UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE 5 Vlastimil Vyskočil

2 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE P ř í r o d o v ě d e c k á f a k u l t a Katedra analytické chemie Polarografické a voltametrické stanovení stopových množství,7-dinitro-9-fluorenonu Diplomová práce Praha 5 Vlastimil Vyskočil

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracoval samostatně, pod vedením školitele doc. RNDr. Jiřího Barka, CSc., a že jsem všechny použité prameny řádně citoval. Jsem si vědom toho, že případné využití výsledků, získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity. V Praze dne 6. května 5. podpis

4 Předmětová hesla: nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky, polarografie, voltametrie, HPLC, rtuťové elektrody Klíčová slova:,7-dinitro-9-fluorenon, DC tast polarografie, diferenční pulsní polarografie, diferenční pulsní voltametrie, adsorpční rozpouštěcí voltametrie, rtuťová kapková elektroda, visící rtuťová kapková elektroda, extrakce tuhou fází 3

5 Tato diplomová práce byla vypracována na Katedře analytické chemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze v letech 4 5 a byla finančně podporována Grantovou agenturou České republiky (grant 3/3/18). Prohlašuji, že jsem pracoval samostatně a veškerou použitou literaturu jsem citoval. V Praze dne 6. května 5 4

6 Úvodem bych chtěl vyjádřit svůj dík svému školiteli doc. RNDr. Jiřímu Barkovi, CSc. a současně i doc. RNDr. Jiřímu Zimovi, CSc. a všem členům Katedry analytické chemie za odborné vedení, všestrannou pomoc a cenné připomínky k mojí práci. Současně bych rád poděkoval i Mgr. Jiřímu Fischerovi a Mgr. Karlu Čížkovi za vřelý přístup a ochotu, se kterou mi poskytovali pomoc. V neposlední řadě děkuji svým rodičům za umožnění studia na vysoké škole a celé rodině i přátelům za podporu. 5

7 Obsah 1. Úvod Cíl práce Biologické účinky, vznik a výskyt nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků Nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky a metody jejich stanovení Spektrometrické metody Polarografické a voltametrické metody Chromatografické metody Experimentální část Reagencie Studovaná látka Referenční látky Aparatura Použité pracovní elektrody Rtuťová kapková elektroda Visící rtuťová kapková elektroda Pracovní postupy Polarografie a voltametrie Modelové vzorky Vysokoúčinná kapalinová chromatografie....4 Stálost zásobního roztoku,7-dinitro-9-fluorenonu Polarografické a voltametrické stanovení,7-dinitro-9-fluorenonu na rtuťových elektrodách DC tast polarografie,7-dinitro-9-fluorenonu Diferenční pulsní polarografie,7-dinitro-9-fluorenonu Diferenční pulsní voltametrie,7-dinitro-9-fluorenonu na visící rtuťové kapkové elektrodě

8 3.4 Adsorpční rozpouštěcí voltametrie,7-dinitro-9-fluorenonu na visící rtuťové kapkové elektrodě Výsledky a diskuse ke stanovení,7-dinitro-9-fluorenonu na rtuťových elektrodách Stanovení,7-dinitro-9-fluorenonu v modelových vzorcích Extrakce,7-dinitro-9-fluorenonu tuhou fází z deionizované vody Stanovení,7-dinitro-9-fluorenonu v pitné vodě Přímé stanovení,7-dinitro-9-fluorenonu v pitné vodě Extrakce,7-dinitro-9-fluorenonu tuhou fází z pitné vody Extrakce,7-dinitro-9-fluorenonu tuhou fází z říční vody Výsledky a diskuse ke stanovení,7-dinitro-9-fluorenonu v modelových vzorcích Stanovení,7-dinitro-9-fluorenonu metodou HPLC s UV detekcí Vliv obsahu methanolu v mobilní fázi na HPLC chování,7-dinitro-9-fluorenonu Vliv ph na HPLC chování,7-dinitro-9-fluorenonu Kalibrační závislosti HPLC stanovení,7-dinitro-9-fluorenonu Výsledky a diskuse k HPLC stanovení,7-dinitro-9-fluorenonu Souhrn Literatura

9 Seznam použitých zkratek a symbolů,7-dnf,7-dinitrofluoren,7-dnfn,7-dinitro-9-fluorenon A absorbance [AU] AdSV adsorpční rozpouštěcí voltametrie a i A p APAH A s b i BR pufr pravá pološířka v desetině výšky píku [s] plocha píku [AU.s] aminoderiváty polycyklických aromatických uhlovodíků asymetrie píku levá pološířka v desetině výšky píku [s] Brittonův - Robinsonův pufr c molární koncentrace [mol.l -1 ] C.A.S. Chemical Abstract Service DCTP tast polarografie DME klasická rtuťová kapková elektroda DPP diferenční pulsní polarografie DPV diferenční pulsní voltametrie E ½ E acc E p FID půlvlnový potenciál [mv] potenciál akumulace [mv] potenciál píku [mv] plamenový ionizační detektor F m průtoková rychlost [ml.min -1 ] FN h HMDE h p HPLC I.D. I I lim I p 9-fluorenon výška rtuťového sloupce [cm] visící rtuťová kapková elektroda výška píku [AU] vysokoúčinná kapalinová chromatografie vnitřní průměr [mm] elektrický proud [na] limitní proud [na] proud píku [na] 8

10 IR infračervená spektroskopie k retenční faktor LC kapalinová chromatografie L D mez detekce [mol.l -1 ] L Q mez stanovitelnosti [mol.l -1 ] m průtoková rychlost rtuti [mg.s -1 ] M r n NMR NO X NPAH NPD PAH ph ph a ph f RP-HPLC relativní molekulová hmotnost počet teoretických pater nukleární magnetická rezonance oxidy dusíku nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky termoionizační detektor citlivý na dusík a fosfor polycyklické aromatické uhlovodíky záporný dekadický logaritmus koncentrace oxoniových iontů ph použitého BR pufru ph směsného vodně-methanolického roztoku chromatografie s obrácenými fázemi S povrch rtuťové kapky [cm ] S/N poměr signálu k šumu t čas [s] t acc t k TLC t M t R t v UV w,5 doba akumulace [s] doba kapky DME [s] tenkovrstvá chromatografie mrtvý čas [s] retenční čas [s] doba otevření ventilu HMDE elektrody [s] ultrafialová spektroskopie šířka píku v polovině jeho výšky [s] molárnío absorpční koeficient [mol -1.L.cm -1 ] vlnová délka [nm] max vlnová délka absorpčního maxima [nm] 9

11 1. Úvod 1.1 Cíl práce Předkládaná diplomová práce byla vypracována v rámci širšího projektu, který je řešen na Katedře analytické chemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy a je věnován studiu elektrochemického chování karcinogenních a genotoxických sloučenin. Mezi tyto látky se řadí i polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH) a jejich amino- (APAH) a nitroderiváty (NPAH). Mezi nitroderiváty patří i studovaná látka:,7-dinitro-9-fluorenon (,7-DNFN). Tato práce se zabývá studiem elektrochemického chování,7-dnfn s využitím moderních polarografických a voltametrických metod. Cíle práce lze shrnout do následujících bodů: 1) Nalezení vhodných podmínek pro stanovení,7-dnfn na běžně rozšířených rtuťových elektrodách s cílem dosáhnout co nejnižší meze stanovitelnosti. Za tímto účelem byla použita klasická rtuťová kapková elektroda (DME) s využitím techniky DC tast polarografie (DCTP) a diferenční pulsní polarografie (DPP). Dále byla použita visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s technikou diferenční pulsní voltametrie (DPV) a adsorpční rozpouštěcí voltametrie (AdSV). Chování látky bylo z důvodů její malé rozpustnosti ve vodě studováno ve smíšeném vodně methanolickém prostředí 1. ) Stanovení,7-DNFN v modelových vzorcích pitné a říční vody po předchozí extrakci tuhou fází za využití techniky DPV na HMDE. 3) Nalezení vhodných podmínek pro stanovení,7-dnfn metodou HPLC s UV detekcí s cílem dosáhnout co nejnižší meze stanovitelnosti. Srovnání meze stanovitelnosti metod uvedených v bodu 1) s metodou HPLC s UV detekcí. 1

