ELIMINAČNÍ VOLTAMETRIE AMINODERIVÁTŮ PURINU

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav chemie ELIMINAČNÍ VOLTAMETRIE AMINODERIVÁTŮ PURINU DIPLOMOVÁ PRÁCE Brno 2009 Autor: Bc. Lenka Žůrková Vedoucí: Doc. RNDr. Libuše Trnková, CSc.

2 Prohlášení literatury. Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně za využití uvedené 2

3 Poděkování Ráda bych poděkovala Doc. RNDr. Libuši Trnkové, CSc. za vedení diplomové práce, za cenné rady a připomínky, ochotu a čas, který mi věnovala. Dále děkuji pí. Ireně Postbieglové za pomoc při laboratorních měřeních. Děkuji také Prof. RNDr. Miroslavu Holíkovi, CSc. za pomoc při statistickém zpracování dat. Práce byla finančně podporována projekty: INCHEMBIOL (MSM ) a BIO-ANAL-CHEM (LC06035) od MŠMT České republiky. 3

4 Anotace Předkládaná diplomová práce se zaměřila na studium elektrochemického chování aminoderivátů purinu na visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE) v prostředí fosfátoacetátového pufru o různém ph. Chování tří aminopurinů (2-aminopurinu, 2,6-diaminopurinu a adeninu) bylo zkoumáno pomocí metody lineární sweep voltametrie (LSV) v tříelektrodovém zapojení na elektrochemickém analyzátoru Autolab. Ke zpracování naměřených voltametrických křivek byla využita metoda eliminační voltametrie s lineární polarizací elektrody (EVLS), která umožňuje eliminovat některé dílčí proudy a jiné zachovávat. Bylo zjištěno, že všechny tři báze podléhají redukci a jejich redukční signály se liší nejen polohou (potenciál píku), ale také proudovou odezvou (výška píku). Zatímco 2-aminopurin poskytuje nízké redukční signály v pozitivnějších oblastech potenciálů (~ -1V vs. Ag/AgCl/3MKCl), zbylé dva deriváty jsou redukovány při negativnějších potenciálech (~ -1,3V), přičemž jejich odezvy se potenciálově velmi málo liší. V závislosti na ph i na rychlosti polarizace pracovní elektrody se signály aminopurinů posouvaly k negativnějším hodnotám. Tento posun s ph umožnil blíže kvantifikovat elektrodový proces (koeficient přenosu náboje, počet zúčastněných elektronů a protonů). Bilogaritmická závislost výšky píku na rychlosti polarizace dala informaci o nejpomalejším (řídícím) kroku sledovaného elektrodového procesu. Zkoumány byly také směsi aminoderivátů. Vzhledem k rozdílným hodnotám potenciálů redukčních signálů se podařilo dobře oddělit 2-aminopurin ve směsi s 2,6-diaminopurinem a 2-aminopurin ve směsi s adeninem. Adenin a 2,6-diaminopurin, vykazující signál při podobných hodnotách potenciálů, se od sebe ve směsi nepodařilo oddělit. V této práci bylo pomocí konfidenční elipsy ukázáno statistické vyhodnocení naměřených dat základního elektrolytu. Výsledky této studie budou použity ve vývoji a výzkumu elektrochemických senzorů nukleových kyselin. Klíčová slova: visící rtuťová kapková elektroda, 2-aminopurin, 2,6-diaminopurin, adenin, lineární sweep voltametrie, eliminační voltametrie s lineární polarizací elektrody, konfidenční elipsa 4

5 Annotation The submitted thesis deals with the electrochemical behaviour of aminoderivatives of purine on the hanging mercury drop electrode (HMDE) in phosphate-acetate buffer solutions at various ph values. The behaviour of three aminopurines (2-aminopurine, 2,6-diaminopurine and adenine) was studied using linear sweep voltammetry (LSV) and Autolab, an electrochemical analyser, with the three-electrode cell. Elimination voltammetry with linear electrode polarization (EVLS) was used for further processing of measured data. EVLS enables to eliminate certain partial currents and to conserve the others. It has been found that all three bases are reduced and the reduction signals differ not only in the positions (peak potentials), but also in the current responses (peak heights). While aminopurine provides low reduction signals at positive potentials (~ -1V vs. Ag/AgCl/3MKCl), the other two derivatives are reduced at more negative potentials (~ -1,3V) and the potential difference of their responses is very small. The signals of aminopurines were shifted to more negative values, depending on ph and scan rate. This shift, in dependence on the ph, enabled further quantification of the electrode process (the charge transfer coefficient, the number of participating electrons and protons). Bilogarithmic dependence of the peak height on the rate of polarization provided information on the rate determining step (rds) of the electrode process. The mixtures of aminoderivatives were investigated too. Due to the differing potentials of reduction signals, it was possible to separate 2-aminopurine from the mixture with 2,6-diaminopurin and 2-aminopurin from the mixture with adenine. Adenine and 2,6-diaminopurine, which provides signal at similar values of potential, were not possible to separate from each other. The statistical evaluation of measuring data of the supporting electrolyte has been shown using confidence ellipse. The results of the study will be used in the research and development of electrochemical sensors for nucleic acids. Keywords: hanging mercury drop electrode, 2-aminopurine, 2,6-diaminopurine, adenine, linear sweep voltammetry, elimination voltammetry with linear polarization of electrode, confidence ellipse. 5

6 OBSAH ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST PURIN A JEHO AMINODERIVÁTY Purin Adenin (6-aminopurin) aminopurin ,6-diaminopurin ELEKTROCHEMICKÉ METODY POLAROGRAFIE (POLAROGRAPHY) A VOLTAMETRIE (VOLTAMMETRY) Voltametrická cela Voltametrické elektrody Voltametrické křivky LINEÁRNÍ SWEEP VOLTAMETRIE A CYKLICKÁ VOLTAMETRIE Lineární sweep voltametrie (LSV) Cyklická voltametrie (CV) ELIMINAČNÍ VOLTAMETRIE S LINEÁRNÍ POLARIZACÍ (EVLS ELIMINATION VOLTAMMETRY WITH LINEAR SCAN) Teorie EVLS Proudový eliminační koeficient β EVLS Koeficient přenosu náboje α Výhody a nevýhody EVLS METODA KONFIDENČNÍ ELIPSY EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ CHEMIKÁLIE EXPERIMENTÁLNÍ PODMÍNKY KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE POSTUP PŘI VYTVÁŘENÍ KONFIDENČNÍ ELIPSY VÝSLEDKY A DISKUSE JEDNOTLIVÉ AMINOPURINY Adenin aminopurin (2-AP) ,6-diaminopurin (2,6-DAP) Koeficient přenosu náboje SMĚSI AMINOPURINŮ Směs 2-AP s 2,6-DAP Směs 2-AP s Ade Směs 2,6-DAP s Ade Směs všech tří aminopurinů KONFIDENČNÍ ELIPSA ZÁVĚR SEZNAM ZKRATEK LITERATURA

