Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství Genetická kontrola vitality obilek ječmene

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství Genetická kontrola vitality obilek ječmene Doktorská disertační práce Vedoucí práce: prof. Ing. Oldřich Chloupek, DrSc. Vypracovala: Ing. Kamila Ullmannová Brno 2013

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma,,genetická kontrola vitality obilek ječmene vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disetační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího disertační práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne. Podpis doktoranda..

3 PODĚKOVÁNÍ Velice ráda bych poděkovala svému školiteli panu prof. Oldřichovi Chloupkovi za odborné vedení, cenné rady a skvělý přístup během zpracovávání této disertační práce i po celou dobu doktorského studia. Ráda bych poděkovala za spolupráci všem svým kolegům na Ústavu pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství, především Ing. Tomášovi Středovi, Ph.D za spolupráci při sepisování článku. Od srdce děkuji své rodině, svému manželovi a dětem za všestrannou pomoc při zpracovávání této disertační práce.

4 SUMMARY The aim of the dissertation was to evaluate the parameters of seed vigour and germination capacity in a set of 133 dihaploid lines (DHL) of spring barley and their parents (Derkado and lines B83/5) in various environments. The analysed samples were grown in six environments (Želešice and Hrubčice in ) and tested for seed vigour and germination parameters in a laboratory. Furthermore, a standard laboratory germination test was carried out. Seed vigour Seed vigour values expressed as the percentage of the germination capacity under water and temperature stress (-0.2 MPa and 10 C) ranged between the values of the parents whilst the performances of 29 DHL were better than the performance of the better of both parents. The measured values indicate additive genetic effects of both parents in the studied set because the values ranged between the values of the parents. According to the three-factor analysis of variance, with a very high statistically significant probability, the impacts of the main factors on the total seed variability were found: locality 32%, year 19%, and lines 8%. The genetic effect was therefore higher when compared to findings of Laiding et al. (2008) who evaluated extensive experiments with barley grain yield in Germany (3.5%). Therefore, we can conclude that it is sufficiently high for successful breeding for higher seed vigour. Evaluation of germination parameters Seed quality was also established by evaluation of germination parameters: germination energy (GE), germination index (GI), and germination rate (GR). According to the three-factor analysis, the locality factor had the highest impact in case of all three parameters (GR 41%, GI 36%, GE 35%). The effect of the year was more reflective in case of germination parameters than in case of vigour, for GI (33%), GE (27%) and GR (25%). The highest impact of the line was found for GI (9%), lower for GR (6%) and GE (5%). All the studied parameters were highly statistically significant (P = 0.01). Frequency of the studied parameters Vigour values showed normal frequency, indicating a polygenic control of this parameter. DHL often reached higher values in contrast to the the parents. In case of

5 vigour, 29 of them surpassed the better parent. In case of standard germination, 27 DHL surpassed the better parent. This enables selection for higher values of vigour and germination. Germination capacity A standard germination capacity test under optimal conditions was conducted in order to evaluate seed quality. The germination capacity ranged between %, with the average value of 97.5% (average of all environments). The germination capacity of all lines was higher than their vigour and germination energy, by 2.9% higher than vigour and by 4.6% higher than germination energy on average. This finding has confirmed opinions of many authors who had reported that seed performance under optimal conditions is often higher in comparison to the seed performance in vigour experiments under stress and field conditions. Moreover, it has been confirmed that samples of the same germination capacity may have different vigour and storage potential. Correlations among studied parameters The studied parameters were compared by means of linear correlation and all of them correlated mutually positively. The individual germination parameters had the tightest mutual correlations. This can be explained by the fact that they were calculated from the same input data. The tightness of correlation between the vigour and the germination parameters (r 2 = 0.206** 0.291**) was higher than in case of the germination capacity and germination parameters (r 2 = 0.071** 0.123**). Based on the above stated findings, we consider barley seed vigour to be a polygenic parameter that is of key importance for field seed emergence and malting quality, with good prospects of improvement by traditional breeding methods. Ullmannová, K., Středa T., Chloupek O. (2013): Use of barley seed vigour to discriminate drought and cold tolerance in crop years with high seed vigour and low trait variation. Plant Breeding. 132 (3), ISSN

6 OBSAH Summary Úvod Literární přehled Proces klíčení semen Biochemická podstata klíčení Imbibice (bobtnání semen) Fáze aktivace biochemických procesů Fáze růstu klíčku Vnější podmínky klíčení Voda Kyslík Teplota Světlo Vnitřní podmínky klíčení Kvalita osiva Laboratorní zkouška klíčivosti Vitalita semen Testy stanovení vitality Test urychleného stárnutí (AA accelerated ageing) Test řízené deteriorace (CD controlled deterioration) Chladový test Klíčení za chladu Hilterův test (test laboratorní vzcházivosti) Testy s působením osmotického stresu Konduktometrický test vodivosti výluhu... 27

7 Topografický tetrazoliový test Testy určující respirační aktivitu semen Index růstu semenáčků Testy hodnotící parametry klíčení Testy růstu a vývinu kořínků a klíčků Ostatní testy vitality semen Genetická kontrola vitality semen Hlavní abiotické vlivy Chlad Sucho Tvorba dihaploidů Cíl Materiál a metodika Polní pokus Popis lokalit a průběh vegetačních let Laboratorní hodnocení Stanovení vitality obilek Stanovení parametrů klíčení Zkouška klíčivosti Výsledky Vitalita obilek ječmene Vitalita obilek Vitalita obilek Vitalita obilek Vitalita obilek Parametry klíčivosti... 49

8 5.2.1 Stanovení energie klíčení Stanovení energie klíčení Stanovení energie klíčení Stanovení energie klíčení Index klíčení Index klíčení Index klíčení Index klíčení Rychlost klíčení Rychlost klíčení Rychlost klíčení Rychlost klíčení Souhrnné hodnocení tří parametrů klíčení Zkouška klíčivosti Hodnocení vzcházení na poli Vztahy hodnocených parametrů Diskuse Kvalita vstupního materiálu Hodnocení vitality obilek ječmene Hodnocení parametrů klíčení Hodnocení zkoušky klíčivosti Vztahy mezi sledovanými vlastnostmi Souhrn Seznam použité literatury Přílohy Seznam použitých zkratek

