Vliv růst podporujících rhizosférních mikroorganismů na rostliny

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Vliv růst podporujících rhizosférních mikroorganismů na rostliny Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Jaroslav Záhora, CSc. Vypracovala: Kateřina Millerová Brno 2012

2

3

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Vliv růst podporujících rhizosférních mikroorganismů na rostliny vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne. Podpis.

5 PODĚKOVÁNÍ Tímto děkuji vedoucímu práce Ing. Jaroslavu Záhorovi, CSc. za odborné vedení, cenné rady a metodickou výpomoc. Tato bakalářská práce byla podpořena projektem NAZV. ev. č. QJ a Výzkumným záměrem č. MSM

6 ABSTRAKT V rámci bakalářské práce byla shromážděna dostupná literatura k tématu vlivu růst podporujících rhizosférních mikroorganismů na rostliny, literární prameny byly roztříděny podle jednotlivých druhů a významu možných interakcí a současně byly zmíněny perspektivní oblasti možného využití získaných poznatků v oblasti ochrany rostlin. Součástí bakalářské práce byla také realizace praktického experimentu, jehož cílem bylo stanovit vliv komerčních biologických preparátů SYMBIVIT a POLYVERSUM na klíčivost a citlivost semenáčků kaktusů druhů Ferocactus latispinus a Echinofossulocactus multicostatus. Semenáčky byly pěstovány ve čtyřech variantách pomocí Fleischerovy metody. Pokus byl vyhodnocen a komentován na základě získaných výsledků a významnost rozdílů byla testována statisticky. Ani u jednoho z přípravků nebyl prokázán vliv na podporu klíčivosti semen modelových rostlin. U druhu F. latispinus měla varianta přípravku Symbivit v kombinaci s preparátem Polyversum pozitivní vliv na větší odolnost vůči napadení patogeny. V případě varianty s preparátem Symbivit bylo napadených jedinců zjištěno nejvíce. V případě druhu E. multicostatus oba dva preparáty napomáhaly shodně ke zvýšení odolnosti k patogenním mikroorganismům. Klíčová slova: mykorhiza, rhizosférní bakterie, SYMBIVIT, POLYVERSUM, kaktusy

7 ABSTRACT Within bachelor thesis the available literature sources were collected concerning the effect of plant growth promoting rhizosphere microorganisms, literary sources have been categorized by type and importance of possible plant-microbs interactions and also the promising areas of potential use of the acquired knowledge in the field of plant protection were highlighted. Included was also a practical experiment whose objective was to determine the influence of commercial and biological preparations SYMBIVIT and POLYVERSUM on germination and sensitivity of seedlings of two cacti species Ferocactus latispinus and Echinofossulocactus multicostatus. The seedlings were grown in four variants with the Fleischer's method. The evaluation and comments of our experiment were based on the obtained results and the significances of individual differences were tested statistically. Neither of the products did show the supporting effect on germination of model plants. The preparations SYMBIVIT in combination with the preparation POLYVERSUM have exhibited positive impact on the resistance to attack pathogens at F. latispinus. In the case of SYMBIVIT most affected individuals were found. In the case of the species E. multicostatus both medication helped to increase resistance against pathogenic microorganisms. Positive impact on the greater resistance to attack pathogens was observed for the product SYMBIVIT in combination with the preparation Polyversum at the F. latispinus seedlings. In the case of SYMBIVIT application were found most affected individuals. In the case of the species E. multicostatus both preparations foster identically the resistance against pathogenic microorganisms. Key words: mycorrhiza, rhizosphere bacteria, SYMBIVIT, POLYVERSUM, cacti

8 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Rhizosféra Mykorhizní symbióza Ektomykorhiza Endomykorhiza Arbuskulární mykorhiza Erikoidní mykorhiza Orchideoidní mykorhiza Ektendomykorhiza Monotropoidní mykorhiza Arbutoidní mykorhiza Interakce hostitel patogen Bakterie Vztahy mezi mykorhizními houbami a bakteriemi Rhizosférní bakterie Antagonistické bakterie Diazotrofní bakterie Interakce mezi kořeny rostlin a půdními organismy Rhizodepozice MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ Modelové rostliny Založení pokusu Přípravek SYMBIVIT Přípravek POLYVERSUM Fleischerova metoda VÝLEDKY PRÁCE A DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ...62

9 1 ÚVOD Interakce mezi rhizosférními mikroorganismy a rostlinami jsou složité. V čem tyto půdní organismy rostlinu podporují? Podstatou pro pochopení vnitropůdního vztahu jsou vzájemné interakce na povrchu kořene. Rostlina je v roli donora uhlovodíků a energie, čímž stimuluje život v půdě. Heterotrofní organismy jsou na dárci závislí. Disponují enzymatickým aparátem, kterým mohou rostlině zprostředkovat důležité živiny. Vzorovým příkladem může být mutualistický vztah mezi kořeny rostlin s půdními houbami mykorhizní symbióza. Mykorhizní symbióza je nejrozšířenější soužití půdních hub a vyšších rostlin, vzájemně prospěšné pro oba organismy. Houba žijící v symbióze s kořeny rostlin se vyživuje uhlíkatými látkami hostitele a na oplátku napomáhá rostlině v zásobování minerálními látkami. Rhizosférní bakterie jsou druhou skupinou, která si zaslouží náš zájem. Tyto bakterie mají příznivý vliv na rostlinu hned několika způsoby. Nejenže mají blahodárný účinek na kořeny rostlin, některé druhy fixují vzdušný dusík, tímto obohacují nejen sebe, ale i rostliny a navíc podporují dostupnost ostatních důležitých živin pro správný růst a vývoj rostliny. V rámci mé bakalářské práce byl proveden v laboratorních podmínkách jednoduchý experiment. Vychází z reálné poptávky po alternativních přípravcích na ochranu rostlin, z trendu v dnešní společnosti, kterým je obracet pozornost od chemických látek na biologicky aktivní látky a vyvarovat se takto negativnímu působení na přírodní a zejména na půdní prostředí. Pokus byl zaměřen jednak na efekt klíčivosti mimořádně citlivých rostlinných organismů a jednak na stanovení jejich napadení, pomocí preparátů na biologické bázi značky SYMBIVIT. Druhým přípravkem byl produkt POLYVERSUM. Modelovými rostlinami byly kaktusy dvou odlišných druhů Ferocactus latispinus a Echinofossulocactus multicostatus. 9

10 2 CÍL PRÁCE 1. Vypracovat literární přehled zaměřený na rhizosférní mikroorganismy podporující růst a vývoj rostlin. 2. Popsat a vysvětlit interakce mezi rhizosférními mikroorganismy a hostitelskými rostlinami. 3. V rámci experimentu zhodnotit komerční biologické preparáty na modelových rostlinách, konkrétně zjištění efektu klíčivosti a citlivosti modelových rostlin na biologické přípravky Symbivit a Polyversum. 4. Získané výsledky vyhodnotit a navrhnout vhodná doporučení. 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Rhizosféra Vzájemné vztahy mezi mikroorganismy a rostlinami vynikají neobyčejnou složitostí. Jde zde o vliv rostlin na mikroorganismy a o vliv mikrobů na rostliny. Vztah může být v obou případech více méně příznivý nebo nepříznivý. Na mikroorganismy jsou nejbohatší půdy pod leguminózami, chudší pod okopaninami a na mikroorganismy nejchudší jsou půdy pod obilninami. Největší množství mikroorganismů se nachází v nejužším okruhu kořenů rostlin, tzv. rhizosféře (KÁŠ, 1964). Uplatňují se zde složité vztahy mezi biotickými a abiotickými činiteli prostředí (ROZMOŠ, 2009). Rhizosféra se dělí na vnitřní rhizosféru, prostor těsně na povrchu kořenů, kterou osidluje mikroflóra uvolnitelná až po jejich důkladném promytí vodou, dále na vnější rhizosféru, což je vrstvička půdy v síle cca 0,5 mm; její mikroflóra se uvolní až po máčení kořenů. Příkořenová zóna je půda v těsné blízkosti kořenů, cca 1 mm, která zůstává po hrubém oklepání. Poslední je širší rhizosféra, což je půda vzdálenější od kořenů více než 1 mm, která se získá prosátím kořenového systému přes síto. Ve vnitřní rhizosféře je rhizosférní efekt nejvyšší. V různých obdobích růstu rostlin podléhá celkový počet rhizosférních bakterií i vzájemný počet jednotlivých skupin mikroorganismům výkyvům. Nejvyšší počet je zjištěn v raných fázích růstu rostlin a v období květu. Naopak nejnižší počet bakterií je v období zrání. Právě rhizosférní bakterie často podporují příjem minerálních a organických živin rostlinami tím, že zvyšují přijímací a syntetickou schopnost kořenů. Zvláště minerální a organické sloučeniny fosforu (KÁŠ, 1964). 11