12 1. Biologické účinky, vznik a výskyt nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků Mezi látky, jejichž výskyt v životním prostředí lze příčinně spojovat se zvýšeným výskytem onemocnění rakovinou, která je jednou z hlavních příčin úmrtí ve vyspělých zemích, patří NPAH,3. Přítomnost těchto látek v životním prostředí ohrožuje přirozené biologické funkce živé přírody s negativním dopadem na zdravý vývoj organismů. Zvýšený zájem o přítomnost a projevy NPAH v životním prostředí se datuje od konce sedmdesátých let minulého století, kdy Jager 4 a Pitts 5 nezávisle zjistili, že PAH mohou reagovat s oxidy dusíku (NO X ) 6 za vzniku NPAH za podmínek, které lze očekávat ve znečištěném ovzduší 7 a při spalovacích procesech 8, zvláště u dieselových motorů 9,1. Nitrované polyaromáty byly v pozdějších letech zaznamenány například v emisích spaloven, výfukových plynech, produktech spalování fosilních paliv, cigaretovém kouři a dále ve vodách, sedimentech vodních toků a potravinách 11. Mateřské PAH interagují v atmosféře spolu s NO X dvěma reakčními mechanismy v závislosti na denní době. Za světla převládá atak OH radikálem následovaný reakcí s oxidy dusíku a v noci pak reakce s N O 5. V atmosféře probíhá i zánik NPAH. Děje se tak v přítomnosti radikálového činidla iniciovaného fotochemickou reakcí. Za sníženého obsahu kyslíku dochází k redukci NPAH až na příslušné APAH 1. Hlavním problémem působení NPAH na organismy je skutečnost, že růst zhoubných nádorů může být vyprovokován extrémně malým množstvím karcinogenu, přičemž choroba se může projevit až za mnoho let po počáteční expozici. Proto neustále roste potřeba po mimořádně citlivých a selektivních metodách stanovení těchto látek. Nitrosloučeniny patří mezi poměrně snadno redukovatelné látky, a to jak chemicky, tak i elektrochemicky. Studium elektrochemické redukce NPAH může mít význam při objasňování mechanismu jejich genotoxického působení a vést k vysvětlení pochodů probíhajících při odbourávání těchto látek v organismu. 11

13 NPAH vstupují do organismu nejčastěji dýchacími či trávícími cestami, mohou však být také snadno vstřebávány kůží 1 a jsou pravděpodobně redukovány jaterními nitroreduktasami za vzniku sloučenin indukujících tvorbu methemoglobinu, například nitrosoderivátů či N-hydroxylaminů 13. Tyto intermediáty jsou však dále redukovány až na odpovídající APAH, které jsou vylučovány močí ve volné formě či po acetylaci 13,14. Celulární redukce NPAH je katalyzována reduktázami systému NADPH-cytochrom P-45 podle schématu [A]. Ar-NO ArNO - Ar-N=O Ar-NHOH Ar-NH [A] Současně však může docházet i k C-hydroxylaci aromatického systému či k N-N dimerizaci výše uvedených meziproduktů 15. Za specifické genotoxické účinky aromatických nitrosloučenin zřejmě odpovídají právě výše uvedené reaktivní nitroaromatické anion-radikály, které snadno reagují s buněčnými nukleofily, zejména proteiny a nukleovými kyselinami 16,17. Molekulárně biologické detaily týkající se metabolismu a biologických účinků NPAH lze nalézt ve specializované lékařské literatuře 9,1,13,15-6 a řadu důležitých odkazů na jejich genotoxické účinky lze nalézt v přehledech 11,,7. Stanovovaná látka,7-dnfn je zatím z karcinogenity pouze podezřelá 8, přímé karcinogenní účinky zatím potvrzeny nebyly 9. 1

14 1.3 Nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky a metody jejich stanovení Pro stanovení NPAH byla popsána celá řada analytických metod s různou citlivostí a selektivitou. Jejich podrobnější přehled je uveden například v práci 11. Volba metody závisí na matrici, ve které se látka vyskytuje a koncentraci, ve které je v dané matrici obsažena. Vzhledem ke složitosti environmentálních vzorků je nutná předběžná separace za použití extrakčních a chromatografických technik. Konkrétní analytická metoda pro stanovení,7-dnfn zatím nebyla popsána. Vzhledem k podobným chemickým a fyzikálním vlastnostem se strukturně blízkými NPAH lze přepokládat užití níže popsaných metod i ke stanovení,7-dnfn Spektrometrické metody NPAH díky rozsáhlému aromatickému systému a přítomnosti nitroskupiny dostatečně absorbují záření v ultrafialové oblasti a viditelné oblasti spektra. UV maxima NPAH spolu s hodnotami molárních absorpčních koeficientů v cyklohexanu jsou pro velké množství těchto látek známy, podrobnější informace lze nalézt v přehledu. NMR, IR, fluorescenční a hmotnostní spektra řady NPAH jsou shrnuta v monografii 3. Fluorimetrie, která je velmi výhodná pro důkaz a stanovení PAH, nemůže být použita přímo pro NPAH, protože nevykazují prakticky žádnou fluorescenci Polarografické a voltametrické metody Vzhledem ke snadné polarografické redukci nitroskupiny na aromatickém jádře lze ke stanovení stopových množství NPAH použít moderní polarografické a voltametrické metody, jmenovitě diferenční pulsní polarografii na klasické rtuťové kapkové elektrodě či diferenční pulsní voltametrii na visící rtuťové kapkové elektrodě. Vzhledem k nízké polaritě NPAH a jejich silné 13

15 adsorpci na rtuťové elektrodě dané rozsáhlým aromatickým systémem lze použít k jejich mimořádně citlivému stanovení v koncentračním rozmezí 1-7 až 1-1 mol.l -1 adsorpční rozpouštěcí voltametrii na visící rtuťové kapkové elektrodě Chromatografické metody Chromatografické metody jsou nejčastěji používány při stanovení NPAH v environmentálních i biologických vzorcích vzhledem k jejich mimořádné selektivitě, citlivosti a vhodnosti pro sériové analýzy. V současnosti se při analýze NPAH uplatňuje do značné míry plynová chromatografie, využívající detektor FID 36,37, NPD 38, nebo hmotnostní detektor 39, a vysokoúčinná kapalinová chromatografie. HPLC umožňuje dosáhnout vyššího rozlišení a reprodukovatelnosti než LC 8 a TLC 4. Velmi často se pro stanovení NPAH používá RP-HPLC na koloně C-18 s mobilní fází tvořenou methanolem a vodným roztokem pufru, případně je místo methanolu použit acetonitril. K detekci NPAH je používán UV detektor 1,41-44, fluorescenční detektor (po předchozí redukci NPAH) 8,44,45 či elektrochemický detektor 46. HPLC metoda pro stanovení,7-dnfn je popsána v kapitole 5. Studiem a separací nitroderivátů a aminoderivátů fluorenu se zabývá práce 1. 14

