vzorků reprodukovatelnost flexibilita a snadná manipulovatelnost různé druhy gelů, méně často papír, film acetyl celulosy, tenká vrstev silikagelu.

6 Uspořádání gelů vertikální elektroforéza horizontální elektroforéza

7 Gely na bázi agaru Agarové gely Agar směsi dvou polysacharidů, agarosy a agaropektinu. V současné době gely na bázi agaru nahrazeny gely agarosovými Agarosové gely 0,2 % agarosy - teplota pod 45 o C - vzniká gel Velikost pórů 1 % (w/v) agarosy 150 nm 0,16 % agarosy 500 nm nejčastěji gely o koncentraci agarosy 0,5 až 1 %.

8 Dvoušroubovice polysacharidu se spojují mezi sebou a vytvářejí pevnou síť Použití tam, kde je zapotřebí větších pórů částice nad 10 nm analýza a čištění DNA a RNA a jejich fragmentů.

9 Polyakrylamidové gely polymerací monomerů akrylamidu a síťovacího činidla N,N -methylenbisakrylamidu (BIS) transparentní chemicky inertní mechanicky stálý

10 Velikost pórů přesný poměr akrylamidu a BISu Množství akrylamidu (T) - celková koncentrace akrylamidu v gelu (w/v) Množství BISu (C) - hmotnostních procentech vztažených na celkovou hmotnost akrylamidu v gelu (w/w) podle rovnic: %T = 100. (AA + BIS)/V %C = 100. BIS/(AA + BIS)

11 Závislost velikosti pórů v polyakrylamidoném gelu na koncentraci %T akrylamidu a %C BISu Velikost pórů úměrně závisí na koncentraci akrylamidu ne však BISu Nejmenší póry - koncentrace BISu 5 %

12 Fázový diagram závislosti přechodu polyakrylamidového gelu ze stavu transparentního do stavu zakaleného na koncentraci %T akrylamidu a %C BISu

13 rozdělovací limit pro koncentrace akrylamidu a BISu

14 Příprava PAGE gelů Polymerizace katalyzátor - N,N,N,N -tetramethylendiamin (TEMED) anionty persíranu - zdroj kyslíkových radikálů riboflavin - UV záření - volné radikály inertní atmosféra - kyslík lapač radikálů mezi dvěma skleněnými deskami opatřenými spacery polymerační směs - převrstvená (vodný roztokem alkoholu) teplotně závislá - zpomaluje snižováním teploty běžně teplota místnosti tj. asi 20 o C

15 Nosiče na bázi dextranu Inertní polysacharid dextran Použití v Izoelektrické fokusaci Semipreparativní účely

16 Elektroforéza (ELFO) částice se dělí v elektrickém poli v závislosti na jejich pohyblivosti

17 Volná elektroforéza Dělené látky se pohybují volně v roztoku Minimální odpor prostředí Pohyblivost dána hlavně velikostí náboje Nebezpečí difůze

18 Elektroforéza na gelových nosiších agarosový polyakrylamidový vertikální horizontální nerestriktivní restriktivní

19 Desková nerestriktivní elektroforéza dostatečně velké póry - odpor prostředí zanedbatelný pohyblivost dána velikostí náboje agarosové gely horizontální uspořádání

20 Desková restriktivní elektroforéza velikost pórů - odpor prostředí pohyblivost - celkový náboji + velikosti molekul logaritmická závislost relativní pohyblivosti na koncentraci gelu - dekadický logaritmus relativní pohyblivosti Fergusnův plot. A - Bílkoviny mají stejnou velikost ale rozdílný náboj. B - bílkoviny mají rozdílný náboj i velikost.

21 Agarosová gelová elektroforéza veliké částice gely o vyšší koncentrací zakalené proteiny pouze vysokomolekulární nebo komplexy standardní metoda dělení nukleových kyselin a jejich fragmentů DNA, RNA horizontální uspořádání tzv. submarine (ponořených) gelů

22 Polyakrylamidová elektroforéza (PAGE) nejrozšířenějším typem elektroforézy proteinů bílkoviny i nukleové kyseliny u nukleových kyselin sekvenovámí DNA lze rozdělit fragmenty DNA lišící se o 6 bází při celkové délce 500 bází 0,5 mm gely vyšší citlivost než agarosa Gely s velkými póry (T = 2 % a C = 9 %) řetězce DNA okolo 2300 párů bází (800kDa) bílkoviny deskové gely horizontální i vertikální

23 Diskontinuální elektroforéza gel - dvě části zaostřovací (stacking) dělící (resolving) složení a ph - zaostřovací gel izotachoforéza dělící gel elektroforéza

24 Gradientová elektroforéza postupná změna koncentrace akrylamidu v polymerační směsi směsi látek s velkým rozsahem pohyblivosti (velikosti, molekulové hmotnosti)

25 Dělení proteinů v různých typech gelů

26 Nativní elektroforéza Elektroforéza za nedenaturujících podmínek Proteinům dodává náboj specifická látka Elfo na základě přirozeného náboje molekul

