ENZYMOLOGIE - praktikárna Chanos

Transkript

1 ENZYMOLOGIE - praktikárna Chanos 1. Specifita enzymů (sacharáza, α-amyláza) Závislost enzymů na ph (α-amyláza) Stanovení α-amylázy v moči (EPS, Wohlgemuthova metoda) 2. Stanovení Michaelisovy konstanty kyselé fosfatázy Sledování aktivity katalázy 3. Stanovení aktivity laktátdehydrogenázy v séru Sledování aktivity aminotransferáz ALT a AST v jaterním extraktu Stanovení aktivity alkalické fosfatázy v séru 4. Sledování aktivity mitochondriální sukcinátdehydrogenázy, inhibice reakce malonátem Stanovení aktivity aldolázy Sledování aktivity mléčné xanthin-oxidoreduktázy

2 Závislost aktivity α-amylázy na ph prostedí Závislost aktivity enzymu na ph má obvykle Gaussovo rozložení a proto enzym vykazuje maximální aktivitu v relativn úzkém rozmezí hodnot ph. Tato oblast se oznauje jako optimální rozmezí ph pro daný enzym, nkdy se vztahuje pímo ke konkrétní hodnot ph. Obvykle se však uvádí rozmezí hodnot ph, kdy se s 95% pravdpodobností dosáhne jeho maximální aktivity. Slinná -amyláza se inaktivuje pi ph 4,0 a nižším, což znamená, že v kyselém prostedí žaludku se její úinek zastaví. Pankreatická -amyláza má ph optimum 7,1. Roztoky: 1% roztok škrobu (nepufrovaný) roztok jodu Na 2 HPO 4 (0,2 mol/l) kyselina citronová (0,1 mol/l) 1. Do sady 7 zkumavek pipravených ve stojánku napipetujte složky pufr podle tabulky. Lihovým fixem zkumavky oíslujte a oznate je tak, abyste si je poznali (iniciály). íslo zkumavky Na 2 HPO 4 (ml) kys. citronová (ml) ph 1 2,9 2,1 5,6 2 3,1 1,9 6,0 3 3,5 1,5 6,4 4 3,8 1,2 6,8 5 4,3 0,7 7,2 6 4,7 0,3 7,6 7 4,9 0,1 7,8 2. Do každé zkumavky pidejte 1 ml roztoku škrobu. 3. Píprava enzymového preparátu α-amylázy: Odbr slin provedete pomocí soupravy Salivette. Odzátkujte zkumavku, vyjmte z vrchní ásti žvýkací váleek a jemn žvýkejte nebo pevalujte v ústech po dobu asi 1 minuty, aby došlo k nasátí slin do váleku. Vatový váleek pak vložte zpt do píslušné centrifuganí zkumavky a uzavete víkem. Zkumavku odevzdejte laborantce. K získání vzorku slin se provede odstední po dobu 3 minut pi rychlosti 2000 ot./min. Všechny sliny nepipetujte do isté zkumavky a pidejte 6 ml destilované vody, otáením zkumavky obsah promíchejte. Tím získáte zednou slinu, kterou budete používat jako enzymový preparát α-amylázy (i pro úlohu: Specifita enzym!). 4. Do každé ze sedmi pipravených zkumavek (obsahujících stejné množství substrátu škrobu, ale lišících se v ph) napipetujte 0,5 ml pipraveného enzymového preparátu α-amylázy. 1

3 5. Celou sadu sedmi zkumavek umístte do vodní lázn zaháté na 37 o C. Od okamžiku vložení do vodní lázn zante mit as. 6. Aktivita α-amylázy v pipraveném enzymovém preparátu se mže vzorek od vzorku velmi lišit. Pro vyhodnocení experimentu bude nutné ze zkumavek inkubovaných ve vodní lázni odebírat opakovan vzorky v asových intervalech zhruba 5-10 minut (v žádném pípad ne delších!). 7. Odbr vzork a vyhodnocování: Z každé zkumavky inkubované ve vodní lázni odpipetujte 1 ml roztoku do další isté oznaené zkumavky. Zbytek smsi nechte dále inkubovat ve vodní lázni (pro pípadné další odbry). K odebraným vzorkm pidejte 5 ml destilované vody, kapátkem kapku roztoku jodu a dkladn obsah zkumavek promíchejte. Provete zhodnocení. Není-li vyhodnocení ješt možné (ve všech zkumavkách je stále pítomen nehydrolyzovaný škrob), pokraujte v odbrech nových vzork ze zkumavek inkubovaných ve vodní lázni (viz bod 6 návodu). 2