16 . Experimentální část.1 Reagencie Studovaná látka:,7-dinitro-9-fluorenon (97%, Sigma Aldrich, Praha, ČR). Zásobní roztok,7-dnfn v methanolu o koncentraci.1-4 mol.l -1 (nižší koncentrace,7-dinitro-9-fluorenonu byla použita vzhledem k jeho omezené rozpustnosti) byl připraven rozpuštěním,7 g látky v 5 ml tohoto rozpouštědla. Referenční látky: 9-fluorenon (98%, Sigma Aldrich),,7-dinitrofluoren (97%, Sigma Aldrich). Zásobní roztoky 9-fluorenonu a,7-dinitrofluorenu o koncentraci.1-4 mol.l -1 v methanolu byly připraveny rozpuštěním přesně odváženého množství látky v tomto rozpouštědle. Roztoky o nižších molaritách byly připravovány přesným ředěním zásobních roztoků látek methanolem. Všechny roztoky byly uchovávány ve tmě za laboratorní teploty. Další použité chemikálie: kyselina boritá, octová kyselina (99%), kyselina fosforečná (85%), hydroxid sodný, methanol (99%) - čistota p. a., Lachema Brno, ČR. Brittonovy-Robinsonovy tlumivé roztoky 47 o příslušném ph byly připraveny smísením, mol.l -1 NaOH s roztokem obsahujícím kyselinu boritou, fosforečnou a octovou, každou o koncentraci,4 mol.l -1. Přesná hodnota ph byla měřena digitálním ph-metrem Jenway 433 (Jenway, Essex, Velká Británie) s kombinovanou skleněnou elektrodou (typ 94 5). ph metr byl kalibrován standardními vodnými pufry za laboratorní teploty. V textu je dále často používaná hodnota výsledného ph f methanolicko vodného roztoku. Jedná se o hodnotu získanou měřením těchto roztoků pomocí skleněné elektrody kalibrované standardními roztoky vodných pufrů. Tato hodnota není 15

17 termodynamická veličina, ale pomocný parametr zavedený za účelem co nejstručnější charakterizace měřených roztoků. Pro přípravu vodných roztoků byla používána deionizovaná voda (Millipore Milli-Q plus system, Millipore, USA). Používané roztoky byly uchovávány ve skleněných nádobách. 16

18 .1.1 Studovaná látka,7-dinitro-9-fluorenon C.A.S. Name: 9H-Fluoren-9-one,,7-dinitro- C.A.S. Registry Number: C 13 H 6 N O 5 M r =7, zkratka:,7-dnfn O N NO O.1. Referenční látky 9-fluorenon C.A.S. Name: 9H-Fluoren-9-one C.A.S. Registry Number: C 13 H 8 O M r =18, zkratka: FN,7-dinitrofluoren C.A.S. Name: 9H-Fluorene,,7-dinitro- C.A.S. Registry Number: C 13 H 8 N O 4 M r =56,1 zkratka:,7-dnf O O N NO 17

19 . Aparatura Při všech polarografických a voltametrických technikách byla použita sestava Eco-Tribo Polarograf se softwarem PolarPro verze 5.1, firma Polaro-Sensors, Praha, ČR. Software pracoval v operačním systému Windows XP (Microsoft Corp.). Jednotlivá měření byla prováděna ve tříelektrodovém zapojení, kdy byla jako referentní použita argentochloridová elektroda (1 mol.l -1 KCl) typu RAE 113, Monokrystaly, Turnov. Jako pomocná elektroda byla pak použita platinová drátková elektroda. Použité pracovní elektrody jsou charakterizovány níže. Při pulsních technikách byly na elektrody vkládány pulsy o šířce 8 ms a modulační amplitudě 5 mv. Při technice DPV byla použita rychlost nárůstu potenciálu 1 mv.s -1. Spektrofotometrická měření byla prováděna na přístroji Pye Unicam PC 88 UV/VIS Spectrophotometer (Cambridge, Velká Británie) v křemenných kyvetách měrné tloušťky, cm a dále na přístroji HP Hewlett-Packard 8453 Diode Array Spectrophotometer (Nizozemí) ve stejných kyvetách. Měření technikou HPLC byla prováděna na kapalinovém chromatografu ve složení: vysokotlaká gradientová pumpa BETA 5, dávkovací ventil D s L smyčkou, UV detektor Sapphire (vše ECOM, Praha, ČR), kolona Kromasil B C-18, 7 m (délka 5 cm, vnitřní průměr 4,6 mm). Ovládací software tvořil program Clarity v..3. (DataApex, Praha, ČR), pracující v operačním systému Windows XP (Microsoft Corp.). Pro dávkování byla použita 5 ml laboratorní injekční stříkačka...1 Použité pracovní elektrody Pro studium polarografického a voltametrického chování,7-dnfn (popř. FN či,7-dnf) byly používány rtuťové elektrody (DME a HMDE). V následujícím textu jsou stručně charakterizovány používané pracovní elektrody a jsou uvedeny specifické pracovní postupy při práci s nimi. 18

20 ..1.1 Rtuťová kapková elektroda Při práci s klasickou rtuťovou kapkovou elektrodou DME byla použita rychlost polarizace 4 mv.s -1, elektronicky řízená doba kapky 1 s a výška rezervoáru 36 cm. Doba kapky (t k ) při zvolené výšce rezervoáru (h) byla měřena při vloženém nulovém napětí proti argentochloridové elektrodě (1 mol.l -1 KCl). Kapilára byla ponořena do roztoku,1 mol.l -1 KCl. Průtoková rychlost rtuti (m) byla stanovena ponořením ústí kapiláry do předem zvážené nádobky s malým množství rtuti po dobu 3 s při dané výšce rezervoáru. Po uplynutí této doby byla nádobka se rtutí znovu zvážena a z rozdílu hmotností byla vypočtena váha rtuti prošlé za 1 s kapilárou 48. Konstanty použité rtuťové kapkové elektrody jsou uvedeny v Tab. 1. Tab. 1 Konstanty klasické rtuťové kapkové elektrody DME, h je výška rezervoáru, t k doba 1 kapky a m průtoková rychlost Hg při zvolené výšce rezervoáru. h [cm] t k [s],6 1,8 1,3 1,,8 m [mg.s -1 ] 4,87 6,96 9,55 1,41 15, Visící rtuťová kapková elektroda Při technikách DPV a AdSV byla používána visící rtuťová kapková minielektroda typu UM E 49 (Polaro-Sensors, Praha, ČR). V průběhu měření byly použity dvě různé elektrody výše uvedeného typu označené jako HMDE 1 a HMDE. Při tvorbě kapky byl ventil otevřený po dobu ms pro HMDE 1 používanou v kap. 3.3, 3.4 (stanovení,7-dnfn technikou DPV a AdSV) a 3 ms pro HMDE používanou v kap. 4.1, 4., 4.3 (stanovení,7-dnfn v modelových vzorcích technikou DPV). V Tab. jsou uvedeny plochy Hg kapky pro danou 19

21 dobu otevření ventilu obou elektrod. Povrch Hg kapky (S) byl vypočítán z experimentálně zjištěné hmotnosti kapek rtuti odkápnutých v prostředí,1 mol.l -1 KCl při nulovém vloženém napětí proti používané argentochloridové referentní elektrodě. Tato hmotnost byla určena z váhového rozdílu před a po přidání kapek rtuti, přičemž základní elektrolyt byl slit a rtuť několikrát opláchnuta methanolem a osušena proudem vzduchu do konstantní hmotnosti. Pro výpočet povrchu Hg kapky byl předpokládán její kulový charakter. Tab. Charakteristika používaných visících rtuťových kapkových elektrod (HMDE), t v je doba otevření ventilu a S je povrch Hg kapky. Elektroda t v [ms] S [cm ] HMDE 1,145 HMDE 3,196

