STANOVENÍ OXIDU SIŘIČITÉHO VE VÍNĚ STANDARDNÍMI I ALTERNATIVNÍMI METODAMI Diplomová práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici STANOVENÍ OXIDU SIŘIČITÉHO VE VÍNĚ STANDARDNÍMI I ALTERNATIVNÍMI METODAMI Diplomová práce Vedoucí diplomové práce Ing. Michal Kumšta Vypracoval Bc. Petr Dufek V lednici 2014

2 Mendelova univerzita v Brně Ústav vinohradnictví a vinařství Zahradnická fakulta 2013/2014 ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE Autor práce: Studijní program: Obor: Název tématu: Rozsah práce: Bc. Petr Dufek Zahradnické inženýrství Zahradnictví Stanovení oxidu siřičitého ve víně standardními i alternativními metodami 80 stran textu, tabulky a grafy Zásady pro vypracování: 1. Prostudujte literaturu týkající se stanovení oxidu siřičitého ve víně. 2. U několika vzorků vína stanovte různými metodami jednotlivé formy oxidu siřičitého. 3. Získané výsledky porovnejte z hlediska přesnosti a použitelnosti jednotlivých metod ve vinařské praxi. Seznam odborné literatury: RIBÂEREAU-GAYON, P. -- DUBOURDIEU, D. -- DONÁECHE, B. Handbook of enology. Chichester, West Sussex, England ISBN , , , URL: RIBÂEREAU-GAYON, P. -- DUBOURDIEU, D. -- DONÁECHE, B. Handbook of enology. Chichester, West Sussex, England ISBN , , , URL: POLO, C. M. -- MORENO-ARRIBAS, V. M. Wine chemistry and biochemistry. 1. vyd. New York: Springer, s. ISBN Datum zadání diplomové práce: prosinec 2012 Termín odevzdání diplomové práce: duben 2014 Bc. Petr Dufek Autor práce Ing. Mojmír Baroň, Ph.D. Vedoucí ústavu Ing. Michal Kumšta Vedoucí práce doc. Ing. Robert Pokluda, Ph.D. Děkan ZF MENDELU

3 Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Stanovení SO 2 ve víně standardními i alternativními metodami vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu použité literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendlovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici dne Podpis.

4 Poděkování patří panu Ing. Michalu Kumštovi za profesionální pomoc a odborné rady při zpracování tématu této práce.

5 ABSTRAKT STANOVENÍ OXIDU SIŘIČITÉHO VE VÍNĚ STANDARDNÍMI I ALTERNATIVNÍMI METODAMI Tato diplomová práce je zaměřena na prostudování domácí i zahraniční literatury týkající se stanovení oxidu siřičitého ve víně. Podrobný popis standardních i alternativních metod, jejich rozbor, stanovení možných nedostatků, či nevýhod a konkretizování předností a výhod. Teorii získanou studiem literatury ověřuje tak, že na několika vzorcích vína se různými metodami stanoví jednotlivé formy oxidu siřičitého. Následně jsou pak získané výsledky u jednotlivých metod porovnané z hlediska přesnosti a použitelnosti ve vinařské praxi. Vše by mělo být zpracováno tak, aby se tato diplomová práce mohla stát doplňkovým studijním materiálem pro studenty vysokých škol. KLÍČOVÁ SLOVA: jodometrie oxid siřičitý, rozbor vína, metody stanovení, průtoková chronopotenciometrie, THE ABSTRACT DETERMINATION OF SULFUR DIOXIDE IN WINE BY STANDARD AND ALTERNATIVE METHODS This thesis focuses on the study of domestic and foreign literature on the determination of sulfur dioxide in wine. A detailed description of the standard and alternative methods, their analysis, identification of possible shortcomings or disadvantages and specifying strengths and advantages. Theory obtained by studying literature is verified by a several samples of wine are provided different forms of sulfur dioxide with different methods. Subsequently, the results obtained by various methods are compared in terms of accuracy and applicability in the viticultural practice. Everything should be processed in order that the thesis could become an additional study material for university students. KEY WORDS: Sulfur dioxide, wine analysis, methods of determining, Flow through chronopotentiometry, iodine

6 Obsah 1 Úvod Cíle práce Literární přehled Oxid siřičitý SO SO 2 jako chemická látka SO 2 v potravinářství SO 2 ve vinařském provozu SO 2 ve víně Formy SO Vliv SO2 na zdraví člověka Normy pro SO Možné alternativy jako náhrada SO 2 ve víně Standardní metody pro stanovení SO 2 ve víně Referenční metoda Titrační jodometrie Malá vinařská laboratoř Alternativní metody pro stanovení SO2 ve víně Průtoková chronopotenciometrie Kapalinová chromatografie Interferometrie Automatická titrace Citlivost k možným interferencím a časová náročnost U referenční metody U titrační jodometrie U malé vinařské laboratoře U průtokové chronopotenciometrie... 42

7 3.4.5 U kapalinové chromatografie U interferometrie U automatické titrace Materiály a metody Testovaná vína Sauvignon blanc, pozdní sběr 2011, VM Chardonnay, pozdní sběr 2011, VM Veltlínské zelené, pozdní sběr 2011, VM Ryzlink rýnský, pozdní sběr 2011, VM Pinot blank, výběr z hroznů 2011, VM Cabernet sauvignon rosé, pozdní sběr 2012, BS Laurot rosé, Moravské zemské víno 2010, SL Zweigeltrebe rosé, Moravské zemské víno 2012, SL Cabernet sauvignon, pozdní sběr 2011, BS Modrý portugal, jakostní víno odrůdové 2011, BS Marlen, Moravské zemské víno 2012, SL Frankovka, Moravské zemské víno 2011, SL Potřebné přístroje a pomůcky Přístroje a pomůcky pro metodu OIV Přístroje a pomůcky pro metodu EHS Přístroje a pomůcky pro metodu HI Potřebné roztoky a chemikálie Roztoky a chemikálie pro metodu OIV Roztoky a chemikálie pro metodu EHS Roztoky a chemikálie pro metodu HI Pracovní postup Pracovní postup pro metodu OIV... 48

8 4.4.2 Pracovní postup pro metodu EHS Pracovní postup pro metodu HI Výsledky práce Výsledky metodou OIV v LBM Výsledky metodou EHS v LÚVV Výsledky metodou HI v LÚVV Diskuse Závěr Souhrn Seznam použité literatury Přílohy Seznam příloh... 66

9 1 Úvod Člověk mladší doby kamenné sbíral plody plané révy, a i když nejsou důkazy, právem se lze domnívat, že poznal účinky zkvašené šťávy z hroznů. Četné archeologické nálezy svědčí o tom, že již let před Kristem se na území Iránu, Afganistanu a v Číně pěstovala vinná réva. V Iránu byl při archeologických výzkumech konaných v polovině minulého století nalezen džbán s úzkým hrdlem, na jehož dně byla zjištěna usazenina. Po analýze bylo prokázáno, že obsahuje kyselinu vinnou v množství jejího přirozeného výskytu v hroznech a terebintovou pryskyřici, která se ve starověku používala ke konzervaci vína. Vinná réva provází člověka od doby, kdy se změnil z člověka lovce na člověka zemědělce. A právě tato změna odstartovala dlouhý vývoj vzájemného vztahu mezi vinnou révou, vínem a člověkem. Vztah, který obohacuje přírodu o nový genofond a člověka o požitky z jejího využívání. Dostatečně dlouhý vývoj na to, aby se réva vinná a víno staly neodmyslitelnou součástí našich životů. Taková, člověkem řízená evoluce zaměřená na jediný cíl, čímž je po celou dobu snaha o co možná nejpreciznější výrobu, s pokud možno, nejchutnějším výsledkem. Řadou změn prošly i nádoby určené k výrobě vína, a to ve všech možných parametrech, které jsou důležité pro tuto funkci. Měnila se u nich velikost, tvar, materiál, ale i technologické využití. Obdobným způsobem se projevil vývoj ve všech oblastech výrobního procesu, ale i ve skladování finálního výrobku, či jeho konzumace, ve zdokonalování výrobních technologií a pracovních postupů, nebo ve funkčních i estetických změnách na obalech finálního výrobku. Prostě vývoj poznamenal všechny oblasti lidského života, a proto se nevyhnul ani oblasti výroby vína. Společným jmenovatelem všeho toho zlepšování, zdokonalování, experimentování a vynalézání byla snaha o co nejvyšší kvalitu hotového produktu a o jeho co možná nejdelší skladovatelnost. Naplnění této snahy se zdá být téměř nekonečnou cestou, po které bychom nemohli jít, kdyby vývoj nepostihl i oblast konzervace vína, a to jak krátkodobé, tak na delší dobu. Samozřejmě, že i zde se vyzkoušelo mnoho různých látek, sloučenin a chemikálií. Nakonec se jako nejlepším konzervačním a stabilizačním činidlem ukázala být síra, přesněji oxid siřičitý. Ten je použitelný jak při výrobě vína, tak při jeho skladování, a to i dlouhodobě. Jeho dávkování a obsah je ovšem potřeba pečlivě sledovat, aby se jeho ochranné schopnosti nezměnily ve škodlivého činitele poškozujícího naše zdraví. K tomu, abychom měli 9

10 neustálý přehled a kontrolu, nám slouží různé metody. Jednoduché, složité, standardní, alternativní, s různou přesností interpretace výsledků. I tyto metody mají za sebou totiž dlouhý vývoj, který i zde stále není u konce a pokračuje. V následujících kapitolách bude obsah, jakož i jejich pořadí seřazeno podle logických návazností. Od samotného popsání zadané problematiky, přes její prozkoumání, až po její vyhodnocení. Všechny informace by měly být srozumitelné, stručné a přehledně seřazeny. Text bude vhodně doplněn tabulkami, či obrázky tak, aby bylo dosaženo co možná nejucelenějšího přehledu o dané problematice, kterou se bude tato práce zabývat. 10