7 Úvod Struktura DNA byla dlouhou dobu velkou neznámou. Přelom nastal až s rozvojem rentgenové krystalografie. V r se americkému genetikovi a biochemikovi J. D. Watsonovi a britskému fyzikovi F. H. C. Crickovi podařilo sestavit model DNA struktury dvoušroubovice s komplementárními bázemi adenin-thymin, A-T, a guanin-cytosin, G-C) za pomoci rentgenové strukturní analýzy M. H. F. Wilkinse a R. Franklinové. V roce 1962 získali J. D. Watson, F. H. C. Crick a M. H. F. Wilkins Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství. Analýza DNA poskytuje dostatek informací o rozvoji a fungování všech známých organismů. Z lidské DNA lze dnes identifikovat sekvence podmiňující dědičná onemocnění a neoplastické změny, určovat genetickou identitu pro účely lékařství a kriminalistiky [1]. V dnešní době zaznamenaly velký rozvoj technologie založené na DNA čipech. DNA čipy představují nový analytický nástroj v oblasti molekulární biologie a genetiky [2]. DNA čipy umožňují analyzovat široké spektrum mutací a polymorfismů v různých genech způsobujících dědičná onemocnění v rámci jediné analýzy, urychlují DNA diagnostiku a snižují její ekonomickou nákladnost [3]. Podstatnou součástí vývoje čipů je výzkum a konstrukce biosenzorů. Biosenzor všeobecně představuje účinný nástroj pro chemické, biologické, medicínské a environmentální oblasti analýzy vzhledem k jeho vlastnostem jako je malá velikost, reálný čas analýzy a jednoduché použití. Pro konstrukci biosenzorů je zapotřebí znát fyzikálně-chemické vlastnosti zkoumaných látek (purinové a pyrimidinové báze, ribóza či deoxyribóza, nukleosidy, nukleotidy, oligonukleotidy a polynukleotidy). Pro studium DNA se nyní využívají i moderní elektrochemické metody. Těmito metodami jsou v poslední době především zkoumány báze nukleových kyselin. Bylo zjištěno, že adenin a cytosin podléhají na rtuťové elektrodě redukci a guanin navíc poskytuje i oxidační signál [4-6]. V této diplomové práci je studováno kromě adeninu i elektrochemické chování dalších purinových bází (2-aminopurinu a 2,6-diaminopurinu) pomocí metod lineární sweep voltametrie (LSV) a eliminační voltametrie s lineární polarizací elektrod. 2-aminopurin je díky vykazující intenzivní fluorescenci využíván při zkoumání vlastností nukleových kyselin. Nukleosidické analogy 2,6-diaminopurinu přispívají k léčbě rakoviny a virových onemocnění. 7

8 1 Teoretická část 1.1 Purin a jeho aminoderiváty Purin Purin (imidazo[4,5-d]pyrimidin) patří mezi kondezované dusíkaté heterocyklické sloučeniny s více heteroatomy. Je tvořen pyrimidinovým a imidazolovým kruhem (obr. 1.). Obr. 1. Vzorec purinu a číslování atomů Vodíkové atomy v molekule purinu mohou být navázány na jeden ze čtyř dusíkových atomů, purin se tedy může vyskytovat ve čtyřech tautomerních formách (obr. 2.), přičemž převládá forma 9H-purin. Formy 1H-purin a 3H-purin nebyly dosud objeveny [7]. Obr. 2. Tautomerní formy purinu Výskyt Purin se v přírodě jako zcela volný nevyskytuje. S jeho deriváty se ale můžeme setkat v tělech živočichů, rostlin a mikrobů. Hlavním zdrojem purinu a jeho derivátů je kyselina močová (2,6,8-trihydroxypurin). 8

9 Mezi další významné deriváty purinu patří purinové báze. Jsou to adenin (6-aminopurin), guanin (2-amino-6-hydroxypurin), hypoxanthin (6-hydroxypurin) a xanthin (2,6-dihydroxypurin). Adenin, a guanin hypoxanthin představují hlavní složky nukleových kyselin (DNA, RNA). Některé deriváty purinu se v přírodě nacházejí ve formě alkaloidů. Patří sem methylderiváty xanthinu jako jsou kofein (1,3,7-trimethyolxanthin), obsažený v čaji a kávě, theofylin (1,3-dimethylxanthin) v čaji a theobromin (3,7-dimethylxanthin) v kakaových bobech [7]. Chemické vlastnosti Purin je krystalická látka slabě bazické povahy (pk a = 2,5). Zásaditost purinu zvyšuje přítomnost aminoskupiny (adenin pk a = 4,25). Není přesně známo, který z dusíkových atomů se bude protonizovat jako první. Z hlediska kyselosti je purin silnější kyselinou než fenol (pk a = 10) [8]. Jeho kyselost může být způsobena delokalizací elektronů mezi dusíkovými atomy [7]. Metabolismus purinů Spojením purinové báze s cukernou složkou vznikají nukleosidy. Fosforečné estery nukleosidů se pak nazývají nukleotidy. Purinové nukleotidy představují základní stavební složku nukleových kyselin. Lidský organismus získává puriny nejen z potravy, ale dokáže je také syntetizovat. Syntéza purinů Puriny jsou syntetizovány z nenukleotidových prekurzorů (syntéza de novo). Důležitými látkami při syntéze jsou cukr ribóza a aminokyseliny glycin, glutamin a aspartát. Výchozí sloučeninou je ribóza-5-fosfát, která se aktivuje adenosintrifosfátem za vzniku 5-fosforibosyl-1-difosfát (fosforibosylpyrofosfát, PRPP). Syntéza de novo probíhá v cytosolu (játrech), kde se vyskytují potřebné enzymy. Důležitým krokem je vznik 5-fosforibosylaminu nahrazením difosfátu v PRPP aminoskupinou glutaminu. Dusík aminoskupiny představuje N 9 v purinovém skeletu [9-11]. 9

10 Obr. 3. Syntéza 5-fosforibosylaminu [11] Obr. 4. Schéma syntézy purinu [11], THF (tetrahydrofolát=kyselina listová) koenzym [10] Katabolismus purinu Konečným produktem katabolismu purinu u člověka je kyselina močová. Tvoří se hlavně v játrech a je vylučována ledvinami ve formě moči. U ostatních savců je konečným produktem allantoin, který vzniká následnou oxidací kyseliny močové [9-11]. Přeměna nukleotidů na báze Nukleotidy obsahující guanin jsou hydrolyzovány na nukleosid guanosin, který podléhá fosforylaci za vzniku guaninu a ribózy-1-fosfát. AMP se deaminuje na IMP, následnou hydrolýzou se uvolňuje inosin, který je dále fosforylován na hypoxanthin. 10

11 Adenosin vzniká z S-adenosylmethioninu. Ten podléhá deaminaci za vzniku inosinu. Tuto přeměnu katalyzuje enzym adenosindeamináza [11]. Přeměna bází na kyselinu močovou Meziproduktem přeměny nukleotidů na kyselinu močovou je xanthin. Vzniká oxidací hypoxanthinu a deaminací guaninu. Deaminací guaninu dochází k uvolnění aminoskupiny ve formě amonného iontu. Xanthin je oxidován kyslíkem za přítomnosti enzymu xanthinoxidázy a uvolnění peroxidu vodíku na kyselinu močovou [11]. Obr. 5. Katabolismus purinů [11] Purin v lékařství Poruchy metabolismu purinů mohou způsobovat řadu onemocnění [9], např. Lesh- Nyhanův syndrom projevující se močovými kameny nebo dnu (vylučování kyseliny močové v krystalické formě). Při replikaci DNA mohou některé deriváty purinu nahrazovat jiné deriváty a vytvářet nevratné chyby v nové DNA a tedy působit jako mutageny a karcinogeny (např. 2-aminopurin). Některé deriváty purinu mají léčebné učinky. Využívají se při léčbě nádorů Adenin (6-aminopurin) Adenin je bílá krystalická látka. Její molekulová hmotnost je 135,13 g mol -1. Teplota tání je 360 C a hodnota pk a 4,25 [12-14]. 11