22 .3 Pracovní postupy.3.1 Polarografie a voltametrie Při měření polarografických či voltametrických křivek bylo postupováno, pokud není uvedeno jinak, následujícím způsobem: do odměrné baňky na 1 ml bylo odpipetováno příslušné množství roztoku,7-dinitro-9-fluorenonu (popř. FN či,7-dnf) o potřebné koncentraci v methanolu, 3 ml methanolu a 5 ml BR pufru o příslušném ph a doplněno na 1 ml methanolem. Takto připravený roztok byl po promíchání převeden do polarografické nádobky a zbaven kyslíku pětiminutovým probubláváním dusíkem. Před vstupem dusíku do nádobky byla zařazena promývačka obsahující směs vody a methanolu ve stejném poměru jako analyzovaný roztok, tj. 1:1. Poté byl proveden záznam polarografické či voltametrické křivky. Všechny křivky byly měřeny třikrát. Při AdSV byla akumulace prováděna v míchaném roztoku. Po skončení akumulace bylo míchání vypnuto a po 15 s byl v ustáleném roztoku proveden záznam. Všechna měření byla prováděna za laboratorní teploty. Mez stanovitelnosti (L Q ) byla počítána jako desetinásobek směrodatné odchylky stanovení sledované látky o koncentraci odpovídající nejnižšímu bodu příslušné kalibrační přímky Modelové vzorky Jako vzorek pitné vody byla použita voda z vodovodu v budově chemických kateder PřF UK, Hlavova 8, Praha. Vzorek říční vody byl odebrán z Vltavy v Praze na Výtoni, 1 m po proudu od železničního mostu. Vzorky říční vody byly přefiltrovány přes fritu S4. Modelové vzorky,7-dnfn v deionizované, pitné či říční vodě byly připraveny přidáním potřebného množství (5 5 l) zásobního roztoku 1

23 ,7-DNFN o potřebné koncentraci v methanolu ke zpracovávanému objemu modelového vzorku (1 5 ml)..3.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Zásobní roztok látky v methanolu byl připraven o koncentraci.1-4 mol.l -1. Roztoky o nižší koncentraci byly připraveny přesným ředěním zásobního roztoku. Mobilní fáze pro kapalinovou chromatografii byly připraveny smísením příslušných objemových dílů vodné složky a organického modifikátoru. Obsah organické složky - methanolu - byl vyjádřen v objemových procentech. ph mobilních fází bylo upravováno změnou ph vodné složky, takže údaje, týkající se ph mobilní fáze, udávají ph vodné složky fáze. Všechna měření byla prováděna při laboratorní teplotě. Mez detekce (L D ) byla určována z kalibračních závislostí v oblasti nízkých koncentrací jako množství analytu poskytující pík, jehož výška se právě rovná trojnásobku absolutní hodnoty šumu. Při vyhodnocování ploch píků byla mez detekce vypočtena z kalibračních závislostí pomocí software Adstat Calibration v. 1., TriloByte.

24 .4 Stálost zásobního roztoku,7-dinitro-9-fluorenonu Stálost zásobního roztoku studované látky o koncentraci.1-4 mol.l -1 v methanolu byla sledována spektrofotometricky v křemenných kyvetách o měrné tloušťce, cm. Referentní kyveta byla naplněna methanolem. Absorbance zásobního roztoku byla měřena při vlnové délce max (86 nm), kde studovaná látka vykazovala absorpční maximum. Absorpční spektrum studované látky je uvedeno na Obr. 1. Hodnota molárního absorpčního koeficientu ( ) při této vlnové délce činila 3, mol -1.L.cm -1. Výsledky měření stálosti zásobního roztoku jsou shrnuty v Tab. 3. Z výsledků v Tab. 3 vyplývá, že v zásobním roztoku,7-dnfn v methanolu, uchovávaném za nepřístupu světla, nedošlo během 1 roku k významnému poklesu koncentrace studované látky. Je tedy patrné, že zásobní roztok je při uchování ve tmě dostatečně stálý. Tab. 3 Spektrofotometrické studium stálosti zásobního roztoku,7-dnfn o koncentraci.1-4 mol.l -1 v methanolu. Číselné hodnoty udávají relativní hodnotu absorbance v % proti hodnotě absorbance čerstvě připraveného roztoku ( max = 86 nm). Dny A 86 1,33 1,33 1,315 1,34 1,3 1,31 1,35 [%] 1, 1, 99,4 98,6 98,4 99, 98,6 3

25 1,6 A, AU 1,,8,4, Obr , nm Absorpční spektrum roztoku,7-dnfn (c =.1-4 mol.l -1 ) v methanolu. Měřeno proti methanolu v křemenných kyvetách o měrné tloušťce, cm. 4

26 3. Polarografické a voltametrické stanovení,7-dinitro-9-fluorenonu na rtuťových elektrodách 3.1 DC tast polarografie,7-dinitro-9-fluorenonu Vliv ph na chování,7-dnfn při DCTP na DME byl sledován ve směsi methanolu a BR pufru o příslušném ph ( 1) v poměru (1:1). Koncentrace látky byla mol.l -1. Zaznamenané polarografické křivky ukazuje Obr.. Na změřených polarogramech lze pozorovat 3 dobře vyvinuté ireverzibilní vlny. Při ph a 3 lze na změřených polarogramech rozlišit 3 vlny, při ph 4 až 7 lze rozlišit vlny (při ph 4 je první vlna nerozštěpená a druhá vlna je částečně rozštěpená, při ph 5 až 7 je první vlna částečně rozštěpená a druhá vlna je nerozštěpená) a v rozmezí ph 8 1 lze rozlišit 3 vlny. Lze tedy předpokládat, že k redukci studované látky dochází ve dvou stupních, přičemž každému stupni odpovídá jedna vlna, která může být při určitých ph rozštěpena na vlny dvě 51. Limitní proud odpovídající prvnímu stupni je při c = mol.l -1 zhruba 4 na a vlna (ať již splynulá či rozštěpená) odpovídající tomuto ději leží v závislosti na ph v rozmezí potenciálů až 7 mv. Limitní proud odpovídající druhému ději je srovnatelný (úhrnný limitní proud obou dějů se pohybuje kolem -8 na) a odpovídající vlna (opět splynulá či rozštěpená) leží v závislosti na ph v oblasti potenciálů 3 až 11 mv. Pro přesnější interpretaci reakčního mechanismu elektrochemické redukce,7-dnfn byly změřeny DC tast polarogramy FN,,7-DNF a,7-dnfn o koncentraci mol.l -1 ve směsi methanolu a BR pufru o výsledném ph f,7 (viz Obr. 3), 7, (viz Obr. 4) a 11, (viz Obr. 5). Na polarografickém záznamu FN při ph f,7 je patrná vlna s E ½ ~ 73 mv, při ph f 7, s E ½ ~ 95 mv a při ph f 11, s E ½ ~ 17 mv. Tato vlna odpovídá -elektronové redukci karbonylové skupiny FN na 9-fluorenol 51. 5

