Sledování vývoje primárního gushingu v závislosti na čase

Transkript

1 Seznam sekcí a složení komisí ústav 319 Komise: Předseda: Členové: Soutěžící: (přednášková) Knihovna ústavu 319, 9:00 doc. Dr.Ing. Petra Patáková Ing. Olga Maťátková, PhD Ing. Lukáš Jelínek, PhD Bc. David Bandy () Bc. Jana Doležalová () Bc. Nataliya Holovatska () Bc. Jana Michailidu () Bc. Marcela Nováková () Bc. Zora Pecháčová () Lukáš Pekárek (B3) Bc. Kateřina Staňková () Bc. Zuzana Vonková () Bc. Nikola Zralá () Sekce : Sledování vývoje primárního gushingu v závislosti na čase Bc. David Bandy Biotechnologie doc. Ing. Tomáš Brányik, Ph.D., Ing. Michaela Poštulková Gushing (přepěňování) je negativní fenomén, při kterém dochází k prudkému úniku sycené kapaliny ven z transportního obalu v důsledku poklesu tlaku nad kapalinou (otevření transportního obalu). Pivo se zdá být k tomuto jevu nejnáchylnější, protože obsahuje extrakt sladu, který může být kontaminován plísněmi produkujícími tzv. hydrofobiny (malé povrchově aktivní proteiny). V důsledku interakce mezi hydrofobiny a CO2 pak vzniká jev, jež se nazývá primární gushing. Primární gushing je velmi náročný na studium, především z důvodu komplexnosti složení piva. Prakticky byl tento problém řešen pomocí modelového roztoku, který obsahoval pouze sycenou vodu a izolát hydrofobinů typu HFBII. V práci byl testován vliv doby skladování izolátu, čas a frekvence mechanického pohybu na intenzitu přepěňování. Pro měření gushingu byl použit Modifikovaný Carslberg test (MCT). Bylo zjištěno, že skladování izolátu nemá vliv na sílu gushingu (hydrofobiny jsou dlouhodobě stabilní), dále bylo dle literatury potvrzeno, že doba mechanického pohybu vede k intenzivnějšímu gushingu a nově bylo zjištěno, že vyšší frekvence mechanického pohybu způsobuje silnější přepěňování. Díky těmto poznatkům je možné prakticky upravit nastavení používaných testů tak, aby byla tendence k přepěňování stanovitelná reprodukovatelně.

2 Vliv teploty na profil mastných kyselin kvasinek izolovaných z vinařského průmyslu Bc. Jana Doležalová Ing. Irena Kolouchová Ph.D., Ing. Lucia Gharwalová V tradičních biotechnologiích se s odpadními surovinami zachází různým způsobem. Mezi odpadní meziprodukty z těchto procesů patří i kvasinky. V pivovarství se odpadní kvasnice využívají např. pro krmné účely nebo je možné je využít jako zdroj výživově významných mastných kyselin. V rámci vinařského průmyslu je v České republice každoročně vyprodukováno přibližně 3300 tun hrubých kalů, které obsahují kvasinky po hlavním kvašení. Ve vinařském průmyslu se ovšem vinné kaly likvidují jako odpad. Cílem této práce bylo prozkoumat změny profilu mastných kyselin vinařských kvasinek v závislosti na teplotě a možnost využití mastných kyselin jako způsob zhodnocení odpadních kalů. Za tímto účelem byla stanovena růstová charakteristika jedenácti vybraných kvasinkových kmenů izolovaných z vinařského průmyslu, kultivovaných při teplotách 5, 10, 20, 30 a 40 C, měřením optické density vzorků odebíraných v pravidelných intervalech po celou dobu kultivace. Další fází výzkumu je analýza složení mastných kyselin biomasy získané kultivacemi a analýza obsahu mastných kyselin a mikrobiálního složení vinných kalů. Působení anti-biofilmových látek na Gram-negativní bakterie Bc. Nataliya Holovatska prof. Ing. Jan Masák, CSc.; Ing. Martina Paldrychová Bakterie mají schopnost vytvářet heterogenní strukturovaná společenství, produkovat v nich extracelulární polymerní matrici, adherovat k libovolnému povrchu a přetrvávat takto ve formě biofilmu. Biofilmy v lidském těle lépe odolávají reakcím imunitního systému a jsou rezistentní vůči běžně používaným antibiotikům a dezinfektantům. Přispívá k tomu mimo jiné i vysoká hustota populace mikroorganismů v biofilmu, a s ní související mezibuněčná komunikace QS (quorum sensing) prostřednictvím signálních molekul. QS umožňuje expresi genů zodpovědných za virulentní chování buněk. V této práci byl testován vliv mukolytického činidla N-acetylcysteinu a esenciálního oleje cinnamaldehydu na suspenzní růst a počáteční tvorbu biofilmu vybraných kmenů gramnegativních bakterií Serratia marcescens a Pseudomonas aeruginosa. Bylo provedeno stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC 80) obou účinných látek pomocí mikrokultivačního zařízení Bioscreen. Nejnižší stanovená MIC 80 cinnamaldehydu pro suspenzní buňky S. mercescens odpovídala hodnotě 250 mg/l. V průběhu kultivace byly získány odběry pro stanovení viability buněk metodou MTT a stanovení signálních molekul pomocí biosenzoru.