12 3.2 Mykorhizní symbióza Mykorhiza je specifický vztah, který je utvářen mezi kořeny rostlin a houbami (PROCHÁZKA et al., 1998). Hyfy mykorhizních hub vybíhají do půdy jako síť dlouhých vlásků, které absorbují minerální látky a část těchto látek předávají kořenům (LUŠTINEC, ŽÁRSKÝ, 2003). Mycelium hub je buď hlavně na povrchu (ektotrofní mykorhiza) nebo proniká hlouběji do kořenových pletiv (endotrofní mykorhiza) a supluje tak často chybějící kořenové vlášení (KŮDELA, HEJNÝ, 1989). Většinou se jedná o vztah symbiotický, jestliže ale jeden z partnerů získá převahu, může se tento vztah změnit na parazitický (PROCHÁZKA et al., 1998). V přírodě je hojně rozšířena. Jde obvykle o mutualistický vztah mezi rostlinou a houbou. Je známo okolo 92 % čeledí rostlin, které se na její tvorbě účastní (WANG, QIU, 2006). Mykorhizu netvoří rostliny z čeledi Brassicaceae (brukvovité), Cyperaceae (šáchorovité), Chenopodiaceae (merlíkovité) a Juncaceae (sítinovité) (TESAŘOVÁ, 1998). Základními rysy látkové výměny v mykorhize je vyšší příjem minerálních živin (hlavně fosforu) a vody mykorhiznimi houbami a tok sacharidů z rostliny do houby. Rostliny přijímají od mykorhizních hub rovněž růstové hormony (cytokininy a auxiny). Zvýšená produkce hormonů vyvolává morfologické změny kořenů, čímž přispívá k efektivnější mobilizaci i transformaci živin rostlinou. Kolonizace rostlinných kořenů mykorhizními houbami může také omezovat napadení hostitelské rostliny kořenovými patogeny (např. Fusarium oxysporum, Pythium ultimum). Ochranná funkce mykorhizních hub roste u rostlin s hojně větvenými kořeny (PROCHÁZKA et al., 1998). Mykorhizní houby se řadí mezi houby vřeckovýtrusé (Ascomycetes), stopkovýtrusé (Basidiomycetes) a spájivé (Zygomycetes) (FITTER, 1996). Podmínky pro rozvoj mykorhizy jsou dobře provzdušněné půdy, dostatek organických látek v půdě, ph půdního roztoku 4-5, růstová fáze rostlin podmiňující rychlost tvorby mykorhizy, stav rostlin a složení mikrobiocenózy nepotlačující rozvoj mykorhizních hub (KOPČANOVÁ et al., 1987). Rozvoj mykorhizních hub je soustředěn jen na kořenovou pokožku (rhizodermis) a primární kořenovou kůru v kořenech hostitelských rostlin. Nikdy nevstupují do středního válce kořene, ve kterém jsou obsažena vodivá pletiva. Vlákna mykorhizních hub spojují vnitřní prostor kořene s prostředím půdy. 12

13 Utváří síť mimokořenového mycelia, jež podstatným způsobem zvětšuje půdní objem. Z tohoto objemu může rostlina sorbovat živiny (MAIER et al., 1999). Symbióza mezi kořeny rostlin a houbami se vyznačuje velkou citlivostí na cizorodé látky v prostředí, například v oblastech postižených imisemi mykorhiza rychle mizí. Ale také některé mykorhizní houby mají schopnost kumulovat těžké kovy jako je olovo nebo kadmium a redukovat tak jejich vstup do rostlin, a tím do potravního řetězce (PROCHÁZKA et al., 1998). Mykorhizní houby jsou často nápomocny vzniku rostlinného pokryvu na různých čerstvě se formujících substrátech. Tyto substráty mají jinak pro rostliny nepříznivé vlastnosti (například vysoké koncentrace jedovatých kovů nebo můžou být příliš kyselé či suché). Mykorhizní houby tak mohou v těchto případech najít praktické uplatnění, kromě dalšího také jako protierozní činitelé (GRYNDLER et al., 2004). V důsledku okyselování půd vlivem kyselých dešťů dochází k odumírání mykorhizních hub. Stromy jsou poté oslabené a snadněji napadány škůdci (JELÍNEK, ZICHÁČEK, 2005). Prvotní vytvoření mykorhizního vztahu se datuje od ordoviku nebo siluru. Rostliny opustily vodu a přešly na souš, rhizomy s rhizoidy měly pouze funkci uchycení v půdě a potenciálního čerpání vody. Limitujícím faktorem pro rostliny byla přístupnost fosforu. Prvními mykorhizními houbami (mykobionty) byli s největší pravděpodobností parazité, kteří sami žili v nedostatku tohoto prvku. Začali tedy transportovat fosfor z okolní půdy, z něhož část byla přenášena i do rostliny ( 13

14 Obr.1: Typy mykorhizní symbiózy Zdroj: 14

15 3.2.1 Ektomykorhiza Je vývojově mladší, více specializovaná mykorhizní symbióza dřevin, je přítomna např. u čeledí Fagaceae (bukovité), Salicaceae (vrbovité), Pinaceae (borovicovité) ( Při tomto typu mykorhizy nepronikají hyfy mykorhizní houby do buněk hostitele (LUŠTINEC, ŽÁRSKÝ, 2003). Houby napadají krátké postranní kořeny a mladé nesuberinizované kořenové špičky. Postranní kořeny se jejich vlivem silně rozvětvují. Větvení kořenů nejspíše způsobují auxiny (zejména kyseliny indolyl-3-octové), které mykorhizní houby produkují. Kolem kořenů se postupně vytváří houbový plášť, který omezuje tvorbu kořenového vlášení, jehož funkci přebírají houbové hyfy. Rozsáhlá síť houbových vláken sbírá v půdě živiny (hlavně fosfor), čerpá vodu a odevzdává je rostlině. Hyfy hub pronikají také do mezibuněčných (intercelulárních) prostor v kůře, avšak nikdy do buněk kořene. Houby vytvářejí uvnitř kořenových pletiv hustou síť, která nese název podle svého objevitele Hartigova síť. Pomocí těchto hyf je zprostředkovávána výživa mykorhizní houby uhlíkem. Uhlík poskytuje rostlina ve formě asimilátů (PROCHÁZKA et al., 1998). Ektomykorhizní houby produkují také do okolí řadu enzymů. Enzymy se uplatňují při rozkladu organických látek. Mycelium těchto hub v přítomnosti jiných půdních organismů celkem často vykazuje např. polyfenoloxidázovou aktivitu. Enzymové aktivity se později uplatňují při uvolňování minerálních látek, jež jsou vázány v organické hmotě a při jejich znovu zpřístupnění rostlině (GRYNDLER et al., 2004). Ektomykorhiza je jednoletý systém, který se každoročně obnovuje, nejčastěji se nachází v lesních společenstvech a podílejí se na ní až stovky různých druhů hub přednostně ze třídy stopkovýtrusných (Basidiomycetes), vřeckatých (Ascomycetes) a spájivých (Zygomycetes) (PROCHÁZKA et al., 1998). Ektomykorhizní houby tvoří v blízkém okolí hostitelského stromu makroskopické nadzemní plodnice (LEPŠOVÁ, 2003). 15

16 Obr. 2: Ektomykorhiza, (Foto: M. Vohník) Zdroj: Endomykorhiza Při tomto typu mykorhizy pronikají hyfy hub skrz epidermis kořenových vlásků do kořenového parenchymu. V buňkách parenchymu se dále rozvíjejí. Morfologicky se kořeny nemění a kořenové vlášení je zachováno (PROCHÁZKA et al., 1998). Je známo několik druhů endomykorhizy. Jejich názvy často bývají odvozené od skupiny rostlin, v kterých se daná mykorhiza vyskytuje. Nejvíce častými houbovými symbionty jsou symbionti z oddělení Glomeromycota ( 16