11 2 Cíle práce Cílem této práce je prostudování domácí i zahraniční literatury týkající se stanovení oxidu siřičitého ve víně. Podrobný popis standardních i alternativních metod, jejich rozbor, stanovení možných nedostatků, či nevýhod a konkretizování předností a výhod. Teorii získanou studiem literatury ověřit tak, že na několika vzorcích vína se různými metodami stanoví jednotlivé formy oxidu siřičitého. Následně pak získané výsledky u jednotlivých metod porovnat z hlediska přesnosti a použitelnosti ve vinařské praxi. Vše by mělo být zpracováno tak, aby se tato diplomová práce mohla stát doplňkovým studijním materiálem pro studenty vysoké školy. 11

12 3 Literární přehled 3.1 Oxid siřičitý SO 2 Síra S hoří na vzduchu modrým plamenem za vzniku oxidu siřičitého SO 2 a v malém množství i oxidu sírového SO 3. Z toho vyplývá, že oxid siřičitý je jedním ze dvou oxidů síry, který se ve volné přírodě vyskytuje především v sopečných plynech, nebo rozpuštěný v podzemních minerálních vodách ve vulkanicky aktivních oblastech jako kyselina siřičitá H 2 SO 3. V menším množství byl spektroskopicky zjištěn v atmosféře planety Venuše, nebo v plynech vyvrhovaných sopkami na Jupiterově měsíci Io SO 2 jako chemická látka Jedná se o pronikavě zapáchající, bezbarvý, kyselý a jedovatý plyn. Je dráždivý, a to především na horní cesty dýchací. Dostavuje se kašel a při vyšších koncentracích může vznikat až edém plic. Vyšší dávky po kratší dobu působení mohou vyvolávat astma nebo záněty průdušek. Dlouhodobé vystavení působení, byť i malých dávek oxidu siřičitého, negativně ovlivňuje krvetvorbu, výrazně poškozuje srdeční sval, nevhodným způsobem působí na menstruační cyklus a může způsobit rozedmu plic. Reaguje s chlorofylem, tím narušuje dobrý a běžný průběh fotosyntézy a tím se stává pro rostliny prudce jedovatým. V atmosféře pozvolna oxiduje za přítomnosti molekul vody na kyselinu sírovou, která je ve společném působení s kyselinou siřičitou hlavní příčinou kyselých dešťů. (VOHLÍDAL, ŠTULÍK, JULÁK, 1999). Ve vodě se velmi snadno rozpouští za vzniku tepla a kyseliny siřičité SO 2 + H 2 O H 2 SO 3, čímž se řadí mezi kyselinotvorné oxidy. Co se týče reakcí oxidu siřičitého s kyslíkem, tak ty jsou závislé na teplotě. Platí, že čím je teplota vyšší, tím je probíhající oxidační reakce rychlejší. Při této reakci se mění oxid siřičitý na oxid sírový 2SO 2 + O 2 2SO 3. Stejné pravidlo bude platit i při redukci oxidu siřičitého vodíkem, který se za žáru redukuje až na elementární síru SO 2 + 2H 2 S + 2H 2 O. Když ovšem umístníme stejnou reakci do nižších teplot, povede tato změna až ke vzniku nežádoucího sulfanu SO 2 + 3H 2 H 2 S + 2H 2 O. Zisk elementární síry z oxidu siřičitého je možný i jeho průchodem přes rozžhavený koks, kde místo vodíku slouží jako redukční činitel uhlík SO 2 + C S + CO 2. ( 12

13 Existuje několik způsobů, jak průmyslovou cestou získat oxid siřičitý. Tím nejčastějším je spalování síry S + O 2 SO 2. Druhým, poměrně dost využívaným způsobem, je pražení pyritu 4Fe 2 S O 2 2Fe 2 O 3 + 8SO 2. Oxid siřičitý vzniká též při hoření sulfanu (sirovodíku) 2H 2 S + 3O 2 2H 2 O + 2SO 2, nebo je vznik možný při redukci kyseliny sírové některými kovy (například mědí) na mokré cestě 2H 2 SO 4 + Cu SO 2 + 2H 2 O + CuSO 4. Možnou alternativou výroby by mohl být rozklad siřičitanů (například siřičitanu sodného) koncentrovanou kyselinou sírovou Na 2 SO 3 + H 2 SO 4 H 2 O + SO 2 + Na 2 SO 4, ale ten se v průmyslové výrobě už téměř nepoužívá. ( Oxid siřičitý je základní surovinou pro výrobu kyseliny sírové. K tomuto účelu se používá oxid siřičitý získaný ze spalování síry či pražení pyritu. Ten se nechá následně oxidovat na oxid sírový, který dá rozpuštěním ve vodě vzniknout i velmi koncentrované kyselině sírové SO 2 v potravinářství E 220 je mezinárodní označení na obalu potravin, pod kterým se skrývá oxid siřičitý. Vzhledem k jeho antioxidačním, antibakteriálním a fungicidním účinkům je nejstarším konzervačním činidlem. V rámci širokého pole působení (působí i proti kvasinkám) se řadí i mezi nejpoužívanější konzervovadla. V potravinářském průmyslu nachází oxid siřičitý uplatnění při konzervaci polotovarů typu pulpa a sukus, při výrobě ovocných nápojů, bramborových výrobků a sušeného ovoce, zejména meruněk. V konzervárenství se využívá i jeho synergického působení v kombinaci s kyselinou askorbovou, a to zejména u polotovarů, kde se předpokládá tepelné zpracování před finálním plněním do obalů. Snižuje se tak použití kyseliny askorbové asi o polovinu, čímž se stává daná potravina pro lidský organismus zdravější. Díky bělícím a desinfekčním účinkům se oxid siřičitý využívá také k ošetření a desinfekci sklepních prostor určených pro skladování ovoce a zeleniny, nebo též na bělení přírodních materiálů. V menší míře se může oxid siřičitý používat na ochranu a ošetření osiva proti plísním. ( SO 2 ve vinařském provozu Ve vinařském provozu je stejně jako v jiných odvětvích potravinářského průmyslu nutno udržovat naprostou čistotu, v některých případech i sterilitu. Bez dodržování této primární zásady se nedá vyprodukovat kvalitní a nezávadné víno. Jednou z možných 13

14 cest jak provést desinfekci sklepních prostor je i spalování sirných svící. Hořením vzniká oxid siřičitý, který působí desinfekčně na vše kolem sebe. Krátkodobě se používá oxid siřičitý i ke konzervaci prázdných suchých sudů a prázdných nádob. Jedná se o velmi účinnou metodu. Vzhledem k tomu, že je oxid siřičitý těkavá látka, tak se jedná pouze o krátkodobou ochranu. (LAHO, MINÁRIK, NAVARA, 1970) SO 2 ve víně Vedle pasterizace je síření, tedy přidávání oxidu siřičitého do vína, v předepsané minimální koncentraci zákonem povolená konzervační metoda i pro ekologické zemědělství. Oxid siřičitý ve víně působí jako stabilizační a konzervační prostředek. Má antiseptické účinky, tedy potlačuje nebo úplně likviduje činnost mikroorganismů v průběhu celého procesu výroby. Působí antioxidačně, čímž zabraňuje oxidaci vyvázáním přítomného kyslíku O 2. Protienzymatické účinky se projevují v tlumení nebo zabránění činnosti některých negativně působících enzymů, například laccasy spojené s výskytem šedé hniloby na hroznech. (LAHO, MINÁRIK, NAVARA, 1970). Podle (BAROŇ, 2012) existují čtyři důvody použití oxidu siřičitého k ošetření moštů a vín. Za prvé jsou to antiseptické účinky projevující se inhibicí množení mikroorganismů a při vyšších koncentracích i jejich smrtí. Za druhé se projevuje jako antioxidant tím, že váže rozpuštěný kyslík za vzniku SO 3, chrání před oxidací složek aroma a fenolických sloučenin. Současně při tom udržuje nízký redox potenciál. Za třetí má antioxidační účinky, a to zejména proto, že inhibuje funkci oxidačních enzymů (tyrozinázy, lakázy), což způsobuje odstranění negativního aroma nahnilých hroznů v moštu. Za čtvrté váže oxidační produkty, jako je acetaldehyd a podobné látky s karbonylovou skupinou, a chrání tak aroma vína. V každé etapě výroby vína probíhají ve víně procesy oxidace a redukce. Tyto procesy jsou spojeny s výměnou elektronů a přenosem kyslíku nebo vodíku. Procesy oxidace a redukce jsou navzájem propojeny (jestliže se jedna látka oxiduje, tak se musí druhá látka redukovat), a proto jsou nazývány oxidačně-redukční procesy. Každý zásah do moštu nebo vína znamená narušení oxidačně-redukční rovnováhy. Po určitém čase se rovnováha opět ustaví, a mošt nebo víno proto můžeme považovat za roztok, ve kterém se nacházejí vratné rovnovážné redoxní systémy. Příkladem redoxního systému ve víně jsou například rovnováhy: (KOVÁČ, 1990). Fe 2+ Fe 3+ 14