3 Buněčná signalizace mikroorganismů a možnosti jejího ovlivnění Bc. Jana Michailidu prof. Ing. Alena Čejková, Csc., Ing. Martina Paldrychová Hledání nových cest, jak bojovat proti rezistentním mikroorganismům, se stalo ožehavým tématem posledních let. Společně s objevem quorum sensing se objevily také nové možnosti ovlivňování patogenity těchto mikroorganismů - bylo totiž zjištěno, že úspěšná komunikace v rámci mikrobní populace přímo indukuje vznik virulentních faktorů jako je například tvorba biofilmu, či produkce toxinů. Cílem námi realizovaných experimentů bylo stanovení účinnosti chitosanu, polysacharidu vyrobeného částečnou deacetylací chitinu, v boji proti gramnegativním i grampozitivním bakteriím. Aktivita chitosanu byla určována různými metodami barvením krystalovou violetí jsme byli schopni určit přítomnost proteinů a DNA, pomocí enzymatické reakce s MTT jsme určili metabolickou aktivitu a stanovením komunikačních molekul pomocí geneticky modifikovaného kmenu Agrobacterium tumefaciens, neschopného produkovat vlastní komunikační molekuly jsme určili inhibici quorum sensing. Vyšlo najevo, že chitosan účinně ovlivňuje jak adhezi buněk v suspenzi, tak buňky v již narostlém biofilmu, a to u grampozitivních Sekcia: Vplyv nanočastíc kovov na tvorbu reaktívnych kyslíkových radikálov u Trichosporon cutaneum Školiteľ: Bc. Marcela Nováková prof. Ing. Alena Čejková, CSc.; Ing. Karolína Pádrová V posledných rokoch sa do popredia dostávajú častice v mierke niekoľkých nanometrov tzv. nanočastice. Tieto častice tvoria základ mnohých technologických a biologických inovácií. Záujem o ich využitie vychádza predovšetkým z výhodných fyzikálnych, chemických a biologických vlastností, ktoré sú dané ich malou veľkosťou a tvarom. Vďaka týmto vlastnostiam sú častice schopné interagovať s bunkovými povrchmi a následne nimi prenikať, čím sa zapájajú do rôznych metabolických procesov. V mnohých prípadoch spôsobujú narušenie správneho chodu intracelulárnych reakcií, ktoré vedú k zvýšenej tvorbe reaktívnych foriem kyslíka a v prípade nedostatočnej produkcie antioxidačných enzýmov, zodpovedných za detoxikáciu bunky, aj následnú smrť bunky. Vzhľadom k veľkému uplatneniu nanočastíc vznikajú riziká spojené s ich používaním a to v uvoľňovaní väčšieho množstva častíc do životného prostredia. Práve preto sme sa v tejto práci zamerali na sledovanie hladiny reaktívnych foriem kyslíka, ktoré sú vytvárané po expozícii buniek s nanočasticami kovov (Ag, Au, Fe), kde nám ako modelový mikroorganizmus slúžila pôdna kvasinka Trichosporon cutaneum. Taktiež bol sledovaný vplyv týchto nanočastíc na morfológiu buniek.