4 Specifita enzym Sacharáza je enzym, který štpí disacharid sacharózu na glukózu a fruktózu. Sacharáza vzniká v enterocytech tenkého steva. Sacharáza z kvasnic (invertáza) je zamena na -glykosidovou vazbu (jde o -fruktofuranosidázu, její systematický název je -Dfruktofuranosid-fruktohydroláza). Tím se liší od sacharázové aktivity tenkého steva savc, která patí mezi -glykosidázy. -amyláza štpí -1,4-glukosidové vazby polysacharid. Výsledkem hydrolytického štpení škrobu je maltóza. Maltóza je redukující cukr. Redukující sacharidy jsou schopny za vyšších teplot redukovat ionty tžkých kov (nap. Ag+, Cu2+, Bi3+). Enzymová hydrolýza škrobu prochází rznými stádii, která se projeví také reakcí s jodem. Škrob se barví jódem temn mode, štpné polysacharidy dextriny fialov (amylodextrin), purpurov až erven (erytrodextrin), pop. se nebarví jódem vbec (achrodextrin). Souasn pibývá redukujících cukr ve smsi. Roztoky: roztok škrobu pekaské kvasnice Lugolv roztok (roztok jodu roztok jódu v jodidu draselném) roztok Fehling I a Fehling II 1. Píprava enzymového preparátu sacharázy: Na hodinovém sklíku máte pibližn 0,5 g kvasnic, ke kterému pidejte 2 ml destilované vody a pomocí tyinky rozpuse. 2. Píprava enzymového preparátu α-amylázy: viz návod k úloze: Závislost aktivity α-amylázy na ph prostedí 3. Pipravte si sadu 8 zkumavek, do kterých napipetujte roztoky dle tabulky. Lihovým fixem zkumavky oíslujte a oznate je tak, abyste si je poznali (iniciály). ENZYM SUBSTRÁT α-amyláza 0,5 0,5 0, sacharáza ,5 0,5 0,5 - - destil. voda ,5 0,5 POVAENÍ - - ANO - - ANO škrob 2,0-2,0-2,0-2,0 - sacharóza - 2,0-2,0-2,0-2,0 Všechny zkumavky inkubujte 30 minut ve vodní lázni pi 37 o C. Obsah každé zkumavky rozdlte pibližn na 2 poloviny. (do paralelní ady 8 zkumavek pelijte vždy asi polovinu obsahu píslušné zkumavky) 1

5 Jedna sada zkumavek: Prove te Fehlingovu reakci: smíchejte 3 ml roztoku Fehling I a 3 ml roztoku Fehling II; do každé zkumavky pidejte 0,5 ml Fehlingova roztoku a povate. Druhá sada zkumavek: Pidejte 5 ml destilované vody, kapku jodu a promíchejte. Výsledek Fehlingovy reakce Zbarvení vzniklé s jodem 2

6 !!"# " $%! &$ # '!( # #))*+,- ( 1.. /012 / 345+ # ( # # 2. ( " 6 ( 3. 7## 4. 6 #), - 6 ( ' ## 5. 8!9 %! % :( ;!"!! #((,& -% (#! 6. #) (!! < # # 7. =! "# >% # $% = (!>#! " (,#))(#?@A0- BC 4 DC? &C 5 BC 5 DC &C? #$%&$!' BC? DC + &C ()!' B!* +,-./,)(-

7 Stanovení α-amylázy v moi (Wohlgemuthova metoda) α-amyláza je produkována pedevším pankreatem a také ve slinných žlázách a normáln je odvádna do zažívacího traktu. Do krve se dostává fyziologicky jen nepatrné množství. Vzhledem k tomu, že α-amyláza má pomrn malou molekulu, prochází glomerulární filtrací do moi. α-amyláza štpí škrob, jehož hydrolýzu sledujeme reakcí s jodem. Mo zedíme geometrickou adou a zjišujeme poslední zední, v nmž ješt došlo k hydrolýze škrobu. Výhodou metody je to, že nevyžaduje tém žádné laboratorní zaízení. Roztoky: fyziologický roztok (0,9% NaCl) roztok škrobu roztok jodu vzorek vlastní moi ední moi geometrickou adou (kvocient ½) 1. Ve stojánku máte 10 zkumavek. Do všech krom první dejte 1 ml fyziologického roztoku. Jak mžete postupovat: Pomocí sklenné pipety (10 ml) a balónku - Sklennou pipetu naplte po horní znaku (tj. bude v ní 10 ml), do jednotlivých zkumavek budete upouštt vždy po 1 ml. Tedy jedno naplnní pipety bude stait na všech 9 zkumavek. K dispozici je i automatická pipeta (1000 µl) s píslušnou špikou. Fyziologický roztok (1 ml) 2. Do 1. a 2. zkumavky odmte po 1 ml moi (sklenná pipeta - tenká - na objem 1ml, balónek). Mo (1ml) 1