27 Na polarografickém záznamu,7-dnf při ph f,7 (viz Obr. 3) je patrná jedna vlna s E ½ ~ 7 mv (jediná pozorovatelná vlna se slabým náznakem rozštěpení odpovídá 8-elektronové redukci dvou nitroskupin,7-dnf na dvě skupiny hydroxylaminové). Při ph f 7, (viz Obr. 4) jsou patrné vlny první vlna je mírně rozštěpená a leží kolem 44 mv (vlna odpovídá 8-elektronové redukci dvou nitroskupin,7-dnf na dvě skupiny hydroxylaminové), druhá vlna má E ½ ~ 71 mv (druhá vlna odpovídá 4-elektronové redukci dvou hydroxylamonivých skupin na dvě skupiny aminové) poměr výšky vln je asi :1. Při ph f 11, (viz Obr. 5) jsou patrné dvě vlny první vlna s E ½ ~ 64 mv (vlna odpovídá 4-elektronové redukci jedné nitroskupiny,7-dnf na hydroxylamin), druhá vlna s E ½ ~ 76 mv (vlna odpovídá 4-elektronové redukci druhé nitroskupiny,7-dnf na hydroxylamin) poměr výšky vln je asi 1:1. Při zkoumání elektrochemické redukce,7-dnfn bylo vycházeno z výše uvedených skutečností. Předpokládaný úhrnný reakční mechanismus redukce,7-dnfn je uveden na schématu B. Jedná se o 14-elektronovu redukci 51, jejíž jednotlivé kroky jsou popsány na schématech C až F. Na polarografickém záznamu,7-dnfn při ph f,7 (viz Obr. 3) jsou patrné tři vlny první vlna s E ½ ~ 14 mv (vlna se slabým náznakem rozštěpení odpovídá 8-elektronové redukci dvou nitroskupin,7-dnfn na dvě skupiny hydroxylaminové, viz schéma C a D), druhá vlna s E ½ ~ 37 mv (vlna odpovídá 4-elektronové redukci dvou hydroxylamonivých skupin na dvě skupiny aminové, viz schéma E) a třetí vlna s E ½ ~ 57 mv (vlna odpovídá -elektronové redukci karbonylové skupiny na sekundární alkohol, viz schéma F) poměr výšky vln je asi 4::1. Při ph f 7, jsou patrné vlny - první vlna je mírně rozštěpená a leží kolem 35 mv (vlna odpovídá 8-elektronové redukci dvou nitroskupin,7-dnfn na dvě skupiny hydroxylaminové, viz schéma C a D), druhá vlna má E ½ ~ 88 mv (vlna odpovídá současně 4-elektronové redukci dvou hydroxylamonivých skupin na dvě skupiny aminové, viz schéma E, a -elektronové redukci karbonylové skupiny na sekundární alkohol, viz schéma F) poměr výšky vln je asi 4:3. Při ph f 11, jsou patrné tři vlny první vlna s E ½ ~ 61 mv (vlna odpovídá 4-elektronové redukci jedné nitroskupiny 6

28 ,7-DNFN na hydroxylamin, viz schéma C), druhá vlna s E ½ ~ 7 mv (vlna odpovídá 4-elektronové redukci druhé nitroskupiny,7-dnfn na hydroxylamin, viz schéma D) a třetí vlna s E ½ ~ 111 mv (třetí vlna odpovídá současně 4-elektronové redukci dvou hydroxylamonivých skupin na dvě skupiny aminové, viz schéma E, a -elektronové redukci karbonylové skupiny na sekundární alkohol, viz schéma F) poměr výšky vln je asi ::3. Navrhovaný mechanismus elektrochemické redukce,7-dnfn uvedený na schématech B až F bude nutno ještě ověřit pomocí potenciostatické coulometrie a cyklické voltametrie. I, na E, mv Obr. Polarogramy,7-DNFN (c = mol.l -1 ) měřené technikou DCTP na DME v prostředí methanol BR pufr (1:1) o výsledném ph f,7 (1); 4,9 (); 7, (3); 9,3 (4); 1,4 (5). 7

29 -1 I, na Obr E, mv -13 Polarogramy základního elektrolytu (1), FN (),,7-DNF (3),,7-DNFN (4) (všechny látky o c = mol.l -1 ) měřené technikou DCTP na DME v prostředí methanol BR pufr (1:1) o výsledném ph f, I, na E, mv -1 Obr. 4 Polarogramy základního elektrolytu (1), FN (),,7-DNF (3),,7-DNFN (4) (všechny látky o c = mol.l -1 ) měřené technikou DCTP na DME v prostředí methanol BR pufr (1:1) o výsledném ph f 7,. 8

30 -16 I, na E, mv -13 Obr. 5 Polarogramy základního elektrolytu (1), FN (),,7-DNF (3),,7-DNFN (4) (všechny látky o c = mol.l -1 ) měřené technikou DCTP na DME v prostředí methanol BR pufr (1:1) o výsledném ph f 11,. 9

31 Schéma elektrochemické redukce,7-dinitro-9-fluorenonu O N NO + 14e H H O H 3 N + NH 3 + [B] O OH O N NO + 4e - + 5H + + H O HOH N + NO [C] O O HOH N + NO + 4e - + 5H + + H O HOH N + NH + OH [D] O O HOH N + + 4e - + 4H + + H O NH + OH H 3 N + NH 3 + [E] O O H 3 N + NH 3 + O + H + + e - H 3 N + NH 3 + OH [F] 3

32 Zjištěné závislosti I lim a E ½ na ph jsou zaznamenány v Tab. 4. Graficky je závislost E ½ na výsledném ph vodně-methanolického roztoku (ph f ) znázorněna na Obr. 6. Půlvlnový potenciál všech vln se s rostoucím ph posouvá k zápornějším hodnotám. Metodou lineární regrese byl pro závislost půlvlnového potenciálu první vlny na ph f roztoku v rozmezí ph f 8,7 1,4 vypočten vztah: E 1 ½ [mv] = 45,9 ph f 4,8 (korel. koef.,9618) Pro závislost půlvlnového potenciálu druhé vlny na ph f roztoku v rozmezí ph f 8,7 1,4 byl vypočten vztah: E ½ [mv] = 33,8 ph f 38,4 (korel. koef.,9477) Pro závislost půlvlnového potenciálu vlny vzniklé splynutím první a druhé vlny na ph f roztoku v rozmezí ph f,7 8, byl vypočten vztah: E 1+ ½ [mv] = 44,7 ph f 4,4 (korel. koef.,9994) Pro závislost půlvlnového potenciálu vlny vzniklé splynutím třetí a čtvrté vlny na ph f roztoku v rozmezí ph f 4,9 9,3 byl vypočten vztah: E 3+4 ½ [mv] = 67,1 ph f 376,4 (korel. koef.,978) Pro závislost půlvlnového potenciálu vlny vzniklé splynutím třetí a čtvrté vlny na ph f roztoku v rozmezí ph f 1,5 1,4 byl vypočten vztah: E 3+4 ½ [mv] = 3,7 ph f 975,53 (korel. koef.,9958) Vzhledem k rozdílnému polarografickému chování,7-dnfn v prostředích o různém ph byla pro proměření koncentrační závislosti vybrána tři prostředí o různých ph f. Koncentrační závislost byla měřena v roztocích, které obsahovaly methanol a BR pufr (1:1) o ph, 6 a 11 (ph f,7; 7, a 11,). Koncentrační závislosti byly proměřeny v rozmezí ( 1).1-6 mol.l -1 pro ph f,7 (viz Obr. 7, příslušná kalibrační závislost viz Obr. 8), ph f 7, (viz Obr. 9, příslušná kalibrační závislost viz Obr. 1) a ph f 11, (viz Obr. 11, příslušná kalibrační závislost viz Obr. 1). Při ph f,7 byl vyhodnocován I lim odpovídající splynulé první a druhé vlně (při potenciálu 3 mv), úhrnný I lim třetí vlny (při potenciálu 47 mv) a úhrnný I lim čtvrté vlny (při potenciálu 8 mv). Při ph f 7, byl vyhodnocován I lim odpovídající splynulé první a druhé vlně 31

33 (při potenciálu 5 mv) a úhrnný I lim odpovídající splynulé třetí a čtvrté vlně (při potenciálu 1 mv). Při ph f 11, byl vyhodnocován I lim první vlny (při potenciálu 55 mv), úhrnný I lim druhé vlny (při potenciálu 8 mv) a úhrnný I lim odpovídající splynulé třetí a čtvrté vlně (při potenciálu 1 mv). Parametry kalibračních přímek pro stanovení,7-dnfn metodou DCTP na DME jsou uvedeny v Tab. 5. Ze srovnání kalibračních závislostí v prostředí o ph f,7; 7, a 11, vyplývá, že při ph f,7 jsou největší směrnice kalibračních závislostí, meze stanovitelnosti jsou u všech proměřovaných ph f téměř stejné a na hodnotě ph f nezávislé. Při ph f 7, jsou úseky na ose mírně větší. Pro co nejcitlivější stanovení je výhodné použít vyhodnocení úhrnného limitního difusního proudu. 3

