Ionty vznikají interakcí molekuly s proudem elektronů o definované energii (70 ev)

Transkript

1 motnostní spektrometrie (2) 12_Chudoba_CVDGrigsby_1ACC 12 (.677) 1 % Josef Chudoba Využití MS - kvalitativní analýza Electron Impact ionizace (EI + 7 ev) Databáze spekter GC/MS LC/MS MS/MS experimenty Využití MS - kvantitativní analýza Kalibrace technikou s vnitřním standardem Úprava vzorků pro MS analýzy SPE, SPME, extrakce. Speciální aplikace MS ICP-MS, Isotope Ratio MS, pyr-gc/ms, Ion Mobility MS

2 Elektronová ionizace (EI + 7 ev) Ionty vznikají interakcí molekuly s proudem elektronů o definované energii (7 ev) Molekulový ion lichý počet počet elektronů Neutrální molekula sudý počet elektronů Ionizační energie (IE) energie nutná k odtržení elektronu z molekuly Elektronová ionizace (EI + 7 ev) Molekulový ion informace o hmotnosti popř. chemickém složení látky, ion s lichým počtem elektronů, jeho m/z nejvyšší v MS spektru (mimo ionty izotopických příspěvků a pozadí); v MS spektru existují také nižší fragmenty s m/z molekulového iontu zmenšenou o logickou ztrátu neutrálních molekul a fragmentů Zakázané ztráty m/z 4-14, Jsou-li přítomny tyto fragmenty v MS spektru, sledovaný ion určitě není molekulární. Povolené ztráty m/z 15 C C 2 4 nebo C 35 Cl 36 Cl Podle intenzity izotopických fragmentů lze poznat přítomnost Cl, Br, lze zjistit počet atomů uhlíku fragmentu R+DB musí být celé číslo (R+DB = C -1/2 + 1/2N +1)

3 Elektronová ionizace (EI + 7 ev) ragmentace molekulového iontu a dalších vzniklých iontů omolytické štěpení eterolytické štěpení Přesmyky Elektronová ionizace (EI + 7 ev) ragmentace EI+ 7 ev = 29 Ztráta neutrální částice (molekuly nebo radikálu) z rozdílů hmot píků se získají tzv. neutrální ztráty vypovídají o struktuře molekuly

4 Běžné neutrální ztráty EI+ (7 ev) ionizace Série nízkých iontů (1) - EI+ (7 ev) ionizace

5 Série nízkých iontů (2) - EI+ (7 ev) ionizace EI + 7 ev: MS spektra - alkany C C n-dekan inkrement C 2 C C C C

6 EI+ 7 ev: MS spektra alkanů (2) n-alkan iso-alkan n-c 8 iso-c 8 n-c 22 iso-c 8 EI+ 7 ev:ms spektra alkenů a cykloalkanů alken alkylcyklopentan alkylcyklohexan MS spektra alkenů jsou podobná cykloalkánům

7 alkylsubstituované benzeny EI+7 ev: MS spektra aromátů chudší fragmentace stabilní arom. kruh, fragmenty z alkylu nejintenzivnější píky 91 / 92 (tropilium) molekulový ion (toluen 92, xyleny 16, trimebenzeny 12, atd.) benzen M + 78 butylbenzen (mainlib) Benzene M EI+ 7 ev: MS spektra polyaromátů 51_PA_EPAstandMixk_2 1 Magnet EI+ TIC 4.77e4 51_PA_EPAstandMixk_ (19.343) Cm (1914:1918-( )) 1 % benzo(b)fluoranthen benzo(k)fluoranthen benzo(a)antracen Benzo(a)pyren Magnet EI e3 M + = _PA_EPAstandMixk_ (18.737) Cm (1855:1856-( )) 1 % Magnet EI e3 % M + /2 = m/z Time Benzo(b)fluoranthen m/z M + = 252 geometrické izomery PAU prakticky nelze rozlišit pomocí MS intenzivní molekulový iont M + (m/z ; z=1) + 2x nabitý mol. iont (m/z ; z=2) PZR!!! nejedná se o fragment!!!