8 3. Obsah 2. zkumavky promíchejte a peneste z ní 1 ml do 3. zkumavky, opt promíchejte a 1 ml peneste do 4. zkumavky atd., takže po promíchání se penáší vždy 1 ml do následující zkumavky, z poslední zkumavky pak odebraný pebytený 1 ml vylijte do odpadu. 1 ml Tím jste dosáhli geometrického ední (s kvocientem ½), tzn. že v každé další zkumavce je vždy poloviní koncentrace než v té pedcházející viz obr.: 1 ½ ¼ atd. 1x 2x 4x 8x 16x 32x 64x atd Do každé zkumavky pidejte 2 ml roztoku škrobu a nechte celou adu zkumavek inkubovat 15 minut ve vodní lázni pi 45 C. 5. Vyjmte zkumavky z vodní lázn, nechte je vychladnout. 6. Do každé zkumavky pidejte kapku roztoku jodu a obsah promíchejte. V posledních zkumavkách zpravidla zstane nehydrolyzovaný škrob, takže se v nich vyvine tmav modré zbarvení jodoškrobové reakce. Zajímá nás poslední zkumavka, v níž ješt probhla hydrolýza, tj. v níž není pítomno modroerné zbarvení. Výpoet: Výsledek se udává ve Wohlgemuthových jednotkách (W.j.). Pi postupu, který jsme použili, získáte výsledek tak, že faktor ední v poslední zkumavce, kde ješt probhla hydrolýza, vynásobíte dvma. P.: jedná-li se o zkumavku.4: ední 8x 8 x 2 = 16 W.j. Wohlgemuthovy jednotky (W.j.) numericky odpovídají pibližnkat amylázy / l. 2

9 Stanovení Michaelisovy konstanty (K M ) kyselé fosfatázy Fosfatázy štpí esterové vazby fosforené kyseliny, takže uvolují fosfát a píslušný alkohol. Pro sledování enzymové aktivity je výhodné použít syntetický substrát, který umožní pímé fotometrické stanovení: O 2 N PO - H O 4 2 O 2 N OH HPO 2-4 p-nitrofenylfosfát (bezbarvý) p-nitrofenol (žlutý v alkalickém prostedí) Reakci provedeme pi rzných koncentracích substrátu a budeme sledovat závislost rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu a graficky vyjádíme v systému dvojích reciprokých hodnot. Roztoky: citrátový pufr ph 4,96 (pibližn 0,01 mol/l) roztok substrátu (4-nitrofenolát, sodná sl) 2,5 mmol/l v citrátovém pufru inhibiní roztok (0,1 mol/l NaOH 0,03 mol/l EDTA) roztok enzymu (kyselá fosfatáza v eppendorfce ) Pette celý návod ped zahájením vlastní práce! K dosažení dobrých výsledk je nutné pipetovat pesné objemy roztok a dodržovat dobu inkubace! 1. Do stojánku pipravte a oznate 10 zkumavek. 2. Mechanickými mikropipetami napipetujte podle následující tabulky nejdíve citrátový pufr a teprve potom substrát (lze použít stejnou špiku na pipetu), po dokonení práce špiku vyhote. Zkumavka Citrátový pufr [µl] Substrát [µl] Sadu zkumavek umístte do vodní lázn 37 C teplé a nechte je pedehát 5 minut. Mezitím pineste enzym z ledniky (kyselá fosfatáza v Eppendorf zkumavce), pipravte stopky a pipetu na 50 µl s istou špikou. 4. Další práci zorganizujte tak, že jeden student(ka) pipetuje enzym a druhý student(ka) mí as a hlásí jej tak, aby pipetování enzymu probhlo v naprosto pesných 20 sekundových intervalech. Pipetující student/ka nejprve nasaje roztok enzymu do špiky pipety, pak vyjme první zkumavku z vodní lázn, zavede špiku pipety do zkumavky asi 0,5 cm nad hladinu, ale substrátu se nesmí dotknout. Z této vzdálenosti vypustí enzym do roztoku substrátu (nikoliv tedy na stnu zkumavky) a ve stejný 1