9 11 Seznam tabulek Seznam obrázků

10 1 ÚVOD Plody a semena jsou odezvou na adaptabilitu organismu a vyvíjely se za účelem lepšího šíření druhu a možnosti přečkání nepříznivých podmínek pro růst a vývoj rostliny, jsou přizpůsobeny svými životními cykly průběhu počasí v přírodě a dokáží klíčit ve vhodnou dobu. Plody a semena rostlin jsou nepostradatelnou součástí pro lidskou společnost jako zdroj výživy, vstupní materiál pro nejrůznější odvětví průmyslu a také jsou výchozím genetickým materiálem pro nové generace plodin v následujících letech. V současné době se společnost nespokojí s faktem, že má k dispozici semena či plody dané rostliny, ve středu zájmu je především kvalita těchto zdrojů. V zemědělství, je kvalita vyjádřena biologickou a semenářskou hodnotou osiva, jako je klíčivost, čistota, hmotnost tisíce semen, zdravotní stav, vlhkost, odrůdová pravost a čistota. Pro uživatele osiva a pěstování zemědělských plodin je nejvýznamnější založení optimálního porostu, jen takový porost splňuje předpoklady pro vysoký výnos a pozitivně ovlivňuje rentabilitu pěstování a efektivitu vložených vstupů. Kvalita osiva je k založení vyrovnaného porostu stejně důležitá jako ostatní faktory, mezi které patří například kvalitní předseťová příprava, kvalitní setí, příznivé vláhové a teplotní podmínky při vzcházení. Jakost osiva může být obzvláště důležitá v ekologickém zemědělství, protože špatný počáteční růst není kompenzován následnými chemickými zásahy, jak v konvenčním zemědělství (Kristensen, 2003). Nejvíce zřetelný vliv kvality osiva je při klíčení a vzcházení. Pro pěstitele je důležitá také uniformita a rychlost klíčení, neboť dává předpoklad dobře vzrostlému klíčenci, jenž má potenciál vyšší konkurenceschopnosti vůči plevelům a lepší adaptabilitu k environmentálním stresům a tak maximalizuje biologický výnos plodiny (Ghiyasi et al., 2008). Proto také nové pojetí kvality osiva zahrnuje i vnitřní kvalitu rostlin, za kterou je považována i vitalita semen. Rozvoj testování vitality osiv byl vynucen požadavky uživatelů osiv. Diskuse o vitalitě probíhá od 60. let minulého století a po 27 letech definovala komise ISTA v roce 1981 pojem vitalita semen jako přirozenou vnitřní sílu zdravých semen zabezpečující rychlé klíčení po zasetí a vzejití i za rozmanitých přírodních podmínek. Vitalita semen je velice aktuální téma v oblasti 10

11 kvality semen, proto také ISTA věnuje značné úsilí ve výzkumu v této oblasti, o čemž svědčí i každoroční pořádání seminářů o vitalitě po celém světě. 11

12 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED Ječmen (Hordeum vulgare L.) se sklízí v plné zralosti, v době postupného snižování jakosti rostliny. Rychlost těchto procesů je závislá na vlivu počasí, stavu porostu, agrotechnických opatřeních a v neposlední řadě na vlastnostech odrůdy a odolnosti odrůdy k procesům deteriorace. U jarního ječmene je výnos tvořen počtem plodných stébel na jednotce plochy, počtem zrn v klasu a velikostí zrn. V době sklizně se hlavní stéblo podílí na výnosu rostliny 50 % a zbytek tvoří odnože převážně prvního a druhého řádu. Bylo zjištěno, že hmotnost 1000 zrn u hlavního stébla a prvých dvou odnoží byla téměř stejná, to je předpokladem vyrovnanosti zrna, která je požadována u osiva i ve sladovnickém průmyslu. Setím na spodní hranici doporučované dávky a dobrými podmínkami pro odnožování (hnojením dusíku a jeho dobrou zásobou v půdě) se tedy dostaví požadovaná produktivita porostu, za předpokladu vysoké kvality osiva a dobré klíčivosti. V době, kdy se zakládá budoucí klas u obilovin v hustě setém porostu s výsevkem 500 obilek na 1 m 2, se založí jen 84 % základu klásku, oproti porostu s výsevkem 300 obilek na 1 m 2. Konečný počet obilek v klasu byl v hustě setém porostu nižší a činil jen 92 % obilek z řídkého porostu, což vyplývá z principů autoregulace výnosových prvků, kdy při vysoké úrovni předcházejícího prvku se sníží kvantita následného prvku (Capouchová et al., 2009). 2.1 Proces klíčení semen Pro výrobce osiv, pěstitele ječmene a výrobce sladu je klíčení ječmene základním technologickým procesem, během kterého dochází v obilce k aktivaci a syntéze enzymů a k řadě dalších změn (Koller et al., 1962; Šottníková et al., 2011). Obnovuje se metabolická aktivita semen vedoucí k prodlužování buněk radikuly a hypokotylu embrya. Obilky v endogenní dormanci mohou klíčit až po jejím odeznění, oproti semenům bez endogenní dormance, které při příjmu dostatečného množství vody zbobtnají, jsou-li zároveň splněny vnější podmínky klíčení (Toole et al., 1956). Příjmem vody do koloidního systému semen během bobtnání je narušena dormance související s odvodněním cytoplazmy. Bobtnat však mohou i mrtvá semena, neschopná dále klíčit. 12

13 Snížená klíčivost osiva je dána výskytem semen dormantních a semen neživých. Semenářské hledisko je náročnější, neboť za klíčivá semena považuje pouze ta, která poskytnou normální, plně životaschopnou klíční rostlinu, schopnou dalšího vývoje (ISTA, 1995). Výskyt anomálních a poškozených klíčenců při klíčení semen není započítáván. Klíčení začíná vždy růstem radikuly (obr. 2.1), přičemž po určitou dobu brzdí růst nadzemních částí klíční rostliny. Obr. 2.1: Proces klíčení obilky ječmene (Koning, 1994) Ve fázi fyziologické zralosti obsahují zrna nejvyšší množství suché hmoty a mají velký potenciál pro klíčení (Tekrony et al., 1979), nicméně sklizeň probíhá až v době sklizňové zralosti, v období vhodném pro skladování se sníženým množstvím vody. Po fyziologické zralosti se klíčivost snižuje v důsledku dormance a nepříznivých faktorů, které na semena působí (Finch-Savage and Leubner-Metzger, 2006). Obilka ječmene patří mezi ortodoxní semena, která vyžadují pro svůj úplný vývoj fázi vyschnutí, během které se změní metabolismus vývoje na metabolismus umožňující následné klíčení semen. Rozeznáváme tři stádia vývinu embrya u krytosemenných rostlin: embryogeneze (vývin embrya), zrání a klíčení. Všechna zmíněná stádia jsou ovlivněna různým stupněm enzymatické a hormonální aktivity a procesem dýchání. Za nepřítomnosti kyseliny abscisové (ABA) může být proces zrání semen zkrácen, je-li embryo ze semene vyjmuto a kultivováno na živném mediu, kdy začne předčasně klíčit. Klíčení regulují také gibereliny, které působí protichůdné procesy ABA. Společně pak regulují procesy 13