15 etanol acetaldehyd acetaldehyd kyselina octová Podle (BAROŇ, 2012) je oxid siřičitý nepostradatelnou zdravotní pomocí ve vinařství, používaná je již od konce osmnáctého století. Je téměř nemožné vyrobit víno s úplnou absencí oxidu siřičitého. A to zejména proto, že v průběhu alkoholové fermentace produkují kvasinky malé množství oxidu siřičitého, a to asi 10 mg.l -1. Toto množství se však téměř okamžitě vyváže na volný acetaldehyd. Takzvaný endogenní oxid siřičitý obsahuje víno i bez jakéhokoli síření. Enzymatické systémy kvasinky transformují málo se vyskytující elementární síru a sirné aminokyseliny (cystein, cystin, metionin, glutation) a jejich deriváty sírany. Produkují se i další aminokyseliny ze sulfidů a jiných těkavých vonných sloučenin, ze síranů a siřičitanů. Produkce SO 2 se pohybuje od několika mg.l -1 až po mg.l -1. (MICHLOVSKÝ, 2012). Do vína se oxid siřičitý dostává v průběhu celého výrobního procesu. Od zpracování hroznů až po nalahvování vína připraveného k prodeji. Může se k tomu využít několik způsobů. Ve velkovýrobních podmínkách se nejčastěji využívá aplikace plynného oxidu siřičitého z tlakových nádob s dávkovacím zařízením. Zde se dávka vypočítá jako objem vína v litrech x o kolik mg.l -1 oxidu siřičitého chceme dosířit x 0,001 a dostaneme dávku v ml oxidu siřičitého, kterou je potřeba vypustit z tlakové láhve do přisiřovaného vína. U středních a menších vinařů se naopak těší velké oblibě používání disiřičitanu draselného v podobě bílého prášku, a to zejména díky jednoduchému dávkování a snadné aplikaci. Je totiž ve víně rozkládán kyselinou vinnou na oxid siřičitý, hydrogenvínan draselný a vodu: K 2 S 2 O 3 + C 4 H 6 O 6 2SO 2 + 2KH C 4 H 4 O 6 + H 2 O. Výpočet dávky je obdobný jako u plynného oxidu siřičitého, a to objem vína v litrech x o kolik mg.l -1 oxidu siřičitého chceme dosířit x 0,002 a dostaneme výsledek v g disiřičitanu draselného, který je potřeba rozpustit v přisiřovaném víně. Možnosti využití aplikace oxidu siřičitého za pomoci spalování sirných knotů nebo plátků se využívá zejména k ošetření prázdných nádob. Je to dáno především problémy způsobenými špatným určením dávky při aplikaci do vína, či moštu. (MALÍK, 1996). Podle (BAROŇ, 2012) začíná u malých vinařů vstupovat do obliby tekutá forma oxidu siřičitého v podobě čtyřicetiprocentního roztoku pyrosiřičitanu amonného (NH 4 ) 2 S 2 O 5. Jeho rostoucí popularita je dána tím, že se dá bez problému dávkovat 15

16 i do malých objemů, je tekutý, a tudíž se snadno rozpouští a nezvyšuje pravděpodobnost vysrážení vinného kamene. Výpočet dávky je obdobný jako u plynného oxidu siřičitého, a to objem vína v litrech x o kolik mg.l -1 oxidu siřičitého chceme dosířit x 0,0025 a dostaneme výsledek v ml roztoku pyrosiřičitanu amonného, který je potřeba rozpustit v přisiřovaném víně. Oxid siřičitý působí ve víně redukčně a konzervačně. Kromě toho má příznivý vliv na tvorbu buketu vína. Jako redukovadlo působí na stabilizaci vína. Zabraňuje a odstraňuje hnědnutí bílých a červených vín. S aldehydy vytváří sloučeniny, které dodávají vínu osobitou vůni a chuť. (LAHO, MINÁRIK, NAVARA, 1970). Oxid siřičitý pomáhá víno vytvářet a udržuje ho ve svěžím a zdravém stavu. Má příznivý vliv na tvorbu buketu. Redukuje mnohé látky hroznového vína, jako jsou polyfenoly, antokyanová barviva, třísloviny, čímž zvyšuje stabilitu a kvalitu vína. Zabraňuje tvorbě stařiny ve vínech a udržuje redukční prostředí ve víně. (MALÍK, 1996). Působí jako redukční činidlo, a díky své schopnosti vázat kyslík ve víně, chrání víno před enzymatickými a neenzymatickými oxidacemi. Sám se při tom oxiduje na neškodné sírany. Pomáhá tak udržovat správnou barvu bílých i červených vín a zabraňuje jejich hnědnutí. Mimo to má oxid siřičitý schopnost udržet správné senzorické vlastnosti vín, což znamená redukovanou barvu, svěží i zdravou chuť a celkově dobrý zdravotní stav vína. (KOVÁČ, 1990). Antioxidační vlastnosti oxidu siřičitého jsou dané tím, že odebírá v prostředí rozpuštěný kyslík a oxiduje se na oxid sírový (SO 3 ). Rozpustnost kyslíku ve víně vzrůstá se zvyšováním tlaku, snižováním teploty s nižším obsahem extraktu a snižováním koncentrace oxidu siřičitého. Rychlost rozpouštění kyslíku ve vodním prostředí urychluje přítomnost alkoholu. Obsah kyslíku ve víně se pohybuje v rozmezí 0,5 7,0 mg.l -1 a na vyvázání jednoho miligramu rozpuštěného kyslíku O 2 je potřebných 6 mg oxidu siřičitého SO 2. (MALÍK, 1996) Formy SO 2 Oxid siřičitý je reaktivní látka a ve víně se vyskytuje ve dvou základních formách, a to ve formě vázané a volné. Volná forma oxidu siřičitého je ta, která plní onen ochranný účinek, kdežto vázaná forma tento účinek již nemá. Celkové množství oxidu 16

17 siřičitého ve víně se pak vypočítá jako jednoduchý součet formy vázané a formy volné. (LAHO, MINÁRIK, NAVARA, 1970). Většina účinku oxidu siřičitého se obvykle připisuje pouze koncentraci volného SO 2, avšak zjistilo se, že podstata jeho činnosti, zejména vůči mikroorganizmům, je spojená s podílem molekulárního SO 2 nazývaného aktivní SO 2. Aktivita se zvyšuje s poklesem ph asi o +25 % na 0,1 ph. Aktivita se zvyšuje také zvýšením podílu alkoholu při přechodu z moštu do vína, ale rozdíly mezi víny jsou malé, řádově 0,1 % aktivního SO 2. Aktivita rychle narůstá s teplotou, takže je čtyřikrát vyšší při 40 C než při 20 C. (MICHLOVSKÝ, 2012). V případě prvního použití oxidu siřičitého je potřeba počítat s jeho vyvázáním. Určitá část vyvázaného oxidu siřičitého může vytvářet pufr z hlediska možného vyvázání na volný oxid siřičitý. V případě velmi nízké koncentrace oxidu siřičitého a zanedbání vína může docházet ke vzniku nových sloučenin, které jsou vhodné pro navázání volného oxidu siřičitého. (BAROŇ, 2012). Při síření hroznového moštu se z celkového přidaného množství oxidu siřičitého větší část vyváže na kyselinu pyrohroznovou, kyselinu 2-oxoglutarovou a acetaldehyd. Tedy na meziprodukty alkoholového kvašení, ale i na jiné látky, které jsou schopny na sebe vázat oxid siřičitý, anebo s ním reagovat. Menší část zůstává volná. Protože se však nachází ve vodním roztoku, tak volný oxid siřičitý reaguje s vodou a vytváří kyselinu siřičitou H 2 SO 3. Jen malá část volné kyseliny siřičité zůstává jako nedisociovaná, tedy jako molekulová kyselina siřičitá. Převážná část disociuje a vyskytuje se ve formě iontů a. Formy veškerého oxidu siřičitého přidaného do vína nebo moštu můžeme znázornit pomocí jednoduchého schématu: (KOVÁČ, 1990). vázaná H 2 SO 3 celková H 2 SO 3 volná H 2 SO 3 disociovaná ve formě a nedisociovaná (molekulová) H 2 SO 3 Kyselina siřičitá je v moštu vázána na glukózu, což je aldehydický cukr. Méně je pak vázána na fruktózu, ta jako ketonický cukr hůře váže na kyselinu siřičitou. V obou případech se jedná o kyselinu glukózosiřičitou C 5 H 11 O 5 CHOH HSO 3 a kyselinu 17

18 fruktózosiřičitou C 4 H 9 O 4 CHO HSO 3 CH 2 OH. (KERP in LAHO, MINÁRIK, NAVARA, 1970). Podíl volného SO 2 nezávisí na ph, vyjadřuje přebytek SO 2, který se nevázal se složkami vína. Iont kyselého siřičitanu (HSO - 3 ) představuje podíl příslušné kyseliny, která je neutralizována zásadami, tedy ve formě prakticky plně ionizovaných solí. S aktivním SO 2 (neboli kyseliny siřičité ve stavu volné kyseliny) představuje volný oxid siřičitý nebo volný dioxid síry, jak se tento pojem v enologii používá. Zaznamenáváme odlišnost s pojmem volné kyseliny, která existuje v chemii a stojí proti pojmu kyseliny převedené na sůl. Z těchto pojmů vyplývá, že antiseptické vlastnosti vůči kvasinkám nebo bakteriím v dávce uváděné jako volný SO 2 jsou variabilní v závislosti na hodnotě ph, i když rovněž formě HSO - 3 se připisuje určitá účinnost. Nicméně je potom pach a nepříjemná chuť oxidu siřičitého při stejné hodnotě volného SO 2 tím větší, čím je víno kyselejší. Nepříjemný pach oxidu siřičitého je často menší u přehnané dávky než u vína nedostatečné kvality. Naopak je tento pach silnější u vín s chybějícími odrůdovými vůněmi a za velmi vysoké acidity. (MICHLOVSKÝ, 2012). Oxid siřičitý se ve víně váže na některé produkty alkoholové fermentace s karbonylovou skupinou. Existují různé formy vázaného oxidu siřičitého lišící se podle disociační konstanty, tedy síly vazby či schopnosti vyvázat se zpět na volný oxid siřičitý. Nejsilnější tato vazba je na acetaldehyd (etanal), přitom kyselina acetaldehydsiřičitá reprezentuje hlavní složku vázané síry. Je to dáno silou konverze mezi acetaldehydem a oxidem siřičitým, která je větší než 99%. Síla navázání je obrovská a téměř nevratná. Mezi další složky vázaného oxidu siřičitého patří kyseliny ketoglutarová, pyrohroznová, galakturonová a cukry, jejichž disociační konstanta je minimálně o řád vyšší, což znamená, že jsou lépe schopny se vyvázat zpět na volnou formu. Pokud však není koncentrace těchto látek výrazně vysoká, k čemuž může dojít především v případě nahnilých hroznů, hrají pouze druhotnou roli. (BAROŇ, 2012). Zráním vína se část kyseliny siřičité okysličuje na kyselinu sírovou, která se váže na draslík. Nejen že tím přibývá vázaných forem kyseliny siřičité, ale i oxidací vzniklé množství kyseliny sírové, která rozkládá soli kyseliny jablečné a vinné, a i samotné kyseliny sírové. Proto ve starších vínech působí oxid siřičitý kratší dobu, a to zejména díky větší přítomnosti aldehydů. Naproti tomu v mladých vínech je to obráceně. Oxid siřičitý působí delší dobu díky nižšímu obsahu aldehydů. (LAHO, MINÁRIK, NAVARA, 1970). 18