10 moment druhý student/ka stiskne stopky. Zkumavkou pak lehce zatepe a okamžit ji vrátí do vodní lázn. Stopky necháme bžet po celou dobu pokusu. 5. Pipravte další enzym a druhou zkumavku, do které pesn za 20 sekund rovnž pidejte enzym a tak pokraujte. Intervaly mezi jednotlivými zkumavkami musí být vždy stejné!!! 6. Pipravte inhibiní roztok, který ukoní enzymovou reakci. Láhev je opatena dávkovaem. Pesn za 10 minut od pidání enzymu do první zkumavky pidejte do téže zkumavky 2 ml inhibiního roztoku a promíchejte. Zkumavku již nevracejte do vodní lázn. Do dalších zkumavek pidávejte inhibiní roztok pesn ve stejných intervalech, jako jsme pidávali enzym, takže ve všech zkumavkách probíhá reakce naprosto stejnou dobu, tj. 10 minut. Po zpracování všech zkumavek stopky zastavte. 7. Zmte absorbanci všech vzork proti vod pi 405nm na fotometru. Mte od 1. do 10. zkumavky bez vyplachování kyvet, pouze je vylejte a obrácením a kontaktem s buniinou odsajte tekutinu. 8. Zmené hodnoty vložte do tabulky v poítai. Vypoítejte a vložte též koncentraci substrátu (p-nitrofenylfosfát) v každém reakním vzorku. Koncentrace základního roztoku substrátu je 2,5 mmol/l. Zmená absorbance je úmrná enzymové reakní rychlosti v každé zkumavce, protože reakní rychlost znamená množství pemnného substrátu za jednotku asu. V tomto pípad výsledek pedstavuje množství produktu vzniklého za 10 minut. Program vytvoí Lineweaverv-Burkv graf, tj. závislost 1/v na 1/[S] a zobrazí rovnici pro danou pímku. Výpoet: Michaelisovu konstantu zjistte výpotem z rovnice nebo odetením z grafu, kde ovšem teme hodnotu -1/K M. Zpracujte konený protokol, jehož ástí je výtisk tabulky a grafu. 2

11 Sledování aktivity katalázy Kataláza erytrocyt je souástí systému, který odbourává nežádoucí reaktivní formy kyslíku, respektive jejich produkty. Kataláza uvolnná z erytrocyt rozkládá peroxid vodíku. kataláza 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 Koncentraci substrátu, tj. peroxidu vodíku, stanovujeme manganometricky. Roztoky: roztok substrátu (0,01 mol/l peroxidu vodíku v 0,1 mol/l fosforenanového pufru ph 6,8) odmrný roztok KMnO 4 (0,32 g KMnO 4 do 1l) kyselina sírová (1 mol/l) roztok enzymu (hemolyzovaná krev 100x zedná) 1. Pipravte si 10 titraních bank, které oznaíte 0-9 a do každé pipravíte 2,5 ml kyseliny sírové. Kyselina sírová zastaví pozdji enzymovou reakci a je rovnž nezbytná pro manganometrické stanovení. 2. Pipravte enzymovou reakci: Do 100 ml Erlenmayerovy baky odmte 60 ml roztoku substrátu (pufrovaný roztok peroxidu vodíku) a vložte též magnetické míchadlo. Postavte na magnetickou míchaku, zapnte ji a seite míchání. 3. Pipravte si 5 ml pipetu na odbr vzork a provete první odbr, tj. penesete 5 ml substrátu do titraní baky. 0. Pipeta se nesmí kontaminovat kyselinou sírovou, jinak by se nedala použít pro další odbry. 4. Odmte 1 ml roztoku enzymu (hemolyzovaná krev 100x zedná) a pidejte k substrátu. V okamžiku pidání stisknte stopky a nechte je bžet. 5. Pipravte si 5 ml pipetu pro odebírání vzork a odebírejte vzorky v minutových intervalech a ihned penášejte do pipravených titraních bank. Rozhodujícím okamžikem není moment odebrání, nýbrž okamžik vypuštní obsahu pipety do baky s kyselinou sírovou, která zastavuje reakci. Tzn., že vzorek nasajete nkolik sekund ped celou minutou a obsah pipety vypustíte do baky pesn v urený moment. Všechny vzorky titrujte pomocí manganistanu a stanovte koncentraci substrátu (peroxidu vodíku) v jednotlivých vzorcích. 6. Zopakujte celý pokus s desetkrát zedným roztokem enzymu, tzn. celkové zední je 1000x, (1ml roztoku enzymu + 9 ml vody nebo pidejte k substrátu pouze 0,1 ml roztoku enzymu). 7. Hodnoty získané titrací vložte do tabulky v poítai pipravené v programu Excel. Program doplní hodnoty v tabulce a vytvoí grafické vyjádení zmn koncentrací substrátu na ase a zmn rychlosti enzymové reakce na ase. 8. Posute kinetiku a pokuste se odhadnout ád reakce. 9. Výtisk poítaového zpracování pipojte k vašemu protokolu.