14 odvozené od působení abiotických a biotických stresů (Jones, 1987; Wanyan et al., 2010; Jacobsen and Olszewski, 1993). Semena předčasně klíčí i v případě, jsou-li před dozráním vyjmuta a kultivována v živném médiu obsahující dusík a sacharózu (Kermode, 1990) Biochemická podstata klíčení Rozeznáváme tři fáze klíčení: imbibice, fáze aktivace biochemických procesů, fáze růstu klíčku (Toole et al., 1956) Imbibice (bobtnání semen) První fáze je nezávislá na metabolické aktivitě semene, je ovlivněna aktivitou vodního potenciálu (ψ suchých semen = -100 až -400 MPa, voda má vodní potenciál 0 MPa), chemickým složením a velikostí semen. Schopnost přijímat vodu je dána prostupností semenných obalů. Fází imbibice prochází semena dormantní, nedormantní, životaschopná i neživá (Finch-Savage and Leubner-Metzger, 2006). Příliš rychlé bobtnání vede až k tzv. poškození semen z bobtnání a ke ztrátě jejich životaschopnosti. Pokud dojde k přerušení příjmu vody ve fázi bobtnání s následným vyschnutím semen a k opakovanému bobtnání, pak nemusí docházet k porušení klíčku. Jakmile je klíčení spojeno s buněčným dělením a růstem klíčku, k poškození již dochází Fáze aktivace biochemických procesů S příjmem vody semeny (obr. 2.2) dochází ke zvýšení intenzity dýchání a roste potřeba dostatečného množství kyslíku v růstovém médiu (vyjma vodních a bahenních rostlin). V prvních etapách klíčení (do hod) převažuje u semen anaerobní typ dýchání (Koller et al., 1962), o čemž svědčí i vysoká aktivita alkoholdehydrogenázy. Oxidační reakce jsou spojeny s oxidační fosforylací, kterou je energie uvolněná dýcháním vázána chemicky v podobě makroenergických vazeb (Botha et al., 1992). Dále dochází k enzymatické mobilizaci zásobních látek semen a jejich translokaci do zárodku. Syntéza α-amylázy (štěpící škrob) je spojena s účinkem kyseliny giberelové, její biosyntéza probíhá u ječmene ve štítku embrya a později v celém embryu. Embryo uvolňuje gibereliny do aleuronové vrstvy endospermu, kde aktivují geny pro syntézu hydrolytických enzymů, které jsou odtud transportovány do endospermu (Jacobsen and 14

15 Olszewski, 1993). Tuky jsou rozkládány lipázami na mastné kyseliny, které jsou dále štěpeny na acetyl-coa vstupujícího do citrátového cyklu v mitochondriích, nebo je použit k syntézám sacharidu. Glycerol, jako produkt štěpení tuku, je využit v metabolizmu sacharidů. Bílkoviny jsou štěpeny proteázami a později peptidázami na aminokyseliny a amidy. Ionty NH + 4 vznikající při klíčení hydrolýzou glutaminu a asparaginu se zabudovávají do různých organických sloučenin (např. nukleových kyselin). Purinové nukleotidy jsou štěpeny nukleázami za vzniku substrátu pro syntézu cytokininů. Z aminokyselin se činností proteáz uvolňuje i tryptofan, který je nezbytný pro syntézu IAA (auxinů). Druhou fází klíčení již neprochází semena neživá a dormantní (Bewley, 1997). Obr. 2.2: Schéma základních fyziologických a biochemických pochodů klíčení obilky (Hess, 1983 in Houba a Hosnedl, 2002) 15

16 Fáze růstu klíčku Je fáze viditelného klíčení, tedy růstu radikuly embrya, skrz prasklou testu semene (Toole et al., 1956). Radikula zprvu roste jen prodlužováním buněk vytvořených v embryu, později začíná mitotická aktivita v kořenovém meristému. Radikula po určitou dobu brzdí růst nadzemních částí klíční rostliny. Vodní potenciál (ψ) semen se pohybuje okolo hodnoty -1 MPa a tím se blíží k vodnímu potenciálu vody Vnější podmínky klíčení Mezi hlavní vnější faktory, které se podílejí na utváření a snižování klíčivosti patří podmínky prostředí během vývinu semen a podmínky uskladnění. Závisí na vyváženosti teplotních a vlhkostních podmínek při dozrávání porostu. Maximální zdraví rostlin a minimální stres během kritických fází vývoje rostlin podporuje vysokou klíčivost a vitalitu, zvláště ve fázi nalévání zrna (Haque et al., 2007). Kromě abiotických podmínek prostředí ovlivňují klíčivost i podmínky biotické (půdní mikroflóra, choroby a škůdci), dále i vlivy antropogenní (předplodina, příprava a způsob setí, použití hnojiv a pesticidů, výsevek, termín, hloubka a kvalita setí), (Hosnedl, 2009) Voda Voda je nezbytná pro bobtnání semen, které předchází klíčení. Semena bobtnají různou intenzitou a s různou spotřebou vody; semena bobovitých rostlin potřebují více vody na stejnou hmotnost než obilky trav. Kilogram suchých obilek pšenice (Triticum aestivum L.) spotřebuje 550 ml vody, na rozdíl od kilogramu semen hrachu (Pisum sativum L.) se spotřebou 1850 ml. Při nedostatku vody (vodním deficitu) je proces klíčení a tedy i vzcházení redukován, jsou však značné mezidruhové rozdíly mezi rostlinami (Springer, 2005). Závislost příjmu vody na osmotickém tlaku roztoku, v němž semena bobtnají, je nepřímá. Jakmile je embryo hydratované na 60 %, začnou se v semeni aktivovat metabolické systémy. Příjem vody se zvyšuje, když kořínek embrya prorazí osemením. Do vody se také mohou vyluhovat inhibiční látky ze semene, což může vést ke zvýšení rychlosti klíčení. 16

17 Kyslík Kyslík je nezbytnou podmínkou klíčení, neboť energie nezbytná k tomuto procesu se získává při oxidační fosforylaci, vyjma bažinných rostlin. Důležitost dostatečného množství kyslíku pro klíčící semeno je všeobecně známá a je podporována pěstitelskou praxí dodržováním hloubky setí u jednotlivých druhů rostlin. Při nadměrné vlhkosti půdy může dojít k tzv. zamazání osiva, přičemž dochází k poškozování klíčícího semene v důsledku anoxie (nedostatku kyslíku). Obecně jsou na anoxii citlivější deteriorovaná semena než osivo vitální. Osivo ječmene s málo vitálními obilkami hyne v půdě vlivem anoxie již během dvou dnů po zasetí, zatímco vitální obilky přežívají minimálně dvojnásobně déle (Hosnedl a Honsová, 2002). Normální obsah kyslíku v půdním vzduchu neklesá pod 19 %, ale může se snížit až pod 1 %, například při vytvoření půdního škraloupu. K inhibici klíčení zpravidla dochází u méně citlivých druhů k anoxii při poklesu obsahu kyslíku v půdní atmosféře pod 1 až 3 %. K citlivým druhům na nedostatek půdního vzduchu patří například ječmen jarní (Hosnedl a Honsová, 2002) Teplota Kardinální teplotní body (minimum, optimum, maximum) jsou specifické pro jednotlivé druhy i odrůdy. Ječmen má kardinální teplotní charakteristiky pro klíčení semen dle Dostála a Dykyjové (1962) minimum 3 4 o C, optimum 20 o C a maximum o C. Semena o vysoké kvalitě jsou schopná klíčit při větším rozpětí teplot než semena s nízkou kvalitou (Hosnedl a Honsová, 2002). Toleranci ke stresovým teplotním podmínkám ovlivňuje také provenience, kvalita a stáří osiva. Optimum a maximum klíčení leží obyčejně níže než optimum a maximum růstu. Jakost obilovin je ovlivněna průběhem teplot a srážek před plnou zralostí. Kvalita v tomto období je negativně ovlivněna kombinací nižších teplot s vysokými srážkami. Významně negativní vliv na klíčivost měl průběh počasí v letech, kdy červenec byl vlhký a chladný (okolo 100 mm srážek, pod 17 o C). Naproti tomu ročníky s vyššími červencovými teplotami a nižším úhrnem srážek vykazovaly nejlepší klíčivost. Řada vlhkých ročníků (např. 2010) se sumou srážek nad 100 mm, ale s vyššími průměrnými teplotami, se projevila velmi vysokou klíčivostí obilovin (Čapek a Horčička, 2011). Byl zjištěn statisticky průkazně negativní vztah (-0,889*) mezi teplotou vzduchu v první dekádě července a klíčivostí 17