19 Působení volného oxidu siřičitého ve víně závisí na ph vína. Ve vínech s vyšším obsahem kyselin a s nižším ph je obvykle nižší potřeba aplikace oxidu siřičitého. Naproti tomu ve vínech s nižším obsahem kyselin a vyšším ph je potřeba aplikace oxidu siřičitého vysoká. Kvantitativní poměr mezi volnou a vázanou kyselinou siřičitou je závislý na ph a teplotě. Rychlost této reakce je podporována vyšším ph a nižší teplotou. Množství celkové i vázané kyseliny siřičité závisí na koncentraci acetaldehydů. Nežádoucí nadměrné tvorbě acetaldehydů je možné předejít omezením několikanásobného přidávání oxidu siřičitého v průběhu tvorby a zrání vína. (MALÍK, 1996) Vliv SO2 na zdraví člověka Oxid siřičitý jako čistý plyn je dráždivý, a to především na horní cesty dýchací. Dostavuje se kašel a při vyšších koncentracích může vznikat až edém plic. Vyšší dávky po kratší dobu působení mohou vyvolávat astma nebo záněty průdušek. Dlouhodobé vystavení působení, byť i malých dávek SO 2, negativně ovlivňuje krvetvorbu, výrazně poškozuje srdeční sval, nevhodným způsobem působí na menstruační cyklus a může způsobit rozedmu plic. (VOHLÍDAL, ŠTULÍK, JULÁK, 1999). Při běžném množství obsaženém ve víně je oxid siřičitý zdravotně nezávadný. Proto jeho používání lze považovat za pozitivní z pohledu zdravotní bezpečnosti výrobku. Pouze ve velmi vysoké koncentraci může způsobit bolesti hlavy. (LAHO, MINÁRIK, NAVARA, 1970). Podle přílohy č. 1 k vyhlášce č. 113/2005 Sb. ve znění pozdějších předpisů (vyhláška č. 117/2011 Sb.) je však oxid siřičitý považován za alergen a jako takový se musí (podle 8 odstavce 10 téže vyhlášky) uvádět na obalu. A to jak oxid siřičitý, tak i siřičitany v koncentracích vyšších než 10 mg.kg -1 nebo 10 mg.l -1, vyjádřeno jako SO 2. (Vyhláška č. 113/2005 Sb.) Podle nového prováděcího nařízení Komise EU č. 579/2012 může nařídit stát doplnění slovního označení o patřičný piktogram (viz. Obrázek č. 1). Obrázek č. 1: Piktogram pro označení SO2 na etiketě (zdroj: NKEU č. 579/2012) 19

20 Kyselina acetaldehyd-siřičitá je zdrojem bolesti hlavy, a to zejména u citlivých osob, a proto existují limity pro veškerý oxid siřičitý ve víně. (BAROŇ, 2012) Normy pro SO 2 I přes to, že kvasinky vyprodukují určité množství oxidu siřičitého a ten má nepřeberné množství užitečných a pozitivních vlastností, je nutné brát oxid siřičitý ve víně jako aditivum a do jisté míry i jako cizorodou látku. Proto bylo zapotřebí zajistit dozor a kontrolu nad touto látkou, a to v podobě norem či zákonů, které by přesně stanovily, v jaké maximální výši lze oxid siřičitý ve víně používat. Regulace vinařství je stará stejně jako sama výroba vína. Již staří Římané si uvědomovali potřebu závazně upravit některé postupy při výrobě tohoto okouzlujícího nápoje. Snažili se ovšem také dát určitý rámec kultuře pití vína. V českých zemích se setkáváme s množstvím panovnických dekretů a artikulí. Kraus považuje za mezník ve vývoji právních vztahů ve vinohradnictví a vinařství počátek 12. století. (Pavelková, 2007). V bližší historii to je Zákon o připravování a prodávání nápojů vínu podobných ze dne 21. července 1880 a doplněn daňovým zákonem z 16. září téhož roku. Dlouho trvající propad a stagnaci našeho vinařství se dařilo postupně eliminovat. Významně k tomu přispěl vinařský zákon z 12. dubna Tento zákon již obsahuje přesnou definici révového vína a stanovuje povolené i nepovolené postupy v průběhu jeho výroby. Ke kontrole dodržování ustanovení vinařského zákona byl zaveden institut sklepních inspektorů. Již v dobách první republiky vznikla úprava, která byla z velké části převzata z právní úpravy rakousko-uherské. Klíčovým předpisem z této doby je zákon č. 56/1941 zahrnující i moderní enologické přístupy jako je čiření, filtrace či scelování vín. Od 1. října 1954 došlo ke změně a legislativní opatření týkající se vinohradnictví a vinařství spadala pod Československou státní normu č Zákonem č. 61/1964 Sb. o rozvoji rostlinné výroby bylo vinařství podřazeno pod rostlinnou výrobu, a tudíž již nebylo regulováno samostatně, což mělo negativní dopad. Významná změna nastala až přijetím zákona 115/1995 Sb. o vinohradnictví a vinařství snažící se reflektovat unijní úpravu. Jelikož se v tomto zákoně odrážely pouze klíčové unijní předpisy, zůstala naše právní regulace vinařství nedostatečná. Proto se přistoupilo k novelizacím. Jednalo se o zákon č. 216/2000 Sb., 50/2002 Sb. a související zákon č. 147/2000 Sb. o Ústředním kontrolním a zkušebním ústavu zemědělském. Přínosem zákona 216/2000 Sb. bylo, že jeho prostřednictvím 20

21 se do českého právního řádu včlenilo nařízení Rady (ES) 1493/1999. Pojem včlenění není zcela přesný, spíše se jednalo o přiblížení se evropským předpisům a přesnějšímu vymezení pojmů. K vinařskému zákonu č. 321/2004 Sb. o vinohradnictví a vinařství patří prováděcí vyhlášky Ministerstva zemědělství č. 323/2004 Sb. a č. 324/2004 Sb. Zákon zakazuje používat chemické látky ke konzervaci vína, povolen zůstává pouze SO 2. (Pavelková, 2007). Po vstupu do Evropské unie jsme jako všechny země přijali a zavedli normy, které stanovuje Nařízení rady (ES) č. 479/2008 ze dne 29. dubna 2008 o společné organizaci trhu s vínem, příloha V a Nařízení komise (ES) č. 607/2009 ze dne 10. července 2009, kterým se stanoví některá prováděcí pravidla k Nařízení rady (ES) č. 479/2008, pokud jde o druhy výrobků z révy vinné, enologické postupy a omezení, které se na ně použijí. Příloha I.B tohoto nařízení stanovuje mezní hranice pro obsah celkového oxidu siřičitého, a to pro vína vyrobená v České republice. U tichých vín nesmí celkový obsah SO 2 překročit: 160 mg.l -1 u červených vín, 200 mg.l -1 u bílých a růžových vín. Jestliže je v tichých vínech obsah cukru vyjádřený jako součet glukosy a fruktosy vyšší nežli 5 g.l -1, tak celkový obsah SO 2 nesmí překročit: 200 mg.l -1 u červených vín, 250 mg.l -1 u bílých a růžových vín. Zvýšené hodnoty pro vína s původem v České republice s přívlastkem: 300 mg.l -1 pro pozdní sběr, 350 mg.l -1 pro výběr z hroznů, 400 mg.l -1 pro výběr z bobulí, výběr z cibéb, slámové a ledové víno. Celkový obsah oxidu siřičitého v likérovém víně nesmí v okamžiku uvedení do oběhu překročit tyto hodnoty: 150 mg.l -1 u likérových vín s obsahem cukru do 5 g.l -1, 200 mg.l -1 u likérových vín s obsahem cukru nad 5 g.l -1. U šumivých vín je horní hranice oxidu siřičitého stanovena na: 21

22 185 mg.l -1 u jakostních šumivých vín, 235 mg.l -1 u všech ostatních šumivých vín. Samozřejmě že to není jediná norma, která nám upravuje množství, manipulaci, stanovení či dávkování oxidu siřičitého do vína. Dalšími takovými normami jsou: Nařízení komise (EHS) č. 2676/1990 ze dne 17. září 1990, kterým se stanoví metody Společenství používané pro rozbor vína. Doporučení komise (EHS) OIV-AS DIOSU, kterým se upřesňují metody pro stanovení oxidu siřičitého ve víně. Vyhláška č. 28/2010 Sb. ze dne 22. ledna 2010, kterou se mnění vyhláška č. 323/2004 Sb., kterou se provádějí některá ustanovení zákona o vinohradnictví a vinařství, ve znění vyhlášky č. 437/2005 Sb.. Nařízení komise (EHS) č. 579/2012, kterým se novelizuje stávající nařízení Komise (EHS) 607/2009, kterým se stanoví některá prováděcí pravidla k nařízení Rady (EHS) č. 479/2008, pokud jde o chráněná označení původu a zeměpisná označení, tradiční výrazy, označování a obchodní úpravu některých vinařských produktů Možné alternativy jako náhrada SO 2 ve víně Jak uvádí Eder u.a. (2003) oxid siřičitý zůstává dnes, stejně jako dříve, prostředkem volby. Zásada tak málo, jak je to možné, tak mnoho, jak je to nutné je základem racionálního sklepního hospodářství a při správné aplikaci není důvod k obavám. Zůstává faktem, že oxid siřičitý je ve víně nezbytný, ale zároveň je nutno podotknout, že má i negativní vlastnosti. A právě špatný vliv na zdraví člověka je jeden z důvodů, proč se profesionálové snaží najít odpovídající náhradu, která by plnila tutéž funkci. Snaha není určena k úplnému odstranění oxidu siřičitého ve výrobní technologii, ale k jeho omezení. To se však prozatím moc uspokojivě nedaří, a to zejména díky mnohostrannému působení a použití SO 2. Po mnoha pokusech a omylech s nejrůznějšími enologickými preparáty a prostředky se ukázalo, že nejpravděpodobnějším adeptem je kyselina askorbová. Ta je jako antioxidační činidlo povolena v různých zemích, a to nejčastěji v dávce 100 až 150 mg.l -1. Kyselina askorbová má však kromě vynikajících antioxidačních vlastností i schopnost působit jako velmi dobré oxidační činidlo. Ve víně se totiž kyselina 22