12 Stanovení aktivity laktátdehydrogenázy v séru Laktátdehydrogenáza katalyzuje pemnu pyruvátu na laktát za souasné oxidace NADH na NAD +. Rychlost úbytku absorbance NADH pi 340nm se využívá ke kinetickému stanovení aktivity enzymu. Roztoky: pracovní roztok - 4 ml inidla R1 (tris 127 mmol/l, ph 7,2, NaCl 323 mmol/l, pyruvát 2,5 mmol/l) a 1 ml R2 (NADH 6,6 mmol/l) sérový standard vyšetované sérum 1. Zapnte fotometr Libra S 6 + (vyhívaný na 37 C). Dle piloženého návodu nastavte vlnovou délku 340nm. 2. Do fotometru vložte sklennou kyvetu urenou pro mení LDH. 3. Pomocí pipety 1000 µl napipetujte do kyvety slepý vzorek (destilovaná voda) a provete mení slepého vzorku A = 0, Sklennou kyvetu vyprázdnte a vložte zpt do fotometru. 5. Stanovení aktivity standardu: Do eppendorfky napipetujte 20 l standardu a 1000 l pracovního roztoku, spuste stopky, promíchejte roztok 2x nasátím do pipety na 1000 l a neprodlen vpravte do kyvety. Na konci 2., 3., 4. a 5. minuty stlate zelené tlaítko (pro mení absorbance) a na displeji fotometru odette absorbanci. Po zmení standardu obsah odstrate a kyvetu nkolikrát propláchnte destilovanou vodou. 6. Stanovení aktivity vzorku: Do eppendorfky napipetujte 20 l vzorku a 1000 l pracovního roztoku, spuste stopky, promíchejte roztok 2x nasátím do pipety na 1000 l a neprodlen vpravte do kyvety. Na konci 2., 3., 4. a 5. minuty stlate zelené tlaítko (pro mení absorbance) a na displeji fotometru odette absorbanci. Po analýze vzorku obsah odstrate a kyvetu nkolikrát propláchnte destilovanou vodou. 7. Získané hodnoty zadejte do pipravené tabulky v poítai (LD, letní semestr).

13 Stanovení aktivity ALT a AST v jaterním extraktu Metoda je založena na rozdílné svtelné absorpci 2,4-dinitrofenylhydrazon kys. 2- oxo-glutarové a pyrohroznové, která vzniká u reakce ALT pímo, u reakce AST po spontánní dekarboxylaci oxalacetátu. Pi sledování aktivity jaterního enzymového preparátu demonstrujeme pouze pítomnost aminotransferáz, pi vyšetení séra urujeme aktivitu z kalibraní kivky, sestrojené podle absorpcí rzn koncentrovaných hydrazon pyrohroznové kyseliny. Roztoky: substrát ALT (DL-alanin, 2-oxoglutarát, fosfátový pufr ph 7,4) substrát AST (L-aspartát, 2-oxoglutarát, fosfátový pufr ph 7,4) roztok 2,4-dinitrofenylhydrazinu (DNP-hydrazin rozpuštný za horka v HCl) NaOH (0,4 mol/l) fosforenanový pufr, ph 7,4 1. Do 4 pipravených zkumavek napipetujte roztoky dle tabulky: ALT AST pokusná porovnávací pokusná porovnávací substrát ALT 0,50 ml 0,50 ml - - substrát AST - - 0,50 ml 0,50 ml 2. Zkumavky preinkubujte 10 minut pi 37 o C ve vodní lázni. 3. Píprava jaterního extraktu (enzymového preparátu) (1x pro celý pracovní stl): Asi 1 cm 3 jaterní tkán (už pipraveno na pracovním stole) rozdrte v tecí misce, pidejte 5 ml fosforenanového pufru a ješt chvíli pokraujte v homogenizaci. Celý obsah tecí misky ( homogenát ) peneste do centrifuganí zkumavky a zkumavku odevzdejte laborantce (odstední 5min/2000 ot.). Supernatant použijete jako enzymový preparát. 4. Do vlastních pokusných zkumavek pidejte získaný enzymový preparát (jaterní extrakt): jaterní extrakt 0,10 ml - 0,10 ml - 5. Všechny 4 zkumavky inkubujte 30 minut pi 37 o C, pak pidejte do všech zkumavek roztok dinitrofenylhydrazinu: dinitrofenylhydrazin 0,50 ml 0,50 ml 0,50 ml 0,50 ml 6. Obsah zkumavek promíchejte a nechte stát 15 minut. 1

14 7. Do všech zkumavek napipetujte roztok NaOH: NaOH 5,00 ml 5,00 ml 5,00 ml 5,00 ml 8. Jaterní extrakt pidejte i do porovnávacích zkumavek: jaterní extrakt - 0,10 ml - 0,10 ml 9. Obsah zkumavek promíchejte. Na spektrofotometru pi nastavené vlnové délce 506nm zmte za 5 minut absorbanci zkumavky.1 proti zkumavce.2 (odpovídá aktivit ALT) a absorbanci zkumavky.3 proti zkumavce.4 (odpovídá aktivit AST). 10. Výslednou hodnotu aktivity ALT a AST odette z kalibraních graf. 11. Výsledek zhodnote. 2

