Stanovení α-amylázy v moči

Transkript

1 Stanovení α-amylázy v moči α-amyláza je produkována především pankreatem a také ve slinných žlázách a normálně je odváděna do zažívacího traktu. Do krve se dostává fyziologicky jen nepatrné množství. Vzhledem k tomu, že α-amyláza má poměrně malou molekulu, prochází glomerulární filtrací do moči. A) Kinetické stanovení α amylázy Princip metody: Pro stanovení enzymové aktivity α-amylázy se používá syntetický substrát 4-nitrofenyl-maltoheptaosid-etylidenu. α-amyláza jej štěpí na menší oligosacharidy, které jsou hydrolyzovány alfa-glukosidázou za uvolnění 4-nitrofenolu. Katalytická koncentrace je určena stupněm vzniku 4-nitrofenolu a měří se při 405 nm. Pracovní postup: 1. Fotometr ECOM E 6125 zapněte hlavním vypínačem na zadní straně a zapněte tiskárnu. 2. Pomocí tlačítka Absorbance zvolte šipkami vlnovou délku 405 nm a potvrďte tlačítkem Enter. 3. Několikrát propláchněte kyvetu fotometru destilovanou vodou. 4. Proveďte měření slepého vzorku (destilovaná voda) tlačítkem Blank a potvrďte tlačítkem Enter. Kyvetu opět několikrát propláchněte destilovanou vodou. 5. Příprava vzorku do zkumavky Eppendorf automatickou pipetou napipetujte 100 µl vzorku moči a 1000 µl pracovního roztoku. Promíchejte a přepipetujte do kyvety. Na stopkách spusťte čas. Ve 2., 3., 4., a 5. minutě stlačte tlačítko Enter (tisk absorbance A), nebo odečtěte absorbanci na displeji fotometru. Po ukončení měření vzorek moči odstraňte z kyvety a několikrát kyvetu propláchněte destilovanou vodou. 6. Zkontrolujte vytištění výsledků, vypněte fotometr. 7. Ze získaných hodnot vypočtěte průměr A /min a dosazením do vzorce vypočítejte aktivitu α - amylázy ve vzorku moči. Výpočet aktivity α amylázy v moči při reakční teplotě 37 C: A 1 = A 2 A 1 A 2 = A 3 A 2 A 3 = A 4 A 3 průměr A /min = A 1 + A 2 + A 3 / 3 µkat/l = A /min x 105,9 (koeficient přepočtu) U/L = A /min x 6384 (koeficient přepočtu) Referenční hodnoty při 37 C: µkat/l = 0,26-8,15 U/L =

2 B) Wohlgemuthova metoda Princip: α-amyláza štěpí škrob, jehož hydrolýzu sledujeme reakcí s jodem. Moč zředíme geometrickou řadou a zjišťujeme poslední zředění, v němž ještě došlo k hydrolýze škrobu. Výhodou metody je to, že nevyžaduje téměř žádné laboratorní zařízení. Ředění moči geometrickou řadou (kvocient ½) 1) Ve stojánku máte 10 zkumavek. Do všech kromě první dejte 1 ml fyziol. roztoku (0,9% NaCl). Jak můžete postupovat: Pomocí skleněné pipety (10 ml) a balónku - Skleněnou pipetu naplňte po horní značku (tj. bude v ní 10 ml), do jednotlivých zkumavek budete upouštět vždy po 1 ml. Tedy jedno naplnění pipety bude stačit na všech 9 zkumavek. K dispozici je i automatická pipeta (1000 µl) s příslušnou špičkou. Fyziologický roztok (1ml) 2) Do 1. a 2. zkumavky odměřte po 1 ml moči (skleněná pipeta - tenká - na objem 1 ml, balónek). Moč (1ml) 3) Obsah 2. zkumavky promíchejte a přeneste z ní 1 ml do 3. zkumavky, opět promíchejte a 1 ml přeneste do 4. zkumavky atd., takže po promíchání se přenáší vždy 1 ml do následující zkumavky, z poslední zkumavky pak odebraný přebytečný 1 ml vylijte do odpadu. 1 ml

3 Tím jste dosáhli geometrického ředění (s kvocientem ½), tzn. že v každé další zkumavce je vždy poloviční koncentrace než v té předcházející viz obr.: 1 ½ ¼ atd. 1x 2x 4x 8x 16x 32x 64x atd. ř. ř. ř. ř. ř. ř. ř. 4) Do každé zkumavky přidejte 2 ml roztoku škrobu a nechte celou řadu zkumavek inkubovat 15 minut ve vodní lázni při 45 C. 5) Vyjměte zkumavky z vodní lázně, nechte je vychladnout. 6) Do každé zkumavky přidejte kapku roztoku jodu a obsah promíchejte. V posledních zkumavkách zpravidla zůstane nehydrolyzovaný škrob, takže se v nich vyvine tmavě modré zbarvení jodoškrobové reakce. Zajímá nás poslední zkumavka, v níž ještě proběhla hydrolýza, tj. v níž není přítomno modročerné zbarvení. 7) Výsledek se udává ve Wohlgemuthových jednotkách (W.j.). Při postupu, který jsme použili, získáte výsledek tak, že faktor ředění v poslední zkumavce, kde ještě proběhla hydrolýza, vynásobíte dvěma. Př.: jedná-li se o zkumavku č.4 --> ředění 8x --> 8 x 2 = 16 W.j.

