Zuzana Zemanová, Kyra Michalová Centrum nádorové cytogenetiky, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1.

Transkript

1 Návrh laboratorní směrnice pro molekulárně cytogenetickou analýzu chromosomových odchylek metodou mnohobarevné fluorescenční in situ hybridizace (mfish) a mnohobarevného pruhování s vysokou resolucí (mband). Zuzana Zemanová, Kyra Michalová Centrum nádorové cytogenetiky, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1.LF UK Praha 1. Úvod Tato metodika platí pro pracovníky molekulárně cytogenetických laboratoří a je závazná při zpracování cytogenetických preparátů a analýze chromosomových odchylek v mitosách metodou mnohobarevné fluorescenční in situ hybridizace (mfish) a mnohobarevného pruhování s vysokou rozlišovací schopností (mband). 2. Princip metody mfish: Malovací DNA sondy pro všechny lidské chromosomy jsou kombinatoriálním způsobem označny pomocí pěti fluorochromů (např. DEAC, FITC, Spectrum Orange, Texas Red, Cy 5; schema kombinatoriálního značení viz. aplikační manuál firmy Metasystems). Takto označené sondy jsou simultánně kohybridizovány na cytogenetický preparát připravený konvenčním způsobem. Po hybridizaci a detekci je mnohobarevný obraz z fluorescenčího mikroskopu snímán citlivou CCD kamerou přes sadu specifických optických filtrů s velmi úzkým spektrem, které odpovídá použitým fluorochromům. Obraz je dále zpracováván pomocí speciálního softwaru (např. ISIS MetaSystems), který proměří intenzitu fluorescenčních signálů podél jednotlivých chromosomů a na základě měření přiřadí ke každému homolognímu páru klasifikační barvu, tzv. pseudobarvu. Takto lze barevně odlišit všechny autosomy a pohlavní chromosomy, které jsou pak dále karyotypovány podle ISCN nomenklatury (ISCN, 2005). Metoda je vhodná k analýze komplexních chromosomových přestaveb (ukázka normálního a patologického karyotypu zpracovaného metodou mfish je na Obrázku č.1). mband: Metoda je založena na použití parciálních sond, které jsou komplementární k různě velkým překrývajícím se úsekům DNA sledovaného chromosomu a jsou označeny pomocí pěti fluorochromů (schéma rozsahu a značení parciálních sond viz. např. aplikační manuály pro mband firmy MetaSystems). Po hybridizaci se fluorescenční signály jednotlivých parciálních sond částečně překrývají a podél sledovaného chromosomu tak dochází ke kontinuálním změnám v intenzitě signálů jednotlivých fluorochromů a jejich kombinací. Počítačový program (např. ISIS, MetaSystems) na základě analýzy intenzity fluorescenčních signálů přiřadí k jednotlivým specifickým oblastem na chromosomu rozdílné pseudobarvy a vznikne tak charakteristický obraz sledovaného chromosomu s mnohobarevnými pruhy.

2 Metoda umožňuje analyzovat chromosomy bez ohledu na stupeň jejich kondenzace a je vhodná k analýze rozsahu delecí na jednotlivých chromosomech a k mapování zlomových míst na chromosomech zahrnutých v komplexních přestavbách (ukázka delece dlouhých ramen chromosomu č.5 prokázaná metodu mband je Obrázku č.2). 3. Indikace k vyšetření metodou mfish/mband Metody mfish/mband používáme vždy cíleně, na základě výsledků klasického cytogenetického vyšetření a po domluvě s ošetřujícím lékařem. 4. Materiál k vyšetření Pro vyšetření metodami mfish/mband používáme cytogenetické preparáty z kultivovaných buněk připravené klasickým způsobem a s dostatečným množstvím hodnotitelných mitos. Je vhodné používat čerstvé preparáty připravené ze zamražených fixovaných buněčných suspenzí jeden den až maximálně jeden týden před hybridizací. 5. Pracovní postupy a protokoly Všechny reagencie a preparáty obsahující fluorochromy chránit před světlem! Mikrozkumavky s reagenciemi před otevřením vždy krátce protřepat na vortexu a stočit v pikofuze! 5.1. Příprava roztoků Postfixační roztok 1% Formaldehyd v 1xPBS/50mM MgCl 2 na jeden preparát: 2,7μl 37% FA 97,3μl 1xPBS/50mM MgCl 2 Pepsin stock solution 1 g Pepsinu (Sigma, P7012) 50 ml sterilní redestilované vody rozdělit na aliquoty po 500 μl, do použití uchovávat v mrazáku při -20±1 C Alkoholová řada: 30% alkohol 30 ml 96% ethanolu 65 ml redestilované H 2 O 50% alkohol 50 ml 96% ethanolu 45 ml redestilované H 2 O 70% alkohol 58 ml 96% ethanolu 22 ml redestilované H 2 O Zásobní roztoky uchovávat cca 1 měsíc při pokojové teplotě. 20xSSC, ph=7,0-7,5 Zásobní roztok uchovávat při pokojové teplotě. 0,1xSSC, ph=7,0-7,5 2,5 ml 20xSSC 497,5 ml redestilované H 2 O 500,0 ml