15 Stanovení aktivity alkalické fosfatázy (ALP) v séru Alkalická fosfatáza (alkalická fosfohydroláza monoester kys. trihydrogenfosforené) štpí 4-nitrofenylfosfát na 4-nitrofenol a trihydrogenfosfát. Mírou aktivity enzymu je množství uvolnného 4-nitrofenolu, který se stanovuje fotometricky v alkalickém prostedí. Roztoky: pufr (roztok báze a hydrochloridu methylglutaminu s MgSO 4 ) substrát (dvojamonná sl 4-nitrofenylfosfátu s glukózou) zedný roztok inhibitoru (Chelaton 3 v NaOH) sérum (sérum najdete v malé plastové zkumavce - Eppendorf zkumavka) 1. Do 2 pipravených zkumavek napipetujte roztoky dle tabulky: Pi pipetování malého objemu séra je teba pracovat velice peliv, dbát na to, aby se sérum dostalo na dno zkumavky - sérum nesmí ulpt na stn zkumavky! zkumavka.1 vzorek zkumavka.2 porovnávací roztok pufr 1,00 ml 1,00 ml sérum 0,02 ml - 2. Obsah zkumavek promíchejte a peinkubujte 5 minut pi 37 o C ve vodní lázni. 3. Pidejte do obou zkumavek substrát: substrát 0,20 ml 0,20 ml 4. Inkubujte pesn 10 minut pi 37 o C, pak enzymovou reakci zastavte pidáním inhibitoru: inhibitor 0,50 ml 0,50 ml 5. Do zkumavky obsahující porovnávací roztok pidejte 0,02 ml séra: sérum - 0,02 ml Tím dosáhnete toho, že ob zkumavky obsahují to samé. Ale do zkumavky obsahující porovnávací roztok bylo sérum pidáno až po pidání inhibitoru. Enzym obsažený ve vyšetovaném séru tedy zpracovával substrát pouze ve zkumavce.1. ím více enzymu je ve vyšetovaném séru pítomno, tím více substrátu se ve zkumavce.1 pemnilo na barevný produkt. 6. Obsah zkumavek promíchejte. Na spektrofotometru pi nastavené vlnové délce 420nm zmte absorbanci (A) vzorku (zkumavka.1) proti porovnávacímu roztoku (zkumavka.2). 1

16 Výpoet: Výpoet katalytické koncentrace ALP ve vyšetovaném séru: Výsledek zhodnote. ALP (µkat/l) = A 10,236 2

17 Sledování aktivity mitochondriální sukcinátdehydrogenázy, inhibice reakce malonátem Aktivitu sukcinátdehydrogenázy budeme demonstrovat pímo na mitochondriích, a to pomocí umlého penašee elektron. Jako elektronový akceptor poslouží ferrikyanid draselný, ( ervená krevní sl ), který se pijetím elektron redukuje na ferrokyanid draselný ( žlutá krevní sl ). Tento pechod mžeme dobe fotometricky sledovat, je provázen blednutím žlutého roztoku ferrikyanidu. Vzhledem k tomu, že v mitochondriích jsou pítomny všechny lánky terminálních oxidací, je teba zabránit pestupu elektron z redukované formy koenzymu pirozenou cestou, tj. pes koenzym Q a cytochromy na kyslík. Tuto cestu zablokujeme v našem experimentu kyanidem draselným, který selektivn inhibuje cytochromový systém. sukcinát KCN 1/2 O 2 sukcinátdehydrogenáza 2e - cytochromy fumarát O 2- [Fe 3+ (CN) 6 ] [Fe 2+ (CN) 6 ] (syt žlutý) (svtle žlutý) Na takto uspoádaném pokusu mžeme snadno sledovat kinetiku enzymové reakce i úinky inhibitor, nap. kompetiního inhibitoru sukcinátdehydrogenázy, malonátu. (Ten se mj. uplatnil pi objevu metabolit citrátového cyklu.) Roztoky: ph roztok je upraveno na 7,2 sukcinát (jantaran) sodný (0,2 mol/l) kyanid draselný (0,1 mol/l) ferrikyanid draselný (0,01 mol/l) malonát sodný (0,01 mol/l) fosforenanový pufr ph 7,2 (0,1 mol/l) vzorek zmraženého srdce k píprav enzymového preparátu 1. Do 250 ml kádinky pipravte kostky ledu, které vyjmte z mrazniky, proudem vody je uvolnte ze zásobníku, pidejte trochu studené vody a máte tak pipravenu ledovou láze pro pípravu enzymového preparátu. 2. V kalibrované zkumavce naete fosforenanový pufr 5x destilovanou vodou (2ml pufru + 8 ml destilované vody), promíchejte a umístte do ledové lázn. 3. Píprava tkáového homogenátu ze zmražené srdení tkán: Preparát mitochondrií nesmí obsahovat ervené krevní a svalové barvivo (interferuje pi fotometrii), proto je nutno ješt ped vlastní homogenizací zbavit tká krve a hemoglobinu. Svalovinu rozstíhejte na kousky do vychlazené tecí misky, tlakem pestíku rozdrte a 2-3x suspendujte v ledovém zedném fosfátovém pufru. Tkáovou dr peneste do vychlazené centrifuganí zkumavky a krátce odstete (5min/2000 ot.). V prbhu pípravy preparátu mitochondrií jeden student ze skupiny pipraví reakní roztoky (bod 5 tohoto návodu). 1