8 EI+ 7 ev:ms spektra alkoholů m/z 31 1-hexadecanol 1-hexadecen Alkoholy podobná spektra jako alkeny, lze je rozlišit podle iontu m/z 31 (alkeny nemají), mají navíc velmi malý molekulový ion, nebo úplně chybí EI+7 ev: MS spektrum - aromatický alkohol benzylalkohol molekulový ion inkrement C 2 inkrement m/z 19 M+1 izotop 13 C fenyl + tropylium +

9 1 EI+7 ev: MS spektrum dusíkaté látky - amíny Triethylamin 86 N (mainlib) Triethylamine 1 Anilin 93 N (mainlib) Aniline EI+7 ev: MS spektrum dusíkaté látky - nitrosloučeniny 2,4,6 - trinitrotoluen 1 21 N N N (mainlib) Benzene, 2-methyl-1,3,5-trinitro- 46 RDX plastická trhavina M = 222 Da N N N N 5 N N (mainlib) 1,3,5-Triazine, hexahydro-1,3,5-trinitro-

10 EI+ 7 ev: Knihovny MS spekter Univerzální komerční databáze National Institute of. NIST spekter Standards and Techn ( sloučenin) John Wiley & Sons Wiley Registry 8th Ed spekter Pallisade MS Pallisade Complete > 6 spekter borové komerční databáze John Wiley & Sons Biomarkes 111 spekter John Wiley & Sons Steroids 2979 spekter borové free-ware databáze American Academy of orensic Science (AAS) Comprehensive drug LIbrary ( The Int. Association of orensic Toxicologosts (TIAT) Derivatives of Drugs ( EI+ 7 ev: Knihovny MS spekter počítačové vyhledávání Změřené MS spektrum je porovnáváno s databázovými spektry podle různých algoritmů PBM - Probability Based Matching (McLafferty & Stauffer) rok 1976 Dot Product (innigan/incs) rok 1978 Mass Spectral Tree Search (Mistrik) od roku 2 (pro MS/MS experimenty, LC/MS aplikace) Weighted Dot Product (Stein) od r algoritmus součástí NIST SEARC programu orward search porovnává všechny píky spektra, nejvíce podobná spektra přiřadí Reverse search nebere v úvahu všechny píky měřeného spektra, píky, které se neshodují s přířazeným databázovým spektrem ignoruje

11 EI+7 ev: Identifikace podle databázových MS spekter Výsledkem porovnání měřeného MS spektra s databázovými je několik spekter (ITů) - o kvalitě knihovního nálezu vypovídá tzv. MATC factor (-999) vyšší hodnota lepší shoda EI+7 ev: Identifikace podle databázových MS spekter Vysoký MATC faktor nemusí vždy znamenat správný výsledek!!! Podobné látky mohou mít odlišná MS spektra, ale S i N S i N S i S i S ilanamine, N,1,1,1-tetramethyl-N-[1-methyl-2-phenyl-2-[(trimethyls ilyl)oxy] N-Methylphenylethanolamine, bis (trimethyls ilyl)-

12 EI+7 ev: Identifikace podle databázových MS spekter Vysoký MATC faktor nemusí vždy znamenat správný výsledek!!! Ale odlišné látky mohou mít i podobná MS spektra T etradecene Cyclotetradecane GC/MS: pomoc při identifikaci Kovatsův retenční index (RI) RI = 1n + 1[log(t x ) log(t n )] / [log(t n+1 ) log(t n )] 17_V14_1 1 % n-c 14 n-c 15 n-c 16 n-c 17 n-c 18 t n t n+1 t x Magnet EI+ TIC 7.25e5 n počet atomů uhlíku n-alkánu před sloučeninou X t n retenční čas n-alkánu před sloučeninou X t n+1 retenční čas n-alkánu za sloučeninou X Time t x retenční čas sloučeniny X log.. přirozený logaritmus odnoty RI jsou dostupné pro celou řadu látek a podmínek fáze GC kolony (nepolární vs polární), teplotní program separace atd. NIST 5 MS knihovna