23 askorbová oxiduje dvěma způsoby. Při enzymatické oxidaci vzniká kyselina dehydroaskorbová a voda, kdežto při oxidaci bez enzymů vzniká monohydroaskorbová kyselina a peroxid vodíku. A ten je schopen způsobit oxidaci i takových látek, které v aerobním prostředí za použití oxidu siřičitého nejsou kyslíkem oxidovatelné. Proto je vhodné používat kyselinu askorbovou pouze u vín, jež už se nebudou provzdušňovat (víno připravené na lahvování). (Rodopulo, 1996). Podle údajů (Kielhofer, Würdig, 1960) je kyselina askorbová oxidována na peroxid vodíku, který za přítomnosti železitých iontů velmi intenzivně oxiduje kyselinu siřičitou, čímž velmi rapidně snižuje její obsah ve víně a tím i její ochrannou schopnost. Proto je nutné používat kyselinu askorbovou za anaerobních podmínek. Kyselina askorbová není však jediná možnost, jak snížit potřebu oxidu siřičitého ve víně. Jednou z těchto možností je i výroba vína speciálními technologiemi, kde je dávkování oxidu siřičitého omezené, nebo zcela odstraněné. Jsou to například technologie u vín typu Sherry, Portské, Madeira, Marsala, Malaga aj.. Nebo metoda Surlie, která v překladu znamená na kvasnicích. Jedná se o francouzský termín označující metodu, při níž mladá vína zrají delší dobu (až jeden a půl roku) za pravidelného míchání batonage na zdravých kvasničných kalech élevage, což zvyšuje ovocné aroma vín. ( Sur lie (čti syr li) je metoda, při které se mladé víno nechává ležet delší dobu na odumřelých kvasinkách élevage, někdy za současného intenzivního promíchávání battonage. S vínem se po tuto dobu musí míchat, a neměl by se přidávat oxid siřičitý. Ležením na kvasnicích s probíhající autolýzou kvasinek vznikají sloučeniny dusíku, polysacharidy, glykoproteiny, které nepatrně zlepší kvalitu vín. Metoda sur lie zvyšuje intenzitu ovocného charakteru vína. V některých případech se víno stáčí do láhví přímo z vína na kvasnicích, nebo se kvasnice přidávají do vína na dosažení charakteristické příchutě. Základní činností kvasnic při metodě sur lie je jejich antioxidační činnost, hlavně u červených vín, u kterých zpomaluje stárnutí a změnu barvy a chuti. Použití metody je individuální a je odvislé od charakteru vína. (vino-radce.cz). Dalšími možnostmi jsou tiamin, kyselina sorbová, dimetyldikarbonát, lysozym. Tiamin se přidává na počátku fermentace, mění metabolizmus kvasinek a dovoluje menší produkci silně vážících ketonových sloučenin, čímž se zvyšuje podíl volné formy oxidu siřičitého. Povolena je dávka 0,6 mg.l -1 a dávkuje se ve formě tiamin 23

24 hydrochloridu. Kyselina sorbová nebo sorban draselný svou působností proti kvasinkám může nahradit SO 2, pokud hledáme pouze působení proti kvasinkám (například stabilizace sladkých produktů). Může být používán pouze sorban draselný a maximální množství kyseliny sorbové ve víně nesmí přesáhnout 200 mg.l -1. Při tom se v České republice nesmí používat do vín s přívlastkem. Dimetyldikarbonát (DMDC) se smí přidávat do vína za účelem zajištění mikrobiologické stabilizace lahvovaného vína obsahujícího zkvasitelné cukry a do částečně zkvašeného moštu. Maximální množství činí 200 mg.l -1, ve víně nesmí být zjištěná žádna rezidua (etylkarbamát). Pro biovíno není povolen. Lysozym je enzym extrahovaný z vaječného bílku. Působí velmi rychle a eliminuje se po samovolném vysrážení nebo přidáním bentonitu. Jeho specifické působení proti mléčným bakteriím a proti vláčkovatění vína je výhrou pro situace, kdy je zapotřebí napomáhat kvasinkám. Od roku 2001 je povolen v maximální dávce 500 mg.l -1 a od sklizně 2012 se jeho použití musí uvádět na etiketě a stát může nařídit doplnění o patřičný piktogram (viz. Obrázek č. 2). (MICHLOVSKÝ, 2012). Obrázek č. 2: Piktogram pro označení lysozymu na etiketě (zdroj: NKEU č. 579/2012) 3.2 Standardní metody pro stanovení SO 2 ve víně Od té doby, kdy se přišlo na to, že může být oxid siřičitý pro člověka nebezpečný, začalo se i s jeho sledováním a kontrolou jeho obsahu ve víně. Stejně dlouho probíhá i vývoj jednotlivých metod, kterými lze oxid siřičitý ve víně stanovit. Základním požadavkem na tyto metody je, aby byly co nejjednodušší v rámci provedení, ale co nejpřesnější v rámci stanovených výsledků. Dnes už jsou metody pro stanovení oxidu siřičitého v podstatě ustálené a pracuje se na jejich zdokonalování a vylepšování. Standardní metody jsou ve své podstatě jednoduché, relativně přesné a jsou dostupné jak středním vinařům, tak zahrádkářům. Některé jsou používány Státní zemědělskou a potravinářskou inspekcí, či jiným státním orgánem k ověření dodržování litery zákona. Mezi standardní metody patří: Referenční metoda (proudem vzduchu nebo dusíku). Titrační jodometrie: 24

25 o Metoda OIV. Malá vinařská laboratoř. o Metoda EHS - standardní jodometrie Referenční metoda (BALÍK, 1998) uvádí tuto metodu jako vhodnou pro stanovení všech forem oxidu siřičitého, vyskytujících se ve víně, a to jak volné, tak vázané. Závislost poměru těchto forem je dána hodnotou ph a teplotou, které nám posléze dopomáhají k možnosti procentního vyjádření molekulárního oxidu siřičitého zastoupeného jako H 2 SO 3. (NK ES č. 2676/90, 1990). Metoda je založena na tom, že je oxid siřičitý těkavou látkou, a je proto velmi dobře unášen proudem vzduchu, či dusíku. Proto musí být plná uzavřená láhev testovaného vína uložena v laboratoři při 20 C dva dny před stanovením. K tomu se používá aparatura (viz. Obrázek č. 3), která bývá často označována jako destilační. Obrázek č. 3: Frantz - Paulova aparatura na referfenční stanovení SO2 ve víně (zdroj: Toto mají společné jak volný, tak vázaný oxid siřičitý. V dalším postupu jsou však rozdíly, a je proto potřeba si je rozepsat samostatně pro každou formu Pro stanovení volného oxidu siřičitého Do první promývačky se nachystá roztok peroxidu vodíku ( 9,1 ) a dvě kapky indikátorového činidla, které jsme si čerstvě připravili rozmícháním 100 mg methylové červeně a 50 mg methylenové modři ve 100 ml 50% obj. alkoholu. To celé se poté zneutralizuje pár kapkami roztoku hydroxidu sodného (NaOH 25

26 0,01 mol -1. Promývačka se nasadí na aparaturu, čímž je připraven absorpční konec. Do druhé promývačky o objemu 250 ml se odpipetuje 50 ml testovaného vzorku vína společně s 15 ml kyseliny fosforečné ( 85 % ). Promývačka se připojí k aparatuře, a tím je extrahovací aparatura sestavena. Následuje probublávání testovaného vína proudem vzduchu nebo dusíku, který by měl mít rychlost přibližně 40 litrů za hodinu. Toto probublávání trvá 15 minut při nízké teplotě (10 C). (ZOECKLEIN, FUGELSANG, GUMP, NURY, 1990). Volný oxid siřičitý je uvolňován ze zkoumaného vína kyselinou fosforečnou a proudem vzduchu nebo dusíku je unášen do promývačky, kde je zachycen neutrálním roztokem peroxidu vodíku, který jej zároveň oxiduje za vzniku kyseliny sýrové. Nádobka se opatrně sundá a malým množstvím destilované vody se opláchne výstupní trubička a kapalina se titruje odměrným roztokem louhu ( 0,01 ) až do světlého odstínu zelenomodré barvy z původního modrofialového odstínu. Výsledek vyjádřený v volného oxidu siřičitého označeného x se vypočítá ze spotřebovaného roztoku 0,01 označeného a ve vztahu = 6,4 #. Písmeno f představuje faktor 0,01 a číslo 6,4 udává kolik mg volného oxidu siřičitého se vyváže na 1 ml spotřebovaného titračního roztoku louhu. (BALÍK, 1998) Pro stanovení veškerého oxidu siřičitého První promývačka se nachystá stejným způsobem jako pro stanovení volného oxidu siřičitého a opět se nasadí na aparaturu. Do druhé promývačky o objemu 100 ml se napipetuje 20 ml zkoumaného vína společně s 5 ml kyseliny fosforečné a nádobka se nasadí na aparaturu. (NK ES č. 2676/90, 1990). Po připojení chladicího zařízení se nádobka se zkoumaným vzorkem začne zahřívat malým přímým plamenem o velikosti 40 až 50 mm. Vzorek je pak během varu 15 minut probubláván proudem vzduchu nebo dusíku, který za pomoci kyseliny fosforečné unáší všechen oxid siřičitý do absorpční nádobky. Po této době se nádobka opatrně sundá a výstupní trubička se malým množstvím destilované vody opláchne. Získaný roztok kyseliny sýrové vzniklý oxidací oxidu siřičitého se pak titruje neutrálním roztokem louhu stejně jak při stanovení volného oxidu siřičitého do světle zelenomodrého zbarvení. Výsledek vyjádřený v veškerého oxidu siřičitého označeného x se vypočítá ze spotřebovaného roztoku 0,01 označeného 26