4 Hodnocení fyziologického stavu a sporulačního cyklu bakterií rodu Clostridium Bc. Zora Pecháčová Ing. Barbora Branská, Ph.D. Solventogenní klostridie jsou charakterizovány produkcí organických kyselin a rozpouštědel v procesu aceton-butanol-etanolové fermentace. V průběhu svého životního cyklu prochází řadou morfologických změn. Cílem naší práce bylo proto objasnit vztah mezi buněčnou morfologií a produkcí metabolitů u kmene Clostridium pasteurianum NRRL B-598 a mutantního kmene s over-expresí genu spo0a. Během experimentu byla v jednotlivých časových intervalech měřena buněčná viabilita a počet spor pomocí průtokové cytometrie s využitím kombinací fluorescenčních barviv propidium jodid/karboxyfluorescein diacetát, propidium jodid/syto9 a bisoxonol. Změny morfologie byly hodnoceny pomocí mikroskopie, gravimetricky změřena koncentrace biomasy a pomocí HPLC stanovena produkce metabolitů. Dále byl průběh kultivací na základě změny ph média rozdělen do čtyř oblastí, které byly charakterizovány pomocí měrné rychlosti syntézy produktů a spotřeby substrátu spojené s morfologií bakteriální populace. U kmene C. pasteurianum kultivovaném na TYA médiu byla pozorována typická změna morfologie buněk na tzv. klostridiální formu spojená se sporulací, zatímco při kultivaci na RCM médiu byla sporulace omezená či k ní nedocházelo vůbec. Mutantní kmen intenzivně sporuloval. Celková produkce rozpouštědel při kultivaci na TYA médiu byla 11,5 g/l. Nejvyšší koncentrace rozpouštědel byla dosažena na RCM médiu Příprava expresního vektoru pro produkci strukturních proteinů vybraného zástupce flavivirů Lukáš Pekárek B3 Dr. Ing. Michaela Rumlová; Ing. Alžběta Dostálková Flaviviry jsou malé +ssrna (jednovláknová RNA s pozitivní polaritou) viry, přenášené zpravidla členovci. Způsobují horečnatá onemocnění často spojená s dalšími komplikacemi. Spolu se zvýšenou urbanizací a globalizací světa (cestování, obchod) v posledních několika dekádách, roste i počet oblastí ohrožených těmito viry (zejména virem Dengue). Pro studium struktury a životních cyklů těchto virů je výhodné pracovat nejen s celými virovými částicemi, ale i s jednotlivými virovými proteiny. K tomu je vhodné využít expresní systémy (bakterie, kvasinky, tkáňové kultury). Ty jsou schopné produkovat velké množství rekombinantních proteinů, které potom lze izolovat a přečistit. Takto získané virové proteiny je možné použít pro studium jejich interakcínapř. s nukleovými kyselinami in vitro a pro vývoj metod pro testování potenciálních léčiv (inhibitorů životního cyklu). Podařilo se nám připravit expresní vektory strukturních kapsidových proteinů virů Dengue a Zika. Úspěšně jsme ověřili a optimalizovali expresí obou proteinů v E. coli BL21(DE3)-RIL. Buňky jsme analyzovali za využití transmisní elektronové mikroskopie (TEM). Výstupem naší práce je čistý kapsidový protein získaný pomocí gelové a katexové chromatografie. Dále plánujeme vyvinout in vitro systém pro skládání virové kapsidy virů Dengue a Zika v přítomnosti nukleových kyselin.