27 SDS denaturující elektroforéza SDS - sodium dodecylsulphate (dodecylsulfát sodný, sodium laurylsulphate) dělení proteinů za základě molekulových hmotností výsledný náboj - množství záporně nabitých molekul detergentu

28 SDS denaturující elektroforéza SDS narušuje jak terciální tak i sekundární strukturu disulfidické můstky redukující činidlo 2-merkaptoethanol nebo dithiotreitol (DTT). bílkoviny získávají jednotný tvar elipsoidu Během dělení nutná přítomnost 0,1 % SDS v gelu logaritmický vztah mezi molekulovou hmotností pohyblivostí

29 SDS denaturuje proteiny, DTT nebo merkaptoethanol štěpí S-S můstky

30 Situace kdy pohyblivost v přítomnosti SDS neodpovídá molekulové hmotnosti: protilátky bez redukce disulfidických můstků glykoproteiny - na polysacharidy se SDS neváže membránové bílkoviny na hydrofobní oblasti se SDS váže v jiném poměru silně kyselé proteiny a nukleoproteiny - SDS se váže v neurčitých poměrech

31 DNA sekvenování polymerace DNA na izolované jednovláknové DNA frakce s různě dlouhými fragmenty - syntéza ukončena značenými terminálními dideoxynukleotidy elektroforetické dělení fragmentů DNA sekvence nukleotidů se odečte z gelu Dideoxycytosine (ddctp)

32 Kapilární elektroforéza Roku 1981 J. W. Jorgenson a K. D. Lukacsová popsali separaci různých iontů (aminokyselin, dipeptidů, aminů) zónovou elektroforézou ve velmi tenké skleněné kapiláře s vnitřním průměrem 75 μm vodné prostředí v úzkých kapilárách v délce od 10 cm až do 1 m vnitřní průměr nejčastěji 25 až 50 μm vnitřní úprava - zabraňuje nespecifické adsorpci dělených látek na stěnu možnost automatizace - automatické dávkovače vzorků, detektory na principu UV/VIS absorpce světla malá spotřeba vzorku - nanolitrové množství vzorku většina analýz ve vodném prostředí polyakrylamidové gely, rozpustné hydrofilní polymery

33 Schéma zařízení na kapilární elektroforézu

34 Izoelektrická fokusace (IEF) Dělení látek podle jejich náboje v gradientu ph Základní předpoklad - vytvoření stabilního a spojitého gradientu ph Látky, které doputují do místa kde se jejich pi rovná ph v gelu se zastaví

35 amfoterické látky - bílkoviny, peptidy nízké ph R-COO- + H+ -> R-COOH R-NH3 + H+ -> R-NH4+ vysoké ph R-COOH + OH- -> R-COO- + H2O R-NH4+ + OH- -> R-NH3 + H2O ph - molekula se jeví jako elektroneutrální - izoelektrický bod pi pi je pro každou bílkovinu specifické glykoproteiny a nukleoproteiny - pi určují i cukry a báze nukleových kyselin Proteinem s nejnižším známým pi 1,8 - kyselý glykoprotein ze šimpanze Proteinem s nejvyšším známým pi 11,7 - lysozym z lidské placenty

36 ph gradienty tvořené amfolyty Amfolyty - směsi uměle připravených amfoterických organických sloučenin oligoamino-oligokarboxylové kyseliny smíchání vhodných látek - rozmezí od ph 3 až do ph 10 anodový pufr kyselý katodový pufr zásaditý

37 Imobilizované ph gradienty deriváty akrylamidu s pufrujícími funkčními skupinami kopolymerace a akrylamidem a síťovacím činidlem ph gradient - postupná změna poměru jednotlivých derivátů akrylamidu v gelu pk od 3 do 9 použití mísiče gradientu není nutné používat kyselých a zásaditých elektrodových pufrů nedochází ke změně ph v čase během dělení látek

38

39

40 Vliv rozsahu ph na dělení proteinů IEF

41 Podmínky izoelektrické fokusace nedenaturující metoda - důležité optimalizovat podmínky agregace, precipitace kontrola teploty - pk, pi závislé na teplotě předfokusace - vytvoření ph gradientu před nanesením vzorků optimální pozice pro nanášení vzorků ph gradienty citlivé k vyšším koncentracím solí - dialíza doba dělení - kompromis mezi optimálním rozdělením a minimálním osunem ph gradientu

42 2D (dvojrozměrná) ELFO První rozměr: dělení látek za nedenaturujících podmínek - separace celých komplexů Druhý rozměr: dělení látek za denaturujících podmínek - analýza separovaných komplexů

43 2D ELFO a IEF

44 2D ELFO multicoulor

45

46 2D ELFO Blue native bílkoviny získají v prvním rozměru náboj navázáním záporně nabité Commassie Brilliant Blue G-250, která je přítomná v katodovém pufru 2 rozměr SDS ELFO

47 Barvení gelů Commassie Brilliant Blue G-250 Barvení stříbrem ng proteinu / band ng proteinu / band Specifické barvení např. cytochromy