17 3.2.3 Arbuskulární mykorhiza Arbuskulární mykorhiza je vývojově nejstarší typ mykorhizní symbiozy. Mezi vyššími rostlinami je v současné době nejvíce rozšířena ( pdf). Arbuskulární mykorhiza se utváří mezi více než 80 % cévnatých rostlin a mykorhizními houbami, které patří převážně do kmene Glomeromycota. Vzhledem k tomu, že jsou arbuskulární mykorhizní houby obligátní biotrofové, potřebují ke svému růstu hostitelskou rostlinu. Spory těchto mykorhizních hub jsou schopny klíčit i v laboratorních podmínkách, ale klíčí velmi špatně nebo vůbec (KABRHELOVÁ, ZÁHORA, 2009). Arbuskulární mykorhizní houby jsou důležitou a hojnou součástí půdních společenstev ve většině suchozemských ekosystémů. Tato skupina mikroorganismů představuje rovněž skupinu biotrofů, odlišných od většiny mikrobiální biomasy v půdě (VARMA, 1999). V buňkách kořene se konce houbových vláken mnohonásobně dichotomicky větví, vytvářejí zvláštní útvary připomínající keříky odtud i pojmenování tzv. arbuskuly. (PROCHÁZKA et al., 1998). Vznikají uvnitř buněk primární kůry kořene rostlin (hostitele). Při průniku hyfy houby dovnitř buňky rostliny nedochází k perforaci cytoplazmatické membrány rostlinné buňky. Cytoplazma hostitele zůstává oddělena od okolního prostředí. Cytoplazmatická membrána rostlinné buňky se dále vchlipuje před rostoucí a větvící se hyfou (GRYNDLER et al., 2004). Arbuskuly dokončují svůj vývoj za pár dní, poté kolabují v amorfní houbovou tkáň a jejich funkce končí. Předpokládá se, že arbuskuly jsou hlavním místem symbiotického přenosu fosfátů a uhlíkatých látek mezi houbou a rostlinou. Někdy můžou v kořeni vznikat také vezikuly. Nacházejí se buď uvnitř buněk primární kůry kořene, nebo v intercelulárních prostorech kořenového kortexu ( Tyto útvary jsou nepravidelné i kulovité. Vznikají rozšířením hyf kořenového mycelia, od kterého nejsou nijak odděleny (GRYNDLER et al., 2004). Jejich funkce je zásobní, obsahují především látky lipidického charakteru ( 17

18 Mycelium mykorhizních hub arbuskulárního typu vylučuje do půdy velmi důležitou látku - glykoprotein glomalin. V půdě se glomalin hromadí roky až desetiletí (WRIGHT, UPADHYAYA, 1996). Vytváří na povrchu půdních agregátů hydrofobní vrstvu a může je i spojovat dohromady. Ze sítě hyf a rostlinných kořínků se mohou spojovat půdní mikroagregáty (< 250 µm), které vytvářejí makroagregáty (> 250 µm). V některých případech se vytvoří "slepence" s anaerobním prostředím uvnitř, zatímco vnější povrch je aerobní. Vzniká tak prostředí vhodné pro aerobní i anaerobní mikroorganismy ( Z morfologického hlediska se dělí AM na dva typy: Typ Arum (lineární typ dle Brundretta) a typ Paris (coiling typ dle Brundretta) ( Typ Arum je typický rychlejším šířením houbových vláken v apoplastickém prostoru primární kůry hostitele. Tvoří-li se vezikuly, jsou mezibuněčné (intercelulární) nebo vnitrobuněčné (intracelulární). Arbuskuly vznikají v hlubších vrstvách buněk. Typ Paris naopak nemá mezibuněčné hyfy a symbiotická houba se šíří symplasticky. Tvoří tedy několik intracelulárních hyfových závitů s drobnými arbuskulami (GEBAUER, MEYER, 2003). Arbuskulární mykorhizu tvoří zejména houby z čeledi Gigasporaceae, Glomaceae a Acaulosporaceae. Tento typ mykorhizy se hojně vyskytuje u hospodářsky prospěšných rostlin například u vinné révy, jabloní, hrachu, jetelovin, jahodníku atd. (PROCHÁZKA et al., 1998). Dříve byla tato mykorhiza označována jako vezikulo-arbuskulární. Byla pojmenována z důvodu přítomnosti jiné charakteristické struktury, vezikulů ( V 90. letech 20. století bylo zjištěno, že zástupci čeledi Gigasporacae nikdy vezikuly nevytvářejí, proto bylo zavedeno označení arbuskulární mykorhiza (AM), který postupem času dřívější termín úplně vytlačil ( 18

19 Obr. 3: Kolonizovaný kořen kukuřice obarvený trypanovou modří, (Foto R. Sudová, D. Püschel) 1) vezikuly; 2) arbuskuly Zdroj: Erikoidní mykorhiza Tento typ mykorhizy je typický tím, že houbová vlákna uvnitř kořenů rychle degenerují a rostliny z nich tak čerpají hlavně dusík, fosfor a další mikroelementy, ale taky rostlinné hormony a vitamíny (PROCHÁZKA et al., 1998). Pro vnitrokořenovou strukturu této mykorhizy jsou charakteristická nahloučená klubíčka houbových vláken epidermálních buněk tzv. smotky. Kolonizace se nerozšiřuje prorůstáním houbových hyf mezi sousedními buňkami. Každá epidermální buňka je samostatný infekční systém, který je iniciován penetrací houbových vláken mimokořenového mycelia (SMITH, READ, 1997). Mykorhizní kořeny u hostitelských rostlin nemají kořenové vlášení a jeho funkce je suplována myceliem (GRYNDLER et al., 2004). 19

20 Erikoidní mykorhizní houby se vyznačují značnými saprotrofními schopnostmi, dokáží přežívat po dlouhou dobu bez hostitelské rostliny. Vyrábějí speciální enzymy (proteázy, chitinázy apod.), které jim pomáhají čerpat látky z komplexních organických zdrojů, jež jsou pro rostliny nepřístupné (peptidy, proteiny, chitin z houbového mycelia nebo odumřelého hmyzu atd.) ( Hostitelské rostliny pro tento typ mykorhizy se vyskytují na půdách s velmi nízkou zásobou živin dostupných pro rostlinu. Jde o půdy s nízkými hodnotami ph, s vysokým obsahem organických uhlíkatých látek a vysokými hodnotami poměru uhlíku ku dusíku. Uplatňují se proto výrazným způsobem saprotrofní schopnosti symbiotických hub utilizovat různé formy živin, které mohou být následně předány hostitelské rostlině. Erikoidní mykorhizní houby mají hlavní roli v zpřístupňování, sorpci a transportu dusíku a fosforu do rostliny, ale také se tato asociace podílí na regulaci příjmu železa. Celý mykorhizní systém může rovněž zabránit zvýšenému příjmu toxických elementů často přítomných ve vřesovištních půdách, zejména Al 3+ iontů ( Erikoidní mykorhizu tvoří imperfektní (Oidiodendron) nebo vřeckaté houby (nejspíše jen z řádu Helotiales a Leotiales) nebo některé stopkovýtrusné (Tulasnella, Sebacinales). Jejich protějšky jsou rostliny z čeledi Ericaceae, rostoucí obvykle na silně kyselých půdách chudých na živiny (vegetace vřesovišť, tunder, rašelinišť) 20

21 Obr. 4: Erikoidní mykorhiza: kořen Rhododendron kolonizovaný erikoidní mykorhizní houbou, (Foto M. Vohník) Zdroj: Orchideoidní mykorhiza Orchideoidní mykorhizní symbióza se objevuje jen u rostlin čeledi Orchidaceae (vstavačových). Je specifická průnikem mykorhizní houby přímo do vnitřního prostoru buněk kořene hostitelské rostliny. Tato symbióza má zásadní význam pro životní cyklus hostitelských rostlin, jelikož jsou na ni přizpůsobeny a nemohou bez ní v přirozených přírodních oblastech s úspěchem vyklíčit. Jelikož orchideje tvoří malá semena s omezeným množstvím zásobních látek, jsou proto v počátečních vývojových stádiích závislé na přísunu uhlíkatých látek od vhodné symbiotické houby. (McKENDRICK et al., 2000). Obvykle jde o Rhizoctonia solani, která je patogenem mnoha klíčících 21