5 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Tvorba biofilmu na biodegradovatelném náplňovém materiálu Bc. Kateřina Staňková doc. Ing. Martin Halecký, Ph.D. Biofilm je velmi rozšířenou formou života mikroorganismů, vznikající jejich interakcí s rozlišnými povrchy a za různých okolností. Cílem provedených experimentálních pokusů bylo porovnání tvorby biofilmu mezofilními (Leucobacter sp., Pichia pastoris a Fusarium solani) a termofilními (Geobacillus sp., Aeribacillus pallidus) mikroorganismy na biodegradovatelném nosiči. Jako biodegradovatelný nosič biofilmu byla použita pěna na bázi polyolů, vyvinutá na Ústavu makromolekulární chemie AV ČR. Pro účely analýzy obrazu byla připravena i plochá transparentní verze tohoto materiálu. Vzhledem k vysoké afinitě používaných barviv k nosiči a specifickému barvení termofilních bakterií byla nejprve optimalizována metodika barvení buněk. Vznikající biofilm byl pozorován pomocí světelné mikroskopie a následně byla provedena obrazová analýza programem NIS-Elements. Experimentální výsledky ukázaly podstatný rozdíl v kinetice počátečního osidlování povrchu nosiče mezofilními a termofilními mikroorganismy. U směsných vzorků (bakterie Leucobacter sp. a plíseň Fusarium solani) bylo možné obrazovou analýzou rozlišit jak bakteriální buňky, vlákna plísní, tak i spory. Zavedení a ověření lentivirového systému pro in vivo testování a charakterizaci inhibitorů skládání částic HIV-1 Bc. Zuzana Vonková Dr. Ing. Michaela Rumlová Aktuální terapie lidského onemocnění AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome), které je způsobeno HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus) je založena na kombinaci inhibitorů virových enzymů (reverzní transkriptasy, proteasy, integrasy). Virus HIV, který díky nepřesnému přepisu své genetické informace velmi často mutuje, se časem stává k daným lékům rezistentní. Z těchto důvodů je neustálá snaha objevovat další látky/inhibitory, které by cílily na jiná cílová místa, než virové enzymy. Jedno ze slibných cílových míst inhibice HIV-1 představuje proces skládání virové částice. Pro testování inhibitorů skládání nezralé virové částice jsme zavedli a optimalizovali lentivirový systém druhé generace, který využívá třech vektorů v kombinaci s reportérovým proteinem GFP. Nejprve byly optimalizovány vzájemné poměry vnášených DNA vektorů pro co nejúčinnější produkci pseudotypizovaných HIV-1 virionů, a následně byly optimalizována množství virionů pro účinnou infekci buněk. Po optimalizaci systému byla testována první série sloučenin, které, na základě znalosti vyřešené 8A struktury nezralé HIV-1 částice, byly navrženy in silico doc. Spiwokem jako potenciální inhibitory skládání. Tyto sloučeniny byly také testovány pro jejich cytotoxickou aktivitu a jejich anti HIV-1 aktivita byla porovnána s komerčně dostupnými HIV-1 inhibitory.

6 Využití odpadních surovin ze zemědělství a průmyslu jako suroviny pro biotechnologickou produkci obohacených krmiv Bc. Nikola Zralá Dr. Ing. Leona Paulová Cílem této práce je produkovat obohacená krmiva, která obsahují probiotické kultury tvořené kombinací kmenů mléčných a propionových bakterií rostoucích na substrátech připravených z odpadních produktů zemědělského a potravinářského průmyslu. Jako konzervační prostředek u těchto krmiv slouží vyprodukovaná kyselina mléčná a kyselina propionová. V první části práce byl proveden screening sbírkových kmenů propionových bakterií, které byly následně kultivovány s vybranými kmeny mléčných bakterií v různých kombinacích a uspořádání (současné a postupné zaočkování), kdy kritériem byl nárůst biomasy a produkce organických kyselin. Na základě těchto výsledků byly vybrány vhodné kombinace kmenů mléčných a propionových bakterií (Propionibacterium acidipropionici DSM 4900 a P. acidipropionici DSM 20273, Lactobacillus casei CCM 198 a L. rhamnosus CCDM 1828) pro kultivaci na zvolených odpadních produktech. Na základě výsledků byly jako nejvhodnější odpadní produkty zvoleny pivovarské mláto (koncentrace k. mléčné 3,84 g/l a propionové 5,63 g/l pro kombinaci kmenů a 6,45 g/l resp. 4,87 g/l pro kombinaci ) a melasové lihovarské výpalky (koncentrace k. mléčné 18,97 g/l a propionové 4,92 g/l pro kombinaci kmenů ).