PORUŠENÍ ZDRAVÍ CHEMICKÝMI LÁTKAMI

Transkript

1 PORUŠENÍ ZDRAVÍ CHEMICKÝMI LÁTKAMI Ing. Eliška Bradková Ústav soudního lékařství a toxikologie Studničkova 4, Praha 2 Eliska.Bradkova@vfn.cz

2 Toxikologie je věda o poškození živého organismu následkem působení jedů a jejich metabolitů. Úkolem toxikologie je: -identifikovat jed -zjistit účinky jedů s cíli: diagnostickými preventivními terapeutickými forenzními

3 Pojmy: JED OTRAVA PŘEDÁVKOVÁNÍ Jedem je látka, která po vstřebání podílu aplikované dávky do organismu vyvolá poškození zdraví přechodné nebo trvalé a v krajním případě může způsobit také smrt.

4 Otrava je chorobný stav organismu vyvolaný škodlivinou, jedovatou látkou. Noxa (škodlivina ) může být látka, která je kvalitativně organismu cizí (xenobiotikum) nebo látka, která je organismu cizí kvantitativně. Vyvolané účinky dávkou noxy souvisí se: a) způsob podání b) jednorázová dávka x opakovaná dávka c) individuální momentální zdravotní stav organismu (zdravotní stav osoby)

5 Toxicita látek se vyjadřuje obecně dávkou, potřebnou k dosažení určitého účinku (např. letální dávka ( střední LD50 - po které uhyne 50% pokusných zvířat) - podání více léků nebo jiných nox současně může vést ke změně účinků ve smyslu a) synergickém b) antagonistickém - změna kvality účinku - změna velikosti a trvání účinku

6 Mezinárodní klasifikace nemocí ( MKN-10 ) schválená Světovou zdravotnickou organizací hodnotí otravy pro statistické účely spíše nepřímo Jako např. sebevražda drogová závislost neúmyslná nesprávná aplikace látky aj. Nikoliv jednoznačně podle jedu, který zapříčinil intoxikaci Předávkování jednou látkou může být v různých souvislostech zařazeno pod několik kódů

7 Předmět zájmu forenzní toxikologie: vyhledávání neznámé noxy a její správná identifikace a kvantifikace pro vysvětlení toxických účinků, popř. příčiny smrti Forenzní toxikologie je aplikace poznatků z toxikologie pro právní účely. -zaměřuje se: a) zkoumání biologického materiálu post mortem b) zkoumání biologických vzorků živých osob, zejm. ve vztahu k návykovým látkám v dopravě, v pracovním procesu

8 Základní předpoklad zdařilého toxikologického zkoumání je: A) správná volba vhodných vzorků biologického materiálu k analýze - krev, moč, žaludeční obsah, v případě osob zemřelých se provádí vyšetření parenchymatosních orgánů: jater, ledvin a sleziny B) dostatečné množství biologického materiálu vzhledem k řešenému úkolu v konkrétním případě Velikost odebíraného vzorku by měla být dostatečná, aby bylo možné analýzu zopakovat

9 Problematika stanovení ethanolu v biologickém materiálu a používané vyšetřovací metody Metodický pokyn s názvem: Metodický pokyn pro postup při laboratorním stanovení alkoholu (ethylalkoholu ) v krvi Věstník Ministerstva zdravotnictví září 2006, částka 7

10 Ethanol v krvi se zjišťuje pro potřeby: a) zdravotnické b) právní Pro potřeby zdravotnické: Vyšetření se provádí za účelem a) diagnostickým b) epidemiologický 1) u osob živých ( např. dopravní nehody, dopravní kontroly) 2) u osob zemřelých (odběr krve při pitvě zemřelého)

11 O indikaci odběru a vyšetření krevního vzorku pro potřeby zdravotnické rozhoduje lékař. Pro účely právní se vyšetření provádí v případech, kdy o to požádají oprávněné orgány. O vyšetření ethanolu v krvi může požádat rovněž občan sám Odběr krevního vzorku pro laboratorní stanovení ethanolu je oprávněn provést ze žíly lékař, popř. jiný, jím pověřený zdravotnický pracovník, za jeho přímého dohledu

12 Bezprostředně před odběrem krve - pro účely právní - lékař provede vyšetření cíleně zaměřené na zjištění známek účinku ethanolu - lékař vyplní protokol na předepsaném formuláři

13 Do Protokolu část B - lékař uvádí dobu (datum a čas) vyšetření a dobu odběru krve, použitou desinfekci. Desinfekční prostředek nesmí obsahovat ethanol ani jiné těkavé látky V případě odběru krve pro účely právní je odběru krve vždy přítomen žadatel ( např. policista) Protokol 4 vyhotovení

14

15 Vyšetření krevního vzorku za účelem stanovené ethanolu - pro účely zdravotnické provádějí příslušné specializované laboratoře - pro účely právní pak specializované toxikologické laboratoře (toxikologické laboratoře Ústavu soudního lékařství)