12 Obr. 6 Vzorec adeninu Adenin patří spolu s guaninem mezi purinové báze nukleových kyselin (DNA a RNA). V RNA je adenin komplementární s uracilem a v DNA se váže k thyminu. Adenin představuje důležitou složku některých antibiotik. Jeho nukleotidy (ATP, ADP, AMP) jsou významnými zdroji energie při biochemických dějích. Elektrochemické vlastnosti V elektrochemii tvoří adenin jednoduchou polarografickou vlnu závislou na ph. Bylo zjištěno, že při ph 6 nedává redukční pík. Úplné redukce adeninu (např. v případě makroelektrolýzy na rtuťovém dnu) se účastní 6 elektronů (tento proces je doprovázen deaminací), zatímco částečné redukce na rtuťové kapce pouze 4 elektrony. V prvním kroku se redukuje dvojná vazba N 1 =C 6 za vzniku 1,6-dihydrogen-6- aminopurinu (II), dalším krokem je redukce vazby mezi C 2 =N 3 na 1,2,3,6-tetrahydrogen-6- aminopurin (III), následuje deaminace za současného obnovení dvojné vazby N 1 =C 6, produktem je 2,3-dihydrogenpurin (IV), jehož redukcí vzniká 1,2,3,6-tetrahydrogenpurin (V), ten může podléhat hydrolýze na konečný produkt, derivát imidazolu (VI) [15]. 12

13 NH 2 N N (I) N N H + 2H + + 2e - H H NH 2 N N N N (II) H + 2H + + 2e - H H N N H (III) N N H - NH 3 H H H H NH 2 N N N N H H (IV) + 2H + + 2e - H H H H H N N H (V) N N H H 2 O H H H N N HOCH 2 N H 2 N H (VI) Obr. 7 Reakční schéma elektrochemické redukce adeninu [15] aminopurin Jedná se o krystalickou látku, která je izomerem adeninu. Molekulová hmotnost je 135,13 g mol -1. Teplota tání je asi 282 C a hodnota pk a 3,8 [12,13]. Obr. 8 Vzorec 2-aminopurinu V molekule DNA může nahradit adenin. Jeho přítomnost způsobuje chyby v nové molekule DNA, jedná se tedy o silný mutagen a karcinogen. Tvoří komplementární bázi s thyminem (přes jednu vodíkovou vazbu) a udržuje strukturu zdvojené DNA. Může být komplementární i s cytosinem. 13

14 Ve srovnání s adeninem vykazuje 2-aminopurin větší fluorescenční vlastnosti, kterých se využívá už více než 30 let při studiu nukleových kyselin. Používá se tedy jako sonda DNA pro studium její konformace a dynamiky nukleových kyselin [16]. Informace o prostředí sondy lze získat z pozorování zhášení v její fluorescenci při vrstvení přiléhajících bází a z doby fluorescence. Dále slouží jako tlumič kinázy (látka stupňující působení enzymů). 2-aminopurin potlačuje p53 fosforylaci v odpovědi na gamma záření, adriamycin nebo UV léčbu. 2-aminopurin usnadňuje buňkám odolávat nepřímému poškození a zániku DNA nezávisle na proteinu p53 [17]. Fluorescenčních vlastností 2-AP je využíváno i ke sledování rovnovážného stavu komplementárních vlastností DNA, která obsahuje neshodné páry [19]. Včleněním 2-AP do molekuly DNA jeho fluorescence zaniká [18], je to způsobeno komplementárními interakcemi se sousedními nukleovými bázemi. Fluorescence 2-AP se používá i k popisu vnějších podmínek ovlivňujících rozdělování komplementárních stavů jako jsou teplota, typ rozpouštědla, druh sousedních bází a vázaných proteinů [20] ,6-diaminopurin 2,6-diaminopurin je krystalická látka molekulové hmotnosti 150,14 g mol -1. Jeho teplota tání je 302 C a hodnota pk a 5,3 [12,13]. Obr. 9 Vzorec 2,6-diaminopurinu 2,6-diaminopurin je metabolickým antagonistou přírodních purinů a silným inhibitorem procesu zdvojení DNA předcházející mitóze. Nukleosidy mají velké uplatnění v lékařství. Používají se při léčbě rakoviny a virových infekcí. 2,6-diaminopurinem se léčí leukémie, onemocnění kostní dřeně, zahrnující i abnormální bujení bílých krvinek. 2,6-DAP je potenciálním antivirem účinnými proti DNA virům a retrovirů [21]. Užívá se k záměně exocyklických funkčních skupin přítomných na purinu, určující jeho specifickou roli v biologii a chemii. 14

15 Ve srovnání s adeninem může 2,6-diaminopurin lépe rozlišit bodové mutace, čehož se pak úspěšně využívá v technologiích pracujících na principu komplementarity [24,25]. Některé významné sloučeniny obsahující 2,6-DAP: 2,6-Diaminopurin arabinoside (DAPA) a 2-amino-6-methoxypurin arabinosid léky, které jsou rychle hydrolyzovány adenosin deaminasou. 2,6-diaminopurin-2,3-dideoxyribosid (dddapr) silný a selektivní inhibitor HIV [22], silný inhibitor lidské ADA (adenosin deaminase deficienty), ve spojení s nukleosidickými léčivy zvyšuje jejich aktivitu a používá se např. v léčbě oparů a některých virových infekcí [23]. 1.2 Elektrochemické metody Elektrochemie se zabývá studiem roztoků elektrolytů a zkoumáním jevů, ke kterým dochází na elektrodách ponořených do těchto roztoků. Studuje rovnováhy, děje v homogenních i heterogenních systémech, v nichž částice alespoň jedné ze složek nesou elektrický náboj [26,27]. Přehled elektrochemických metod Metody založené na elektrických vlastnostech roztoků (na přenosu náboje a na dielektrické polarizaci) KONDUKTOMETRIE, DIELEKTROMETRIE Metody založené na elektrodové reakci o Rovnovážné metody reakce přenosu náboje mezi elektrodou a elektrolytem při nulovém elektrolytickém proudu KLASICKÁ POTENCIOMETRIE o Proudové metody reakce přenosu náboje mezi elektrodou a elektrolytem při konečném elektrolytickém proudu Transport látky k povrchu elektrody konvekcí a difúzí VOLTAMETRIE Transport látky k povrchu elektrody pouze difúzí KLASICKÁ POLAROGRAFIE ELEKTROGRAVIMETRIE COULOMETRIE 15

16 Vzhledem k názvu mé diplomové práce se dále budu zabývat pouze voltametrií na rtuti se zaměřením na lineární sweep voltametrii a eliminační voltametrii. 1.3 Polarografie (Polarography) a Voltametrie (Voltammetry) Polarografie (1922, J. Heyrovský) a voltametrie patří mezi základní elektrolytické metody. Jsou založeny na sledování závislosti proudu, který prochází pracovní elektrodou ponořenou v analyzovaném roztoku, na potenciálu, který se na elektrodu vkládá z vnějšího zdroje [29]. Výsledkem je polarizační křivka. Při polarografii se využívá rtuťových elektrod, jejichž povrch se snadno obnovuje a na nichž vzniká velké přepětí vodíku, tudíž je lze použít při studiu katodických dějů spadajících do oblastí značně záporných potenciálů [28]. Voltametrické metody rozšiřují možnosti studia a stanovení látek v oblasti pozitivních potenciálů [28] Voltametrická cela Jedná se o elektrochemický článek pro voltametrická měření. Může být dvouelektrodového nebo tříelektrodového uspořádání. Dvouelektrodové uspořádání se skládá z pracovní elektrody ponořené do analyzovaného vzorku a referenční elektrody, která je spojená s analyzovaným roztokem solným můstkem. Tříelektrodové uspořádání obsahuje kromě pracovní a referenční elektrody také elektrodu pomocnou. Napětí vkládané na pracovní a referenční elektrodu se měří voltmetrem a proud procházející článkem ampérmetrem. V praxi se používá hlavně tříelektrodového zapojení, protože u dvouelektrodového zapojení není přesně znám potenciál pracovní elektrody, neboť při průchodu proudu se část vloženého napětí ztratí na odporu analyzovaného vzorku (úbytek napětí se rovná součinu procházejícího proudu a tohoto napětí, IR). Zdrojem napětí v tříelektrodovém zapojení je potenciostat, který zaručuje vklad i kontrolu přesné hodnoty polarizačního napětí, tzn. napětí mezi pracovní a referenční elektrodou [29]. 16