27 b ve vztahu =16 # $. Písmeno f představuje faktor 0,01 a číslo 16 udává kolik mg veškerého oxidu siřičitého se vyváže na 1 ml spotřebovaného titračního roztoku louhu. (BALÍK, 1998) Pro stanovení molekulárního oxidu siřičitého Při běžném ph vína je volný oxid siřičitý přítomný především jako hydrogensiřičitanový iont % &. Třebaže tato forma vykazuje dobrou aktivitu proti mikroorganizmům a oxidaci. Nejaktivnější formou je molekulární forma oxidu siřičitého. Procento volného oxidu siřičitého v molekulární formě závisí na ph a je vyšší, když je hodnota ph nižší. Na tomto základě je působení siřičitanů intenzivnější, když je ph vína nižší. Obsah alkoholu a teplota také ovlivňují rovnováhu mezi hydrogensiřičitanovými ionty (HSO 3 - ) a molekulárním oxidem siřičitým, takže molekulární podíl se zvyšuje při vyšších koncentracích alkoholu a vyšších teplotách. Nejvyšší aktivitu vykazuje molekulární oxid siřičitý v průběhu kvasného procesu, kdy se přednostně váže na acetaldehyd. Některé kvasinky pak můžou zvyšovat produkci acetaldehydu, což může mít za výsledek malý rozdíl mezi obsahem volného a veškerého oxidu siřičitého v hotovém víně. ( Tabulka č. 1: Procentické vyjádření molekulárního SO 2 (zdroj: NK ES 2676/90) T = 20 C (I = 0,038) ph Obsah alkoholu v % objemových ,8 7,73 9,46 11,55 14,07 17,09 2,9 6,24 7,66 9,40 11,51 14,07 3,0 5,02 6,18 7,61 9,36 11,51 3,1 4,03 4,98 6,14 7,58 9,36 3,2 3,22 3,99 4,94 6,12 7,58 3,3 2,58 3,20 3,98 4,92 6,12 3,4 2,06 2,56 3,18 3,95 4,92 3,5 1,64 2,04 2,54 3,16 3,95 3,6 1,31 1,63 2,03 2,53 3,16 3,7 1,04 1,30 1,62 2,02 2,53 3,8 0,83 1,03 1,29 1,61 2,02 (NK ES č. 2676/90, 1990) Uvádí procentuální podíl molekulárního oxidu siřičitého ve volném oxidu siřičitém jako výpočet funkce ph, obsahu alkoholu a teploty. Protože platí, že za dané teploty a obsahu alkoholu jde o vratný proces vyjádřený rovnicí jako ( +. Výpočet je složitý a už je zanesený do tabulek (viz. Tabulka č. 1). V základním výpočtu se počítá se střední hodnotou 27

28 iontové síly * = 0,038 a pak vypadá vzoreček takto: %1&, -= Zde platí, že 9 =, -+, - a :; < = :; @, kde I = iontová síla, A a B = koeficient, který se mění s teplotou a obsahem alkoholu,. / K C = termodynamická disociační konstanta, tabulková hodnota, K D = směsná disociační konstanta Titrační jodometrie Jedná se o nejvyužívanější metodu pro stanovení oxidu siřičitého ve víně. V dnešní době ji nevyužívají jen velké vinařské podniky, ale i menší soukromníci. V podstatě máme dvě metody stanovení SO 2, a to metoda EHS neboli standardní jodometrie, která je všeobecně nejvyužívanější metodou pro stanovení oxidu siřičitého. Tou druhou je metoda OIV, která je klasifikována jako metoda nařízená pro akreditované laboratoře, které dělají rozbory pro zatřídění vína. (OIV, 2012) Jodometrie se řadí do kategorie IV, kam spadají pomocné metody. To jsou všechny konvenční metody nebo nedávno realizované techniky, u nichž subvýbor pro metody rozboru dosud nemá stanovena potřebná kritéria (např., syntetická barviva, oxidačně-redukčního potenciálu). Jodometrie je princip odměrného stanovení založený na redukci jodu na jodid v neutrálním prostředí. Použití této titrační metody v analytické chemii vychází z faktu, že thiosíranový anion stechiometricky reaguje s jodem, redukuje ho na jodid a sám je oxidován na tetrathionát: 2 %F&+* %F& H %F&+2* %F&. Jedná se o souhrn odměrných stanovení založených jednak na redukci jódu na jodid v neutrálním prostředí podle rovnice: * / +2I 2* a jednak na oxidaci jodidu v kyselém prostředí na jód podle rovnice: 2* 2I * /. (BALÍK, 1998) Udává, že odměrný roztok jódu přímo reaguje s volným oxidem siřičitým, který je obsažený ve víně, a to tak, že jej oxiduje. Vázaný oxid siřičitý se nejdříve před oxidací musí uvolnit z vazeb s karbonylovými sloučeninami, a to v alkalickém prostředí. (NK ES č. 2676/90, 1990) Popisuje titrační jodometrii jako rychlou metodu pro stanovení volného i veškerého oxidu siřičitého jak ve víně, tak i v moštech. 28

29 Pro uvolnění vazeb je důležité využít alkalickou hydrolýzu, ale jinak se vzorek vína nemusí nijak předem upravovat. Jedná se ovšem o méně přesnou metodu, zejména když víno určené na rozbor vykazuje vyšší obsah veškerého oxidu siřičitého. (LAHO, MINÁRIK, NAVARA, 1970) Titrace volného oxidu siřičitého při metodě EHS Titrační stanovení volného oxidu siřičitého se provádí v 200 ml Erlenmayerově baňce, z které se nejprve za pomoci oxidu uhličitého (J ) vypudil okysličený vzduch. Do takto připravené titrační nádoby se napipetuje 50 ml testovaného vína tak, že se ústí pipety dotýká dna baňky. Následně se v rychlém sledu přidá 5 ml roztoku kyseliny sýrové ( =25%) a 5 ml roztoku škrobu (š$lý =0,5%). Hned započne titrace odměrným roztokem jódu * =0,02. Titrace probíhá za stálého krouživého pohybu až do doby, než se dosáhne bodu ekvivalence, který je v tomto případě indikován jako modrá inkluzní sloučenina jodu se škrobem v prostředí *. (LAHO, MINÁRIK, NAVARA, 1970). (BALÍK, 1998) používá ke stejnému stanovení konické baňky o objemu 250 ml a10 ml roztoku kyseliny sírové ( =16%). Dále dodává, že testované víno musí být z čerstvě otevřené láhve, a bod ekvivalence, tedy modré zbarvení titrátu, musí vydržet alespoň 30 sekund. Poté se odečte spotřeba odměrného roztoku jódu a množství volného oxidu siřičitého se vypočítá podle vzorečku = # 12,8 kde: x = volného oxidu siřičitého vyjádřené v celých číslech, a = spotřeba 0,02 roztoku jódu, f = faktor 0,02 roztoku jódu, 12,8 = udává, kolik mg oxidu siřičitého se vyváže na 1 ml spotřebovaného roztoku jódu Titrace volného oxidu siřičitého při metodě OIV Při stanovení volného oxidu siřičitého je potřeba postupovat co nejpřesněji a používat pro každé čisté a suché laboratorní pomůcky. Dále je potřeba postupovat systematicky a svižným tempem. Začínáme tím, že si do titrační 500 ml baňky odpipetujeme přesné množství 50 ml testovaného vína. Přidáme přesné množství 3 ml roztoku kyseliny sírové H 2 SO 4, přesné množství 1 ml Chelatonu III a přibližně 29

30 objem 1 ml škrobového mazu. Ihned titrujeme za stálého míchání krouživým pohybem 0,02 M roztokem jódu I 2 do modrofialového zbarvení, které vydrží alespoň 15 sekund. Spotřeba jódu na titraci se označí jako výsledek číslo 1. (NK ES č. 2676/90, 1990) Titrace veškerého oxidu siřičitého při metodě EHS Do 200 ml Erlenmayerovy baňky se napipetuje zhruba 25 ml roztoku hydroxidu sodného ( =1 ) a přidáme 50 ml testovaného vín tak, že ústí pipety je stále ponořené do louhu. Baňka se uzavře zabroušenou zátkou a jemným krouživým pohybem se promíchá. Poté se nechá 15 minut probíhat alkalická hydrolýza, která nám uvolní vázaný oxid siřičitý. Posléze se v rychlém sledu přidá 15 ml roztoku kyseliny sírové ( =25%) a 5 ml roztoku škrobu (š$lý = 0,5%) a hned se titruje roztokem jódu * = 0,02 (1,9831 g chemicky čistého jódu a 5 g jodidu draselného se rozpustí v 1litru destilované vody) až do dosažení bodu ekvivalence. (LAHO, MINÁRIK, NAVARA, 1970). (ZOECKLEIN, FUGELSANG, GUMP, NURY, 1990) Ve své publikaci udávají, že je vhodné na stanovení veškerého oxidu siřičitého kónickou baňku 500 nebo 750 ml a při titraci ještě prosvítit vzorek bočním světlem, popřípadě podkládat baňky bílým papírem. K analýze používají rovněž 15 ml roztoku kyseliny sírové ( =16%) a modré zbarvení titrátu musí vydržet alespoň 30 sekund. Výpočet je potom stejný jako u volného oxidu siřičitého, jenom výsledek x bude udávat veškerého oxidu siřičitého vyjádřené v celých číslech. (BALÍK, 1998) Ještě dodává výpočet pro vázaný oxid siřičitý, který se vypočítá jako rozdíl mezi hodnotou veškerého a volného oxidu siřičitého ve vzorečku =, kde udává vázaného oxidu siřičitého vyjádřené v celých číslech Titrace veškerého oxidu siřičitého při metodě OIV Stanovení veškerého oxidu siřičitého bezprostředně navazuje na stanovení volného SO 2. A proto ihned po titraci volného oxidu siřičitého se přidá přesné množství 8 ml 4 M hydroxidu sodného NaOH, zazátkujeme, zamícháme a necháme 5 minut stát. Po uplynutí této doby přidáme za stálého míchání přesné množství 10 ml kyseliny sírové H 2 SO 4 a titrujeme za stálého míchání krouživým pohybem roztokem jódu I 2 do modrofialového zbarvení, které vydrží alespoň 15 sekund. Spotřeba jódu na titraci se označí jako výsledek číslo 2. 30