16 Vzorek krve musí být vyšetřen 2 na sobě nezávislými laboratorními metodami - jedna musí být přísně specifická - metoda plynové chromatografie ( GC ) NEZASTUPITELNÁ - druhá ověřovací - nespecifická, ale přesná metoda ( Widmarkova metoda, enzymatická apod. ) Vyšetření GC - nutno provést nejméně 2 x z téhož vzorku krve ověřovací zkoušku nejméně 1 x

17 Výsledky stanovení se uvádějí v jednotkách g/kg Povolená odchylka mezi výsledky obou metod: v rozmezí koncentrací 0 3,0 g/kg nebo = 0,2 g/kg při hodnotách vyšších než 3,0 g/kg nebo = 0,3 g/kg v opačném případě nutné vyšetření opakovat GC 2 x, ověřovací metodu 2 x z téhož vzorku krve

18 Za pozitivní průkaz požití alkoholického nápoje se pokládá hladina ethanolu v krvi vyšší než 0,20 g/kg, stanovená metodou plynové chromatografie 3. část Protokolu: uvádí se výsledek vyšetření provedeného plynovou chromatografií = průměr ze dvou hodnot měření GC

19 Metoda plynové chromatografie -umožňuje identifikovat jednotlivé těkavé látky obsažené ve vzorku (toxikologická laboratoř ÚSLT vzorek biologického materiálu, např. krev)

20 Princip GC: Složky vzorku v plynném stavu jsou unášeny proudem mobilní fáze ( inertní plyn např. dusík, helium) kolonou obsahující stacionární fázi ( kapalina, gel, elastomer). Dochází k adsorpci jednotlivých látek a následnému uvolnění na základě nestejné rovnováhy složek mezi mobilní a stacionární fází, to se projeví odlišnou dobou zadržení jednotlivých látek v koloně. Doba zadržení závisí na struktuře chromatografovaných molekul a na způsobu jejich interakce se stacionární fází. Teplotní program pro stanovení ethanolu - isotermický

21 Na výstupu z kolony je umístěn detektor. Jednotlivé složky vychází z kolony v definovaném čase retenční čas látky za definovaných podmínek- do detektoru, který indikuje přítomnost látek v nosném plynu v různých časových intervalech. Retenční čas = čas, který uplyne od doby dávkování látky (vstup látky do kolony) do doby maxima eluční vlny látky. V detektoru FID (plameno ionizační) dochází ke spalování organických látek v plamínku vzduch-vodík za vzniku nabitých částic ionizační proud úměrný koncentraci složky

22 Metoda plynové chromatografie v uspořádání Head Space Vhodnou metodou pro jednoznačnou identifikace noxy ethanolu, event. jiných těkavých toxických látek, v toxikologické praxi a následnou kvantifikaci látky je metoda plynové chromatografie v uspořádání Head Space - stanovení těkavých látek přítomných v netěkavé matrici - ustanovení rovnovážného stavu mezi vzorkem ( kapalina, např. krev, moč, pevná fáze) a plynnou fází v prostoru nad vzorkem v hermeticky uzavřené skleněné vialce Výhoda GC metody v Head Space uspořádání: Do injektoru je přiváděn vzorek v plynném stavu. Vyšetření vzorků krve je prováděno v automatizovaném režimu

23

24 Zařízení: TurboMatrix Headspace Sampler -karusel pro 40 vzorků Příprava vzorků biologického materiálu: Do 20 ml skleněné vialky nadávkujeme 1 ml krve a 1 ml vnitřního standardu ( metoda vnitřního standardu pro kvantitativní stanovení ethanolu a event. jiných těkavých toxických látek). Vialku hermeticky uzavřeme. temperování vialek se vzorkem při teplotě 60 C po dobu 20 minut v karuselu TurboMatrix Headspace Sampler

25 Kvantitativní stanovení ethanolu v krvi - metoda vnitřního standardu - příprava vzorků standardů ethanolu o známé koncentraci s vnitřním standardem - příprava kontrolních vzorků ethanolu (o známé koncentraci ethanolu) s vnitřním standardem pro ověření validity kalibrace - příprava neznámých vzorků krve ( 2 vzorky pro analýzu z 1 krevního vzorku)

26 Chromatogram Standard 1

27 Chromatogram Standard 2

28 Chromatogram Kontrola 1

29 Chromatogram Kontrola 2

30 Widmarkova metoda - ověřovací nespecifická metoda v modifikaci dle Weyricha - úseková norma Ministerstva zdravotnictví ÚN Princip metody: Ethanol oddestilovaný z krve je oxidován dvojchromanem draselným v kyselině sírové na kyselinu octovou a přebytek dvojchromanu se určí jodometricky. Reakce probíhá při teplotě 60 C. Pro správné provedení metody je dodržení konstantní teploty nutné, při teplotě nižší než 60 C reakce probíhá na acetaldehyd a vyšší teplotě na oxid uhličitý a vodu.