13 GC-MS: Derivatizace málo těkavých analytů - zlepší tvar píků polárních látek -, -C, - N2 atd. - zlepší těkavost málo těkavých analytů -ACYLACE -ALKYLACE, ESTERIIKACE SILYLACE GC-MS GC-MS spojení plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie první komerční přístroje polovina 6. let 2. století LKB (Švédsko) spojení GC s náplňovými kolonami s magnetickým typem spektrometru 7.léta 2. Století první bench-top instrumenty kvadrupoly ewlett-packard, innigan Zdroj: Agilent Technologies

14 GC-MS První GC-MS - náplňové kolony velký průtok nosného plynu (1 4 ml/min) MS spektrometr (vakuum) nutný restriktor tryskový (JET) separátor (dělí tok nosného plynu bez ztráty vzorku) Dnes kapilární GC kolony (malý průtok nosného plynu do 2 ml/min) není nutný restriktor Dnešní výrobci GC-MS přístrojů Agilent Technologies Thermo Electron Corporation Perkin Elmer, Varian, Shimadzu, Waters a další. Cena GC-MS zákl. konfigurace : kvadrupol, zdroj EI+ ionizace, GC chromatograf, split/splitless nástřik, SW cca 2 mil. Kč GC: MS vs ID detektor MS detektor + identifikace sloučenin podle MS spektra + vysoká citlivost prakticky pro všechny typy sloučenin + prakticky univerzální detektor + TIC záznam blízky ID záznamu dat - při aplikacích kvantitativní analýzy obvykle nutná technika vnitřního standardu (použití izotopicky zančeného (deuterovaného) standardu - odlišná odezva pro různé uhlovodíky - vyšší pořizovací náklady a náklady na údržbu ID detektor + nižší pořizovací náklady, malý rozměr + vyšší dynamický rozsah + prakticky univerzální odezva pro uhlovodíky využití při kvantitativní analýze + použití náplňových i PLT kolon + jako nosný plyn lze i N2 - více provozních plynů (nosný plyn, 2, vzduch) - detekce pouze sloučenin obsahující C- vazbu

15 LC/MS: kvalitativní analýza Sprejové ionizační techniky poskytují pseudomolekulové ionty resp. adukty molekulového iontu s některými kationty (pozitivní režim) nebo anionty (negativní režim). Často vznikají při ionizaci i oligomery sloučenin nebo v ESI vícenásobně nabité ionty. Pozitivní režim Negativní režim M + 1 (+) Možné adukty M + 23 (Na+) M + 39 (K+) M + 32 (C3) M + 41 (C3CN) M - 1 ( - +) Možné adukty M + 22 (Na+ -) M + 45 (C-) M + 59 (C3C-) M + 58 (NaCl) M + 41 (C3CN) LC/MS: kvalitativní analýza Vícenásobně nabité ionty Velké molekuly (ESI) série iontů nestejné rozdíly mezi m/z příklad koňský myoglobin (M = Da) Určení náboje a celkové hmotnosti molekuly: m1 a m2.. m/z dvojice sousedních iontů, n1 a n2 jejich náboj (z), X adukt k molekulovému iontu m1 = [M+n1X]/n1 m2 = [M+n2X]/n2 n2 = (m1-x)/(m2-m1) m1 = 1413, m2 = 1542, odhad X = 1 n2 = 1.94, Mcalc = Da m1 = 135, m2 = 1413, odhad X = 1 n2 = 12.7, Mcalc = Da

16 LC/MS: kvalitativní analýza Vícenásobně nabité ionty malé molekuly příklad dvounásobně nabitý ion poloviční rozdíl u m/z mezi izotopy CalixMB2_1 #2 RT:.54 AV: 1 NL: 1.72E6 T: TMS + p ESI ull ms [5.-38.] z=2 1 Relative Abundance z= z= z= z= z=? z= z=? z=? z=? CalixMB2_ # RT: AV: 1 NL: 1.72E6 T: m/z TMS + p ESI ull ms [5.-38.] z= z=1 9 8 [M+2]2+ z = 2 N N N C 3 C 3 N C 3 N 3C N N C 3 C 3 C 3 C 3 N C 3 CalixMB2_1 #2 RT:.54 AV: 1 NL: 4.74E4 T: TMS + p ESI ull ms [5.-38.] z=1 1 Relative Abundance z= z=? z=? z= z=? z= z=? z= m/z C N8 18 z = z=1,5 Da Relative Abundance z=2 M = 2477,5292 Da [M+]+ = 2478,5372 Da 1 Da z= z=? z=2 z=1 z=1 z=2 z=? z= m/z [M+]+ kvalitativní analýza kombinace více ionizačních technik SV2141_2 #6 RT:.35 AV : 1 NL : 2.64E7 T: TM S + p A P C I c oro na ull m s [ ] Cl 7 Relative Abundance APCI m /z [M+] +