31 Okamžitě po skončení titrace číslo 2 přidáme přesné množství 20 ml 4 M hydroxidu sodného NaOH, zamícháme a necháme 5 minut stát. Po uplynutí této doby přidáme přibližně 200 ml studené destilované vody, promícháme a přidáme přesné množství 30 ml kyseliny sírové H 2 SO 4 a neprodleně titrujeme za stálého míchání krouživým pohybem roztokem jódu I 2 do modrofialového zbarvení, které vydrží alespoň 15 sekund. Spotřeba jódu na titraci se označí jako výsledek číslo 3. (OIV 2009) Titrace korekce na látky oxidované jódem Obě metody, tedy metoda EHS standardní jodometrie a metoda OIV, používají ke stanovení látek oxidovatelných jódem stejný postup. A pro účely této práce se bude v pokusech označovat jednotně jako číslo 4. Je samozřejmostí, že se ve víně nevyskytuje pouze oxid siřičitý stejně jako to, že to není jediná látka, či sloučenina oxidovatelná jódem. Jedná se zejména o sloučeniny s redukční schopností, popřípadě o v malém množství povolenou kyselinu askorbovou. (BALÍK, 1998). Toto stanovení se provádí za účelem zpřesnění vlastního stanovení tak, aby byl výsledek co možná nejpřesnější. Mělo by se provádět zejména v okamžiku, kdy stanovené výsledky jsou na hranici zákonem povolené hladiny a vždy, když byly ve víně použity přípravky na bázi kyseliny askorbové. (ZOECKLEIN, FUGELSANG, GUMP, NURY, 1990). Pro stanovení se odpipetuje 50 ml testovaného vína do odměrné baňky 250 ml a přidá se 1 % roztok acetaldehydu (formaldehydu) v množství 5 ml. Zábrus se uzavře zátkou a baňka se lehce krouživým pohybem zamíchá a odstaví se na 30 minut. Po uplynutí této doby se přidá 1 ml 3 % sodné soli kyseliny etylendiaminotetraoctové (chelatonu III), 10 ml kyseliny sírové v koncentraci použité pro stanovení volného a veškerého oxidu siřičitého a 1 ml škrobového mazu. Okamžitě titrujeme odměrným roztokem jódu * = 0,02 do modrofialového zbarvení, které by mělo vytrvat nejméně 15 sekund. (BALÍK, 1998). Zjištěná spotřeba jódu v ml se používá pro výpočet volného a veškerého oxidu siřičitého po korekci. Výpočet se provádí tak, že se korekční spotřeba odečte od spotřeby při stanovení volného (X 1 ) a veškerého (X 2 ) oxidu siřičitého. Výpočet pak vypadá takto: N =% & #, N =% & #. Dále se takto dá vyjádřit obsah reduktonů a kyseliny askorbové, a to výpočtem N = # 35,2, a výsledek 31

32 je zaokrouhlen na celá čísla v. (ZOECKLEIN, FUGELSANG, GUMP, NURY, 1990) Malá vinařská laboratoř Jedná se o pomůcku pro malé vinaře, kterým usnadňuje a zjednodušuje zdokonalení vlastní výroby. Analýza se provádí pomocí roztoků volně dostupných v prodejnách s vinařskými potřebami. Pro volný oxid siřičitý se používají roztoky A a B (nebo B plus ). A to tak, že do kalibrované zkumavky se nalije 10 ml vína a přidá se 1 2 ml roztoku A. Zaznamená se hodnota x 1 na zkumavce a začne se přidávat roztok B až do doby, kdy se dosáhne bodu ekvivalence. Ten u bílých vín představuje modrý až nafialovělý odstín a u červených vín se obsah proti bílému pozadí stane neprůhledným. Toto musí vydržet alespoň 30 sekund a hodnota x 2 se zaznamená na zkumavce. Obsah volného oxidu siřičitého X v mg.l-1 se vypočítá podle rovnice N =% & 10. U stanovení veškerého oxidu siřičitého je postup obohacen o roztok Z, který se přidá do vína jako první a poté se čeká 15 minut, kdy probíhá uvolnění vazeb. Další postup je totožný se stanovením volného oxidu siřičitého. Obsah veškerého oxidu siřičitého X V se vypočítá podle rovnice N O = % & 20. ( 3.3 Alternativní metody pro stanovení SO2 ve víně Alternativní metody jsou ve své podstatě složitější, méně dostupné a relativně přesnější nežli metody standardní. Jsou dostupné převážně ve vyspělých laboratořích, popřípadě na ústavech vysokých škol. Některé jsou používány Státní zemědělskou a potravinářskou inspekcí, či jiným státním orgánem k ověření dodržování litery zákona. Mezi alternativní metody patří: Průtoková chronopotenciometrie. Kapalinová chromatografie. Interferometrie. Automatická titrace Průtoková chronopotenciometrie Tato technika je vhodná ke stanovení jak organických, tak i anorganických látek. Metoda se dá snadno automatizovat, je rychlá i velmi citlivá, a proto se postupně stává 32

33 součástí analytických laboratoří, kde nalézá stále širší uplatnění. Průtoková chronopotenciometrie je elektroanalytická metoda založená na kvantitativní redoxní přeměně analytu konstantním proudem. Sleduje se elektrický náboj potřebný k úplné elektrolýze analytu, který je podle Faradayova zákona přímo úměrný množství analytu v měřeném roztoku. (BAREK J., OPEKAR F., ŠTULÍK K., 2005). Istran EcaFlow 150 GLP průtokový coulometr (viz Obrázek č. 4) je určen pro stanovení stopových obsahů většiny kationtů i aniontů (kovů, polokovů i nekovů) a některých organických látek v různých matricích. EcaFlow využívá principy průtokové elektrochemie, coulometrie a coulometrických titrací. Měření, spolu s dávkováním vzorku, je řízené počítačem a probíhá plně automaticky bez zásahu obsluhy. Naměřený signál se automaticky koriguje na signál pozadí získaný m roztoku čistého elektrolytu. EcaFlow jako jediné zařízení svého druhu na trhu umožňuje také bezkalibrační ("absolutní") stanovení stopových prvků (jako Zn, Cd, Pb, Cu) již na koncentrační úrovni okolo 1 P Q %::$&. (ZÝKA J., 1988). Obrázek č. 4: Istran EcaFlow 150 GLP s automatickým podavačem vzorků (zdroj: ) (DVOŘÁK J. a kol, 2007) Uvádí tuto metodu jako elektrochemickou, vyvinutou na Slovensku firmou Istran a to tak, aby umožňovala stanovení volného a celkového oxidu siřičitého. Princip spočívá v tom, že se siřičitany převedou okyselením na oxid siřičitý, který se po průchodu semipermeabilní membránou nahromadí na pracovní elektrodě a následně se konstantním proudem oxiduje na síran: + = +3 ( +2I Při tomto kroku se zaznamená signál, ze kterého se vypočítá koncentrace a množství siřičitanů obsažených v testovaném vzorku. Přímo po okyselení se ve vzorku stanovuje obsah volných siřičitanů. Pro stanovení celkového obsahu siřičitanů v daném 33

34 vzorku je zapotřebí převést volné a vázané siřičitany na anion a následně na oxid siřičitý. Při využití chronopotenciometrické metody se v podstatě měří časová závislost potenciálu měrné elektrody. Ze změny potenciálu se stanoví doba, po kterou se vyloučená látka rozpouští (chronopotenciometrický čas). Tato doba je přímo úměrná koncentraci analytu v matrici.(istran, 2003). Průtoková chronopotenciometrie je dvojfázovou analytickou metodou. V první fázi se ze vzorku při konstantním proudu vyloučí analyt na pracovní elektrodě. Ve druhé fázi je tento analyt opět rozpouštěn konstantním proudem, přitom se sledují změny potenciálu této elektrody v průběhu celého rozpouštění, R =#%&. Ve skutečnosti má tvar oxidačně redukční titrační křivky. Z ní je možno vyčíst tzv. přechodový čas. Naměřené, načítané a digitalizované hodnoty křivek jsou definovány jako adresy paměťových jednotek, jejichž nominální hodnota se inkrementuje S SR = #%&. Tím se vlny v původním záznamu mění na píky, jejichž plocha udává přechodový čas určité látky. To vše je zaznamenáno do počítačové paměti za pomoci systému memory mapping Kapalinová chromatografie Chromatografie patří bezesporu mezi základní analytické metody. Její objev je připisován ruskému botanikovi M. S. Cvětovi, který vynalezl separační techniku, kterou pojmenoval chromatografie. Samotný název pochází ze dvou slov: chromos - barva a graphein - psaní. Její pojmenování bylo celkem nasnadě, protože Cvět tuto techniku poprvé použil při rozdělování rostlinných barviv na kolonách naplněných tuhým adsorbentem. Další rozvoj techniky způsobil, že se chromatografie stala třetí nejpoužívanější technikou v analytické chemii pouze za vážení a ph. Dle IUPAC (Mezinárodní unie pro čistou a užitou chemii) má chromatografie následující definici: "Chromatografie je fyzikální separační metoda, při níž jsou separované složky distribuovány mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je stacionární a druhá se pohybuje v daném směru. (Švec, 2009). Stacionární fází se rozumí látka, která má schopnost zadržovat různou měrou jednotlivé složky analyzované látky. Druhá fáze, pohyblivá neboli mobilní, unáší analyzovanou látku kolonou. Jedná se buď o plyn, nebo o kapalinu a podle toho se chromatografie dělí na plynnou nebo kapalinovou. Dle některých definic 34