31 Widmarkova metoda - nespecifická metoda krevní vzorek vedle ethanolu obsahuje další těkavé látky, které mohou být oxidovány dvojchromanem draselným Biologický materiál post mortem

32 Dechové analyzátory a posuzování ovlivnění alkoholem Odborné stanovisko Společnosti soudního lékařství a soudní toxikologie Dopravní policie v souvislosti s prováděnými dopravními kontrolami řidičů a dopravními nehodami používá dechové analyzátory Dräger. Společnost Soudního lékařství a soudní toxikologie ČLS JEP podala odborné stanovisko k vyšetřování alkoholu dechovými analyzátory

33 Zjišťování koncentrace ethanolu v krvi pomocí dechových analyzátorů založených na principu měření koncentrace alkoholu ve vydechovaném vzduchu má svá omezení dechový analyzátor neměří koncentraci alkoholu v krvi přímo Princip přepočtu je založen na existenci poměru mezi koncentrací alkoholu ve vzduchu vydechovaném z plicních sklípků a v žilní krvi pro výpočet je dechovým analyzátorem používána pouze jedna (statisticky nejpravděpodobnější) hodnota

34 Toto principiální omezení použití dechových analyzátorů nelze odstranit ani tím, že měření je provedeno v souladu s metodikou českého metrologického institutu, z níž vychází i metodika Ministerstva dopravy Přesto lze výsledek dechové zkoušky, pokud je prováděna v souladu s metodikou, považovat za významnou informací k posouzení případného ovlivnění osoby alkoholem Vyšetření alkoholu dechových analyzátorem může být výrazně ovlivněno přítomností některých látek v dutině ústní ( po výplachu, užití spreje apod.). Přítomnost těchto látek může výsledek ovlivňovat až 20 minut po jejich užití.

35 Pokud je koncentrace alkoholu v krvi zjištěna pouze pomocí dechového analyzátoru, pak hodnotu do 0,24 promile nelze považovat za průkaznou a v žádném případě ji nelze považovat za identickou s hladinou alkoholu v krvi. Takto zjištěná hodnota v rozmezí 0,00 0,24 promile sama o sobě neprokazuje požití alkoholu vyšetřovanou osobou a tím méně její ovlivnění alkoholem Koncentraci alkoholu v krvi pro forenzní účely lze stanovit přísně specifickým vyšetřením krve provedeným metodou plynové chromatografie v toxikologické laboratoři, která k tomu má oprávnění MZ ČR

36 Množství 0,21 0,5 g/kg ethanolu v krvi poukazuje na to, že vyšetřovaná osoba již nějaký alkohol pila, nelze ale ještě říci, že je podnapilá. Množství 0,5-1,0 g/kg ethanolu v krvi značí, že osoba alkohol požila a může být lehce podnapilá. Při této hladině nedochází k vážnějším poruchám jednání a při běžném vyšetření známky požití alkoholu nemusí se laikovi ( a často ani lékaři) projevovat. Tento stav nelze ještě nazvat jako lehký stupeň opilosti, ale ve většině případů ho není možné považovat za normální Množství 1-1,5 g/kg ethanolu v krvi znamená lehké známky opojení, mnohomluvnost, mírně snížena soudnost, pozornost, sebedůvěra je zvýšena.

37 Množství 1,5 2 g/kg ethanolu v krvi je střední stupeň opilosti. U lidí nezvyklých pít jsou poruchy koordinace, pozornost je snížena. Největší počet dopravních nehod je zaviněno osobami, které mají právě toto množství alkoholu v krvi. Množství 2-3 g/kg ethanolu v krvi se označuje jako těžký stupeň opilosti. Bývá blábolivá řeč, psychické poruchy, často neschopnost samostatné chůze. Množství nad 3 g/kg ethanolu v krvi znamená obluzení a narkozu. Při této koncentraci jsou známy i fatalní případy. Při poskytnuté lékařské péči přežívají pacienti i s hodnotami mnohem vyššími.

38 Množství nad 4 g/kg ethanolu v krvi působí již smrt Některá psychofarmaka (např. benzodiazepiny) a alkohol se navzájem potencují ve svých účincích. Ethanol působí na CNS jako narkotikum. Při pravidelném pití se účinek alkoholu snižuje. Zvýšená tolerance se vysvětluje adaptací CNS, nikoliv zrychlenou eliminací. Alkoholické nápoje obsahují často vedlejší látky, další alkoholy a aldehydy, které mohou být příznačné pro chuť nápoje. V soudní praxi se někdy posuzuje zastoupení těchto přísad v uváděném nápoji pro posouzení věrohodnosti výpovědi obviněného nebo obžalovaného.