22 rostlin. Ve vztahu k orchidejím se stává hostitelem a některé druhy orchidejí na ní po celý život parazitují (PROCHÁZKA et al., 1998). Z morfologicko-anatomického hlediska se orchideoidní mykorhiza rozděluje na typ tolypofágní a ptyofágní. Charakteristickým rysem tolypofágního typu je tvorba hyfových klubíček (pelotonů). Klubíčka se vytváří poté, co hyfa pronikne dovnitř buněk primární kůry kořene. Tam se hyfa větví, roste a tvoří hustou propletenou strukturu. Hyfa může prorůstat do buňky okolní. Při prorůstání hyf do buněk nedochází ke kontaktu s cytoplazmou kořenové buňky, jak je tomu u erikoidní nebo arbuskulární mykorhizy. Hyfa, která penetruje je obalena plazmatickou membránou hostitelské buňky. Takovéto klubíčko může po čase odumírat až se z něj nakonec vytvoří hlouček amorfní houbové tkáně. Tyto buňky nazýváme fygocyty. Buňka může být opět rekolonizovaná novým klubíčkem. Hyfy neprorůstají nikdy až do středního válce. Šíření těchto houbových vláken je omezeno na primární kůru kořene (PRŮŠA, 2005). Tolypofágní typ je běžnější. Ptyofágní typ se vyskytuje jen u několika druhů nezelených tropických orchidejí. Opět dochází ke kolonizaci buněk primární kůry kořene, ale klubíčka hyf se zde nevyvíjejí. Dochází k tomu, že v hlubších vrstvách kortexu hyfa, penetrující buňku, na vrcholu praská a její obsah je uvolněn do cytoplazmy hostitelské buňky (PRŮŠA, 2005). Obr. 5: Typy orchideoidní mykorhizy (Burgeff 1959) a) Tolypofágní typ orchideoidní mykorhizy b) Ptyofágní typ orchideoidní mykorhizy 22

23 Zdroj: Orchideoidní mykorhiza je jediným symbiotickým vztahem, ve kterém je tok sloučenin uhlíku od houby k partnerovi. Při počátečním vývoji mladé nezelené rostlinky to je houba, která produkuje celulázy, kterými se podílí na rozkladu celulózy. Získané jednoduché cukry pak od ní čerpá hostitelská rostlina. V této fázi vývoje rostliny jde v podstatě o parazitismus, dokud se u rostliny naplno nerozběhne fotosyntéza ( Výměna látek mezi houbou a orchidejí je složitý proces. Houba zajišťuje rostlině vyšší přísun fosfátových iontů. Pro orchideje je složitější získat z půdy pomalou difúzí pohybující se fosfor, než si obstarat ostatní makroprvky (např. dusík nebo draslík). U takovýchto elementů se uplatňuje tzv. hromadný tok. Koncentrace fosforu v rhizosféře klesá a získat ho lze buď nárůstem kořenového systému a rozsáhlejším větvením nebo prostřednictvím mykorhizní symbiozy. Pak síť mimokořenového mycelia může být větší, ale i účinnější než je samotný systém kořene rostliny. Houba také zásobuje rostlinu organickými látkami, vodou a dusíkem. Pletivo houby může tvořit mechanickou oporu nebo mít i antibiotický účinek. Pokud rostlina asimiluje, může rostlině poskytnout část uhlíkatých látek. K tomuto toku napomáhá sama houba vytvářením růstových hormonů (auxinů). Auxiny stimulují přenos monosacharidů z listů do kořene. V kořeni jsou tyto látky houbou stravovány (PRŮŠA, 2005). 23

24 Obr.6: Orchideoidní mykorhiza. Zdroj: Ektendomykorhiza Ektendomykorhiza je přechodným typem mezi endomykorhizou a ektomykorhizou. Mezi kořeny rostlin a houbami se vytváří volné spojení, které se tvoří v rhizosféře a na kořenech vytváří peritrofní plášť (PROCHÁZKA et al., 1998). Tuto symbiózu mohou tvořit dřeviny, které zcela běžně tvoří ektomykorhizu a to především v raných vývojových stádiích (např. rod Pinus, Picea). Systematické jednotky hub, jenž vytvářejí ektendomykorhizu mají spojitost s ektomykorhizními houbami, jelikož mohou vytvářet v závislosti na rostlině ektomykorhizní symbiózu (TREVOR et al., 2001). 24

25 3.2.7 Monotropoidní mykorhiza Monotropoidní mykorhiza je vyvinuta u nezelených rostlin z čeledi Monotropaceae. Tyto rostliny ztratily chlorofyl a jsou tedy zcela závislé na svém houbovém partnerovi při získávání uhlíku. Hartigova síť zabíhá jen do vnější vrstvy rhizodermálních buněk. Do buněk pronikají haustoria, kterými houba předává důležité živiny nezelené rostlině, jež jsou potřebné k jejímu růstu. V tomto případě nejde o penetraci, nýbrž jen o invaginaci membrán. Monotropoidně mykorhizní houby jsou schopny zároveň tvořit ektomykorhizu s jinými rostlinami. ( U mykorhizních hub tvořící monotropoidní mykorhizy se vyskytují antibiotické látky, které zvyšují konkurenční schopnosti hub při konkurenci s jinými půdními organismy. Byla izolována dvě antibiotika a pojmenována mykorhizin A a chloromykorhizin A. Vyznačují se vysokou aktivitou proti dřevokazné houbě Fomes annosus (kořenovníku vrstevnatému) (TROFAST, WICKBERG, 1977) Arbutoidní mykorhiza Arbutoidní mykorhiza je charakteristická pro čeledi Pyrolaceae a některé Ericaceae s různými druhy stopkovýtrusných hub. Jedná se zřejmě o ty houby, jež tvoří ektomykorhizu s okolními stromy. Kolonizované kořínky jsou kratší a vidličnatě se větví. Mají vyvinut hyfový plášť a Hartigovu síť. Houba penetruje rhizodermální buňky a tvoří v nich klubka vláken ( 25

26 3.3 Interakce hostitel patogen Mezi rostlinami a fytopatogenními mikroorganismy existuje velmi mnoho interakcí. Interakce jsou posuzovány jak z hlediska taxonomického, tak genetického. Nejobecnější kategorie je specifičnost, což je schopnost patogena napadnout určitou část rostliny pouze jedné odrůdy (druhu). Specifičnost mezi vyššími rostlinami a mikroorganismy je určována mechanickými, fyziologickými, genetickými a biologickými mechanismy (KŮDELA, HEJNÝ, 1989). 3.4 Bakterie Bakterie jsou organismy řazeny do domén Archea s Bacteria, jedná se o prokaryotické organismy. Genetický základ prokaryotické buňky tvoří tzv. nukleoid. Nukleoid není ohraničen jadernou membránou a nedělí se mitoticky. Je složen pouze z DNA a doprovodných bílkovin, souhrnně představují rovněž chromozóm prokaryotické buňky. Ani ostatní buněčné organely nacházející se v cytoplazmě nejsou ohraničeny membránovým systémem. Ten je charakteristický pro buňky eukaryotické. Buňky prokaryot jsou obaleny buněčnou stěnou, která se strukturou a složením odlišuje od buněčné stěny rostlinných buněk. Základní složkou buněčné stěny prokaryotických buněk je peptidoglykan (ROSYPAL et al., 1981) Vztahy mezi mykorhizními houbami a bakteriemi Bakterie zastoupené v půdní mikroflóře způsobují nejrůznější biochemické pochody v půdě, které přímo ovlivňují intensitu růstu rostlin. Rozmanitost a počet těchto procesů je rozsáhlá, ale v podstatě jde vždy o přeměnu různých organických a minerálních látek v půdě (FJODOROV, 1957). Půdní bakterie se vyznačují širokými a univerzálními schopnostmi. Můžeme mezi nimi rozlišit řadu ekologických skupin: bakterie stimulující růst rostlin, bakterie, které rozpouštějí nerozpustné soli fosforu a jiných prvků, bakterie antagonistické, bakterie žijící volně a symbiotičtí fixátoři molekulárního dusíku a mnoho dalších. Přítomné rhizosférní bakterie mohou stimulovat 26