17 kvalitativní analýza kombinace více ionizačních technik ESI+ S V _ 1 # 3 R T :.1 1 A V : 1 N L : E 4 T : T M S + p E S I u ll m s [ ] z = Cl 8 7 Relative Abundance z= z= z = z =? z= z= z= z= 1 z = m /z [M+Na] z=? kvalitativní analýza kombinace více ionizačních technik EI+ 7 ev Cl

18 LC/MS/MS: kvalitativní analýza Lze měřit jen s IT, QqQ, nebo hybridními MS spektrometry (Q-T,IT-rbitrap) 1.Separátor výběr iontu -> definované rozbití iontu v kolizní cele -> analýza produktů 2. analyzátorem SV2141_2 #18 RT: 2.77 AV: 1 NL: 5.66E3 : TMS + p APCI corona ull ms @cid25. [ ] SV2141_2 #19 RT: 2.79 AV: 1 NL: 1.73E7 : TMS + p APCI APCI corona ull ms [ ] pos MS spektrum MS 2 -MS/MS z [M+]+ Relative Abundance [M+]+ Relative Abundance m/z m/z SV2141_2 #47 RT: 8.42 AV: 1 NL: 4.41E4 : TMS + p APCI corona ull ms @cid @cid. [ ] Cl 9 8 Relative Abundance MS 3 - MS/MS z m/z m/z LC/MS: pomoc při identifikaci UV-VIS spektrum ESI, APCI detekce pouze polárních sloučenin PLC do série před MS lze zapojit UV-VIS detektor UV-DAD detektor UV-DAD detekce MS detekce ESI+ MS spektrum

19 LC/MS/MS: kvalitativní analýza Aby se rozdělily jen podle m/z muselo by být R = 74 SV2141_2 (.) Cu (.1); Is (1.,1.) C1532N56Cl C N 5 6 Cl m/z 448,173 Scan ES+ 4.68e12 % SV2141_2 (.185) Cu (.1); Is (1.,1.) C2427N6Na % C N 6 + Na m/z 448,1736 Scan ES+ 7.5e mass Zdroj: Shimadzu LCMS-IT-T brochure MS: Kvantitativní analýza CÍL: 1. Potvrzení, že jde skutečně o sledovaný analyt 2. Zjištění jeho koncentrace ve vzorku Ad 1: většinou se jedná o chromatografické analýzy (GC/MS resp. LC/MS) znám retenční čas (RT) EI+ 7 ev: TIC režim (menší citlivost) pro identifikaci k dispozici celé MS spektrum SIM režim (vyšší citlivost) vždy je lépe snímat alespoň dva charakteristické ionty (identifikaci může potvrdit poměr jejich odezev) ESI, APCI: MRM (Multiple Reaction Monitoring) MS/MS technika 1 analyzátor SIM (výběr iontu) 2. analyzátor kolize 3. analyzátor SIM (více iontů, sleduje se poměr odezvy)

20 LC/MS/MS: Kvantitativní analýza Příklad využití MRM Izotopicky označený standard stejné retenční chování, jiná molekulová hmotnost používá se jako vnitřní standard (Internal Standard IS) Kvalitativní informace: retenční čas a přítomnost dceřinného iontu (m/z) popř. poměr ploch píků stop více dceřiných iontů Kvantitativní informace: plocha píků dceřinného popř. dceřiných iontů (m/z) pro analyt a vniřní standard Zdroj: Agilent technologies App. Note MS: Kvantitativní analýza Kalibrační přímka Vnitřní standard (Plocha Ais) A/Ais Analyt (Plocha A) c.. Koncentrace A/Ais = RR. c/cis c/cis RR.. Relativní odezvový faktor Směrnice přímky je RR Kalibrace s použitím vnitřního standardu Přítomnost vnitřního standardu snižuje vliv kolísání odezvy MS detektoru, u GC chybu při nástřiku atd., jako vnitřní standard lze použít i podobnou sloučeninu ne izotopicky značenou