18 semen, naproti tomu průměrná teplota vzduchu v druhé dekádě června příznivě ovlivnila hmotnost semen (0,918**). Statisticky vysoce průkazná negativní závislost (-0,964**) byla zjištěna při hodnocení vztahu relativní vzdušné vlhkosti ve třetí dekádě května a klíčivostí semen žita lesního (Hofbauer et al., 2011) Světlo Světlo většinou není podmínkou klíčení semen, některá semena však klíčí rychleji na světle než ve tmě. Rozlišujeme druhy na kladně (Poa spp., Nicotiana tabacum, Digitalis purpurea) a záporně fotoblastické (Amarantus caudatus, Cucurbita pepo, Phacelia tanacetifolia) Vnitřní podmínky klíčení Vnitřní podmínky klíčení ovlivňují specifické vlastnosti odrůdy, chemické a fyziologické vlastnosti semen, mikroflóru semene, dle některých autorů i velikost semene (Larsen and Andreasen, 2004). Aktivita fytohormonu je přímo spjata s regulací procesu klíčení a dormancí semen. Přítomnost giberelinu je nezbytná pro klíčení a naopak přítomnost abscisové kyseliny je nezbytná pro zavedení dormance v průběhu zrání semen. Stupeň dormance semen není závislý na aktuální výši hladiny ABA, ale na jejím dřívějším působení v průběhu zrání (Bewley and Marcus, 1990). V obilkách ječmene v průběhu jejich predormance během zrání na mateřské rostlině klesá obsah endogenních giberelinů a stoupá obsah inhibičních látek, především ABA. Po sklizni ještě krátce obsah giberelinů klesá, ale přibližně po měsíci, v období posklizňového dozrávání, obsah giberelinů v obilce opět stoupá. Počáteční zábrana klíčení semen na rostlině je z agronomického hlediska velmi cenná, neboť u obilek s dostatečně dlouhým posklizňovým dozráváním znemožní klíčení přímo v klasech za deštivého počasí během žní (porůstání). Dlouhé posklizňové dozrávání je však nežádoucím jevem ve sladovnictví. 2.2 Kvalita osiva Testování kvality osiva vzešlo z průlomové myšlenky prof. Dr. Johanna Friedricha Nobbela, kdy byl v roce 1869 požádán o botanickou identifikaci několika vzorků semen 18

19 trav koupených na trhu. U těchto vzorků zjistil pouze 30 % druhovou čistotu. Testování osiva se následně rozšířilo do celého světa a dalo impuls pro zakládání semenářských stanic a dále v roce 1924 vedlo k založení ISTA. Od této chvíle je testování osiv nedílnou součástí zemědělské praxe. Kvalita osiva je v současné době hodnocena podle mezinárodních standardů, což umožňuje mezinárodní obchodování s osivem (Pazderů and Hosnedl, 2011). Kvalita osiva je důležitým faktorem trvale udržitelného zemědělství v podmínkách měnícího se klimatu, tomuto faktu odpovídá i stále větší zájem o tuto problematiku odborné veřejnosti i výzkumu z řady zemí (Angulo et al., 2010). V praxi je kvalita osiva v systému certifikace osiv vyjádřena semenářskými hodnotami, jako je klíčivost, čistota, hmotnost tisíce semen, zdravotní stav, vlhkost, odrůdová pravost a čistota. Uživateli osiva je za základní parametr kvality osiv považována klíčivost. Podle dosud platné vyhlášky 369/2009 Sb. je pro jednotlivé plodiny definována minimální klíčivost, při které je ještě možno osivo uvádět do oběhu. Kvalita osiva je chápána mnoha semenářskými firmami a organizacemi i autory jako životaschopnost a vitalita semen (Styler et al., 1980; Hampton, 1995; Kolasinska et al., 2000; Hosnedl, 2009; Šťastný and Pazderů, 2008; Khan et al., 2010; Farahani and Maroufi, 2011; Gul et al., 2012 a jiní). Kvalita osiva je k založení vyrovnaného porostu stejně důležitá jako ostatní faktory, mezi které patří například: kvalitní předseťová příprava, kvalitní setí, příznivé vláhové a teplotní podmínky při vzcházení. Nejvíce zřetelný vliv kvality osiva je při vzcházení u plodin s malou kompenzační schopností výnosových prvků a plodin setých na konečnou vzdálenost, u nichž odchylky od optimální hustoty vždy vedou k ovlivnění výnosu. Například u cukrovky maximálně možný rozdíl v klíčivosti 25 % znamená, na každý hektar plochy 25 tis. semen, tedy jednu výsevní jednotku navíc na každé čtyři hektary (Pazderů and Hosnedl, 2011). Při nižší klíčivosti je třeba vysévat větší množství osiva, abychom dosáhli požadované hustoty porostu. U hustě setých dobře odnožujících obilovin je vliv klíčivosti pro správné založení porostu nižší, optimální porost lze založit i z osiva s nižší klíčivostí. Vliv počtu jedinců v porostu na výnos se u obilnin vzhledem k jejich kompenzační a autoregulační schopnosti projevuje až při nižších počtech rostlin na jednotku plochy (Finch-Savage, 1995). Vyšším výsevkem však neovlivníme vyrovnanost a rychlost vzcházení na poli. U obilovin rychlost vzcházení a následně 19