39 Ethanol je dobře rozpustný ve vodě i v tucích, rychle se dostává do krevní cirkulace Asi 20% dávky se vstřebává již v žaludku (záleží na náplni potravou), zbytek se vstřebává v tenkém střevě Ethanol se vstřebává ihned od začátku požívání alkoholických nápojů, odbourávání ethanolu nastává hned po vstřebání, a proto je nutné počítat odbourávání a pokles hladiny ethanolu hned od počátku pití Rychlost eliminace v závislosti na metabolismu osoby probíhá rychlostí v intervalu 0,12 až 0,20 g/kg za hodinu.

40 Ukončení vstřebávání ethanolu do krve při pití koncentrovaných alkoholických nápojů závisí na velikosti náplně žaludku: - na lačno je vstřebání ukončeno do 30 minut - při lehké náplni žaludku do 60 minut - pří vydatné náplni do 90 minut po ukončení pití. Při pití piva jsou uvedené časy delší o 30 minut. Po ukončení vstřebání ethanolu do krve pouze jeho eliminace.

41 Z výsledku stanovení koncentrace v odebrané krvi v určitém čase lze provést zpětný přepočet a vypočítat koncentraci ethanolu v krvi např. v době dopravní nehody. Soudní znalec - na žádost Policie ČR vypracovává znalecké posudky ve věci obviněného, který požíval alkoholické nápoje před dopravní nehodou a v určité době po dopravní nehodě mu byla odebrána krev ke zjištění ethanolu v krvi

42 V krvi musí být stanovena koncentrace ethanolu nejméně 0,21 g/kg, nižší koncentrace neprokazuje požití alkoholických nápojů. Musí být známa přesně doba odběru krve. Zpětný přepočet se neprovádí na dobu delší než 15 hodin, neboť vzniká značná nepřesnost Nelze provádět zpětný přepočet na základě vyšetření dechovým analyzátorem, protože přepočet koncentrace stanovený ve vydechovaném vzduchu na koncentraci v krvi je nepřesný

43 Bilanční výpočet slouží ke zjištění koncentrace v krvi na základě množství požitého ethanolu K výpočtu je nutné znát čas začátku a konce pití alkoholických nápojů, druh a objem požitých alkoholických nápojů, tělesná hmotnost a výška obviněného a množství a čas požité potravy Distribuční faktor pro muže r = 0,7, pro ženy 0,6 Vstřebávací deficit ( podíl nevstřebaného ethanolu z celkového množství požitého ethanolu) = 10%

44 Vzorec pro výpočet: a - d Ct = ( m. r ) - β60. t Ct - koncentrace ethanolu v krvi v čase t od počátku požívání alkoholických nápojů (g/kg) t - doba od začátku požívání alkoholických nápojů (hodiny) a - množství požitého absolutního ethanolu (g)

45 d vstřebávací deficit (g) m - hmotnost osoby (kg) r - redukční faktor β 60-0,12 až 0,20 g/kg / hod.

46 Těkavé látky Kromě ethanolu se v toxikologické praxi setkáváme s řadou dalších organických těkavých látek. Akutní otrava a) po inhalaci par b) náhodné nebo úmyslné požití tekutin obsahující tyto těkavé látky, např. organická rozpouštědla, čistící prostředky, benzínové směsi Inhalované sloučeniny rychle dosahují vrcholové koncentrace v dobře prokrvených orgánech ( v srdci a v mozku), koncentrace v tukových tkáních jsou nižší

47 Většina těkavých inhalovaných látek je zpětně vylučována dechem v původní formě, jen některé se částečně metabolizují v játrech a metabolity jsou buď vydýchány anebo vyloučeny močí aceton hlavní podíl je vyloučen v nezměněné formě, pouze ve stopách metabolit 2-propanol 2 propanol hlavní metabolit je aceton (80-90% absorbované látky) toluen - hlavní metabolit kyselina benzoová 80% absorbované dávky), velký podíl kyseliny se váže s glycinem v konjugát -kyselina hippurová

48 Průkaz aplikace těkavé látky identifikace látky v krvi průkaz původní formy (např. aceton, toluen) v moči průkaz metabolitů původní látky, event. původní formy látky Jednoznačná identifikace (kvalitativní průkaz) těkavé látky v biologickém materiálu (např. krev, moč, žaludeční obsah) je možná pouze toxikologickou analýzou. Vhodná metoda : plynová chromatografie v Head space uspořádání. Provádí se chromatografie vzorku v plynné fázi na dvou kolonách s odlišnými polaritami, tedy s odlišnou selektivitou s detektorem FID.