35 chromatografie se jedná o transport částic analyzované látky mezi stacionární a mobilní fází a k mnohonásobnému ustavování rovnováhy. Zjednodušeně lze říci, že se jedná o stav, kdy se uvolní určité množství látky ze stacionární fáze do mobilní a současně se stejné množství látky přenese z mobilní fáze do fáze stacionární. O rozdělení složek analyzované látky rozhoduje více jevů než jeden. Aby však mohla být využita chromatografie k dělení směsi látek, musí se významně lišit v některé fyzikálně-chemické vlastnosti. V případě, že se látky liší některou svou vlastností, dojde k rozdělení směsi látek, jinými slovy každá látka se v koloně zdrží různě dlouhou dobu. Tato doba má pak název eluční čas, případně pokud můžeme analyzovat objem mobilní fáze, eluční objem. Plynové a kapalinové chromatografy pak obsahují detektory, které jsou schopny určit i množství dané látky, která se do detektoru dostala. Chromatografie tedy podává informace kvalitativní (tj. jaká je to látka) i kvantitativní (kolik látky je ve směsi). (Mikeš, 1980). Nejširší uplatnění nalezly plynová a kapalinová chromatografie. V plynové chromatografii je mobilní fází plyn, stacionární fází může být pevná látka, která je nasypána do kolony, případně v nových kapilárních kolonách je nanesena tenká vrstva adsorbentu na stěnách kolony. Mobilní fází mohou být i kapaliny, které tvoří tenký film na povrchu stěn kolony. V kapalinové chromatografii je mobilní fází kapalina, stacionární fáze jsou většinou pevné látky v kolonách, výjimečně se může jednat o kapaliny, které jsou však omezeně mísitelné s analyzovanou směsí látek. (Váňa, 1984). Principielně se chromatografy dají rozdělit na několik částí. Zdroj nosného média (tj. mobilní fáze), dávkovací zařízení, chromatografická kolona, termostat a analyzátor. Pro obě techniky je společné, že ze zdroje mobilní fáze je přes ventil kontinuálně přiváděna mobilní fáze. Dávkovacím zařízením je přivedena analyzovaná směs látek, která je mobilní fází unášena přes kolonu, kde dojde k dělení podle některého fyzikálněchemického jevu. Pro účinné rozdělení některých směsí je nutno chromatografickou kolonu zahřívat na určitou teplotu. Toho je docíleno využitím termostatu. Neméně důležitými částmi chromatografů jsou analyzátory. V kapalinové chromatografii se často využívá detektorů, které jsou založeny na využití jiných analytických technik. Mohou být založeny na principu indexu lomu, absorpce ultrafialového světla či fluorescence. Obecně je však na detektor kladeno několik požadavků. Detektor nesmí 35

36 zadržovat analyzovanou látku, aby tak mohl rychle reagovat na změny koncentrace jednotlivých složek směsí. (Mikeš, 1980) Interferometrie Jde o metodu založenou na principu využití infračerveného záření. Do povědomí vinařů se dostává pod názvem firmy Foss. Ta dodává na trh celou řadu přístrojů, které provádí částečnou nebo kompletní chemickou analýzu. Pravdou je, že ne všechny jsou určeny pro sledování složení vína, ale v poslední době se už i v menších laboratořích začínají přístroje tohoto typu objevovat. Jedná se o přístroje typu WienScan TM (viz Obrázek č. 5). Obrázek č. 5: Přístroj WineScanTM Flex pro kompletní analýzu vína (zdroj: jsou: Jedná se o přístroje, které pracují jako průtokový systém. Jeho hlavními částmi Vibrační pipeta a detektor vyprázdnění nádobky. Výměník tepla. Homogenizátor. Kyveta. Peristaltické čerpadlo. H čerpadlo. In line filtr. Sběrná nádoba pro odpad s čidlem hladiny jejího přeplnění. 36

37 Zásobníky kapaliny pro čištění a nastavení nuly s čidlem pro spodní hladinu kapaliny. Když se takový přístroj spustí, proběhnou čtyři operace: Pipeta začne vibrovat, aby se filtr udržel čistý. Peristaltické čerpadlo začne čerpat. H čerpadlo začne čerpat. Ventil by passu se otevře, aby umožnil odtok odpadní tekutiny ze systému do odpadu. Čím viskóznější vzorek je zkoumán, tím vyššího tlaku je zapotřebí k čerpání kapaliny výměníkem tepla. Tento tlak je vytvářen peristaltickým čerpadlem. Při průchodu tepla výměníkem se vzorek ohřeje na 40 C z výchozí teploty v rozmezí 5 C až 39 C. Vyšší teplota už není vhodná, a to zejména kvůli interferometru. Série horkých vzorků by jej mohla přehřát, což by mohlo narušit jeho funkci. Po průchodu výměníkem je vzorek homogenizován dvoustupňovým homogenizátorem za tlaku 200 barů. Zde je tlak tvořen H čerpadlem. Za homogenizátorem postupuje kontrolovaný vzorek do in line filtru, odkud vytéká přes by pass do odpadové nádoby. Takto proteče přístrojem přibližně 85 % vzorku. Toto se děje kvůli zajištění vyčištění systému od předcházejícího vzorku a aby se odstranily částečky z in line filtru. (PELANT I., FIALA J., FÄNHRICH J., POSPÍŠIL J., 1993). Poté se ventil by passu uzavře a zbytek vzorku proudí přes in line filtr do kyvety. Na tomto filtru se zachytí všechny částečky, které by mohly poškodit, či zablokovat kyvetu. Nakonec vzorek pod tlakem 1,5 baru prochází zpětným ventilem a odtéká do odpadu. Toto se děje tak dlouho, dokud není ukončeno pumpování, a tím i. Po celou dobu tohoto procesu zůstává tlak i teplota konstantní. Vlastní je prováděno účelově koncipovaným FTIR interferometrem. FTIR Fourier Transform Infra Red spektroskopy, což se volně překládá jako infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací. Jednotka je schopna měřit celé infračervené spektrum. Současné shromažďování údajů z celého spektra tak přináší obrovskou flexibilitu a nevídané možnosti pro infračervenou analýzu. (BÁRTA V., 2011). Interferometrie je oproti tradičním metodám ve výhodě, neboť všechny frekvence infračerveného zdroje jsou zpracovány současně, bez jakéhokoliv předchozího výběru, a to v době kratší než jedna sekunda. To vše podle principu interference světla, 37

38 kterou se mění amplituda signálu jako funkce rozdílu délky dráhy mezi dvěma interferujícími zdroji. Toto se provádí za pomoci zrcadel a laserového paprsku, který sleduje stejnou dráhu jako infračervený paprsek. Další údaje získáme po rozdělení infračerveného paprsku na dva po dopadu na dělič. Ty se posléze odrážejí od zrcadel až na detektor, kde se rekombinují. Všechny frekvence procházejí interferometrem (viz Obrázek č. 6) ve stejnou dobu, což umožňuje současné vyvolání celého infračerveného spektra. (PELANT I., FIALA J., FÄNHRICH J., POSPÍŠIL J., 1993). Obrázek č. 6: Schéma klasického Michelsonova-Interferometru (zdroj: 45interferometer.glos.html) (JEVICKÝ J.) Uvádí, že všechny výsledky z interferometru jsou zaznamenány do interferogramu, z něhož se posléze odečítají základní informace pro Fourierovy transformace. Ty jsou založeny na principu, že každá periodická funkce je rozložitelná na soubor sinusových funkcí. Přitom platí, že každá takováto funkce je určena dvěma hodnotami: Frekvencí vlnovou délkou infračerveného paprsku. Amplitudou intenzitou infračerveného paprsku. Jean Babtist Josef Fourier, francouzský matematik a fyzik, přišel na postup, který umožňuje rozložit interferogram do souboru sinusových funkcí, z nichž každá reprezentuje jednu vlnu. Její frekvence a amplituda se vypočítá z interferogramu. To ovšem vyžaduje obrovské množství výpočtů, a proto se tato metoda začala využívat až s vývojem výpočetní techniky, díky níž je možné tyto výpočty provést během zlomku sekundy. ( JEVICKÝ J.). 38

39 Tímto procesem je dokončena první část diagnostiky určitého vzorku. Další část pokračuje na bázi obecné teorie spektrometrie - intenzity světla, transmitace, absorbance a jejich vztahu. Konečným výstupem je pak řada číselných hodnot odpovídajících jednotlivým prvkům či látkám, z nichž se zkoumaný vzorek skládá. Momentálně je tato metoda schopna diagnostikovat kromě oxidu siřičitého ještě asi dalších padesát součástí jednoho vzorku. (BÁRTA V., 2011) Automatická titrace (FARKAŠ, 1972) Doporučuje pro stanovení volného i veškerého oxidu siřičitého využití automatického titrátora (viz. Obrázek č. 7), který analýzu urychlí a zvýší její přesnost. Zde se k odhalení bodu ekvivalence používá platinová nebo kalomelová měrná elektroda Obrázek č. 7: Automatický titrátor HI (zdroj: ) Obvykle se jedná o snadno ovladatelný mikroprocesorový automatický titrátor. Přístroj je vybaven jednoduchým a spolehlivým dávkovacím čerpadlem, které zabezpečuje vysokou reprodukovatelnost. V přístroji jsou naprogramovány metody stanovení volného a celkového oxidu siřičitého ve víně využívající propracovaný algoritmus analýzy odezvy elektrody pro přesné stanovení bodu ekvivalence. Přístroj umí výsledky zaznamenat do paměti a je možné je přenášet i do počítače. (PRÓNAYOVÁ, 2014). Většina přístrojů pro automatickou titraci ke stanovení obsahu volného a celkového oxidu siřičitého používá metodu dle Rippera. Tedy přebytek jodidu přidaný do vzorku vína, reagujme s jodičnanem obsaženým v titrantu za vzniku jódu. 39