17 Obr. 10 Schéma zapojení obvodu pro voltametrická měření: vlevo dvouelektrodové uspořádání, vpravo tříelektrodové uspořádání, a (auxiliery) pomocná elektroda, r (reference) referentní elektroda, w (working) pracovní elektroda [29] Voltametrické elektrody Ve voltametrii se jako pracovní elektrody používají rtuťové nebo tuhé elektrody (Pt, Au, C). Z historického hlediska se voltametrie na kapající rtuťové kapkové elektrodě nazývá polarografie. V dnešní době se setkáme i s elektrodami tištěnými, nanostrukturovanými, chemicky či biologicky modifikovanými. Tuhé elektrody mohou mít různý tvar, mohou být použity v klidném i míchaném roztoku (míchání může být dosaženo rotací, popř. vibrací elektrody). Pomocné elektrody mají větší povrch než pracovní elektroda (plíšek, drátek, tyčinka), bývají vyrobeny z inertních materiálů (Pt, C). Jako referenční elektrody se používají elektrody II. druhu (argentchloridová, merkurosulfátová, kalomelová) [26,29]. Vlastnosti některých elektrod: Rtuťové elektrody Ve srovnání s tuhými elektrodami má rtuť řadu předností. Povrch rtuti je homogenní a snadno obnovitelný, můžeme s ní pracovat v neutrálních roztocích při velmi negativních potenciálech. 17

18 Klasická kapková rtuťová elektroda (dropping mercury electrode, DME) skleněná kapilára spojená plastovou hadicí s rozšířeným rezervoárem, výška sloupce volena tak, aby kapky odkapávaly v intervalu 2 5 s (doba kapky). V dnešní době je DME zajištěna elektromagnetickým ventilem spolu s klepátkem. Statická kapková rtuťová elektroda (static mercury drop electrode, SMDE) u ústí kapiláry je vytvořena visící rtuťová kapka, v určitých intervalech může být obnovována, což zamezuje problémům s pasivací elektrody. Visící rtuťová kapková elektroda (hanging mercury drop electrode, HMDE) celé měření probíhá na jedné visící kapce, kapka je obnovena před každým dalším experimentem. a b c Obr 11. Příklady rtuťových elektrod: a - rtuťová kapková elektroda (DME), b - stacionární kapková rtuťová elektroda (SMDE), c- visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) [30,31] Tuhé (pevné) elektrody Jejich povrch není homogenní, v průběhu elektrolýzy se na nich tvoří vrstvičky látek adsorbovaných z roztoků nebo látek, které vznikají při elektrolýze, ale i samotný materiál může podléhat oxidaci nebo redukci. Ve srovnání se rtutí s nimi lze pracovat při pozitivních potenciálech a stanovovat látky oxidací, využívají se pro detekci v separačních metodách, pro měření v průtoku, mohou být i ve formě mikroelektrod (rozměry řádu desítek až jednotek µm) [28,29]. 18

19 Drátkové elektrody (platinové, zlaté) používají se například rotující či vibrující drátkové elektrody, nevýhodou je malá reprodukovatelnost naměřených hodnot, užívají se hlavně při ampérometrických titracích. Rotující disková elektroda nejpoužívanější, dobrá reprodukovatelnost měření, nejčastěji vyrobena z platiny nebo zlata [26] Voltametrické křivky Polarografie a voltametrie sledují závislost proudu na potenciálu. Touto závislostí je polarizační křivka. Jestliže je roztokem u pracovní elektrody pouze základní elektrolyt bez analytu a neprobíhá elektrodová reakce, pak dochází k polarizaci pracovní elektrody a prochází jí pouze proudem kapacitním. S přítomností analytu (depolarizátor), který se redukuje nebo oxiduje, se elektroda depolarizuje a prochází jí elektrolytický proud. Velikost anodického nebo katodického proudu je mírou koncentrace depolarizátoru, a proto tato metoda získala analytické využití [29]. Přítomnost depolarizátoru se na polarizační křivce v klasické polarografii projeví vlnou charakterizovanou hodnotou půlvlnového potenciálu (E 1/2 ), výškou (limitní difúzní proud) a náklonem (směrnice). Tvar a posuny polarizačních křivek jsou ovlivněny polarizací rtuťové kapkové elektrody a koncentrací roztoku. Obr. 12 Polarizační křivka základního elektrolytu [26] Tři oblasti polarizační křivky: Oblast polarizace - při nízkých hodnotách vkládaného napětí roztokem neprochází elektrický proud (na elektrodách nemohou probíhat elektrochemická reakce). Oblast depolarizace dosaženo vhodného napětí, roztokem prochází signifikantní proud, dochází k redukci látky na elektrodě. 19

20 Oblast limitního difúzního proudu po dosažení určitých hodnot napětí proud již dále neroste, difúze částic dosáhla maximální rychlosti, která je přímo úměrná koncentraci reagující látky v roztoku, tento maximální proud se nazývá limitní difúzní proud. Typy proudů na kapkové elektrodě a kritéria pro jejich posouzení [28,29] Difúzní proud Při nadbytku nereagujícího elektrolytu je depolarizátor transportován k elektrodě pouze difúzí. V roce 1934 odvodil D. Ilkovič rovnici pro okamžitý proud 1 / 2 2 / 3 1 / 6 0 * I = 0,732nFD mk t ( c c ) (1) a rovnici pro střední proud získanou vynásobením pravé strany rovnice (1) faktorem 6/7: 1 / 2 2 / 3 1 / 6 0 * I = 0,627nFD mk t ( c c ) (2) kde n počet vyměňovaných elektronů, F Faradova konstanta, D difúzní koeficient, m hmotnostní průtok rtuti, t čas, c 0.objemová koncentrace analytu v roztoku, c *.koncentrace u povrchu elektrody. Jestliže c * = 0, dostaneme difúzní proud I d, který je: přímo úměrný koncentraci analytu (plyne z Ilkovičovy rovnice), hodnota limitního proudu je analytickým signálem, přímo úměrný druhé odmocnině z výšky rtuťového sloupce, nezávisí na koncentraci tlumivého roztoku, závisí na teplotě. Kapacitní proud Po odkápnutí kapky je kapacitní proud výrazně větší, neboť je nutné znovu nabíjet elektrickou dvojvrstvu. Náboj elektrické dvojvrstvy ovlivňuje povrchové napětí rtuti (čím větší je přitažlivá síla mezi opačnými náboji v dvojvrstvě, tím menší je povrchové napětí). Lze ho pozorovat i v roztoku neobsahující depolarizátor. Kinetický proud O jeho velikosti rozhoduje chemická reakce v okolí elektrody. Z hlediska následnosti chemické reakce vzhledem k elektrodovému ději mohou nastat reakce: předřazené elektrodovému ději (látka přechází na jinou formu, která se může na elektrodě oxidovat nebo redukovat), vřazené do elektrodového děje - katalytické (analyt se nachází v roztoku v elektroaktivní formě, po elektrodové reakci je znovu regenerován), následující po 20