21 MS: Kvantitativní analýza Kalibrační rozsah Signál (signal) A/Ais split 1:6 1 ul 5 mg/ml 21_V13aro_ : Magnet EI e3 % Šum (noise) Time LD ~ 3 x (Anoise/Ais) / RR c/cis LQ ~ 1 x (Anoise/Ais) / RR Mez detekce (Limit of Detection - LD) Mez stanovitelnosti (LQ - Limit of Quantification) MS: Kvantitativní analýza citlivost MS spektrometrů Specifikace výrobce: pro konkrétní sloučeninu a podmínky udává se poměrem signál/šum pro absolutní detekované množství sloučeniny zpravidla se jedná o množství v řádu pikogramů (pg = 1-12 g) nebo femtogramů (fg = 1-15 g) GC/MS: splitless nástřik: 1 pg oktafluorunaftalenu (N) SIM režim m/z S/N > X C 1 8 LC/MS/MS: IA: ESI+ 1 fg reserpine MRM: m/z 69 ->m/z 397 a 447 S/N > X C 33 4 N 2 9 Nejmenší absolutní detekované množství : SIM (MRM): řádově fg-pg TIC (ull Scan): řádově pg-ng Maximální abs. detekované množství: dané dynamickým rozsahem cca 3-5 řádů tzn. SIM (MRM) ng ;TIC (ull Scan) mg vždy však záleží na typu sloučeniny odezva MS detektoru není univerzální

22 MS: Kvantitativní analýza citlivost MS spektrometrů Předúprava vzorků Cíl: zjednodušení matrice vzorku (odstranění interferujících sloučenin) zakoncentrování analytu ve vzorku změna rozpouštědla např. voda není vhodná pro GC/MS analýzu Způsoby předúpravy: filtrace centrifugace zakoncentrování odpařením extrakce (rozpouštědlová, Soxhlet) SPE (Solid Phase Extraction) Purge and Trap SPME (Solid Phase Microextraction) Pro těkavé sloučeniny (VC)

23 Předúprava vzorků: SPE Solid Phase Extraction Vzorek (analyt s matricí) je nanesen na kondiciovanou vrstvu sorbentu. Matrice je oddělena a zakoncentrovaný analyt je eluován malým objemem vhodného rozpouštědla. Normální uspořádání fází Polární sorbent, nepolární rozpouštědlo Reverzní uspořádání fází Nepolární sorbent, polární rozpouštědlo Iontová výměna pro iontové sloučeniny Předúprava vzorků: SPME (Solid Phase Microextraction) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z plynných matricí nebo těkavých a semitěkavých sloučenin z vody Vlákno: polymerní sorbent na nosiči: Carboxen 75 µm/ Polydimethylsiloxan (PDMS) 85 µm těkavé látky Mw Da PDMS 1 µm PDMS 3 µm těkavé látky Mw Da semitěkavé nepolární Polyakrylát (PA) 85 µm semitěkavé polární Kompatibilita s vodnou matricí

24 Předúprava vzorků: Purge and Trap (P-T) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z vody Vzorek je vystripován z vody proudem plynu (dusík, e) a organické látky jsou sorbovány na sorbent Sorbent je desorbován, organické látky zakoncentrovány a přeneseny na GC kolonu Praktické aplikace hmotnostní spektrometrie normované metody různé oblasti vodní hospodářství potravinářství Toxikologie testování metabolitů drog v moči, krvi, vlasech atd. Medicinální diagnostika farmakokinetické studie léčiv orenzní analýza požářiště, celníci např.ropné produkty Průmyslové aplikace testování kvality zahraniční normy např. ASTM (American Society for Testing Materials) Výzkum, vývoj