20 i intenzita odnožování a v konečném důsledku počet plodných stébel ovlivní výnos. Tekrony and Egli (1991) zjistili, že vitalita osiva má vliv na vegetativní růst a ovlivňuje výnos porostů sklízených ve vegetační nebo rané generativní fázi více než výnos plodin sklizených ve fázi plné zralosti, neboť výnos v plné reprodukční zralosti není tak těsně propojen s vegetativním růstem. Lze tedy i při nižší vitalitě dosáhnout požadované hustoty porostu, ale porost bude nevyrovnaný. Zvyšování výsevku u málo vitálních partií osiva nemůže zaručit optimální výnos a pouze u vyrovnaných porostů lze účinně ošetřovat během vegetace a dosahovat vyrovnanější jakosti sklizeného zrna. Interakce podmínek prostředí během vývoje semen a odrůda jsou považovány za hlavní faktory variability kvality osiva (Šťastný a Pazderů, 2008). K negativnímu projevu snížené vitality osiva v praxi dochází také u časně setých jařin na špatně připraveném seťovém lůžku, u plodin náročných na množství vláhy a vyšší teplotu vzcházení, při pozdním termínu setí či při větší hustotě setí (Farahani and Maroufi, 2011). 2.3 Laboratorní zkouška klíčivosti Za hlavní hodnotu definující kvalitu osiva je považována laboratorní klíčivost, tato veličina je hodnocená podle mezinárodních pravidel ISTA (International Seed Testing Association) v Evropě a AOSA (Association of Official Seed Analyst) v USA, které zaručují mezinárodní srovnání a umožňují obchod nejen v evropském, ale i v celosvětovém měřítku. Z biologických hodnocení poskytuje základní charakteristiku osiva procento laboratorní klíčivosti. Hodnota laboratorní klíčivosti udává maximální možnou schopnost (potenciál) semen dané partie klíčit a vytvořit novou rostlinu v optimálních podmínkách. V pěstitelské praxi, i když máme osivo s vysokou klíčivostí, maximální možná klíčivost nemusí být dosažena, neboť podmínky prostředí, ve kterých semena klíčí, nejsou často optimální. Klíčivost byla v roce 1931 chápána jako schopnost semen vytvořit normální rostlinu. V současné době udává test klíčivosti hodnotu maximální. Existují práce, které hlásí vysoce významné korelační koeficienty mezi standardním testem klíčivosti a polním vzcházením, ale mnoho jiných poukazuje na problémy predikce polní vzcházivosti testem klíčivosti (Khan et al., 2010). Metody stanovení klíčivosti jsou nastaveny tak, že 20

21 mají vysokou úroveň reprodukovatelnosti a spolehlivosti, ale v polních podmínkách se často setkáme s horšími než optimálními podmínkami (Hampton and Tekrony, 1995). Partie osiva, které se neliší v klíčivosti, se mohou lišit ve vzcházivosti a skladovacím potenciálu (Matthews and Powell, 1986; Kolasinska et al., 2000). Vzhledem k tomu, že klíčivost je pouze parametr sloužící k určení klíčení, je třeba vzít vždy v úvahu vliv dormance, která je také v klasickém testu kvantifikována rozborem klíčenců (Clerkx et al., 2004). 2.4 Vitalita semen Rozvoj testování vitality osiv byl vynucen požadavky uživatelů osiv. Diskuse o vitalitě probíhá od 60. let minulého století. Po diskusích trvajících více jak 27 let definovala komise ISTA v roce 1981 pojem vitalita semen jako přirozenou vnitřní sílu zdravých semen zabezpečující rychlé klíčení po zasetí a jeho dokončení i za rozmanitých přírodních podmínek. Sdružení Association of Official Seed Analyst (AOSA) v roce 1983 definovalo vitalitu semen jako schopnosti semene pro rychlé a jednotné vzcházení a vývoj normálních rostlin při širokém rozsahu polních podmínek. Black and Bewley (2000) uvádějí, že vitalita není jednoduše měřitelná vlastnost, ale pojem popisující několik charakteristik, které zahrnují rychlost a uniformitu klíčení a růst, toleranci ke stresovým podmínkám po zasetí a udržení si vitality během skladování. Jinými autory je vitalita definována jako suma takových vlastností semen, které určují úroveň aktivity a projevu semen během klíčení a vzcházení (Hampton, 1995). Vitalita semen je dle Chloupka et al. (2003) hodnocena jako potenciál semen pro rychlé a uniformní vzejití a pro vývoj normálního semenáčku za širokého spektra polních podmínek. Testy vitality, které měří pouze jeden faktor, určují nespolehlivě vitalitu semen, neboť jen kombinace několika faktorů může dát dobrou předpověď polní vzcházivosti (Hampton and Coolbear, 1990) právě proto, že vitalita je dána mnoha faktory. Vysoce kvalitní semenné partie by měly mít vysokou vitalitu, kde klíčivost je jednotná, synchronizovaná, při klíčení se vyvíjí vysoké procento normálních klíčenců přes působení různých výrobních podmínek. Vitalita semen je nejvyšší při fyziologické 21

22 zralosti, ale podmínky prostředí, sklizeň a skladování mají významný dopad na její úroveň (Matthews and Powell, 1986). Za důvody nízké vitality byly považovány fyzikální vlastnosti semen, novější názory a analýzy se zaměřují na fyziologické příčiny nízké vitality, kde hlavní roli hraje stárnutí osiva a integrita buněčných membrán (McDonald, 1999). Rychlost poklesu vitality ovlivňuje genetický potenciál osiva, podmínky prostředí a tlak patogenů (Dornbos, 1995; Chloupek et al., 2003). Hosnedl a Honsová (2002) dále uvádějí, že pokles vitality se projevuje u ječmene ve zvýšené citlivosti na nedostatek kyslíku (anoxií). Uměle snížená vitalita osiva způsobila nižší klíčivost a pomalejší klíčení, opožděné vzcházení a snížení konkurenceschopnosti vůči plevelům. U semen s nízkou vitalitou došlo ke snížení konkurenceschopnosti a následkem toho k nárůstu biomasy plevelů o % a snížil se výnos plodiny o % (Rasmussen, 2000). Rostliny ze semen s dobrou vitalitou rychleji zastíní povrch půdy při rychlém vzcházení a tím sníží ztráty vody na počátku vegetace (Spielmeyer et al., 2007). Vitalita semen je důležitá agronomická vlastnost kvality osiva, která určuje míru rychlosti růstu embrya, což vede k rychlejšímu rozvoji fotosyntetického aparátu sazenic a lepší odolnosti stresovým podmínkám na poli (Farahani and Maroufi, 2011). Munck and Møller (2004) při analýzách jarního ječmene došli k závěru, že hlavním komponentem podílejícím se na vitalitě semen je struktura endospermu, který je důležitý pro dostupnost látek pro embryo při klíčení a modifikaci zrna při výrobě sladu. Při setí osiva do dobře připraveného seťového lůžka téměř v ideálních podmínkách, budou hodnoty klíčení na poli dobře korelovat s laboratorní zkouškou klíčivosti. Rozdíl ve vitalitě osiva se projevuje v méně optimálních podmínkách prostředí (Hampton and Tekrony, 1995). Partie se srovnatelnou klíčivostí ve standardních podmínkách testu klíčivosti se ve stresových podmínkách mohou chovat různě. Polák a Pazderů (2012) hodnotili klíčivost partií ječmene v optimálních podmínkách (obr. 2.3), kdy nezaznamenali velké rozdíly v celkové klíčivosti ( %), partie tak splňovaly podmínku minimální 85% klíčivosti uváděnou ve vyhlášce 369/2009 Sb. pro osivo ječmene. Však v prostředí snížené dostupnosti vody (test vitality osiva) se mezi jednotlivými partiemi projevily výrazné rozdíly (obr. 2.4), kdy nejlepší partie dosáhla klíčivosti 85 % a nejnižší klíčivost byla u partie 1 a 4 (62 a 65 %). 22