21 elektrodovém ději (proud řízen difúzí, ale primární produkt depolarizace přechází na polarograficky inaktivní formu) a katalytické proudy vodíku. Kinetické proudy: nezávisí na výšce rtuťového sloupce, v případě reakcí prvního řádu jsou lineární funkcí koncentrace analytu, mohou záviset na koncentraci a složení tlumivého roztoku, jsou často ovlivněny hodnotou ph základního elektrolytu, u některých kinetických proudů - podstatný vzrůst proudu s rostoucí teplotou. Katalytické proudy jsou: závislé na výšce rtuťového sloupce (ovšem známy i katalytické proudy na výšce nezávislé), závislé na koncentraci analytu až do určité limitní hodnoty, často funkcí koncentrace a složení tlumivého roztoku, navíc ph má význam i pro katalytické vylučování vodíku. Adsorpční proud U některých reverzibilních redoxních systémů je patrná malá předvlna resp. následná vlna, jež je posunuta o 100 až 150 mv k pozitivnějším nebo negativnějším potenciálům. To je způsobeno adsorpcí redukované nebo oxidované formy na povrchu elektrody. Adsorpční proud: je přímo úměrný výšce rtuťového sloupce, vzrůstá s rostoucí koncentrací analysu až do určité limitní hodnoty, většinou nezávisí na koncentraci tlumivého roztoku. 21

22 1.4 Lineární sweep voltametrie a cyklická voltametrie Obě voltametrické metody se nejčastěji využívají ke studiu redoxních reakcí organických a anorganických sloučenin, slouží velmi často jako první otestování redoxních a adsorpčních vlastností analytů [32] Lineární sweep voltametrie (LSV) Podstatou metody LSV je lineárně se měnící potenciál pracovní elektrody v závislosti na čase. Při studiu redukčních reakcí se potenciál zvyšuje lineárně směrem k negativnějším hodnotám a při studiu oxidačních reakcí k pozitivnějším hodnotám. Vztah mezi výchozím (počátečním) potenciálem E 0, kdy neprobíhá žádná elektrodová reakce, a potenciálem E t v čase t lze vyjádřit rovnicí: E t = E 0 ± v t (3) kde v je rychlost polarizace elektrody (mv/s). Rychlost polarizace elektrody představuje časovou změnu potenciálu. Její hodnota se nejčastěji pohybuje v mezích mv/s, popř. stovky V/s) a lze ji vyjádřit rovnicí: de v = (4) dt V případě anodické reakce je znaménko v rovnici kladné a u katodické reakce záporné. Závislost měřeného proudu na potenciálu je vyjádřena voltametrickou křivkou (obr. 13). Obr. 13 Princip voltametrie LSV (a závislost potenciálu na čase, b výsledná voltmetrická křivka s píkem) [32] 22

23 1.4.2 Cyklická voltametrie (CV) Cyklická voltametrie je metoda, při níž je na elektrodu vkládán potenciál trojúhelníkového průběhu s rychlostí polarizace de/dt (napětí mezi elektrodami se mění lineárně nahoru a dolů k mezím vytyčeným potenciály E 1 a E 2 v závislosti na čase (obr. 14)) [29]. Obr. 14 Princip cyklické voltametrie CV (vlevo: závislost potenciálu na čase, vpravo: příklad cyklického voltamogramu, pík a produkty vzniklé oxidací, pík b redukce produktů při opačném směru potenciálové změny) [29] Hlavní význam CV spočívá ve studiu elektrodových reakcí. Pomocí této metody lze zjistit, kolik elektronů se do elektrodové reakce zapojí, rychlostní konstantu (ze vzdáleností píků), následné reakce, vratné a nevratné procesy. Při reverzibilní elektrodové reakci s přenosem jednoho elektronu se získá stejně vysoký katodický i anodický pík (rozdíl jejich potenciálů je 57mV Nernstova rovnice). Zvětšující se vzdálenost píků nasvědčuje ireverzibilnějšímu ději [29,32]. Hodnotu proudu I p, jako funkci rychlosti polarizace v a koncentrace analytu c v případě reverzibilního procesu, charakterizuje Randles-Ševčíkova rovnice [33]: I p / = 2, n 3 / AD 1/ v c (4) kde n počet vyměněných elektronů, A plocha elektrody (cm 2 ), D difúzní koeficient (cm 2.s -1 ), c objemová koncentrace (mol.cm -3 ), v rychlost polarizace elektrody (V.s -1 ). 23

24 U dějů řízených difúzí platí přímá úměra mezi výškou píku a druhou odmocninou rychlosti polarizace v. U dějů kontrolovaných adsorpcí je výška píku přímo úměrná rychlosti polarizace v. Pro případ kineticky kontrolovaného děje, výška píku je na v nezávislá. Pro vratnou reakci platí, že [29]: rozdíl potenciálů anodického a katodického píku: I p( a) podíl proudů anodického a katodického: = 1, I p( k ) E 0,059 E p( k ), n p( a) = potenciál píku E p nezávisí na rychlosti polarizace a je o 28,5/n mv negativnější (u katodického píku) nebo pozitivnější (u anodického píku) než půlvlnový potenciál E p/2. U nevratných reakcí je hodnota proudu I p, jako funkce rychlosti v a koncentrace analytu c, dána Delahayovou rovnicí [33]: I p 5 1/ = 2, n( αn ) AD 1/ v 1/ c (5) a kde α koeficient přenosu náboje, n a počet vyměněných elektronů v rychlost určujícím kroku, A plocha elektrody (cm 2 ), D difúzní koeficient (cm 2.s -1 ), c objemová koncentrace (mol.cm -3 ), v rychlost polarizace elektrody (V.s -1 ). U nevratných dějů rozdíl potenciálů anodického a katodického píku závisí na rychlosti polarizace a na hodnotách α a k 0 (heterogenní rychlostní konstanta v cm.s -1 ), které charakterizují nevratný děj [29]. 24

25 1.5 Eliminační voltametrie s lineární polarizací (EVLS Elimination Voltammetry with Linear Scan) EVLS je poměrně mladou elektrochemickou metodou. Začala se rozvíjet společně s eliminační polarografií. Její teoretické základy byly položeny O. Dračkou v roce 1996 [34]. EVLS můžeme považovat za matematickou transformaci voltametrických křivek. Na rozdíl od eliminační polarografie, kde nezávisle proměnnou byl čas, v EVLS je nezávisle proměnnou rychlost polarizace elektrody (scan rate). Podstatou metod je možnost eliminace vybraných dílčích proudů [36,37]. Umožňuje nám získat více informací o daném elektrodovém ději a citlivější analytické stanovení [34-37] Teorie EVLS Principem eliminační voltametrie s lineární polarizací elektrody je eliminace vybraných dílčích proudů z naměřených voltametrických křivek za pomoci proudové funkce jako lineární kombinace celkových proudů měřených při různých rychlostech polarizace [37]. Proudy pro lineární kombinaci musí splňovat dvě podmínky: 1) Eliminovaný proud je vyjádřen jako součin dvou nezávislých funkcí: I j = W j ( v) Y j ( E) (6) x I j = v Y j (E) (7) kde W j (v) funkce rychlosti polarizace, Y j (E) funkce elektrodového potenciálu, x rychlostní koeficient. Příklady proudů vyhovující této podmínce a jejich rovnice: 1 - kapacitní proud s rychlostním koeficientem x = 1 I v Y ( E) 2 - difúzní proud s rychlostním koeficientem x = 1/2 I v 1/ Y ( E) 0 - kinetický proud s rychlostním koeficientem x = 0 I v Y ( E) c = d = k = c k d 2) Celkový proud je dán součtem jednotlivých dílčích proudů: n = I I = I + I + I +... (8) j= 1 j c d k 25