34 Tab. 4 Vliv ph na DCT polarogramy,7-dnfn (c = mol.l -1 ), měřeno v prostředí methanol BR pufr (1:1). ph a ph f -E ½ 1 [mv] -I lim 1 [na] -E ½ [mv] -I lim [na] -E ½ 1+ [mv] -I lim 1+ [na] -E ½ 3 [mv] -I lim 3 [na] -E ½ 4 [mv] -I lim 4 [na] -E ½ 3+4 [mv] -I lim 3+4 [na],,7 b b b b e e 3, 4, b b b b e e 4, 4,9 b b b b d d d d , 5,8 b b b b d d d d , 7, b b b b d d d d , 8, b b b b d d d d , 8, c c d d d d , 9, c c d d d d , 1, c c d d d d , 11, c c d d d d , 1, c c d d d d ph a ph použitého BR pufru, ph f výsledné ph směsi methanol BR pufr, E 1 ½ půlvlnový potenciál první vlny, I 1 lim limitní difusní proud první vlny, E ½ půlvlnový potenciál druhé vlny, I lim limitní difusní proud druhé vlny, E 1+ ½ půlvlnový potenciál vlny vzniklé splynutím první a druhé vlny, I 1+ lim limitní difusní proud vlny vzniklé splynutím první a druhé vlny, E 3 ½ půlvlnový potenciál třetí vlny, I 3 lim limitní difusní proud třetí vlny, E 4 ½ půlvlnový potenciál čtvrté vlny, I 4 lim limitní difusní proud čtvrté vlny, E 3+4 ½ půlvlnový potenciál vlny vzniklé splynutím třetí a čtvrté vlny, I 3+4 lim limitní difusní proud vlny vzniklé splynutím třetí a čtvrté vlny, b první a druhá vlna splývají, c první a druhá vlna jsou odděleny, d třetí a čtvrtá vlna splývají, e třetí a čtvrtá vlna jsou odděleny. 33

35 1 -E 1/, mv ph Obr. 6 Závislost půlvlnového potenciálu E ½ polarografických vln,7-dnfn (c = mol.l -1 ) na ph f roztoku, měřeno technikou DCTP na DME ve směsi methanol BR pufr (1:1). 1 půlvlnový potenciál první vlny (rozmezí ph f 8,7 1,4), - půlvlnový potenciál druhé vlny (rozmezí ph f 8,7 1,4), 3 - půlvlnový potenciál vlny vzniklé splynutím první a druhé vlny (rozmezí ph f,7 8,), 4 - půlvlnový potenciál třetí vlny (rozmezí ph f,7 a 4,), 5 - půlvlnový potenciál čtvrté vlny (rozmezí ph f,7 a 4,), 6 - půlvlnový potenciál vlny vzniklé splynutím třetí a čtvrté vlny (rozmezí ph f 4,9 9,3), 7 - půlvlnový potenciál vlny vzniklé splynutím třetí a čtvrté vlny (rozmezí ph f 1,5 1,4). 34

36 -16 I, na E, mv Obr. 7 Polarogramy,7-DNFN měřené technikou DCTP na DME v prostředí methanol BR pufr ph (1:1, ph f,7) v nejnižším dosaženém koncentračním rozmezí. c(,7-dnfn) = (1),.1-6 (), (3), (4), (5), (6) mol.l I lim, na c, mol.l -1 Obr. 8 Závislost proudu I lim na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DCTP na DME v prostředí methanol BR pufr ph (1:1, ph f,7), 1 I lim odpovídající splynulé 1. a. vlně, úhrnný I lim 3. vlny, 3 úhrnný I lim 4. vlny. 35

37 I, na E, mv Obr. 9 Polarogramy,7-DNFN měřené technikou DCTP na DME v prostředí methanol BR pufr ph 6 (1:1, ph f 7,) v nejnižším dosaženém koncentračním rozmezí. c(,7-dnfn) = (1),.1-6 (), (3), (4), (5), (6) mol.l I lim, na c, mol.l -1 Obr. 1 Závislost proudu I lim na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DCTP na DME v prostředí methanol BR pufr ph 6 (1:1, ph f 7,), 1 I lim odpovídající splynulé 1. a. vlně, úhrnný I lim odpovídající splynulé 3. a 4. vlně. 36

38 I, na E, mv -1 Obr. 11 Polarogramy,7-DNFN měřené technikou DCTP na DME v prostředí methanol BR pufr ph 11 (1:1, ph f 11,) v nejnižším dosaženém koncentračním rozmezí. c(,7-dnfn) = (1),.1-6 (), (3), (4), (5), (6) mol.l I lim, na c, mol.l -1 Obr. 1 Závislost proudu I lim na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DCTP na DME v prostředí methanol BR pufr ph 11 (1:1, ph f 11,), 1 I lim první vlny, úhrnný I lim druhé vlny, 3 úhrnný I lim odpovídající splynulé 3. a 4. vlně. 37

39 Tab. 5 Parametry kalibračních přímek pro stanovení,7-dnfn metodou DCTP na DME v prostředí methanol - BR pufr (1:1). c(,7-dnfn) = ( 1).1-6 mol.l -1. směrnice úsek korelační ph f [na.mol -1.L] [na] koeficient L Q [mol.l -1 ],7 a 4, ,4, ,7 b 9, ,9, ,7 c 1, ,, , a 3, ,5, , d 6, ,7, , e, ,8, , g 3, ,8, , d 6, ,4, a vyhodnocován I lim odpovídající splynulé první a druhé vlně, b vyhodnocován úhrnný I lim třetí vlny, c vyhodnocován úhrnný I lim čtvrté vlny, d vyhodnocován úhrnný I lim odpovídající splynulé třetí a čtvrté vlně, e vyhodnocován I lim první vlny, g vyhodnocován úhrnný I lim druhé vlny. 38

40 3. Diferenční pulsní polarografie,7-dinitro-9-fluorenonu Vliv ph na chování,7-dnfn při DP polarografii na DME byl studován ve směsi methanolu a BR pufru o příslušném ph ( 1) v poměru (1:1). Koncentrace látky byla mol.l -1. Zjištěné závislosti I p a E p na ph jsou zaznamenány v Tab. 6. Graficky je závislost E p na výsledném ph vodně-methanolického roztoku (ph f ) znázorněna na Obr. 13. Zaznamenané polarografické křivky ukazuje Obr. 14. Látka poskytuje v oblasti ph 3 čtyři píky (první dva píky jsou v celém rozsahu měřeného ph - 1 nerozdělené, třetí pík v oblasti ph 4 1 chybí), v oblasti ph 4 1 poskytuje látka tři píky. Potenciál všech píků se s rostoucím ph posouvá k zápornějším hodnotám. Metodou lineární regrese byl pro závislost potenciálu prvního píku na ph f roztoku v rozmezí ph f,7 1,4 vypočten vztah: E 1 p [mv] = 43,4 ph f 3, (korel. koef.,9983) Pro závislost potenciálu druhého píku na ph f roztoku byl v rozmezí ph f,7 1,4 vypočten vztah: E p [mv] = 56,1 ph f 1, (korel. koef.,9981) Pro závislost potenciálu čtvrtého píku na ph f roztoku byl v rozmezí ph f,7 7, vypočten vztah: E 4 p [mv] = 78,1 ph f 37, (korel. koef.,9999) Pro závislost potenciálu čtvrtého píku na ph f roztoku byl v rozmezí ph f 8, 1,4 vypočten vztah: E 4 p [mv] = 3, ph f 686, (korel. koef.,994) V prostředích methanol BR pufr (ph, 6 a 11), která byla optimální pro stanovení DCTP na DME, byly DP polarogramy také dobře vyhodnotitelné. Tato prostředí byla proto také použita pro proměření kalibračních závislostí. Byla proměřena koncentrační závislost v rozmezí ( 1).1-6 mol.l -1 pro ph f,7 (viz Obr. 15), 7, (viz Obr. 16) a 11, (viz Obr. 17) a v rozmezí ( 1).1-7 mol.l -1 pro ph f,7 (viz Obr. 18 a 19), 7, (viz Obr. a 1) a 11, (viz Obr. a 3). 39