23 Obr. 2.3: Průběh klíčení neupravených partií osiva 1 5 (kontrola) v optimálních podmínkách prostředí ve filtračním papíře (30 ml vody), (Polák a Pazderů, 2012) Obr. 2.4: Průběh klíčení neupravených partií osiva 1 5 (kontrola) při nedostatku vody (20 ml), (Polák a Pazderů, 2012) Vitalita není důležitá jen v podmínkách, kde nejsme schopni zaručit optimální podmínky pro klíčení, ale také z hlediska dlouhodobého skladování. Vzorky o stejné klíčivosti mohou vykazovat rozdílnou vitalitu, jak dokazuje řada autorů. Důležitost kvality osiva a vitality je reprezentována značným množstvím výzkumných prací v této oblasti, které mají za cíl lepší porozumění vitalitě semen např. u pšenice (Lafond, 1986; Tomer and Maguire, 1990; Soltani, 2000; Modarresi et al., 2002; Spielmeyer et al., 23

24 2007; Samarah et al., 2010), ječmene (Abdalla, 1969; Boyd et al., 1971; Rasmussen, 2000; Hosnedl and Honsová, 2002; Chloupek et al., 2003; Møller and Munck, 2004; Samarah et al., 2011; Farahani, 2010). U modelových rostlin rýže (Roy, 2008) a Arabidopsis thaliana (Jacobsen and Olszewski, 1993; Sugliani et al., 2009; Ronny et al., 2010). Dále u sóje (Torres et al., 2004), hrachu (Hampton et al., 2004), kukuřice (Lovato, 2005; Msuya and Stefano, 2010), řepky (Elias, 1997), pícnin (Zhang et al., 2007) a řady druhů zelenin a květin (Dutra and Vieira, 2006; Rowse and Finch-Savage, 2003; Farahani and Maroufi, 2011) Testy stanovení vitality Většina testů vitality semen doporučených ISTA jsou založeny na principu zhoršení kvality semen a klíčivostí za stresových podmínek (Hampton and Tekrony, 1995). Deteriorace semen je předmětem nejrůznějších studií, neboť stále není dostatečně prozkoumána. Při zhoršování semene dochází k mnoha procesům, které mohou přispět ke ztrátě či zhoršení životaschopnosti, což je pak problémem při určování příčin a důsledků nízké vitality (McDonald, 1999). Vitalita semen není vlastnost jednoduše geneticky založená, ale koncept popisující několik charakteristik jako rychlost a uniformitu klíčení, růst a toleranci vůči abiotickým a biotickým faktorům a udržení si kvality po sklizeň a při skladování semen (Hampton and Coolbear, 1990). U testů vitality semen je nezbytné, aby splňovaly podmínky opakovatelnosti, reprodukovatelnosti v rámci jedné i navzájem mezi semenářskými laboratořemi. V roce 2001 ISTA uvádí mezi standardní metody hodnocení vitality nejprve test konduktometrické vodivosti pro hrách a test urychleného stárnutí u sóje. V roce 2010 byl do metodik ISTA zařazen také konduktometrický test pro fazol a sóju, test řízené deteriorace u řepky; test růstu kořínků pro kukuřici byl přijat a zasazen do pravidel ISTA v roce Byl přijat také biochemický tetrazoliový test pro sóju. Jen málo zkoušek je doporučeno ISTA, především z důvodů nízké reprodukovatelnosti mezi laboratořemi (Van de Venter, 2001). V praxi je však situace jiná a osivářský průmysl testy vitality často využívá (Tekrony, 2001). 24

25 Testy musí být reprodukovatelné a vyhodnotitelné. Bylo navrženo mnoho testů hodnocení vitality, některé získaly širší přijetí jako chladový test kukuřice, další se prokázaly vhodné pouze v lokálním kontextu. Jejich spolehlivost může být určena srovnáním výsledků zkoušek a výkonem v polních podmínkách nebo potenciálu při skladování (Chloupek et al., 2003). Testy vitality musí být objektivní, rychlé, jednoduché a ekonomicky praktické, reproduktivní, citlivější než testy klíčivosti ve vztahu k polní vzcházivosti (Marcos- Filho, 1998). Musí mít vyšší korelaci mezi laboratorními a polními podmínkami než test klasické klíčivosti. Významné korelace mezi polní vzcházivostí a laboratorními zkouškami vitality potvrzují například Jones and Peterson (1976) a McKenzie et al. (1980), Šťastný and Pazderů (2008). Testy vitality stále ještě narážejí na problémy při jejich standardizaci a opakovatelnost výsledků mezi jednotlivými laboratořemi. I když v posledních letech došlo k velkému pokroku při testování vitality semen, což se projevuje také zvyšujícím se zájmen o tyto metody testování semenářskými firmami (McDonald, 2002). Testy vitality jsou velice rozšířeny v USA. Tekrony (2001) uvádí, že testy vitality již v roce 2001 užívalo přes 62 % semenářských laboratoří ISTA, avšak pouze 16 % používá testy rutinně. Hampton and Coolbear (1990) rozdělili zkoušky vitality do tří skupin: a) testy založené na klíčivosti (test klíčivosti, vzcházení semen, chladový test, test urychleného stárnutí, kontrolované deteriorace), b) fyziologické a biochemické testy (test elektrické vodivosti, tetrazoliový test), c) vícefaktorové testy. AOSA klasifikuje testy vitality na biochemické testy (tetrazoliový test, test konduktivity, respirační test, test aktivity kyseliny glutamové a ATP), stresové testy (chladový test, test urychleného stárnutí, brick test, osmotické testy), testy vyhodnocující růst klíčenců (rychlost klíčení, rychlost růstu klíčenců). Níže jsou popsány: a) biochemické testy konduktivity, tetrazoliový test, test respirační aktivity, GADA glutamic acid decarbosylase activity a obsah adenosin triphosphatu (ATP) b) stresové testy test urychleného stárnutí (AA), kontrolované deteriorace, chladový test, chladová klíčivost, brick test Hilterův test, testy za osmotického stresu, c) zkoušky hodnotící růst klíčenců testy hodnotící parametry klíčení, testy růstu a vývinu kořínků a klíčků aj. 25