26 Celkový proud pak můžeme vyjádřit pomocí těchto dvou podmínek rovnicemi [37,38]: - obecná rovnice I v 1 v 1/ 2 v / v = I c I d I ref k vref vref vref v 0... (9) - rovnice proudu při rychlostech polarizace ½(v ref ), v ref, 2v ref I v ref / 2 1 1/ = I c + I d + I k (9a) ai v ref / 2 1 1/ = a I c + a I d + a I k (9b) ( 1 ) I c + ( 1) 1/ I d + ( 1) I k 0 I v ref v = (9c) 1 2 ( 1 ) I c + b( 1) 1/ I d + b( 1) I k 0 bi ref = b (9d) I ( 2 ) I c + ( 2) 1/ I d + ( ) I k = (9e) 2v 2 ref ci ( 2 ) I c + c( 2) 1/ I d + c( ) I k 2v c 2 ref = (9f) kde a, b, c koeficienty lineární kombinace EVLS. Příklad výpočtu eliminační funkce při eliminaci kapacitního I c a kinetického I k proudu a zachování difúzního proudu I d (eliminační funkce E4) při rychlostech polarizace ½v ref, v ref, 2v ref - z rovnic (9b, 9d, 9f) získáme soustavu třech rovnic o třech neznámých: 1/ I d + b 1/ 2 1/ ( 1) I d + c( 2) I d I d a = a I c + b( 1) I c + c( 2) I c = 0 (10) I + 0 k b k a 2 0 ( 1) I + c( 2) I = 0 Vyřešením výše uvedených rovnic dostaneme hodnoty eliminačních koeficientů: a = -11,657 b = 17,485 c = -5,8284. Eliminační funkce E4 je tedy tvaru: f ( I ) 11,657 I v / ,485I v 5, 8284I 2v = (11) Můžeme ji také zapsat jako: I c = 0, I k = 0, I d 0. Podobně jako eliminační funkce E4 byly počítány další proudové funkce [34]: ref ref k ref 26

27 E1: eliminace I k při zachování I d se zkreslením I c 1,707 f I) = 3,4142I v 3, 4142I (12) ( / 2 + ref v ref E2: eliminace I c při zachování I d se zkreslením I k 2,4142 f I) = 4,8284I v 2, 4142I (13) ( / 2 ref v ref E3: eliminace I d při zachování I k se zkreslením I c -0,707 f I) = 3,4142I v 2, 4142I (14) ( / 2 ref v ref E4: současná eliminace I k a I c při zachování I d f ( I ) 11,657 I v / ,485I v 5, 8284I 2v = (15) ref ref ref E5: současná eliminace I d a I c při zachování I k f ( I) 6,8284I v / 2 8,2426I v + 2, 4142I 2v = (16) ref ref ref E6: současná eliminace I d a I k při zachování I c f ( I) 4,8284I v / 2 8,2426I v + 3, 4142I 2v = (17) ref Z výše uvedených rovnic vyplývá, že pro E1-E3 stačí zaznamenat elektrodový proces při dvou rychlostech polarizace, zatímco u E4-E6 je zapotřebí tří rychlostí polarizace elektrody. ref ref Proudový eliminační koeficient β EVLS Eliminovaný proud lze zapsat také ve tvaru [36,38]: f ( I ) β I (18) j = EVLS kde β EVLS proudový eliminační koeficient, který závisí na rychlostním koeficientu x a použité eliminační funkci. Jak již bylo uvedeno výše, pro E1-E3 stačí provést měření při dvou rychlostech polarizace ½v ref = v a a v ref = v b. Obecná rovnice je tedy tvaru: j f ( I ) = ai v + bi (19) a v b kde I va a I vb jsou proudy při stejných hodnotách potenciálů, Y a (E) = Y b (E) = Y ref (E): v ( v (20) a x a Iv = a Ya E) va = a Yref ( E) a v ref b I = b Y ( E) v = b Y ( E) v (21) B V b x b ref x ref x x ref 27

28 x x x va = va f ( I) = Y + + ref ( E) vref a b I a b ref (22) vref vref Z rovnic 18 a 22 pak vyjádříme eliminační koeficient pro eliminaci jednoho dílčího proudu: x f ( I) va β = = + b EVLS a (23) I ref vref V případě eliminací dvou dílčích proudů je zapotřebí měření při třech různých rychlostech polarizace: v ref = v a a v ref = v b, 2v ref = v c. Obecná rovnice má tvar: f ( I) = ai + bi + ci (24) va vb Eliminační koeficient, odvozený podobně jako v předchozím případě, je tvaru: x x f ( I) va + + vc β EVLS = = a b c (25) I ref vref vref Pokud β EVLS = 0, jde o eliminaci daného proudu. Jestliže β EVLS = 1, je daný dílčí proud zachován. vc Z rovnic (23) a (25) můžeme odvodit eliminační koeficienty pro eliminační funkce E1-E6 [38]. E1: β EVLS = 3, ,5 x + 3, x (26) E2: β EVLS = 4, ,5 x 2, x (27) E3: β EVLS = 3, ,5 x 2, x (28) E4: β EVLS = 11,657. 0,5 x + 17, x 5, x (29) E5: β EVLS = 6, ,5 x 8, x + 2, x (30) E6: β EVLS = 4, ,5 x 8, x + 3, x (31) 28

29 Obr. 15 Závislost proudového eliminačního koeficientu β EVLS na rychlostním koeficientu x, pro různé eliminační funkce E1 E6 [36] Koeficient přenosu náboje α Numerická hodnota koeficientu přenosu náboje α je specifickým ukazatelem stupně reverzibility. Lze ji také vypočítat pomocí EVLS ze vztahu [38,39]: E E1 E RT = αn F kde ΔE E1-E4 potenciálový rozdíl eliminačních funkcí E1 a E4, n a počet vyměněných elektronů v rychlost určujícím kroku. U dějů, při kterých dochází k přenosu více elektronů, je obtížné stanovit hodnotu n a, proto se spíše uvádí hodnota αn a. a (32) Výhody a nevýhody EVLS Výhody EVLS: jednoduchost, časová nenáročnost, cenová dostupnost, použitelná i při měření na pevných elektrodách, simultánní eliminace více proudů, zvětšení rozsahu měřících potenciálů (rozšíření potenciálového okna), elektrochemické stanovení látek, jejichž redukce probíhá při negativních potenciálech, odkrytí skrytých nebo minoritních procesů, 29