3 ph=7,0-7,2 Zásobní roztok uchovávat cca 1 měsíc v lednici při 2-8 C. 2xSSC, ph=7,0-7,5 50 ml 20xSSC 450 ml redestilované H 2 O 500 ml ph=7,0-7,2 Zásobní roztok uchovávat cca 1 měsíc v lednici při 2-8 C. 4xSSCT, ph=7,0-7,5 4xSSC/0,05% Tween ml 20xSSC 400 ml redestilovaná H μl 0,05% Tween ml Zásobní roztok uchovávat cca 1 měsíc v lednici při 2-8 C. NaOH 0,07mol/l 1,4 g NaOH 500 ml redestilovaná H 2 0 Zásobní roztok uchovávat v lednici při 2-8 C. 5.2 Ošetření před hybridizací (tzv. pretreatment) 1 ml 1N HCl do 99ml H 2 O předehřát na 37 C přidat 500 μl (250 μl do 50 ml) zásobního roztoku PEPSINU dobře promíchat preparáty inkubovat 10 min (periferní lymfocyty 5 min) 1xPBS, 5 min při pokojové teplotě 100 μl čerstvého POSTFIXAČNÍHO ROZTOKU na každý preparát, krycí sklo 24x60 mm inkubovat 10 min při pokojové teplotě 1xPBS, 5 min při pokojové teplotě Dehydratace: 70%, 90%, 100% ethanol po 3 min Usušit na vzduchu 5.3. Příprava preparátů Připravit do lednice kyvety s 0,1xSSC a 2x SSC (4±1 C) Předehřát 50 ml 2xSSC na 70 C Rehydratace: 100%, 70%, 50%, 30% alkohol po 1 min 0,1xSSC, 1 min při pokojové teplotě 2xSSC, 70 C, 30 min Ochladit na 37 C (cca 20 min) Přenést do 0,1xSSC, 1 min při pokojové teplotě Denaturovat v 0,07N NaOH, 1min při pokojové teplotě 0,1xSSC, 4 C, 1 min 2xSSC, 4 C, 1 min

4 Dehydratace: 30%, 50%, 70%, 100% alkohol po 1 min usušit 5.4. Příprava sondy: 10 μl sondy na jeden preparát, denaturovat 5 min při 75 C přenést na led Inkubovat 30 min při 37 C (protřepat, stočit) Krycí sklo 22x22 mm, obkroužit lepidlem tzv. rubber cementem (např. lepidlo Fixogum od firmy Marabu) Tabulka 1: Doporučené velikosti krycích skel pro různá množství hybridizační směsi Krycí sklo Minimální množství hybridizační směsi 18 x 18 mm 7 μl 22 x 22 mm 10 μl 24 x 24 mm 12 μl 5.5. Hybridizace Inkubovat 2-4 dny při 42 C v hybridizační komůrce v termostatu nebo v HYBritu (Abbott-Vysis) Detekce 1xSSC, 75 C, 5 min 2xSSC, 5 min při pokojové teplotě 4x SSCT (opláchnout) 50 μl Blocking Reagent, krycí sklo, 15 min, 37 C 4xSSCT (opláchnout) smíchat 50 μl Blocking Reagent + 1 μl Detection 1+3 (na jeden preparát), krycí sklo, 30 min, 37 C mytí: 2x 3 min 4xSSCT při pokojové teplotě, třepat smíchat 50 μl Blocking Reagent + 1 μl Detection 2 30 min, 37 C mytí: 2x 3 min 4xSSCT při pokojové teplotě, třepat smíchat 50 μl Blocking Reagent + 1 μl Detection min, 37 C mytí: 2x 3 min 4xSSCT při pokojové teplotě, třepat 1x 3 min, PBS, třepat okapat 20 μl DAPI/antifade, krycí sklo 22x 60 mm 6. Manipulace s fluorescenčními preparáty Preparáty po hybridizaci je nutné chránit před světlem! Před prohlížením ve fluorescenčním mikroskopu po hybridizaci jsou preparáty uchovány ve tmě při pokojové teplotě alespoň po dobu 30 min. Následuje analýza a zpracování obrazu z fluorescenčního mikroskopu pomocí speciálního softwaru.