49 Kvantitativní stanovení těkavé látky v krvi: Provedení kalibrace se standardy o známé koncentraci stanovované látky, ověření platnosti kalibrace pomocí kontrolních vzorků stanovované látky a analýza vzorků krve vyšetřované osoby. Methanol = vysoce toxická těkavá čirá kapalina alkoholového zápachu Výskyt: např. součást rozpouštědel, ostřikovačů na autoskla, alternativní pohonná hmota. Riziko představují nekvalitní alkoholické nápoje obsahující toxikologicky významné množství methanolu

50 Methanol se rychle vstřebává ze zažívacího traktu, v séru maximum je minut po požití. Biologický poločas v organismu 8-28 hodin (průměr 12 hodin). - Pozvolna, 7-10-krát pomaleji než ethanol se metabolizuje v játrech na výrazně toxičtější metabolity formaldehyd a dále na kyselinu mravenčí (maximum v krvi a moči je den po požití). Asi 3% methanolu se vylučuje nezměněno plícemi a močí -jako jiné alkoholy působí excitačně, po velké dávce narkoticky na CNS, ale závažnější je toxicita jeho metabolitů

51 -Kyselina mravenčí se kumuluje v sítnici a očním nervu - Působí i trvalé poruchy zraku Rychlou přeměnou alkoholdehydrogenázou vzniká z methanolu formaldehyd, z něho aldehyddehydrogenázou kyselina mravenčí. Ta se velmi pomalu oxiduje na CO2 a H2O. Proto se významně kumuluje v tkáních Min. toxická dávka čistého metanolu asi 0,1 ml/kg, v průměru se udává 10 ml pro dospělého, ale bylo popsáno oslepnutí po 10 ml a smrt dokonce po 6-10 ml. Hladina metanolu v krvi 200 mg/l již nutně vyžaduje léčbu antidotem ( ethanol nebo fomepizol)

52 Smrtelná dávka: (-200) ml, v průměru asi 1 ml/kg čistého methanolu Průkaz methanolu v krvi se provádí metodou GC uspořádání Head Space (ÚSLT). Stanovení koncentrace methanolu v krvi metodou GC, kalibrace a kontroly platnosti validace analýzou vzorků methanolu připravených ze standardů methanolu o známé koncentraci. Metoda vnitřního standardu.

53 V souvislosti s methanolovou aférou, týkající se ilegálně vyráběných lihovin obsahujících methanol, byl pro rychlé zjišťování koncentrace methanolu v lahvích s alkoholickými nápoji - vyvinut (VŠCHT) přístroj mobilní Ramanův spektrometr - měření vibračních spekter. Tyto mobilní Ramanovy spektrometry má k dispozici Celní správa ministerstva financí ČR, celně technická laboratoř, která používá mobilní přístroje k měření (detekci) v terénu mimo laboratoř.

54 OTRAVY PLYNY OTRAVY OXIDEM UHELNATÝM Oxid uhelnatý plyn bez barvy a zápachu, vzniká spalováním organických látek při omezeném přístupu vzduchu Zdroje intoxikací: kouřové plyny při požárech, z vadných kamen, výfukové plyny aut, spalování zemního plynu v hořácích kotlů na teplou vodu s omezeným přístupem vzduchu- např. v koupelnách. Toxicita spočívá ve velmi velké afinitě oxidu uhelnatého na dvojmocné železo hemoglobinu ve srovnání s kyslíkem.

55 Váže se ve stejném molárním poměru jako kyslík, ale afinita Je asi 220-krát silnější, je tedy schopen vázby na hemoglobin i ve stopových koncentracích ve vzduchu Při otravě je omezen transport kyslíku krví Vážnost otravy souvisí s dobou expozice a se zvýšenou potřebou kyslíku při zvýšené tělesné námaze Pobytem ve smogovém prostředí lze dosáhnout až 10% hladiny karbonylhemoglobinu v krvi, kuřáci mohou mít také takto zvýšenou hladinu. Stavy při koncentraci 30% COHb doprovázeny bolestmi hlavy,, závratěmi, mdlobami, ztrátou vědomí.

56 Koncentrace COHb 40% a vyšší znamená ohrožení života, dostavuje se hluboké kóma, srdeční arytmie, křeče, smrt. Účinná pomoc spočívá v rychlém ukončení expozice, vynesení pacienta na vzduch, zajištění odborné lékařské pomoci. Laboratorní stanovení koncentrace karbonylhemoglobinu v krvi je založena na spektrofotometrických metodách. Spektrofotometrická metoda (podle Heilmeyera): Princip: absopční spektrum oxyhemoglobinu se liší od spektra karbonylhemoglobinu. Po zředění a hemolýze krve se změří extinkce při dvou vlnových délkách, tj. při 546 a 578 nm.

57 Z poměru absorbancí Q = se určí procento COHb. A546 A578

58 PRŮKAZ NEZNÁMÝCH LÁTEK (NOX) A KONFIRMACE V TOXIKOLOGII Léčiva a různé zneužívané návykové látky (tzv. drogy) jsou u nás v dnešní době nejčastější příčinou akutních otrav. Spektrum nox se průběhu času mění, na trh přicházejí nová léčiva, zneužívají se nové látky. Z toho vyplývá kontinuální nutnost studia metabolismu nových léčiv a drog a aktualizace a rozšiřování toxikologického laboratorního systému.

59 Dnešní systém záchytu a průkazu (identifikace) neznámých látek ( léčiv) a jejich metabolitů v biologickém materiálu je založen především na vhodných kombinacích metod imunochemických, chromatografických a hmotnostní spektrometrie. Pro identifikaci neznámé látky má významné uplatnění potvrzení látky navzájem nezávislými metodami.