18 4. Supernatant opatrn slijte do odpadu a sediment, který již musí být bezbarvý, vrate do tecí misky ke konené homogenizaci, kterou usnadníte pidáním sklenných stípk (použijte ochranné brýle!). Ke tkáové drti pak pidejte asi 3 ml vychlazeného zedného fosforenanového pufru, rozmíchejte a peneste do centrifuganí zkumavky. Odsteujte 5 minut pi 2000 otákách. Po odstední opatrn slijte supernatant, tvoený pedevším suspenzí mitochondrií. Ta pedstavuje náš enzymový preparát sukcinátdehydrogenázy. Mitochondrie jsou velmi choulostivé struktury, a proto je uchovávejte v ledové lázni. 5. Píprava základního roztoku: V Erlenmayerov bace smíchejte 3 ml kyanidu, 3 ml ferrikyanidu a 10 ml fosforenanového pufru (needného). 6. Do reakních zkumavek pipetujte roztoky podle schématu: Zkumavky základní roztok (ml) 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml - jantaran (ml) 1,0 ml 1,0 ml - - malonát (ml) - 0,5 ml 0,5 ml - destilovaná voda (ml) 0,5 ml - 1,0 ml 3,5 ml 7. Zapnte fotometr, nastavte vlnovou délku 415nm, a pipravte celkem 3 fotometrické kyvety a stopky. K fotometru peneste reakní zkumavky 1 4 ve stojánku, enzymový preparát v ledové lázni a pipetu na 0,5 ml. 8. Do zkumavky.4 (destilovaná voda) pidejte 0,5 ml enzymového preparátu, promíchejte a nalijte do kyvety. Tím jste pipravili slepý vzorek, proti nmuž nastavte fotometr na nulovou absorbanci. Zbylé dv fotometrické kyvety oznate na boku (matná plocha) íslicemi 1 a Do zkumavky.1 pidejte rovnž 0,5 ml enzymového preparátu, promíchejte a ihned naplte kyvetu. 1 a zmte její absorbanci v ase 0. V okamžiku zmení spuste stopky. Další student provede ihned zápis hodnoty absorbance, protože ta se rychle mní (klesá). 10. Rychle napipetujte 0,5 ml enzymového preparátu též do reakní zkumavky.2, promíchejte, naplte kyvetu.2, vložte do fotometru místo kyvety.1 a zmte absorbanci v kyvet.2. Okamžik mení musí být pesn 30 sekund po zmení zkumavky Pak opt kyvety vymte a pipravte se na zmení absorbance v kyvet.1 pesn 60 sekund po prvém mení. Mte tedy každou kyvetu v jednominutových intervalech, se vzájemným posunem o 30 sekund. Celkem provete 20 mení každé kyvety. 12. Zpracujte ješt reakní zkumavku.3, která je kontrolní, nebo neobsahuje substrát, pouze inhibitor. I k ní pidejte 0,5 ml enzymového preparátu a mte v minutových intervalech. Zde nepozorujeme pokles absorbance, jen nepatrný, který pedstavuje systematickou chybu metody. 13. Hodnoty absorbance všech 3 reakcí zapište do tabulky v programu Excel, který pak graficky reakci zpracuje. 14. Provete vyhodnocení a závr. 15. Peliv vymyjte kyvety, pipety a ostatní nádobí, uvete pracovišt do poádku. 2