5 7. Analýza ve fluorescenčním mikroskopu Analýza fluorescenčních signálů probíhá za pomoci kvalitního fluorescenčního mikroskopu vybaveného specifickými optickými filtry odpovídajícími použitým fluorochromům (nejlépe s motorizovaným měničem filtrů). Obraz z fluorescenčního mikroskopu je snímán velmi citlivou CCD kamerou (chlazenou) a dále zpracován pomocí speciálního softwaru pro mfish/mband (např. ISIS, MetaSystems). Při analýze komplexních chromosomových aberací se doporučuje hodnotit alespoň karyotypů. Všechny nálezy jsou archivovány na pevném disku, případně na magnetooptických discích. 8. Uchování fluorescenčních preparátů Preparáty chráněné před světlem lze před fluorescenční analýzou krátkodobě uchovávat v lednici. Dlouhodobě jsou preparáty uchovávány v mrazicím boxu při teplotě -20±1 C. 9. Bezpečnostní opatření Při zpracování cytogenetických preparátů metodami mfish/mband je nutné dodržovat bezpečnostní opatření vyplývající z provozního řádu příslušného pracoviště. Všechny reagencie obsahující fluorochromy je nutné chránit před světlem! Hybridizační směsi s DNA sondami obsahují mutagen Formamid při manipulaci vždy používat rukavice! 10. Validace Analýzu chromosomových odchylek metodou mfish a mband provádějí vyškolení atestovaní vysokoškoláci nebo laborantky, nálezy jsou popisovány podle mezinárodní ISCN nomenklatury. V pravidelných intervalech jsou veškeré nálezy posouzovány a schvalovány vedoucím laboratoře nebo jeho zástupcem. 11. Interpretace výsledků Interpretaci výsledků provádí vedoucí laboratoře nebo jeho zástupce a zprávu o výsledku poskytuje ošetřujícímu lékaři s případným komentářem. 12. Vydávání výsledků Písemné zprávy o výsledku vydává po podpisu vedoucí laboratoře nebo jeho zástupce. Při vyšetření Statim je možné vydat výsledek telefonicky pouze ošetřujícímu lékaři. 13. Kontrola kvality V pravidelných intervalech (1x ročně) probíhá mezilaboratorní porovnání kvality analýzy chromosomových odchylek metodou FISH mezi akreditovanými cytogenetickými laboratořemi. Kontrolu kvality práce v cytogenetických laboratoří na mezinárodní úrovni připravuje v pravidelných intervalech společnost EUROGENTEST, což je společná organizace EU, která se zabývá testováním kvality práce na genetických pracovištích (CEQA,

6 Vnitřní kontrola kvality v cytogenetické laboratoři je zavedena průběžně, pravidelně se testují chemikálie používané při mfish/mband a pravidelně se vyhodnocuje kvalita získaných výsledků podle diagnóz pacientů. 14. Použité zkratky mfish mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace mband mnohobarevné pruhování s vysokou rozlišovací schopností DAPI - 4,6 diamidino 2-phenylindol DEAC - diethylaminocumarin FITC - fluorescein isothiocyanat 15. Reference 1. ISCN (2005): An International System For Human Cytogenetic Nomenclature. Shaffer L.G., Tommerup N. (eds); S. Karger, Basel, XCyting colors of MetaSystems, Application Manual, Version 04/01, MetaSystems GmbH, Robert Bosch Strasse 6, D Altlussheim, Germany

7 Obrázek č. 1: Mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace - mfish 46,XY 47,XY,+X,t(1;5),t(3;6),t(9;22)

8 Obrázek č. 2: Mnohobarevné pruhování s vysokou rozlišovací schopností - mband