27 růst houbových hyf, jenž vyrůstají ze spor arbuskulárních mykorhizních hub. Tyto bakterie mají protichůdné vlastnosti k patogenům anebo jsou sami producenti látky, která stimuluje růst rostlin. Takovéto bakterie se označují zkratkou (plant growth promoting rhizobackeria PGPR) (GRYNDLER, et al., 2004) Rhizosférní bakterie Vyvíjejí se na povrchu kořenů rostlin i v půdě přiléhající ke kořenům. Obklopují kořen celistvým povlakem a mají schopnost měnit chemické složení minerálních i organických látek. Výzkumy jasně prokazují, jak je přítomnost půdních bakterií důležitou a nezbytnou podmínkou pro normální růst rostlin. Jednotlivé kmeny bakterií mají značný vliv na růst klíčků rostlin v polních i laboratorních podmínkách. Jedny mají stimulační účinek a druhé naopak růst brzdí. Inhibiční účinek je spojen s vylučováním produktů látkové výměny do okolního prostředí. V blízkosti kořenového systému rostlin nastává selekce specifické mikroflóry, která se od mikroflóry půdy bez rostlinného porostu odlišuje druhy a množstvím půdních mikroorganismů. Co je příčinou tohoto výběru? Jelikož zde mohou působit různorodí činitelé, zřejmě nejdůležitějším činitelem jsou kořenové exudáty rostlin. Množství organických látek, které jsou vylučovány kořenovým systémem, je malé. Avšak může dosáhnout až 5 % sušiny rostliny za celé období vegetace (FJODOROV, 1957). Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) Rhizosférní bakterie podporující růst rostlin (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) jsou přirozeně se objevující půdní bakterie, které překotně kolonizují rostlinné kořeny ve prospěch růstu rostlin. Inokulace užitkových plodin určitým druhem PGPR v raném stadiu vývoje zlepšuje biomasu produkce přes přímý efekt na kořenovou soustavu. Inokulace okrasných rostlin, lesních stromů, zeleniny a zemědělské plodiny s PGPR mohou mít za výsledek vícenásobný účinek na dřívější období růstu rostliny, jak je vidět v zlepšení sazenic při klíčení, síly rostliny, zdraví, 27

28 výšky rostliny, obsahu živin v pletivu, brzké kvetení, obsahu chlorofylu. PGPR mají vliv na vyšší růst, výtěžek a absorpci živin u rostlin. Pomáhají také zvyšovat fixaci dusíku u leguminóz, podporují volně žijící bakterie vážící dusík, zvyšují zásobu dalších živin jako např. fosfor, síra, železo a měď, produkci fytohormonů, podporují jiné prospěšné bakterie nebo houby, kontrolují houbové a bakteriální nemoci a pomáhají v kontrole hmyzích škůdců (SAHARAN, NEHRA, 2011). Bakterie rodu Pseudomonas jsou typickými zástupci. Pseudomonas Pseudomonas je nesporulující, gramnegativní bakterie tyčinkovitého tvaru s několika polárními bičíky. Jejich velikost je přibližně 0,5 1,0 1,5-5,0 µm. Nachází se ve většině půd a ve vodních prostředích s dostatečným obsahem kyslíku ( Kyslík je konečným akceptorem elektronů. Ve výjimečných případech může být konečným akceptorem taky nitrát, síran, nitrit, siřičitan atd. Pak je pro příslušníky rodu Pseudomonas možný život v anaerobních podmínkách (GARRITY et al., 1984) Některé druhy jsou fakultativně chemolitotrofní a využívají H 2 nebo CO 2 jako zdroj energie. Některé druhy způsobují denitrifikaci (ROSYPAL et al., 1981). Optimální růst má při C a může být snadno izolována. Např. Pseudomonas putida má několik kmenů, který kolonizuje kořeny rostlin, v nichž je vzájemný vztah mezi rostlinou a bakterií. Povrch kořene umožňuje bakterii prospívat z kořenových živin. Na druhé straně, Pseudomonas putida indukuje růst rostlin a chrání rostliny před patogeny. Pseudomonas putida podporuje vývoj rostlin a vědci tuto bakterii používají v bioinženýrství při výzkumu na vývoj biopesticidů ( 28

29 Obr. 7: Pseudomonas (Foto: Dennis Kunkle) Zdroj: Antagonistické bakterie Jsou skupinou bakterií, která omezuje aktivitu a růst fytopatogenních hub. Je prokázáno, že množství takových bakterií (antagonickým např. vůči půdním patogenním houbám Phytophtora cinnamomi a Fusarium oxysporum) můžeme izolovat z in vitro kultur arbuskulárních mykorhizních hub (CITERNESI et al., 1996). Tyto izoláty zbržďovaly růst parazitů a klíčení zoospor. Výskyt antagonistických bakterií v in vitro kulturách může být prospěšný pro rostliny, které budou ošetřeny inokulem, jež bude vyrobeno z těchto kultur. Po inokulaci arbuskulárním mykorhizním inokulem může být tedy stimulace růstu rostlin přičtena právě těmto antagonistickým bakteriím (GRYNDLER et al., 2004). 29

30 3.4.4 Diazotrofní bakterie Diazotrofní bakterie (fixátoři N 2 ) jsou podstatnou skupinou půdních bakterií, které umějí využívat molekulární dusík, který tvoří hlavní složku vzduchu. V této formě však není pro živé organismy dostupný. Jen málo druhů bakterií a aktinomycet dokáže rozštěpit silnou trojnou vazbu, kterou jsou atomy v molekule dusíku spojeny. Úkolem diazotrofních mikroorganismů je tedy zpřístupnit dusík všem ostatním organismům. Hlavní mechanismus projevu činností diazotrofních bakterií spočívá nejspíše ve fyziologických změnách mikroorganismů a rostlin. Tyto změny jsou způsobené obohacováním ekosystému využitelnými sloučeninami dusíku. Při spolupráci diazotrofních bakterií s arbuskulárními mykorhizními houbami slouží houby jako distributor fixovaného dusíku. Lepší výživa dusíkem zajišťuje rostlině lepší růst a vyšší hromadění organických látek bohatých na energii. Ty jsou tak dostupnější mykorhizním houbám (GRYNDLER et al., 2004). Azotobacter Bakterie rodu Azotobacter jsou diazotrofní bakterie žijící volně v půdě. Bakterie má vzhled lehce zploštělých kuliček, často spojených po dvou (FJODOROV, 1957). Tato gramnegativní, chemoorganotrofní bakterie je tvořena oválnými tyčinkami velikosti asi µm. Je-li nedostatek kyslíku nebo vyšší teplota, dochází ke shlukování do řetízkových útvarů. Pohyb je zajištěn peritrichálně rozmístěnými bičíky. Jestliže se pohyblivost ztrácí, obalují se buňky silnou kapsulou. Optimální teplota pro růst je okolo C. Jelikož využívají vzdušný dusík, rostou v půdách, které neobsahují zdroj dusíku, ale musí obsahovat cukry, alkoholy nebo organické kyseliny. Zástupci tohoto rodu dokáží fixovat vzdušný dusík, a tím obohacují půdu (ROSYPAL et al., 1981). 30

31 Obr. 8: Azotobacter Zdroj: Rhizobium Další způsob mikrobiální fixace dusíku je tzv. symbiotická fixace. Takto získávají dusík rostliny čeledi Fabacea (bobovité). Na kořenech rostlin se tvoří speciální struktury hlízky (noduly), ve kterých se bakterie přímo uvnitř buněk pletiv vyskytuje (GRYNDLER et al., 2004). Hlízky vznikají tak, že bakterie infekčním vláknem rozloží kořenovou pokožku (rhizodermis). Infekční vlákno pronikne až do lýkové části svazků cévních. Odtud přijímá zdroj energie pro fixování dusíku asimiláty. Rhizobium je gramnegativní bakterie tyčinkovitého tvaru o rozměrech 0.5 0,9 µm 1 3 µm. Bakteriím se nejlépe daří na živných půdách, kde tvoří okrouhlé sliznaté kolonie, většinou bezbarvé. Optimální teplota pro růst je 25 C (ROSYPAL et al., 1981). 31