4 1. Příprava enzymového preparátu sacharázy Specifita enzymů Přibližně 0,5 g kvasnic suspendujte ve 2 ml destilované vody. Příprava enzymového preparátu α-amylázy viz návod k úloze: Závislost aktivity α-amylázy na ph prostředí 2. Připravte si sadu 8 zkumavek, do kterých napipetujte roztoky dle tabulky: Lihovým fixem zkumavky očíslujte a označte je tak, abyste si je poznali (iniciály). ENZYM SUBSTRÁT α-amyláza 0,5 0,5 0, sacharáza ,5 0,5 0,5 - - destil. voda ,5 0,5 POVAŘENÍ - - ANO - - ANO škrob 2,0-2,0-2,0-2,0 - sacharosa - 2,0-2,0-2,0-2,0 Všechny zkumavky inkubujte 30 minut ve vodní lázni při 37 o C. Obsah každé zkumavky rozdělte přibližně na 2 poloviny. (do paralelní řady 8 zkumavek přelijte vždy asi polovinu obsahu příslušné zkumavky) Jedna sada zkumavek: Proveďte Fehlingovu reakci. Druhá sada zkumavek: Přidejte 5 ml destilované vody, kapku jodu a promíchejte. Výsledek Fehlingovy reakce Zbarvení vzniklé s jodem Úkoly: a) Zdůvodněte výsledky Fehlingovy reakce a reakce s jodem v jednotlivých zkumavkách. b) Do protokolu zapište ve strukturních vzorcích schéma hydrolýzy škrobu α-amylázou a sacharosy kvasničnou sacharázou. Vyznačte vazby, které uvedené enzymy hydrolyzují.

5 Závislost aktivity α-amylázy na ph prostředí 1. Příprava sady zkumavek s pufry o různém ph Do sady 7 zkumavek připravených ve stojánku napipetujte složky pufrů podle tabulky: Lihovým fixem zkumavky očíslujte a označte je tak, abyste si je poznali (iniciály). Číslo zkumavky Na 2 HPO 4 (ml) kys. citronová (ml) ph 1 2,9 2,1 5,6 2 3,1 1,9 6,0 3 3,5 1,5 6,4 4 3,8 1,2 6,8 5 4,3 0,7 7,2 6 4,7 0,3 7,6 7 4,9 0,1 7,8 2. Do každé zkumavky přidejte 1 ml roztoku škrobu. 3. Příprava enzymového preparátu α-amylázy Odběr slin provedete pomocí soupravy Salivette. Odzátkujte zkumavku, vyjměte z vrchní části žvýkací váleček a jemně žvýkejte nebo převalujte v ústech po dobu asi 1 minuty, aby došlo k nasátí slin do válečku. Vatový váleček pak vložte zpět do příslušné centrifugační zkumavky a uzavřete víčkem. Zkumavku odevzdejte laborantce. K získání vzorku slin se provede odstředění po dobu 2 minut při rychlosti ot./min. Do čisté zkumavky napipetujte 6 ml destilované vody, přidejte 0,5 ml sliny získané výše uvedeným postupem a otáčením zkumavky obsah promíchejte. Tím získáte zředěnou slinu, kterou budete používat jako enzymový preparát α-amylázy (i pro úlohu : Specifita enzymů!). 4. Do každé ze sedmi připravených zkumavek (obsahujících stejné množství substrátu škrobu, ale lišících se v ph) napipetujte 0,5 ml připraveného enzymového preparátu α-amylázy. 5. Celou sadu sedmi zkumavek umístěte do vodní lázně zahřáté na 37 o C. Od okamžiku vložení do vodní lázně začněte měřit čas. 6. Aktivita α-amylázy v připraveném enzymovém preparátu se může vzorek od vzorku velmi lišit. Pro vyhodnocení experimentu bude nutné ze zkumavek inkubovaných ve vodní lázni odebírat opakovaně vzorky v časových intervalech zhruba 5-10 minut (v žádném případě ne delších!). Odběr vzorků a vyhodnocování Z každé zkumavky inkubované ve vodní lázni odpipetujte 1 ml roztoku do další čisté označené zkumavky. Zbytek směsi nechte dále inkubovat ve vodní lázni (pro případné další odběry). K odebraným vzorkům přidejte 5 ml destilované vody, kapátkem kapku roztoku jodu a důkladně obsah zkumavek promíchejte. Proveďte zhodnocení. Není-li vyhodnocení ještě možné (ve všech zkumavkách je stále přítomen nehydrolyzovaný škrob), pokračujte v odběrech nových vzorků ze zkumavek inkubovaných ve vodní lázni (viz bod 6 návodu). Otázky: a) Které ph je pro aktivitu α-amylázy nejvhodnější? b) Jaké barvu poskytuje jod se škrobem a jaké barvy vznikají s hydrolytickými produkty? Uveďte pořadí, v jakém se vyskytují s postupující hydrolýzou. Použité roztoky: 1. 1% roztok škrobu (nepufrovaný) 2. roztok jodu 3. Na 2 HPO 4 (0,2 mol/l) 4. kyselina citronová (0,1 mol/l)