60 Počátečním vodítkem jsou anamnestické údaje, v případě letálních otrav informace z ohledání místa činu, nález léků na místě činu - akutní otravy ( náhodné nebo úmyslné ) způsobeny lékovými přípravky event. v kombinaci s ethanolem Např. kombinace: ethanol a benzodiazepinové deriváty, kombinace : MDMA a ketamin

61 Ve skupině ilegálních drog je v popředí nálezů methamfetamin, kanabinoidy a opiáty morfinové struktury V první fázi laboratorního vyšetření se aplikují rychlé orientační záchytové testy na skupiny látek ( např. benzodiazepiny, barbituráty, tricyklická antidepresiva). Zásadou ovšem je, že orientační rychlý výsledek nesmí být nesprávně a neoprávněně interpretován jako výsledek úplný a konečný. Existují screeningové výsledky falešně pozitivní (které lze vyvrátit potvrzovací specifickou metodou) nebo falešně negativní (nedostatečná citlivost testu na některou látku)

62 Na rychlé imunochemické testy navazuje systematický analytický postup, který zahrnuje citlivé a specifické metody. Tyto metody vyžadují extrakci látek (nox) ze vzorku biologického materiálu speciálními postupy Návazné chromatografické metody chromatografie na tenké vrstvě, chromatografie v kombinaci s hmotností spektrometrií Tyto postupy jsou časově náročnější, ale lze jimi zachytit mnohem širší spektrum extraktivních látek Navíc jednotlivé noxy (původní formu látky) a jejich metabolity od sebe separují a mohou je jednoznačně identifikovat

63 V případě, že je podezření na původce otravy je dostatečně specifikováno ( např. vyplývá z předchozích vyšetření neznámých nox), lze přistoupit k cíleným analýzám a ke kvantitativnímu stanovení látek v krvi Z forenzního hlediska pozitivní orientační záchyt, např. budivých aminů, vyžaduje specifické potvrzení a rozlišení pomocí chromatografických metod, popř. GC/MS, zda jde např. o zneužívání ilegálního methamfetaminu nebo o konzumaci legálních léčiv obsahujících např. phentermin nebo efedrin a nebo zda nejde o falešně pozitivní záchyt způsobený zcela jinou interferující látkou

64 Chromatografické metody mohou být provedeny ve screeningovém uspořádání, pro detekci širokého okruhu potencionálních neznámých nox, anebo cíleně zaměřené pro konfirmaci a stanovení specifické noxy Po úspěšné detekci a jednoznačné identifikaci noxy v biologické matrici může následovat stanovení její koncentrace kvantitativní validovanou metodou Vyžadovaným toxikologických standardem dneška pro záchyt, identifikaci stop organických látek a jejich metabolitů v biologických tekutinách(např. krev, moč) a tkáních je aplikace tandemových metod plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií nebo kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií

65 Chromatografie na tenké vrstvě TLC/CR-screening - spojení chromatografie na tenkých vrstvách se systémem barevných reakcí použitých pro detekci Princip metody: - dvojnásobný, popř. vícenásobný záchyt léčiv a jejich metabolitů po chromatografickém dělení Metoda vychází z hodnocení nálezu léčiv a metabolitů v extrakčních frakcích získaných za různého ph a dále z hodnocení poloh skvrn zachycených látek vzhledem k pěti standardům současně chromatografované směsi

66 TLC/CR screening je jednotnou metodou záchytu pro řadu toxikologicky významných léčiv včetně jejich metabolitů v biologickém materiálu ( moč, žaludeční obsah, parenchymatosní orgány - u osob zemřelých) Je otevřeným systémem, který může být rozšířen o libovolný počet dalších léčiv a jejich metabolitů Je metodou informativní, která umožňuje předpoklad identity na základě posouzení vlastností zachycených látek ze 3 principielně různých hledisek: z hlediska ionizace při extrakci za různého ph, z hlediska pohyblivosti při chromatografii a z hlediska detekčních možností

67 Za určitých okolností je metodou specifickou. A to v případech, kdy léčivo původní forma- s větším počtem barevných reakcí je provázeno stejně reagujícími metabolity seskupenými do typických sestav, takovýto záchyt jako celek je jednoznačně specifický TLC/CR-screening se blíží systematicky prováděnému identifikačnímu pochodu I. Extrakční frakce ExK - obsahuje léčiva kyselého charakteru (např. barbituráty a jejich metabolity, metabolity kyseliny acetylsalicylové včetně původní formy, paracetamol) a prvý podíl léčiv neutrálních ( např. guaifenesin) a prvý podíl slabých basí, které se chovají jako léčiva neutrální (benzodiazepinové deriváty, kofein a jeho metabolity)