41 Parametry kalibračních přímek pro stanovení,7-dnfn metodou DPV na DME jsou uvedeny v Tab. 7, 8 a 9. Ze srovnání kalibračních závislostí v prostředí o ph f,7; 7, a 11, vyplývá, že při ph f 7, jsou největší směrnice kalibračních závislostí i nejnižší meze stanovitelnosti. Pro koncentraci nižší než mol.l -1 nebylo již možné získané DP polarogramy vyhodnotit. Tab. 6 Vliv ph na DP polarogramy,7-dnfn (c = mol.l -1 ) na DME, měřeno v prostředí methanol BR pufr (1:1). ph a ph f -E p 1 [mv] -I 1 p [na] -E p [mv] -I p [na] -E p 3 [mv] -I 3 p [na] -E p 4 [mv] -I 4 p [na],, , 4, , 4, b b , 5, b b , 7, b b , 8, b b , 8, b b , 9, b b , 1, b b , 11, b b , 1, b b ph a ph použitého BR pufru, ph f výsledné ph směsi methanol BR pufr, E 1 p potenciál prvního píku, I 1 p proud prvního píku E p potenciál druhého píku, I p proud druhého píku E 3 p potenciál třetího píku, I 3 p proud třetího píku E 4 p potenciál čtvrtého píku, I 4 p proud čtvrtého píku b pík není patrný 4

42 1 -E p, mv ph Obr. 13 Závislost potenciálu píku E p,7-dnfn (c = mol.l -1 ) na ph f roztoku, měřeno technikou DPP na DME ve směsi methanol BR pufr (1:1), 1 první pík, druhý pík, 3 třetí pík, 4 čtvrtý pík (ph f,7 7,), 5 čtvrtý pík (ph f 8, 1,4). I, na Obr E, mv Polarogramy,7-DNFN (c = mol.l -1 ) měřené technikou DPP na DME v prostředí methanol BR pufr (1:1) o výsledném ph f,7 (1); 4,9 (); 7, (3); 9,3 (4); 1,4 (5). 41

43 6 -I p, na c, mol.l -1 Obr. 15 Závislost proudu I p na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DPP na DME v prostředí methanol BR pufr ph (1:1, ph f,7), 1 první pík, druhý pík, 3 třetí pík, 4 čtvrtý pík. 6 -I p, na c, mol.l -1 Obr. 16 Závislost proudu I p na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DPP na DME v prostředí methanol BR pufr ph 6 (1:1, ph f 7,), 1 první pík, druhý pík, 3 čtvrtý pík. 4

44 5 I p, na Obr c, mol.l -1 Závislost proudu I p na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DPP na DME v prostředí methanol BR pufr ph 11 (1:1, ph f 11,), 1 první pík, druhý pík, 3 čtvrtý pík. 43

45 -1 I, na E, mv -6 Obr. 18 Polarogramy,7-DNFN měřené technikou DPP na DME v prostředí methanol - BR pufr ph (1:1, ph f,7) v nejnižším dosaženém koncentračním rozmezí. c(,7-dnfn) = (1),.1-7 (), (3), (4), (5), (6) mol.l I p, na 4 4 3,,,4,6,8 1, c, mol.l -1 Obr. 19 Závislost proudu I p na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DPP na DME v prostředí methanol BR pufr ph (1:1, ph f,7), 1 první pík, druhý pík, 3 třetí pík, 4 čtvrtý pík. 44

46 -1 I, na Obr. -1 E, mv Polarogramy,7-DNFN měřené technikou DPP na DME v prostředí methanol - BR pufr ph 6 (1:1, ph f 7,) v nejnižším dosaženém koncentračním rozmezí. c(,7-dnfn) = (1),.1-7 (), (3), (4), (5), (6) mol.l I p, na ,,,4,6,8 1, c, mol.l -1 Obr. 1 Závislost proudu I p na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DPP na DME v prostředí methanol BR pufr ph 6 (1:1, ph f 7,), 1 první pík, druhý pík, 3 čtvrtý pík. 45

47 -8 I, na E, mv -11 Obr. Polarogramy,7-DNFN měřené technikou DPP na DME v prostředí methanol - BR pufr ph 11 (1:1, ph f 11,) v nejnižším dosaženém koncentračním rozmezí. c(,7-dnfn) = (1),.1-7 (), (3), (4), (5), (6) mol.l I p, na 1 4 3,,,4,6,8 1, c, mol.l -1 Obr. 3 Závislost proudu I p na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DPP na DME v prostředí methanol BR pufr ph 11 (1:1, ph f 11,), 1 první pík, druhý pík, 3 čtvrtý pík. 46

48 Tab. 7 Parametry kalibračních přímek pro stanovení,7-dnfn metodou DPP na DME v prostředí methanol BR pufr (1:1, ph f,7). c [mol.l -1 ] směrnice [na.mol -1.L] úsek [na] korelační koeficient L Q [mol.l -1 ] 1. pík ( 1).1-6 5, ,1,9999 ( 1).1-7 5, ,89, pík ( 1).1-6 5, ,6,9998 ( 1).1-7 5, ,4, pík ( 1).1-6 3, ,3,999 ( 1).1-7 3, ,5, pík ( 1).1-6 3, ,,999 ( 1).1-7 3, ,1, Tab. 8 Parametry kalibračních přímek pro stanovení,7-dnfn metodou DPP na DME v prostředí methanol BR pufr 6 (1:1, ph f 7,). c [mol.l -1 ] směrnice [na.mol -1.L] úsek [na] korelační koeficient L Q [mol.l -1 ] 1. pík ( 1).1-6 4, ,6,9999 ( 1).1-7 6, ,6, pík ( 1).1-6 3, ,1,9998 ( 1).1-7 6, ,7, pík ( 1).1-6 3, ,8,9997 ( 1).1-7 6, ,5,

49 Tab. 9 Parametry kalibračních přímek pro stanovení,7-dnfn metodou DPP na DME v prostředí methanol BR pufr 11 (1:1, ph f 11,). c [mol.l -1 ] směrnice [na.mol -1.L] úsek [na] korelační koeficient L Q [mol.l -1 ] 1. pík ( 1).1-6 4, ,,9999 ( 1).1-7 4, ,, pík ( 1).1-6 4, ,,9998 ( 1).1-7 5, ,5, pík ( 1).1-6, ,1,9993 ( 1).1-7, ,6,