32 Obr. 9: Rhizobium Zdroj: ootfolder=%2fshoeib%2fpictures%20library%2frhizobium 32

33 3.5 Interakce mezi kořeny rostlin a půdními organismy V rhizosféře dochází k vzájemným interakcím mezi kořeny rostlin a půdními organismy. V této oblasti dosahuje intenzita biochemických dějů nejvyšších hodnot. V oblasti kořenové čepičky jsou citlivá pletiva na vrcholu kořene chráněná tzv. mucilagem, což jsou gelové vysokomolekulární látky (proteiny, polysacharidy). Tyto látky jsou uvolňovány z oblasti kořenové čepičky. Kořenová čepička a navazující pletiva jsou chráněny mucilagem před mechanickým poškozením a také před infekcí půdními patogeny. Intenzita vyměšování mucilagních látek klesá s větší vzdáleností od kořenové špičky. Zvyšuje se podíl rhizosférních mikroorganismů, kteří využívají tyto metabolizovatelné zdroje organických látek pro pomnožení. Rhizosférní mikroorganismy jsou díky velkému zastoupení uhlíkatých látek v mucilagu a nedostatku ostatních živin pro vyšší aktivitu mikroorganismů schopny produkovat vlastní polysacharidy. Tyto látky jsou více odolné k enzymatickému rozkladu. Mucigel je tedy vzniklá směs polysacharidů a glykoproteinů rostlinného a mikroorganického původu a je kostrou mikrobiálního biofilmu, jež pokrývá povrch kořene. Bakterie mění své chování na základě výměny malých molekul, které jsou odvozené od laktonů a peptidů a jimi jsou bakterie schopné poskytovat do okolí informace o své přítomnosti. Výsledkem může být změna jejich chování na chování skupinové, které se může lišit od chování původního. Tento jev je velmi užitečný pro rostlinu i pro mikroorganismy a označuje se jako qourum sensing (ZÁHORA, 2012). Kořenové exudáty jsou nejrychleji metabolizovatelné části rhizodepozic. Exudáty jsou nízkomolekulární látky uvolňované z kořene pasivní difúzí a některé z nich vyvolávají reakci u rhizosférních mikroorganismů. Do mucilagu prorůstá z povrchu kořene kořenové vlášení, které dorůstá do vzdálenosti µm při tloušťce vláken 5 17 µm. Kořenové vlášení zvyšuje velikost absorpčního povrchu kořenů pro příjem půdního roztoku (ZÁHORA, 2010). 33

34 U mnoha druhů se může každá buňka či téměř každá rhizodermální buňka vyvinout v kořenový vlásek. Ve většině případů je kořenové vlášení vytvořeno ze specializovaných buněk mladé rhizodermis (HESS, ČINČEROVÁ, 1983). Kořenové vlásky mají životnost pouze několik dní. Odumřelé vlásky a pokožkové buňky jsou spotřebovávány rhizosférními mikroorganismy. Aktivita rhizosférních mikroorganismů je stimulována organickými látkami v okolí kořene rostliny. Rostliny dokáží podporovat množení mikroorganismů, jež jsou schopny produkovat enzymy. Tyto klíčové enzymy, schopné katalyzovat uvolňování důležitých živin z půdy, si samotné rostliny nedokážou vytvářet. Jsou to živiny, které jsou v rhizodepozicích v nedostatku a brzdí růst rostlin i mikroorganismů. Nedostatek živin nutí jednak mikroorganismy ke zvýšené syntéze enzymů, ale také k produkci rhizodepozit. Výsledkem je uvolnění většího množství živin než mikroorganismy potřebují, což je pro rostlinu prospěšné. Mikroorganismy také chrání rostlinu před napadením fytopatogeny (ZÁHORA, 2010). 3.6 Rhizodepozice Rhizodepozice neboli uvolňování látek a odumřelých pletiv na bázi uhlíkatých sloučenin, je velmi variabilní. U jednoletých rostlin to bývá asi 40 %, u lesních stromů kolem 70 %. V rhizosféře roste depozice při stresu, kterým je např. sucho, nedostatek živin, mechanický odpor apod. Výsledkem jsou odlišné hodnoty u jednotlivých rostlin. Hodnoty mohou být až 4 vyšší u rostlin pěstovaných v půdě než u rostlin pěstovaných v živném roztoku. Mikroorganismy v kořenové sféře zvyšují rhizodepozici. V kořenech rostlin je alokováno okolo % z čisté produkce fotosyntézy. Z tohoto množství je velká část uvolňována formou organických sloučenin a oxidu uhličitého do nejbližšího okolí kořenů rostlin (rhizosféry). Mucigel a odumřelé buňky pletiv mohou způsobit některé přímé účinky na mobilizaci a na vazby minerálních živin. Tyto látky se stávají primárně organickým substrátem pro čerpání uhlíku pro mikroorganismy v rhizosféře. Ale mohou také působit na pohyblivost minerálních látek jako metabolity mikrobiální aktivity (BALÍK, 2009). 34

35 Obr. 10: Model transformace uhlíku v rhizosféře, (Warembourg a Billes, 1979; volně upravil Balík, 2009) 35

36 4 MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1 Modelové rostliny Jako modelové rostliny posloužili klíčenci kaktusů dvou různých druhů. Pro úspěšné výsevy kaktusů je totiž nutné používat chemických přípravků pro moření semen a sterilního substrátu. Nalezení biologicky přijatelné alternativy pro zajištění úspěšných výsevů by tak mělo i praktický dopad. Nezanedbatelnou výhodou jsou také malé prostorové nároky na realizaci experimentu a také extrémně pomalý vývoj klíčenců, z pokusnického hlediska tedy dostatečný časový prostor pro vyhodnocení reakcí klíčenců v delším časovém intervalu. K mému pokusu byla použita semena kaktusů Ferocactus latispinus (Haworth) Britton & Rose (přírodní zdroj, sbíráno na lokalitě Charco Blanco, spolkový stát San Luis Potosí, Mexico v roce 2010, sběr J. Záhora) a semena z kulturních rostlin Echinofossulocactus multicostatus (Hildm.) Britton & Rose. Důvodem pro volbu právě těchto dvou druhů byl jednak vysoký stupeň evoluční příbuznosti, jednak možnost zjištění odezvy použitých biologických přípravků na příkladu výsevu semen z přírodních sběrů a z kulturních rostlin, tedy s odlišnou potenciální kontaminací fytopatogenními mikroorganizmy a konečně také nutnost zajistit dostatečné množství semenného materiálu. Tyto půvabné rostliny z Nového světa přitahují pozornost už více než 400 let (LUX, 1993). Jsou jedny z nejpozoruhodnějších rostlin vůbec, jelikož se dokázaly přizpůsobit podnebí stepí a pouští, což jsou jejich přirozené stanoviště (VERMEULEN, 1998). Kaktusy se řadí mezi sukulenty. Jsou to rostliny, které mají schopnost nashromáždit v listech, stoncích nebo kořenech zásoby vody pro biochemické procesy v buňkách a také pro nepříznivá období, kdy je vody málo (KUNTE et al., 2011). 36

37 4.2 Založení pokusu Celý pokus byl založen Prvním krokem experimentu byla příprava půdního substrátu, který se skládal ze dvou složek, rašeliny a propraného říčního písku. Rašelina vhodná k přípravě pěstebních substrátů o objemovém množství 20 litrů firmy Agro pro všestranné použití v zemědělství, lesnictví a zahradnictví byla proseta sítem o průměru oka 2,80 mm a smíchána s říčním pískem prosetým sítem o průměru oka 2,00 mm. Vznikl substrát v poměru 3 : 2. Sledy pracovních úkonů jsou zobrazeny Obr. 11. Obr. 11: Pracovní postup přípravy výsevního substrátu Připraveným substrátem bylo naplněno 24 květináčů o průměru 6 cm a objemu 280 ml. Samotný tmavý povrch byl zasypán asi dvou centimetrovou vrstvou čistého písku, který musel být nejprve vysterilizován. Písek byl rozprostřen na plech a sterilizován v laboratorní sušárně při 105 C po dobu 60 minut. Došlo tak k usmrcení mikroorganizmů. Po vychladnutí písku byl tento rozprostřen na povrchu substrátu každého květináče. Následně byly dílčí varianty připravovány odlišně (viz níže). Klíčení kaktusových semen bylo testováno celkem ve čtyřech variantách, vždy se třemi opakováními. Každá varianta sadby byla rozdělena podle dvou druhů semen kaktusů. Semena byla pokládána na substrát pomocí sterilní pinzety ve flow boxu. 37

38 Obr.12: Semena kaktusů Do třech takto připravených květináčů byla na povrch uložena semínka kaktusů druhu Ferocactus latispinus a do dalších třech druhu Echinofossulocactus multicostatus.tato varianta sloužila pouze jako kontrola. V každé nádobě bylo připraveno ke klíčení 49 semínek. Substrát v dalších šesti nádobách byl zasypán pískem smíchaným s přípravkem Symbivit v poměru 2:1 v granulované podobě. Opět bylo na krycí vrstvu uloženo 49 semínek kaktusů. U třetí varianty byla semena kaktusů ošetřena mikrobiologickým fungicidním preparátem Polyversum, známým též jako inteligentní houba. Postup činností a množství semen byl opakovaný. Substrát zbývajících šesti květináčů byl doplněn opakovanou směsí Symbivitu a písku, na vrstvu byla pokládána semena opět ošetřena přípravkem Polyversum. 38