19 Stanovení aktivity aldolázy Aldoláza štpí fruktózu-1,6-bisfosfát na glyceraldehyd-3-p a dihydroxyaceton-p, které dokážeme reakcí s dinitrofenylhydrazinem. Hemolýza ovlivuje výsledky vyplavením enzymu z ervených krvinek. Roztoky: roztok fruktóza-1,6-bisfosfát (0,02 mol/l) o ph 7,4 roztok kys. monojodoctové (0,002 mol/l, pomocí NaOH upraveno ph na 7,4) roztok hydrazinsulfátu (ph upraveno na 7,4) kollidinový pufr (2,4,6-trimethylpyridine, úprava ph na 7,4) roztok dinitrofenylhydrazinu ve 2M HCl kys. trichloroctová roztok NaOH (3%) sérum hemolyzované sérum 1. Napipetujte do 4 centrifuganích zkumavek: zkumavka. 1 pokusná zkumavka. 2 slepá zkumavka. 3 pokusná zkumavka. 4 slepá kollidinový pufr 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml sérum 0,2 ml 0,2 ml - - hemol. sérum - - 0,2 ml 0,2 ml hydrazinsulfát 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml kys. monojodoctová 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml kys. trichloroctová - 0,4 ml - 0,4 ml 2. Zkumavky promíchejte, nechte pedehát 5 minut ve vodní lázni 37 C teplé. 3. Do všech zkumavek pidejte 0,1 ml roztoku fruktóza-1,6-bisfosfát, promíchejte a inkubujte ve vodní lázni pi 37 C 20 min. Ve zkumavkách s pidanou kys. trichloroctovou reakce neprobíhá. 4. Po ukonení inkubace pidejte 0,4 ml kys. trichloroctové i do zkumavek. 1 a 3. Sraženinu protein odstrate ve všech zkumavkách odstedním (10 min/2500 ot.). 5. Pipravíme 4 stejn oznaené tenkostnné zkumavky. Ze supernatantu po odstední odebereme po 0,5 ml a peneseme do tchto nových zkumavek. Mezi jednotlivými odbry pipetu vyplachujeme nasátím destilované vody. 6. Do všech zkumavek odmíme 0,5 ml 3% roztoku NaOH a sms necháme stát 5 min pi laboratorní teplot.

20 7. Nyní pidáme do každé zkumavky 0,5 ml dinitrofenylhydrazinu a dkladn promícháme. Zkumavky peneseme do vodní lázn 37 C teplé, po 5 minutové inkubaci pidáme ješt 3 ml 3% NaOH a vzorky ponecháme dalších 5 minut stát pi laboratorní teplot. 8. Intenzitu zbarvení zjistíme promením pokusných zkumavek proti slepým v 1 cm kyvetách pi 540nm. Výpoet aktivity aldolázy: [kat/l] = A x 0,98 Zhodnote své výsledky a urete, o kolik procent se liší aktivita aldolázy v hemolyzovaném séru. Referenní hodnota: do 50 nkat/l

21 Sledování aktivity mléné xanthinoxidoreduktázy Xanthinoxidoreduktáza (XOR) je komplexní molybden obsahující flavoprotein. Xanthinoxidoreduktáza v mléce oxiduje v tomto pokusu formaldehyd na kyselinu mravení a elektrony pedává methylenové modi, která tím pechází na redukovanou (bezbarvou) leukoformu. Jestliže obsah zkumavky protepeme, vzdušný kyslík regeneruje leukoformu na pvodní oxidovanou methylenovou mod. To mžeme opakovat až do vyerpání formaldehydu. Popsanou reakci je možno použít jako jednoduchý test na pasterizaci i povaení mléka. Vyšší teploty zpsobí denaturaci xanthinoxidázy, takže pidání formaldehydu odbarvení methylenové modi nemže vyvolat. Roztoky: roztok methylenové modi 0,01% roztok formaldehydu 2,0% nepasterizované mléko 1. Odmte do 4 zkumavek: Zkumavky erstvé mléko 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml Zkumavky. 3 a 4 povate nad kahanem (opatrn!), ímž zdenaturujeme enzym. Dále pidávejte dle schématu: Methylenová mod 5 kapek 5 kapek 5 kapek 5 kapek Formaldehyd 5 kapek - 5 kapek - 2. Všechny zkumavky protepejte a umístte do vodní lázn 37º C. Sledujte, ve které zkumavce dojde k odbarvení a zdvodnte pro. 3. Zkumavku, ve které došlo k úplnému odbarvení, vyjmte z lázn a energicky protepejte až do zmodrání obsahu. Pak pokraujte v inkubaci. 4. Vykejte opt do úplného odbarvení, znovu protepejte. Celý cyklus opakujte nkolikrát, až se methylenová mod pestane odbarvovat v dsledku úplného vyerpání zásoby substrátu. 5. Pesvdte se, že po pidání nkolika dalších kapek formaldehydu pone reakce probíhat znovu.