25 Aplikace hmotnostní spektrometrie ČSN normy např. ČSN IS Jakost vod - Stanovení jednotlivých izomerů nonylfenolu - Metoda extrakce tuhou fází (SPE) a plynové chromatografie/hmotnostní spektrometrie (GC/MS) ČSN EN IS Jakost vod - Stanovení vybraných ftalátů plynovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií ČSN EN IS Jakost vod - Použití hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) - Část 1: Všeobecné směrnice ČSN EN IS Jakost vod - Použití hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) - Část 2: Stanovení 62 prvků ČSN EN Potraviny rostlinného původu - Stanovení reziduí pesticidů s použitím GC-MS a/nebo LC-MS/MS po extrakci acetonitrilem/separaci a předčištění pomocí disperzní SPE - Metoda QuEChERS Aplikace hmotnostní spektrometrie toxikologie (1) Marihuana (TC) detekce metabolitů v moči hlavní metabolit 11-nor-9-carboxy- 9-tetrahydrocannabinol ( 9-carboxy-TC) immuno-assay testy když jsou pozitivní potvrzení pomocí GC/MS nebo LC/MS/MS v toxikologické laboratoři

26 Aplikace hmotnostní spektrometrie toxikologie (2) GC/MS SPE + nutná derivatizace úprava vzorku na TriMethylSilyl- těkavější deriváty Zdroj: Restek Aplikace hmotnostní spektrometrie toxikologie (2) LC/MS/MS pouze SPE, kratší časy analýz Zdroj: Restek

27 ICP-MS (Indukčně vázaná plazma hmotnostní spektrometrie) Stopová analýza prvků (kovů) ICP-MS (Indukčně vázaná plazma hmotnostní spektrometrie) Způsob dávkování vzorku: Kapalina: tvorba aerosolu Pevné látky: Laserová ablace

28 ICP-MS (Indukčně vázaná plazma hmotnostní spektrometrie) ICP torch tvorba iontů ICP-MS (Indukčně vázaná plazma hmotnostní spektrometrie) ICP-MS video ICP video 212

29 Laserová ablace ICP-MS bsah kovů v ostatcích lidských zubů ISTPE RATI MASS SPECTRMETRY Využití v geologii, archeologii, kriminalistice rganická látka je katalyticky spálena na C 2 (Cu/Pt~ 8 C), voda je odstraněna přes NAIN membránu a C 2 je detekován pomocí MS (obvykle dva detektory jeden na 13 C 2 m/z 45 a druhý na 12 C 2 m/z 44) Standartní ref. látka CaC 3 Pee Dee Belemnite (PDB) rozkladem C 2 s poměrem p PDB = 13 C/ 12 C =,1123 δ 13 C = 1 * (p vzorek p PDB )/p PDB C 2 výdech lidi Evropa C 2 výdech lidi USA osilní paliva Methan atmosféra osilní paliva C 2 atmosféra PDB

30 GC/Isotope Ratio-MS Cholesterol izolován z lidských kostí 5 lidí z doby okolo 1 n.l žíjících na anglickém pobřeží Analyzován přes GC pak katalyticky spálen na C 2 a sledován obsah izotopů 13 C/ 12 C pomocí MS Cholesterol původem z pozemských živočichů Cholesterol původem z mořských živočichů Převzato z Anal.Chem (68), 442 R.Scott, R.P.Evershead Pyrolyzní GC/MS (Py-GC/MS) Vzorek je před GC/MS analýzou zpyrolyzován (teplotně štěpen v atmosféře inertního plynu (neoxidující atmosféra) výsledkem je tvorba lehčích produktů, které lze detekovat pomocí GC/MS dporová spirála ohřeje vzorek až na 14 oc Vzniklé rozkladné produkty jsou nosnýým plynem transportovány vyhřívanou kapilárou do plynového chromatografu

31 Pyrolyzní GC/MS (Py-GC/MS) Pyrolýza polyethylenu (PE) 7 o C Alkadien/ alken alken alkan Pyrolyzní GC/MS (Py-GC/MS)