50 3.3 Diferenční pulsní voltametrie,7-dinitro-9-fluorenonu na visící rtuťové kapkové elektrodě Vliv ph na chování,7-dnfn při DP voltametrii na HMDE byl studován ve směsi methanolu a BR pufru o příslušném ph ( 1) v poměru (1:1). Koncentrace látky byla mol.l -1. Zjištěné závislosti I p a E p na ph jsou zaznamenány v Tab. 1. Graficky je závislost E p na výsledném ph vodně-methanolického roztoku (ph f ) znázorněna na Obr. 4. Zaznamenané voltametrické křivky ukazuje Obr. 5. Látka poskytuje v oblasti ph 3 čtyři píky (první dva píky jsou v celém rozsahu měřeného ph - 1 nerozdělené, třetí pík v oblasti ph 4 1 chybí), v oblasti ph 4 1 poskytuje látka tři píky. Potenciál všech píků se s rostoucím ph posouvá k zápornějším hodnotám. Metodou lineární regrese byl pro závislost potenciálu prvního píku na ph f roztoku v rozmezí ph f,7 1,4 vypočten vztah: E 1 p [mv] = 43,5 ph f -,1 (korel. koef.,9985) Pro závislost potenciálu druhého píku na ph f roztoku byl v rozmezí ph f,7 1,4 vypočten vztah: E p [mv] = 48,1 ph f - 7,5 (korel. koef.,9936) Pro závislost potenciálu čtvrtého píku na ph f roztoku byl v rozmezí ph f,7 7, vypočten vztah: E 4 p [mv] = 8,1 ph f 86,8 (korel. koef.,9968) Pro závislost potenciálu čtvrtého píku na ph f roztoku byl v rozmezí ph f 8, 1,4 vypočten vztah: E 4 p [mv] = 7,7 ph f 717,8 (korel. koef.,984) Nejlépe vyhodnotitelné voltamogramy byly získány v roztoku, který obsahoval methanol a BR pufr o ph 11 a methanol (1:1). Koncentrační závislosti byly naměřeny v rozmezí ( 1).1-6 mol.l -1 (Obr. 6), ( 1).1-7 mol.l -1 (Obr. 7) a ( 1).1-8 mol.l -1 (Obr. 8 a Obr. 9). V koncentračním rozmezí ( 1).1-7 mol.l -1 je již třetí pík nevyhodnotitelný a pro vyhodnocení bylo použito prvního a druhého píku. V koncentračním rozmezí 49

51 ( 1).1-8 mol.l -1 je druhý pík deformovaný přítomností koincidujícího píku v samotném základním elektrolytu, jak je patrné z Obr. 8. Proto bylo pro vyhodnocení použito pouze prvního píku. Pro koncentraci nižší než.1-8 mol.l -1 již nebylo možno získané voltamogramy vyhodnotit. Parametry kalibračních přímek pro stanovení,7-dnfn metodou DPV na HMDE jsou uvedeny v Tab. 11. Tab. 1 Vliv ph na DP voltamogramy,7-dnfn (c = mol.l -1 ) na HMDE, měřeno v prostředí methanol BR pufr (1:1). ph a ph f -E p 1 [mv] -I 1 p [na] -E p [mv] -I p [na] -E p 3 [mv] -I 3 p [na] -E p 4 [mv] -I 4 p [na],, , 4, , 4, b b , 5, b b , 7, b b , 8, b b , 8, b b , 9, b b , 1, b b , 11, b b , 1, b b ph a ph použitého BR pufru, ph f výsledné ph směsi methanol BR pufr, E 1 p potenciál prvního píku, I 1 p proud prvního píku E p potenciál druhého píku, I p proud druhého píku E 3 p potenciál třetího píku, I 3 p proud třetího píku E 4 p potenciál čtvrtého píku, I 4 p proud čtvrtého píku b pík není patrný 5

52 1 -E p, mv ph Obr. 4 Závislost potenciálu píku E p,7-dnfn (c = mol.l -1 ) na ph f roztoku, měřeno technikou DPV na HMDE ve směsi methanol BR pufr (1:1), 1 první pík, druhý pík, 3 třetí pík, 4 čtvrtý pík (ph f,7 7,), 5 čtvrtý pík (ph f 8, 1,4). -5 I, na Obr E, mv Voltamogramy,7-DNFN (c = mol.l -1 ) měřené technikou DPV na HMDE v prostředí methanol BR pufr (1:1) o výsledném ph f,7 (1); 4,9 (); 7, (3); 9,3 (4); 11, (5). 51

53 5 -I p, na Obr c, mol.l -1 Závislost proudu I p na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DPV na HMDE v prostředí methanol BR pufr ph 11 (1:1, ph f 11,), 1 první pík, druhý pík, 3 čtvrtý pík. 4 -I p, na 1 3 1,,,4,6,8 1, c, mol.l -1 Obr. 7 Závislost proudu I p na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DPV na HMDE v prostředí methanol BR pufr ph 11 (1:1, ph f 11,), 1 první pík, druhý pík. 5

54 -13 I, na E, mv -65 Obr. 8 Voltamogramy,7-DNFN měřené technikou DPV na HMDE v prostředí methanol BR pufr ph 11 (1:1, ph f 11,) v nejnižším dosaženém koncentračním rozmezí. c(,7-dnfn) = (1),.1-8 (), (3), (4), (5), (6) mol.l I p, na 3 1,,,4,6,8,1 c, mol.l -1 Obr. 9 Závislost proudu I p (první pík) na koncentraci,7-dnfn v rozmezí mol.l -1. Měřeno technikou DPV na HMDE v prostředí methanol BR pufr ph 11 (1:1, ph f 11,). 53

55 Tab. 11 Parametry kalibračních přímek pro stanovení,7-dnfn metodou DPV na DME v prostředí methanol - BR pufr 11 (1:1, ph f 11,). c [mol.l -1 ] směrnice [na.mol -1.L] úsek [na] korelační koeficient L Q [mol.l -1 ] 1. pík ( 1).1-6 3, ,1,9995 ( 1).1-7 3, ,,999 ( 1).1-8, ,1, pík ( 1).1-6, ,9,9994 ( 1).1-7, ,3, pík ( 1).1-6 5, ,5,

56 3.4 Adsorpční rozpouštěcí voltametrie,7-dinitro-9-fluorenonu na visící rtuťové kapkové elektrodě Vliv ph na chování,7-dnfn při AdSV na HMDE byl studován ve směsi methanolu a BR pufru o příslušném ph ( 1) v poměru (1:9). Bylo pracováno při konstantní době akumulace 6 s v míchaném roztoku. Koncentrace látky byla.1-7 mol.l -1. Potenciál akumulace byl měněn od + mv při ph až po 4 mv při ph 1 tak, aby potenciál akumulace byl vždy před nástupem odpovídající vlny. Zjištěné závislosti I p a E p na ph jsou zaznamenány v Tab. 1. Graficky je závislost E p na výsledném ph vodně-methanolického roztoku (ph f ) znázorněna na Obr. 3. Zaznamenané voltametrické křivky ukazuje Obr. 31. Látka poskytuje v oblasti ph 4 7 tři píky, první pík chybí v oblasti ph 3 (látka poskytuje dva píky), třetí pík chybí v oblasti ph 8 1 (látka poskytuje dva píky). Potenciál všech píků se s rostoucím ph posouvá k zápornějším hodnotám. Metodou lineární regrese byl pro závislost potenciálu prvního píku na ph f roztoku v rozmezí ph f 4,1 1, vypočten vztah: E 1 p [mv] = 39,1 ph f - 4,5 (korel. koef.,9967) Pro závislost potenciálu druhého píku na ph f roztoku byl v rozmezí ph f, 1, vypočten vztah: E p [mv] = 47,8 ph f - 41,5 (korel. koef.,997) Pro závislost potenciálu třetího píku na ph f roztoku byl v rozmezí ph f, 7, vypočten vztah: E 3 p [mv] = 73,9 ph f - 375,3 (korel. koef.,9951) Nejlépe vyhodnotitelné voltamogramy byly získány v roztoku, který obsahoval methanol a BR pufr o ph 11 (1:9). Vyhodnocován byl první pík (nejvyšší a nejlépe vyvinutý). Vliv potenciálu akumulace na výšku píku byl proměřen v rozmezí 1 až 5 mv v prostředí methanol BR pufr o ph 11 (1:9) s koncentrací,7-dnfn.1-7 mol.l -1. Roztok byl při akumulaci míchán a doba akumulace byla 6 s. Jako optimální hodnota potenciálu akumulace bylo vybráno 3 mv. Při tomto 55