30 zvýšení proudové citlivosti, rozlišení potenciálové velmi blízkých elektrochemických signálů. Nevýhody: horší reprodukovatelnost naměřených signálů, zejména v případě pevných elektrod, zkreslení v důsledku vzájemná interakce eliminovaných dílčích proudů, pro některé eliminační funkce nastává nutnost vyhlazování naměřených křivek. Požadavky pro EVLS: stejný potenciálový step, stabilní proudová nula, inertnost základního elektrolytu, dobrý potenciostat, stejné experimentální podmínky, zejména z hlediska povrchu elektrody. 1.6 Metoda konfidenční elipsy Metoda konfidenční elipsy slouží ke statistickému zpracování naměřených dat. Podstatou této metody je transformace každé křivky do jednoho bodu o souřadnicích (x, y). Tyto křivky pak tvoří soustavu bodů, které můžeme ohraničit konfidenční elipsou. Metoda konfidenční elipsy využívá Fourierovu transformaci [41,45], díky níž dokážeme převést vícerozměrná data na dvourozměrná: F k = m 1 j= 0 2πjk Aj cos + i m m 1 j = 0 2πjk Aj sin m kde A j amplituda křivky v daném bodě, m celkový počet bodů, kterými je křivka určena, k nabývá hodnot 0 až m. Využitím rovnic: xf m = 1 k j = 0 (33) 2πjk Aj cos (34) m yf k m = 1 j = 0 2πjk Aj sin m (35) 30

31 transformujeme křivku m bodů do souřadnic bodů xf a yf, kde xf je reálná a yf imaginární část Fourierova koeficientu [42]. Pokud vezmeme v úvahu jen první člen Fourierovy transformace (k = 1) F = + (36) 1 xf1 iyf1 získáme n bodů z n naměřených voltametrických křivek. Tyto body pak proložíme přímkou ortogonální regrese [41], jejíž směrnici b r vypočítáme ze vztahu: kde: = 2 x x c S y Sx S y Sx b = ± 1+ r (37) S xy Sxy S x = x x = S y = y y S 2 y y c xy = xc yc c c i i x i a y i jsou souřadnice transformovaného bodu i-té křivky, x a y vypočteme jako vážený 2 průměr: x n i = 1 = n ωixi i= 1 ω i y n i = 1 = n ω i= 1 i yi ω i Obr. 16 Proložení 7 bodů přímkou ortogonální regrese 31

32 Dále potřebujeme vypočítat standardní odchylky vzdáleností podél regresní přímky (Standard Error of Estimate Longitudinal - SEEL) a kolmo k regresní přímce (Standard Error of Estimate Transverse SEET). SEEL = S x + S y + 2 S x S y S 2 xy + ( n 1) ( n 1) 2 S x + S y 2 S x S y S 2 xy (38) SEET = S x + S y + 2 S x S y S 2 xy ( n 1) ( n 1) 2 S x + S y Na základě vypočítaných hodnot standardních odchylek vzdáleností SEEL a SEET můžeme kolem bodů opsat konfidenční elipsu. Jestliže vezmeme jako velikost poloos trojnásobek standardní odchylky SEET a SEET, opíšeme elipsu s 99% spolehlivostí. 2 S x S y S 2 xy (39) Obr. 17 Konfidenční elipsa Díky využití ortogonální regrese při tvorbě elipsy získáme přesnější vyhodnocení dat, neboť bereme v úvahu chyby obou proměnných (x i y). Z tvaru elipsy, délky a poměru poloos můžeme získat důležité informace. Blíží-li se tvar elipsy přímce, pak mezi naměřenými hodnotami existuje funkční závislost. V případě, že se elipsa bude tvarem blížit kruhu, pak jsou naměřené hodnoty nahodilé. Této metody můžeme využít i pro určení detekčního limitu stanovované látky v elektrochemickém měření a to tak, že vytvoříme konfidenční elipsu základního elektrolytu a konfidenční elipsy po přidání stanovované látky. Jestliže se vzniklé konfidenční elipsy neprotnou, můžeme určit detekční limit [44]. 32

33 2 Experimentální část 2.1 Přístrojové vybavení Všechna měření byla provedena na analyzátoru AUTOLAB (Electrochemical Analyzer firmy EcoChemie, The Netherlands) ve spojení VA-Stand 663 (Metrohm, Schwitzerland). Naměřené voltametrické křivky byly zpracovány pomocí GPES 4.9 AUTOLAB software, dále exportovány a zpracovány v programu Microsoft Excel. Voltametrická cela měla tříelektrodové uspořádání: - pracovní elektroda - visící kapková rtuťová elektroda (HMDE), velikost kapky volena polohou přepínače 2 (plocha 0.4mm 2 ), - referenční elektroda - argentchloridová elektroda (Ag/AgCl/3M KCl), - pomocná elektroda - platinový drátek. Obr. 18 Autolab spojený s VA-Stand [46] Obr. 19 Elektrochemická nádobka [46] 33

34 Před začátkem každého měření (i během jednotlivých měření) byly roztoky probublávány argonem (99,999%) pro odstranění kyslíku. 2.2 Chemikálie Adenin (Adenine, minimum 99%, Sigma Aldrich) 2-aminopurin (2-aminopurine, minimum 99%, Sigma Aldrich) 2,6-diaminopurin (2,6-diaminopurine, minimum 98%, Sigma Aldrich) Fosfáto-acetátový pufr (FA-pufr): NaOH, H 3 PO 4, CH 3 COOH Příprava roztoků Roztoky purinových bází byly připraveny naředěním deionizovanou vodou (Milli-Q systém, Millipore). Jejich přesná koncentrace byla zjišťována spektrálním měřením na UV/VIS spektrometru Unicam UV4 (Cambridge, UK) se softwarem Vision (Cambridge, UK). Koncentrace připravených roztoků byla v rozmezí 1 mm 10 mm. Základní elektrolyty (FA pufry) byly připraveny podle tabulky umístěné v laboratoři, kde byl uveden poměr kyselých a zásaditých iontů (kyselé ionty - 0,4M H 3 PO 4 a 0,4M CH 3 COOH, zásadité ionty 2M NaOH). Takto byly získány roztoky různého ph, které bylo kontrolováno ph metrem (Eutech Instruments, PC5500, Chromservis s.r.o.) s elektrodou HAMILTON (Single pore glass). 34

35 2.3 Experimentální podmínky Před každým měřením byl elektrolyt probubláván argonem po dobu asi 10 min. kvůli odstranění kyslíku, dále také před každým následujícím měřením asi 100 s. Měření byla prováděna za laboratorní teploty, ph roztoků se pohybovalo v rozmezí hodnot 3 6,7. Pro měření byla vybrána metoda LSV (normal linear sweep voltammetry). Parametry měření: počáteční potenciál 0 V konečný potenciál -1,75 V potenciálový step 2 mv Měřené rychlosti polarizace: 25, 50, 100, 200, 400, 800 mv/s. Naměřené křivky pak byly zobrazeny v softwaru GPES 4.9 AUTOLAB a pro výpočet eliminačních funkcí byla data exportována do programu Microsoft Excel vybaveným makrem. Pro vyhlazování křivek a vytvoření konfidenční elipsy byl použit program Matlab verze Kapalinová chromatografie Čistota vzorků aminopurinů byla ověřena na HPLC (celkem 6 vzorků, dva od každého derivátu, stáří prvních vzorků 2 měsíce, druhých 14 dní). Z následujících grafů vyplývá, že roztoky adeninu, 2-aminopurinu a 2,6-diaminopurinu jsou z hlediska kapalinové chromatografie čisté. V případě 2-AP a 2,6-DAP došlo u starších roztoků ke snížení koncentrace. Adenin zůstal v roztoku stálý. Přístrojové vybavení - HPLC systém 10 AVP fy SHIMADZU (Shimadzu, Kyoto, Japonsko): a. odplyňovač GT-154, b. systémová řídící jednotka SCL-10AVP, c. pumpa LC-10AVP na přenos mobilní fáze pod tlakem, d. pícka CTO-10ASVP s dávkovacím kohoutem Rheodyne 7120 a dávkovací smyčkou 20 µl na injektování vzorku na kolonu, 35