68 II. Extrakční frakce ExA - obsahuje léčiva basická ( např. sympatomimetia, tricyklická psychofarmaka, alkaloidy) a další podíl neutrálních léčiv III. Extrakční frakce H izolační technika je výhradně určena pro zpracování moči. Jejím cílem je získat léčiva a jejich metabolity vylučované ve formě konjugátů. Po extrakci moči z kyselého a alkalického prostředí se provede kyselá hydrolýza moči varem s konc. kyselinou chlorovodíkovou. Extrakce je provedena diethyletherem. Tato frakce obsahuje léčiva a jejich metabolity uvolněné z konjugačních vazeb, rovněž substituované benzofenony jako stěpné produkty metabolitů benzodiazepinových derivátů

69 Stacionární fáze nejčastěji se používá silikagel nebo modifikovaný silikagel látkami o různé polaritě - je nanesena v tenké vrstvě na podložní desce Mobilní fáze jsou směsi rozpouštědel o různých polaritách, často s přídavkem amoniaku nebo kyseliny, aby se potlačila ionizace analytů, které mají povahu slabých kyselin a bazí Po extrakci analytů ze vzorku je extrakt nanesen na start chromatografické desky

70 Deska je vyvíjena v uzavřené chromatografické komoře ve směsi rozpouštědel, až je dosaženo rozdělení směsi díky rozdílným distribučním konstantám v dané mobilní a stacionární fázi Po vyvinutí desky a jejím vysušení: 1) detekce fluoreskující skvrny UV světle ( např. metabolity kyseliny acetylsalicylové) 2) detekce jednotlivých skvrn na chromatografické desce systematicky aplikací různých reakčních činidel a jsou pozorovány barevné odstíny

71 3) V každém chromatografickém běhu jsou zařazeny referenční standardy, podle nichž se kompenzuje variabilita v pohyblivosti při mírných výkyvech pracovních podmínek ( např. kolísání teploty, změny ve složení mobilní fáze) Chromatografie na tenké vrstvě je ideální pro vzorky, kde lze očekávat vyšší koncentrace, tj. moč, žaludeční obsah, extrakty tkání- játra, ledvina, slezina). Nehodí se obvykle pro detekci nox v krvi Meze detekce se pohybují řádově kolem 0,5 2 mg/l, u některých látek lze dosáhnout pomocí speciální detekce limity nižší ( např. benzofenon ACB detekce Bratton-Marshallovým činidlem mez postřehu 0,05 µg, benzofenon ANB detekce B-M činidlem mez postřehu 0,04 µg)

72

73

74

75 Předpokladem konfirmace je dostupnost referenčního standardu, se kterým zmíněné chování neznámé noxy porovnáváme. TLC je výhodné kombinovat i s jinými metodami, např. Pokud se např. nedaří identifikovat skvrnu na chromatogramu, lze tuto vyškrábnout, extrahovat a analyzovat získaný extrakt např. pomocí GC/MS

76 Tandemové systémy s hmotnostní spektrometrií Hmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda určování hmotnosti atomů, molekul a jejich fragmentů po převedení na kladně nebo záporně nabité ionty. Tato metoda má dobrou vypovídací schopnost o struktuře analyzovaných látek Využití metody při stopové analýze organických látek s důrazem na zjištění jejich chemické struktury (chemické identity)

77 GC/MS analytická technika pro kvalitativní a kvantitativní analýzu řady směsí látek. Využití kombinace separace látek na GC koloně a jejich následná identifikace a kvantifikace pomocí MS. MS je analytická technika, pomocí které lze stanovit strukturu látek na základě jejich hmotnostního spektra.

78 V toxikologické praxi se používá v kombinaci s plynovou chromatografií ( GC/MS ) a nebo s kapalinovou chromatografií (LC/MS) Limitujícím požadavkem GC/MS je, aby analyt byl schopen zplynění při teplotách pod bodem jeho rozkladu Většina organických látek (nox) je dostatečně těkavá anebo mohou být tyto vlastnosti upraveny chemickou derivatizací

79

80 Základní proces v hmotnostním spektrometru zahrnuje 5 etap: 1. přívod vzorku 2. ionizace molekul 3. separace vzniklých iontů podle hodnoty m/z (efektivní hmota) 4. detekce vzniklých iontů a měření jejich četnosti 5. registrace vzniklých spekter

81 MS pracuje ve vysokém vakuu ( 10-6 torr) zabránění rekombinaci vzniklých iontů, maximalizace počtu iontů, který dopadá na detektor 2-stupňová evakuace A) vakuum vytvořené rotační pumpou B) turbomolekulární pumpou Ztráta vakua ztráta citlivosti detekce Vlastní hmotnostní spektrum představuje čárový graf výška každé čáry představuje relativní četnost iontů příslušné efektivní hmoty

82 Způsob ionizace : 1) nárazem elektronů electron impact Výsledné spektrum je reprodukovatelné a je charakteristické pro chemickou identitu látky 2) chemická ionizace pozitivní nebo negativní - měkčí ionizační technika Chemická ionizace negativní umožňuje velmi citlivou detekci nepatrných stop nox s elektronegativními vlastnostmi např. benzodiazepinů