39 Obr. 13: Moření semen přípravkem Polyversum Obr. 14: Květináče naplněné připraveným substrátem 39

40 Kontrola klíčivosti a počtu infikovaných klíčenců byla prováděna ve čtyřech termínech po 7., 13., 16., 24. dni (18.1., 24.1., 27.1., 3.2.). Při kontrole jsem povrch substrátu vyfotografovala digitálním fotoaparátem a poté vyhodnotila (viz obr. 15). Obr. 15: Označení vyklíčených semen Varianty experimentu: a) C - Kontrola b) S - přípravek SYMBIVIT (aplikace viz kap. 4.3) c) P - přípravek POLYVERSUM (aplikace viz kap. 4.4) d) SP - přípravek SYMBIVIT + POLYVERSUM (aplikováno ve směsi dle doporučení výrobce) 40

41 4.3 Přípravek SYMBIVIT SYMBIVIT je granulovaný přípravek založený na využití vlastností mykorhizních hub. Mykorhizní houby obsažené v SYMBIVIT se napojí na kořeny rostlin. ( SYMBIVIT podporuje růst a zlepšuje výnos většiny druhů rostlin. ( Přípravek se skládá z přírodních jílových nosičů, šesti druhů mykorhizních hub, přírodních složek na podporu mykorhizy a biologicky rozložitelných granulí absorpčního gelu ( Obr. 16: Symbivit Zdroj: 41

42 4.4 Přípravek POLYVERSUM POLYVERSUM je fungicidní preparát. Používá se v ochraně rostlin proti houbovým chorobám napadajícím především kořeny, kořenové krčky. Účinnou složkou je houbový organismus Pythium oligandrum. Pythium oligandrum je silný mykoparazit a parazituje více než dvacet rodů původců houbových chorob (např. Botrytis, Phytophthora, Verticillium, Sclerotinia, Rhizoctonia, Fusarium atd.). Pro svůj rozvoj využívá živiny, které pocházejí z houbových patogenů. Tak chrání rostliny před chorobami, které škodlivé plísně způsobují. POLYVERSUM chrání pěstované rostliny před chorobami, ale také zvyšuje odolnost rostlin proti chorobám nadzemních částí. Podílí se i na aktivní stimulaci výše výnosu ( Obr. 17: Polyversum Zdroj: 42

43 4.5 Fleischerova metoda Kaktusy byly pěstovány pomocí tzv. Fleischerovy metody. Každý květináč byl vložen do skleněné zavařovací láhve o objemu 1 litr, do které bylo nalito 100 ml destilované vody. Hermeticky uzavíratelné sklenice byly opatřeny pryžovým těsněním. Po pečlivém uzavření sklenic byla každá sklenice označena číslem. Láhve i těsnění byly vysterilizovány při 100 C po dobu 60 min. Uzavření sklenic je nezbytné z důvodu udržení sterility substrátu a stálé vlhkosti. Nutností je pracovat co nejpečlivěji s co největší čistotou, jelikož vytvořené mikroklima prospívá také plísním (KUNTE, PAVLÍČEK, 2000). Všech 24 kusů květináčů uzavřených v zavařovacích sklenicích bylo vystaveno přirozenému zdroji světla a ponecháno v učebně s průměrnou pokojovou teplotou na dobu 24 dnů. Klíčení a růst semen bylo dokumentováno formou fotografií. Obr. 18: Sestava zavařovací sklenice a výsevní nádoby (patrný je způsob závlahy podmokem) 43

44 5 VÝLEDKY PRÁCE A DISKUZE Klíčenci FC FS FP FSP EC ES EP ESP Varianta Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Obr. 19 počet vyklíčených jedinců 7. den po založení pokusu Legenda k použitým zkratkám: F - Ferocactus latispinus, E - Echinofossulocactus multicostatus, C varianta Kontrola, S varianta s přípravkem Symbivit, P varianta s přípravkem Polyversum, SP varianta s přípravky Symbivit a Polyversum Z předcházejícího obr. 19 je zřejmé, že během prvního týdne klíčení semena druhu Ferocactus latispinus nejevila známky klíčení. Nejvíce semen druhu Echinofossulocactus multicostatus vyklíčilo ve variantě s přípravkem Polyversum. Varianty Kontrola a Symbivit v kombinaci s přípravkem Polyversum jsou v počtu vyklíčených jedinců přibližně na stejné úrovni. Počet vyklíčených semen ve variantě Symbivit byl nejnižší. 44

45 24.1. Klíčenci FC FS FP FSP EC ES EP ESP Varianta Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Obr. 20 počet vyklíčených jedinců 13. den po založení pokusu Legenda k použitým zkratkám: F - Ferocactus latispinus, E - Echinofossulocactus multicostatus, C varianta Kontrola, S varianta s přípravkem Symbivit, P varianta s přípravkem Polyversum, SP varianta s přípravky Symbivit a Polyversum Obr. 20 znázorňuje měření probíhající v termínu V porovnání s předchozím měření je patrné, že semena F. latispinus vyklíčila až v tomto období. Největší klíčivost projevila semena F. latispinus, na která nebyly aplikovány biologické preparáty a naopak nejmenší počet vyklíčených semen F. latispinus bylo s přípravkem Symbivit. Semena druhu E. multicostatus s přípravkem Polyversum opět projevily největší aktivitu klíčení. V rámci druhu E. multicostatus byla klíčivost semen ve variantě s přípravkem Symbivit nejnižší. 45

46 27.1. Klíčenci FC FS FP FSP EC ES EP ESP Varianta Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Obr. 21: Počet vyklíčených jedinců 16. den po založení pokusu Legenda k použitým zkratkám: F - Ferocactus latispinus, E - Echinofossulocactus multicostatus, C varianta Kontrola, S varianta s přípravkem Symbivit, P varianta s přípravkem Polyversum, SP varianta s přípravky Symbivit a Polyversum Měření zobrazené obr. 21 probíhalo v období tří dnů tj Za tento interval se klíčivost jednotlivých semen druhu F. latispinus výrazně nezměnila. Semena druhu E. multicostatus s variantami Kontrola, Polyversum a Symbivit Polyversum prokazují nepatrný nárůst, zatímco s variantou Symbivit tyto semena vykázala největší aktivitu. 46

47 3.2. Klíčenci FC FS FP FSP EC ES EP ESP Varianta Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Obr. 22: Počet vyklíčených jedinců 24. den po založení pokusu Legenda k použitým zkratkám: F - Ferocactus latispinus, E - Echinofossulocactus multicostatus, C varianta kontrola, S varianta s přípravkem Symbivit, P varianta s přípravkem Polyversum, SP varianta s přípravky Symbivit a Polyversum Poslední měření v období popisuje obr. 22. Nejvyšší rychlost klíčení semen byla v tomto měření vyhodnocena u druhu F. latispinus s variantami Kontrola a Polyversum. Semena druhu E. multicostatus měla maximální nárůst počtu vyklíčených jedinců ve variantě Kontrola a naopak ve variantě Symbivit a variantě Polyversum byl nárůst nepatrný. 47

48 Tab. 1 Statistické porovnání jednotlivých variant u F.latispinus 24. den po založení pokusu Tukeyův HSD test; proměnná Vyklíčené (Záchyt Nmin) Homogenní skupiny, alfa =,05000 Chyba: meziskup. PČ = 13,500, sv = 8,0000 Varianty Vyklíčené - Průměr 1 2 FS 42,33333 **** 1 FC 43,00000 **** 3 FP 44,66667 **** 4 FSP 45,66667 **** Tab. 2 Statistické porovnání jednotlivých variant u E.multicostatus 24. den po založení pokusu Tukeyův HSD test; proměnná Vyklíčené (Záchyt Nmin) Homogenní skupiny, alfa =,05000 Chyba: meziskup. PČ = 38,833, sv = 8,0000 Varianty Vyklíčené - Průměr 1 2 ES 24,33333 **** 4 ESP 26,33333 **** 3 EP 33,66667 **** 1 EC 33,66667 **** Výsledky z posledního dne experimentu byly statisticky zpracovány pomocí programu Statistica verze 10. Výsledkem je, že ani u semen druhu Ferocactus latispinus ani u druhu Echinofossulocactus multicostatus se biologické přípravky neprojevily na zdůvodnění rozdílu klíčení semen. 48