36 e. detektor s fotodiodovým polem, SPD-M10AVP, řídící software Class-VP 5.02, f. chromatografická kolona Phenomenex Luna C18 rozměrů 250 x 4 mm, zrnění 5µm (silikagel s chemicky vázanou oktadecylovou skupinou) g. injekční stříkačka se speciálně upravenou jehlou pro dávkování vzorků Podmínky měření Mobilní fáze byla fosfátový pufr o c = 30 mmol l -1 v 15 % methanolu o ph = 7. Průtok mobilní fáze byl 0,5 ml min -1. Objem dávkovaného roztoku byl 20 µl. Za těchto podmínek se měřily roztoky thiomočoviny, 6-aminopurinu, 2-aminopurinu a 2,6-diaminopurinu při vlnových délkách λ = 254, 260, 305 a 280 nm. Koncentrace thiomočoviny je 0,002 mol l -1, ostatní roztoky měly koncentraci 0,1 mmol l -1. Výpočet kapacitního faktoru t t V V t V k = R M R M R R i = = =,kde k i kapacitní faktor (charakterizuje selektivitu), tm VM tm VM t R retenční čas analytu, t M mrtvý čas kolony, V R retenční objem analytu, V M mrtvý objem kolony. Tabulka č. 1: Výpočet kapacitního faktoru k i roztok ki (nový roztok) k i (starý roztok) 6-aminopurin 0,9641 0, aminopurin 0,6570 0,6570 2,6-diaminopurin 0,5668 0,5625 Chromatogram 6-aminopurinu I (mau) aminopurin (nový roztok) 6-aminopurin (starý roztok) t R (min) Graf 1: Chromatogram adeninu 36

37 Chromatogram 2-aminopurinu I (mau) t R (min) 2-aminopurin (nový roztok) 2-aminopurin (starý roztok) Graf 2: Chromatogram 2-aminopurinu Chromatogram 2,6-diaminopurinu I (mau) t r (min) 2,6-diaminopurin (nový roztok) 2,6-diaminopurin (starý roztok) Graf 3: Chromatogram 2,6-diaminopurinu 2.5 Postup při vytváření konfidenční elipsy Pro vytvoření konfidenční elipsy se využivá programu Matlab. Nejprve je nutné nahrát do podadresáře Work programu Matlab pracovní soubor outly_con1x. Otevřeme Matlab a soubor outly_con1x. Postup: 1) Zkopírování naměřených křivek. Protože všechny voltmetrické křivky byly zaznamenány se stejnou změnou potenciálu (stejný step) stačí pro zpracování konfidenční elipsy zkopírovat pouze data, která vůči sobě vykazují podstatnou změnu, tzn. proud, do programu Matlab postupně křivku po křivce. 37

38 V Matlabu si musíme tyto křivky označit, abychom s nimi mohli dále pracovat, při vkládání dat postupujeme následovně: v programu Matlab napíšeme: >> A=[vložíme zkopírovaná data křivku po křivce]; kde A je označení křivky (libovolné). Středník píšeme proto, aby se nám hodnoty znovu nezobrazily. Tímto způsobem zkopírujeme i ostatní křivky. 2) Převedení vícerozměrného objektu (křivky) na dvourozměrný (bod) pomocí Fourierovy transformace (FT): >>a=fft(a) kde a je označení nové křivky, kterou dostaneme po FT (libovolně zvolené), fft je příkaz, který provede FT, A původní křivka. Výsledkem je křivka, která od druhé hodnoty obsahuje komplexní čísla. Dále pak použijeme pouze první komplexní číslo (tedy druhou hodnotu rozvoje a). Abychom mohli toto komplexní číslo dále využít, opět si ho musíme nějak označit (v uvedeném příkladu je to a1): >>a1=[zkopírovaná druhá hodnota rozvoje a bez imaginární jednotky i]; Opět musíme tento proces provést pro každou křivku zvlášť. Pokud máme 10 původních křivek, dostaneme pomocí FT 10 bodů (např. a1 až a10). 3) Tvorba matice pro konfidenční elipsu z těchto získaných bodů >>AA=[a1 a2 a3 a4... vypíšeme označení všech bodů oddělených mezerou] Apostrof na konci je důležitý, vypíše nám hodnoty ve sloupci. Pokud zapíšeme 10 bodů (a1 až a10), matice AA bude obsahovat 20 hodnot (každé komplexní číslo má reálnou 38

39 a imaginární část). Pro matici konfidenční elipsy (pro náš případ bude mít 2 sloupce a 10 řádků) musíme vybrat z matice AA x-ové (řádky) a y-ové (sloupce) hodnoty zvlášť. Vzhledem k reálné a imaginární části komplexního čísla vybíráme z matice AA jako x-ové hodnoty část reálnou, tzn. první, třetí, pátou až devatenáctou hodnotu. V Matlabu provedeme operaci: >>XA=AA(1:2:19,:) kde XA je označení matice x-ových hodnot, AA matice, ze které tyto hodnoty vybíráme, 1 značí, že začínáme první hodnotou, 2 jdeme po dvou (tzn. další hodnota bude třetí, pátá,atd.), 19 je poslední možná lichá hodnota. Podobně pro hodnoty y: >>YA=AA(2:2:20,:) kde 2 značí, že začínáme druhou hodnotou, druhá 2 jdeme po dvou (tzn. další hodnoty budou čtvrtá, šestá,atd), 20 je poslední možná sudá hodnota. Matici pro konfidenční elipsu dostaneme z XA a YA takto: >>XY=[XAmezeraYA] Vypsané hodnoty této matice zkopírujeme do otevřeného souboru outly_con1x do hranatých závorek za OV a soubor outly_con1x uložíme. 4) Tvorba konfidenční elipsy V Matlabu napíšeme: >>outly_con1x Tento program nám vytvoří konfidenční elipsu. Ze získané konfidenční elipsy můžeme vidět, které body jsou odlehlé. Pokud je chceme vynechat, vymažeme je ze souboru outly_con1x, uložíme změnu a znovu v Matlabu spustíme soubor outly_con1x: >>outly_con1x 39

40 Soubor outly_con1x % outly_con1x.m disp('calculates confidence ellipse 95% disp('from [xf yf] vectors') format compact %clear, close all %set(gcf,'color','w'); version ') OV=[ ]; figure(10),plot(ov(:,1),[ov],'.-'); hold on, set(gcf,'color','w'); [m7 n7]=size(ov); title('matrix OV(m7,n7) - m7=objects(b), n7=variables(g)') xlabel(['no. of objects = ' num2str(m7)]); ylabel(['no. of variables = ' num2str(n7)]); pom='bgr'; % for i=1:m7+1 if i==1 MM=OV(2:m7,:); elseif i==m7 MM=OV(1:m7-1,:); elseif i>1 & i<m7 MM=[OV(1:i-1,:);OV(i+1:m7,:)]; elseif i==m7+1 MM=OV; end [m8 n8]=size(mm); % xf=mm(:,1); yf=mm(:,2); xm=mean(xf); ym=mean(yf); xc=xf-xm; yc=yf-ym; ny=m8-1; % % orthogonal regression Sx=xc'*xc; Vx=Sx/ny; Sy=yc'*yc; Vy=Sy/ny; Sxy=xc'*yc; Vxy=Sxy/ny; 40