26 Test urychleného stárnutí (AA accelerated ageing) Test je založen na předpokladu, že semena s vyšší vitalitou stárnou pomaleji. Test urychleného stárnutí byl původně navržen jako test skladovatelnosti semen. Při testu, který vyvinuli Delouche and Baskin (1973) se hodnotí rozdíl mezi klíčivostí semen před expozicí zvýšené teplotě a zvýšené vlhkosti a po tomto ošetření. Osivo ovlivněné tímto testem vykazuje silné zestárnutí (podobně jako osivo nevhodné ke skladování či staré několik let), čímž se značně snižuje schopnost vyklíčit v důsledku většího poškození buněčných membrán a metabolických procesů v semenech (Suresh, 1991). Dle ISTA hodnocení probíhá při vysoké teplotě 41 o C (40 45 o C) a relativní vlhkosti po krátkou periodu 3 či 4 dnů. Tento test je navržen a doporučen pro mnoho plodin jako kukuřice, sója, čirok, pšenice a zeleninu (AOSA, 1983). Mnoho autorů doporučuje test urychleného stárnutí jako vhodnou techniku pro hodnocení vitality osiva, například rýže (Krishnasamy and Seshu, 1990), ječmene (Samarah et al., 2011), pšenice (Gul et al., 2012; Soltani et al., 2004), řepky (Komba, 2006), sóji (Torres et al., 2004) a zeleniny (Silva et al., 2006). Test AA poskytuje přesnější informace o kvalitě semen než klasická zkouška klíčivosti (Hosnedl a Honsová, 2002). Samarah et al. (2011) sledovali vliv stresu pozdního sucha při nalévání zrna ječmene na klíčivost a vitalitu (AA). Stres při nalévání zrna neměl žádný vliv na standardní test klíčivosti, ale snížil vitalitu semen Test řízené deteriorace (CD controlled deterioration) Tento test byl původně navržen pro vyhodnocování malých semen zeleniny (mrkve a salátu), kde se rutinně používá (Fujikuraa and Karssena, 1992), prokázala se však vhodnost i pro hodnocení trav (Hampton and Tekrony, 1995) a obilovin (Modarresi and Van Damme, 2003; Tekrony et al., 2005) i dalších plodin. Při hodnocení jsou nejprve semena uvedena na stejnou vlhkost a dále vystavena na krátkou dobu vysoké teplotě a vysoké vlhkosti. Modarresi and Damme (2003) zjistili, že nejlepší vypovídací schopnost o vitalitě u obilovin je u testu kontrolované deteriorace při kombinaci 45 o C po dobu 72 hodin. 26

27 Chladový test Test je založen na principu působení nepříznivých vlivů na semeno v podmínkách vysoké vlhkosti v nesterilních podmínkách s půdními patogeny a při nízké teplotě (10 ºC) po dobu sedmi dní. Test simuluje podmínky, které se mohou vyskytnout při jarním setí. Rozlišováni jsou normální a abnormální klíčenci. Test je úspěšně aplikován například u kukuřice (Hampton and Tekrony, 1995) sóji, obilovin, čiroku atd Klíčení za chladu Test byl vyvinut pro hodnocení vitality semen bavlníku. Je méně náročnou alternativou chladového testu, při zachování dostatečných zátěžových podmínek testování. Klíčení probíhá ve tmě při 18 ºC (optimální teplota pro klíčení bavlníku je 26 ºC) po dobu sedmi dnů (AOSA, 1983) Hilterův test (test laboratorní vzcházivosti) Semena jsou během testování zaseta do vlhké cihlové drtě nebo do písku. Klíčení probíhá ve tmě při pokojové teplotě. Semena s nízkou vitalitou, napadená patogeny, poškozená, nejsou schopna proniknout cihlovou drtí. Test byl navržen a doporučen pro kukuřici, pšenici, ječmen, žito a oves (Hampton and Tekrony, 1995) Testy s působením osmotického stresu Semena jsou často při setí v polních podmínkách vystavována stresu suchem. V laboratorních podmínkách se stres suchem simuluje pomocí roztoku s kontrolovaným osmotickým potenciálem pomocí chloridu sodného, glycerolu, sacharózy či polyethylenglykolu (PEG). Test byl úspěšně použit pro hrách a cukrovou řepu (McDonald, 1999; Ghiyasi, 2008), u obilovin (Chloupek et al., 2003; Janmohammadi et al., 2008; Farahani, 2010) i zeleninu (Rowse and Finch-Savage, 2003) Konduktometrický test vodivosti výluhu Je založen na změně vlastností buněčných membrán a jejich integrity. Vodivost exudátu závisí na množství látek iontové povahy vyluhovaných ze semen. Jednotkou jsou μs.g -1 (mikrosiemens na gram hmotnosti suchých semen). ISTA (1995) uvádí hodnoty 27

28 u hrachu do 24 μs.g -1 jako osivo vhodné pro včasný výsev, hodnoty nad 43 μs.g -1 mají semena, která nejsou vhodná pro výsev v polních podmínkách. Test byl úspěšně použit a doporučen pro kukuřici, sóju, hrách (AOSA, 1983; ISTA, 1995). Dále byly dosaženy dobré shody mezi testem vodivosti a polní vzcházivostí například u obilovin Gul (2012), zeleniny (Swanston and Taylor, 1990) a fazolu (Hampton et al., 1992). Cheng et al. (2005) uvádějí, že však semipermeabilní membrána zabraňuje úniku větších molekul z buňky, a proto nepřesně určuje kvalitu osiva, což může ovlivnit přesnost testu doporučeného ISTA a AOSA. Vzhledem k tomu je lépe stanovovat úroveň malých iontů jako Na + a K +, které jsou fyziologicky důležité a mohou přesněji predikovat kvalitu buněčné membrány a úroveň vitality semen. Koncentrace uniklých iontů v elektrolytu (mg/ml) je vypočtena z hodnot naměřených při máčení semen v destilované vodě po dobu 24 hodin při teplotě 25 C, za použití měřiče vodivosti. Test se projevil jako citlivější pro určování vzorku s vyšší vitalitou než konduktometrická metoda Topografický tetrazoliový test Je rychlý, destruktivní test sloužící k určení životaschopnosti semen. Umožňuje efektivně určit mechanické poškození a neživou tkáň u semen různých druhů. Živé pletivo reaguje s roztokem 2, 3, 5 trifenyl tetrazolium chloridu. Neživá tkáň zůstává nezbarvena. Moore v roce 1973 navrhl použití tetrazolia u osiva jako první. Tento test je doporučen u kukuřice, hrachu a sóji Testy určující respirační aktivitu semen Tento test je založen na předpokladu, že semena vykazují vyšší intenzitu dýchání v prvních hodinách klíčení a intenzita dýchání úzce souvisí s rychlostí růstu semenáčku (AOSA). Je používána i nová nedestruktivní metoda přístrojového stanovení klíčivosti semen měřením spotřeby kyslíku (Bopper and Kruse, 2010). Podobně jednoduchou a časově nenáročnou metodou lze měřit hodnoty množství etanolu, který vzniká při klíčení semen. Existuje inverzní korelace mezi vitalitou semen (kvalitou) a množstvím produkovaného etanolu. Zvýšené množství etanolu bylo naměřeno po deterioraci semen 28