49 infikovaní klíčenci FC FS FP FSP EC ES EP ESP varianta Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Obr. 23: Počet infikovaných jedinců 7. den po založení pokusu Legenda k použitým zkratkám: F - Ferocactus latispinus, E - Echinofossulocactus multicostatus, C varianta Kontrola, S varianta s přípravkem Symbivit, P varianta s přípravkem Polyversum, SP varianta s přípravky Symbivit a Polyversum Obr. 23 se vztahuje k měření počtu vyklíčených jedinců znázorněných v obr. 19. Z vyklíčených semen bylo infikováno pouze jedno semeno a to u druhu E. multicostatus varianta Polyversum. 49

50 infikovaní klíčenci FC FS FP FSP EC ES EP ESP varianta Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Obr. 24: Počet infikovaných jedinců 13. den po založení pokusu Legenda k použitým zkratkám: F - Ferocactus latispinus, E - Echinofossulocactus multicostatus, C varianta Kontrola, S varianta s přípravkem Symbivit, P varianta s přípravkem Polyversum, SP varianta s přípravky Symbivit a Polyversum Z obr. 24 je zřejmé, že nejvíce infikovaných semen bylo u druhu F. latispinus ve variantě Kontrola. U tohoto rodu se vyskytla nejnižší infekčnost semen ve variantě s kombinací přípravků Symbivit a Polyversum. V porovnání varianty Symbivit a varianty Polyversum vykazuje varianta s přípravkem Polyversum nepatrně vyšší infekčnost. Semena druhu E. multicostatus s přípravkem Symbivit byla infikována nejméně. Varianty Kontrola a Polyversum vykazovaly průměrně shodný počet infikovaných semen. Nejvíce infikovaných jedinců bylo zaznamenáno ve variantě Symbivit Polyversum. 50

51 Obr. 25: Počet infikovaných jedinců 16. den po založení pokusu Legenda k použitým zkratkám: F - Ferocactus latispinus, E - Echinofossulocactus multicostatus, C varianta Kontrola, S varianta s přípravkem Symbivit, P varianta s přípravkem Polyversum, SP varianta s přípravky Symbivit a Polyversum Dne proběhlo měření, které je znázorněno v předcházejícím obr. 25. U semen z druhu F. latispinus se infekce nejvíce rozšířila ve variantě Symbivit. Vyšší nárůst infekce byl zaznamenán také u varianty Kontrola a Polyversum. Ve variantě Symbivit Polyversum se infekce rozšířila minimálně. U semen kaktusů druhu E. multicostatus se infekce od posledního měření nejvíce rozšířila ve variantě Kontrola. Rozsah infekce se nejméně navýšil ve variantě Polyversum. 51

52 infikovaní klíčenci FC FS FP FSP EC ES EP ESP varianta Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Obr. 26: Počet infikovaných jedinců 24. den po založení pokusu Legenda k použitým zkratkám: F - Ferocactus latispinus, E - Echinofossulocactus multicostatus, C varianta Kontrola, S varianta s přípravkem Symbivit, P varianta s přípravkem Polyversum, SP varianta s přípravky Symbivit a Polyversum Z obr. 26 lze vyčíst, že nejvyšší počet napadených jedinců u semen kaktusů druhu F. latispinus je ve variantě Symbivit. Prudký nárůst infekce byl zaznamenán rovněž ve variantě Polyversum. Nejméně infikovaných jedinců tohoto rodu má varianta Symbivit Polyversum. U semen druhu E. multicostatus se navýšil počet infikovaných pouze ve variantě Kontrola. U zbývajících variant se infekce dále nerozšířila. 52

53 Tab. 3 Statistické porovnání infikovaných F.latispinus 24. den po založení pokusu Tukeyův HSD test; proměnná Infikované (Záchyt Nmin) Homogenní skupiny, alfa =,05000 Chyba: meziskup. PČ = 5,5000, sv = 8,0000 Varianty Infikované - Průměr FSP 8,00000 **** 3 FP 12,33333 **** **** 1 FC 12,66667 **** **** 2 FS 14,66667 **** Na základě výsledků (viz. Tab.3) lze konstatovat, že nejméně infikovaných semen F.latispinus bylo ve variantě Symbivit v kombinaci s přípravkem Polyversum. Naopak nejvíce infikovaných jedinců měla varianta s přípravkem Symbivit. Tab. 4 Statistické porovnání infikovaných E. multicostatus 24. den po založení pokusu Tukeyův HSD test; proměnná Infikované (Záchyt Nmin) Homogenní skupiny, alfa =,05000 Chyba: meziskup. PČ =,33333, sv = 8,0000 Varianty Infikované - Průměr ES 2, **** 3 EP 2, **** 4 ESP 2, **** 1 EC 5, **** Dle Tab. 4 je zřejmé, že u semen druhu Echinofossulocactus multicostatus, měly přípravky Symbivit a Polyversum a jejich kombinace funkci bariéry v šíření houbových chorob. Odolnost vůči napadení se zvýšila o 50%. 53

54 Obr. 27: Průměrný počet vyklíčených a infikovaných semen F. latispinus Legenda k použitým zkratkám: F - Ferocactus latispinus, C varianta Kontrola, S varianta s přípravkem Symbivit, P varianta s přípravkem Polyversum, SP varianta s přípravky Symbivit a Polyversum, (i) infikovaná semena Obr. 27 znázorňuje průměrný počet vyklíčených a infikovaných semen kaktusu druhu F. latispinus. Nejvyšší průměrnou klíčivost měla semena ve variantě Kontrola. Semen ve variantě s přípravkem Symbivit vyklíčilo průměrně nejméně. Průměrný počet infikovaných semen byl nejvyšší ve variantě s přípravkem Symbivit. Naopak průměrně nejméně infikovaných semen bylo ve variantě s přípravky Symbivit a Polyversum. 54

55 Obr. 28: Průměrný počet vyklíčených a infikovaných semen E. multicostatus Legenda k použitým zkratkám: E - Echinofossulocactus multicostatus, C varianta Kontrola, S varianta s přípravkem Symbivit, P varianta s přípravkem Polyversum, SP varianta s přípravky Symbivit a Polyversum, (i) infikovaná semena Obr. 28 znázorňuje průměrný počet vyklíčených a infikovaných semen kaktusu druhu Echinofossulocactus multicostatus. Nejvyšší průměrnou klíčivost měla semena ve variantě Polyversum. Semen ve variantě s přípravkem Symbivit vyklíčilo průměrně nejméně. Průměrný počet infikovaných semen byl nejvyšší ve variantě s přípravkem Polyversum. 55

56 6 ZÁVĚR Během vyhodnocení modelového pokusu jsem nebyla schopna zjistit významné rozdíly mezi jednotlivými variantami. Jinými slovy podle hodnocených kritérií klíčivosti a případného zvýšení odolnosti rostlin vůči houbovým chorobám nebylo podstatné, zda byl anebo nebyl použit biologický preparát. Pro potvrzení či vyvrácení nastíněných závěrů bych doporučovala např. zopakování pokusu při dlouhodobějším sledování, zvýšení vrstvy substrátu anebo větší spektrum rostlinných druhů. Kaktusy byly výborné modelové rostliny, ale pro jejich klíčení a symbiózu s prospěšnými mikroorganismy nejsou v trvale vlhkém prostředí vhodné podmínky, proto navrhuji vyzkoušet experiment na jiných zahradnicky využitelných rostlinách a vyhnout se současné aplikaci bakteriálního a mykorhizního přípravku vzhledem k možným antagonistickým vztahům. Na druhé straně, v době závěrečného sestavování bakalářské práce ( po 105 dnech od založení pokusu) měla varianta s mykorhizními houbami téměř dvojnásobnou velikost semenáčků, což svědčí o pozitivním vlivu symbiotických mikroorganismů na modelovou rostlinu (viz. obr. 29). I proto by bylo dobré prodloužit při možných dalších pozorováních dobu sledování a zahrnout i některé biometrické údaje (např. průměr rostlin). br. 29: Srovnání varianty kontrola a varianty s mykorhizními houbami 105. den trvání pokusu O 56