83 Velká reprodukovatelnost hmotnostních spekter ( a to především EI režimu) dovoluje vytvářet rozsáhlé referenční knihovny spekter a pomocí programového vybavení počítače porovnávat spektra standardů v knihovnách s naměřenými spektry analyzovaných látek. Základním předpokladem úspěchu je, aby referenční databáze příslušnou látku zahrnovala. Velmi užitečné je vytvářet si postupně vlastní uživatelskou knihovnu spekter, která může doplňovat knihovny komerční Knihovna spekter: H.H. Maurer, K. Pfleger, A.A. Weber: Mass Spectral and GC Data

84

85

86 Specifičnost spekter jednotlivých látek se může lišit případ od případu. Např. 3,4-methylenedioxymethamfetamin v podmínkách EI fragmentuje za vzniku dominantního iontu m/z 58, iont 58 má řada dalších látek. Více specifické spektrum je možné získat po chemické derivatizaci látky trifluoracetanhydridem

87

88

89

90 Metoda LC/MS kombinace vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií Vysoké účinnosti separace se dosahuje použitím stacionárních fází o jednotné a velmi malé velikosti částice (2-10 µm), které jsou naplněny v koloně. Mobilní fáze se pohybuje pod tlakem. Nejběžnější jsou stacionární fáze na bázi silikagelu, který je chemicky modifikován různými funkčními fázemi, jako je oktadecyl, oktyl, fenyl aj. Největší uplatnění v toxikologických analýzách nacházejí nepolární stacionární fáze s chemicky vázaným oktadecylsilanem v kombinaci s polárními mobilními fázemi. Mobilní fáze jsou směsi vody a organických rozpouštědel. Separované látky se detekují nejčastěji UV/VIS spektrofotometrickým detektorem.

91 Závislost na drogách je ztráta svobodného rozhodování závislé osoby. Toxikomanie se rozumí chorobné lpění na opakovaném podávání látky působící euforicky na CNS, tedy působící závislost na psychoaktivní látce. Zákon o návykových látkách č.167/1998 Sb. a jeho další znění dělí návykové látky na omamné a psychotropní podle konvence OSN. Podle tohoto zákona jsou omamné látky (OL) roztříděny do 3 skupin a psychotropní látky (PL) do 4 skupin, a to podle stupně společenské nebezpečnosti při jejich šíření a užívání. Novela zákona č. 167/1998 Sb. zákon č. 106/2011 Sb.

92 Novela zákona č. 167/1998 Sb. zákon č. 106/2011 Sb. do seznamu kontrolovaných substancí zařazeno 33 nových syntetických drog, které buď jsou nebo potenciálně mohou být zneužívány. Abúzus je škodlivé patologické (zne)užívání látek Abúzus opiátů, kanabinoidů, kokainu, budivých aminů, psychedelických aminů ( např. taneční drogy)

93 OPIÁTY (zařazeny v seznamu omamných látek) - významný zástupce heroin (diacetylmorfin) - příprava nejčastěji acetylací opia Opium- zaschlá šťáva z naříznutých nezralých makovic máku setého, obsahuje řadu alkaloidů, z nichž největší zastoupení má morfin, menší kodein, papaverin, noscapin, thebain Acetylací opia také acetylkodein Heroin a acetylkodein látky velmi labilní, poměrně snadno deacetylují

94 Abúzus tekutiny Brown- směs připravená nezákonnou manipulací s kodeinem s cílem vyrobit aktivnější složku - hydrokodon (vedlejší produkty syntézy dihydrokodein, zbytkový kodein a další opiátové báze) Nález hydrokodonu v biologickém vzorku svědčí o aplikaci Brownu Aplikovaný heroin se v organismu prakticky okamžitě mění na 6-monoacetylmorfin ( poločas asi 3 min) a postupně deacetyluje na morfin (poločas asi 40 min).

95 Toxikologický důkaz konzumace heroinu se opírá o nález specifického metabolitu, tj. 6-monoacetylmorfinu, který lze prokazovat v závislosti na velikosti dávky poměrně krátce, zpravidla do 24 hodin, později se nachází jen morfin. Morfin může vzniknout však i z jiných opiátů ( kodein, ethylmorfin) a nebo může být aplikován jako takový. Pokud se v nálezech mezi metabolity heroinu objeví kodein, není metabolitem heroinu, ale jeho původ je v acetylkodeinu jako průvodní příměsi

96 Po aplikaci Brown v nálezu figuruje v různém zastoupení hydrokodon a jeho metabolity, dihydrokodein a metabolity, kodein a příslušné metabolity, mezi nimi i morfin Krev je vhodný materiál pro důkaz opiátů jen několik hodin po dávce Moč průkaz opiátů je možný 2-3 dny ( v závislosti na dávce a citlivosti použité metody)

97 DĚKUJI VÁM ZA POZORNOST