29 (zvýšenou teplotou), také byla zjištěna větší produkce etanolu u předčasně sklizených nedozrálých semen oproti semenům ve sklizňové zralosti (Kodde et al., 2012) Index růstu semenáčků Tento test je založen na myšlence, že vitální semena jsou schopna efektivně a rychle vytvořit klíční rostlinu, což se projeví zvýšením suché hmoty klíčence. Semena klíčí při standardních podmínkách, ve tmě po dobu sedmi dní, následně jsou klíčenci vysušení při 80 ºC po dobu 24 hodin. Výsledek je vyjádřen v mg suché hmoty klíčence. Test byl navržen a doporučen pro kukuřici a sóju (AOSA, 1983; ISTA, 1995) Testy hodnotící parametry klíčení Rychlost klíčení je důležitým aspektem vitality semen, neboť rychlejší klíčení usnadňuje včasné vzejití, konkurenceschopnost klíčence (Rasmussen, 2000) i celkové zapojení porostu. Na rozdíl od klasického testu klíčivosti jsou semena hodnocena každý den klíčení. Energie klíčení je vhodnou metodou pro hodnocení vitality, při které se hodnotí fyziologická klíčivost vzorku v termínu prvního počítání klíčivosti dle ISTA, tato hodnota dobře charakterizuje klíčivost ve stresových podmínkách a hodnotu skladovatelnosti osiva (Šťastný and Pazderů, 2008). Khajeh-Hosseini et al. (2009) stanovují počítání obilek ve třetím dni jako potenciální rutinní test pro hodnocení vitality u kukuřice. Energie klíčení může být také alternativou k chladovému testu u obilovin (Matthews et al., 2010). Hosnedl and Honsová (2002) potvrdili testy laboratorní klíčivosti, střední dobu klíčení (MTG), testy jímavosti vody (vlhké prostředí s anoxií) a test v roztoku 0,75 % peroxidu vodíku (vlhké prostředí bez anoxie), že ječmen je při klíčení velmi citlivý na nedostatek kyslíku. Test v peroxidu vodíku měl vysoký koeficient korelace s laboratorní vzcházivostí. Zkouška je prováděná při 20 ºC, po dobu 4 a 7 dní. Dynamika klíčení hodnotí klíčivost po 1, 2, 3, 4, 7 dnech jako denní přírůstky vyklíčených semen. Ellis and Roberts (1981) uvádí další parametr, který poskytuje přesnější informace o klíčivosti střední dobu klíčení (Mean germination time MTG). Průmysl a obchod využívá pro stanovení kriterií klíčení sladovnických ječmenů EBC metodiku. Tato metodika dle Møller and Munck (2004) však slouží jako jednorozměrné 29

30 kritérium s ohledem na klíčení semen během tří až pěti dní. Proto navrhli model vícerozměrné analýzy pro stanovení klíčícího profilu pro vitalitu a životaschopnost semene. PCA (principal component analysis) pracuje pomocí softwaru s využitím algoritmu hlavního komponentu v datovém souboru, který zachycuje nejvíce proměnlivosti. Zahrnuje proměnnou energii klíčení, potenciál vitality v teplotním stresu 68 o C, rychlost klíčení s využitím fluorescenčního světla a chemické sladařské rozbory (Møller et al., 2002) Testy růstu a vývinu kořínků a klíčků Test růstu kořínků přijatý do pravidel ISTA v roce 2012 pro řepku poskytl důkazy, že posuzuje spolehlivě míru vitality i u řady dalších druhů (bavlny, papriky, melounu, okurky). Hodnocení délky kořínků na Petriho miskách naklíčených standardním způsobem, zavlažených deionizovanou vodou s teplotním režimem 10 o C v noci a 20 o C ve dne, hodnocení následovalo po sedmi dnech. Kakhki et al. (2008) regresní analýzou zjistili, že délka kořínku mimo jiné by mohla být používána k zjišťování růstu klíčenců, tedy pro stanovení vitality semen. Délka kořínků může být stanovena obrazovou analýzou a výpočtem VI = GI S x, kde GI je index klíčivosti, S x je průměrná hmotnost radikuly počet dní procesu klíčení (Cheng et al., 2005). Další autoři uvádějí stanovení délky klíčků, z této hodnoty je pak vypočten index vitality jako VI = GI H s, kde GI je index klíčivosti, H s je délka klíčků (Zhang et al., 2007; Cao et al., 2008). Index klíčení vysoce významně souvisel s délkou klíčků (Hosseini, 2009) Ostatní testy vitality semen Principem test GADA je měření koncentrace kyseliny glutamové, která podléhá dekarboxylační činnosti; při této reakci se uvolní CO 2 (Hampton, 1995). Množství CO 2 odráží úroveň enzymatické aktivity. Semena s vysokou vitalitou produkují větší množství CO 2 a naopak. Grabe (1964) zjistil, že tento test silně koreluje s klíčivostí a vzcházením obilovin. Test je používán u obilovin i kukuřice (Kamffer and Van de Venter, 1990). Test stanovující obsah ATP předpokládá, že jeho množství je přímo 30

31 úměrné aktivitě organizmu, ačkoliv pozdější studie nepotvrdily silnou korelaci u kukuřice (Styler et al., 1980). Testy hodnotící brzkou klíčivost s využitím fluorescenčního světla v oblasti 366 nm, kdy byla analyzována kořenová čepička a kořínek. Analýza obrazu vykázala velmi těsnou korelaci s klasickým hodnocením. Analýza obrazu však není vhodná pro testy klíčení v peroxidu vodíku, kdy detekce probíhala po 24 hodinách klíčení (Munck and Møller, 2004). Budoucnost ISTA metod hodnocení vitality semen je založená i na využívání X paprsků a 3D skenování (zjišťování abnormalit embrya či přítomnost škůdců v semenech). Důležitým nástrojem při stanovení klíčivosti a vitality je přesná kvantifikace klíčení, což je jedním z hlavních problémů opakovatelnosti výsledků. Existují výpočetní programy, které automaticky hodnotí klíčence na základě barevného kontrastu klíčních rostlin (Ronny et al., 2010). Obrazová analýza je metoda pro zefektivnění hodnocení kvality osiva (Ducournau et al., 2005). Pomocí multispektrální analýzy ve viditelném a světelném spektru blízkém infračervenému (NIRS) je možno detekovat semena napadená patogeny. Analýza obrazu spolu s výpočetním systémem je s velkou spolehlivostí schopna hodnotit čistotu či analyzovat plochu vyklíčených kořínků při stanovení vitality Genetická kontrola vitality semen Je známo, že vitalita je ovlivněna vlivy genetickými a environmentálními (Whittington, 1973; Hosnedl and Honsová, 2002; Chloupek, 2003). Vlivům environmentálním bylo věnováno značné úsilí, genetická podstata zůstává však skryta (Sinniah et al., 1998). V posledních letech se věnovalo úsilí výzkumu genetického řízení vitality semen a hledáním QTL lokusů, spojených s touto vlastností. Vitalita osiva je určena celkovou tolerancí genotypu, nicméně každý specifický stres má svou vlastní genetickou kontrolu (Clerkx et al., 2004). Byl detekován gen pro dlouhověkost semen u modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Nalezení jeho analogu u polních plodin by mohlo prodloužit dlouhověkost jejich semen (Sugliani et al., 2009). U Arabidopsis thaliana byly identifikovány dva QTL pro počáteční procesy klíčení, tři QTL pro dlouhověkost semen a klíčení po kontrolované deterioraci, tři QTL byly nalezeny pro klíčení ve stresových 31