GENETIKA BAKTERIÍ CENTRÁLNÍ DOGMA G-C A-T STRUKTURA DNA MIKROBIÁLNÍ DNA REPLIKACE DNA. retroviry

Transkript

1 GENETIKA BAKTERIÍ DNA transkripce RNA translace PRT. retroviry replikace RNA viry CENTRÁLNÍ DGMA ŘETĚZEC ssdna PÁRVÁNÍ BASÍ DVUŠRUBVICE dsdna REPLIKACE SEMIKNZERVATIVNÍ STRUKTURA DNA T A G C Ade Thy Cyt Gua 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' H P P P H P P P H A-T G-C MIKRBIÁLNÍ DNA CHRMSMÁLNÍ DNA: VELIKST: E.coli 1,4mm Člověk 1,8m BEZ JADERNÉ MEMBRÁNY UZAVŘENÝ KRUH DVUŠRUBVICE Borrelia: lineární molekula DNA NADŠRUBVICVÉ USPŘÁDÁNÍ INTERAKCE S BAZICKÝMI PRTEINY (ne histony) EXTRACHRMSMÁLNÍ DNA: PRFÁGY PLASMIDY TRANSPSMY REPLIKACE DNA RYCHLST: E.coli bp/s (1) Euk bp/s ( ) JEDEN REPL. PČÁTEK MDEL Y-VIDLICE BUSMĚRNÁ ( Θ-struktura) VIDLICE + REPLIKAČNÍ ENZYMY JSU ASCIVÁNY S PLAZMATICKU MEMBRÁNU (oddělení chromosomů) MDEL RTUJÍCÍH KLEČKA (rolling-circle) KNJUGACE FÁG ΦX174 1

2 SCHEMA REPLIKACE MECHANISMUS REPLIKACE T A G C Ade Thy Cyt Gua 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' H P P P H P P P H DNA PLYMERASA SYNTHESA DNA v 5 3 SMĚRU (volný 3 -H) DNA TEMPLÁT (3 5 vlákno), dxtp DNApol I (doplnění DNA po primeru, PRAVY, 400 molek/buň) DNApol II (SS opravy DNA, 100 molekul/buňku) DNApol III (REPLIKACE, 10 molekul/buňku) Chyba 3x10-5 HELIKASA RZPLÉTÁNÍ DVUŠRUBVICE RYCHLST kbp/s, ATP-dependentní SSB proteiny (single-strand DNA binding proteins) TPISMERASA UVLŇVÁNÍ NADŠRUBVICVÉ STRUKTURY MECHANISMUS REPLIKACE DNA GYRASA TVRBA NADŠRUBVICVÉ STRUKTURY PRIMSM-PRIMASA SYNTHESA RNA PRIMERU RNasa H DSTRANĚNÍ PRIMERU DNA LIGASA SPJENÍ KAZAKIH FRAGMENTŮ BAKTERIE (NAD + dep.), EUK. (ATPdep) ANTIBITIKA RIFAMPICIN: blokace primasy (RNApol), β-subj. H N R AKTINMYCIN D CH 3 KYS. NALIDIXVÁ: inhibice α-subjednotky gyrasy CUMERMYCIN: inhibice β-subjednotky gyrasy (ATPasa) CHRMMYCIN, AKTINMYCIN D: interkaláty DNA N H N R CH 3 TRANSKRIPCE A TRANSLACE TĚSNĚ NÁSLEDUJÍCÍ PRCESY STRUKTURA GENMU, BEZ MEMBRÁNY REGULACE ATENUACÍ (Trp-operon E.coli) TRANSKRIPCE (PŘEPIS GEN.INFRMACE D RNA) RNA polymerasa TRANSLACE (PŘEKLAD GEN.INFRMACE mrna D SEKVENCE PRTEINU) RIBSM PRIBNW BX SHINE-DALGARN Seq. GENE BLAST BLAST TTGACA TATAAT ATG PRMTR INICIACE TRANSKRIPCE INICIACE TRANSLACE RNApol mrna 16S rrna/ribsm PRTEIN 2

3 TRANSKRIPCE RNA polymerasa E.coli aktivních/7000molekul Rychlost 40nk/sec při 37C, chyba kDa, podjednotky: Katalytická část: α 2 ββ Regulace: σ-faktor Terminace transkripce tvorbou vlásenky Vlásenka a 6U PolyU a ρ-faktor Rifampicin: vazba na β-podjednotku CH 3 CH 3 H H 3 C H H 3 C H H H 3 C NH H 3 C H 3 C H N N CH 3 N H 3 C CH 3 RNA polymerasa 480kDa, podjednotky: Katalytická část: α 2 ββ α - rozpoznání promotoru a regulace β - vazba ribonukleotidů β - vazba DNA ω - správná struktura enzymu a asociace podjednotek σ-faktor (rozpozná počátek genu, promotor, a po počátku transkripce oddisociuje) Vlásenka a 6U PolyU a ρ-faktor Terminace transkripce REGULACE TRANSKRIPCÍ modifikace RNApol (sigma podjednotky, ADP-ribosilace) variace promotoru (rozdílná vazebná interakce) Genová indukce katabolická indukce β-galaktosidasy laktosou Genová represe katabolická represe Glc lac-operonu, DIAUXIE (dvojrůst) TRANSCRIBED GENES Trp- operon, His-operon TRANSCRIBED GENES REG P GENES REG P GENES active inducer inactive NT TRANSCRIBED GENES mrna REG P GENES active N mrna inactive NT TRANSCRIBED GENES co mrna REG P GENES inactive active N mrna 3

4 Teorie lac-pernu NC1965, F Jacob, A Lwoff, J Monod "for their discoveries concerning genetic control of enzyme and virus synthesis" E.coli lac transtription-control genes - laktosa, + glukosa dostatek ATP + laktosa, + glukosa dostatek ATP -glukosa, + laktosa nedostatek ATP ATP se štěpí na camp interakce camp s CAP proteinem (catabolite activator protein), vazba na promotor zesílení interakce RNApol s promotorem Lac-PERN CAPsite P GENES acap camp RNApol ncap mrna PŘEKLAD KDN AMINKYSELINA 64 kodonů = 61aa + 3STP STP: UAA, UAG, UGA START: Methionin AUG bčas prok. GUG/euk. CUG NC1968, RW Holley, HG Khorana, MW Nirenberg"for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis" mrna 20 aa-trna syntetáz RIBSM 70S (2,8milDa) MALÁ PDJEDNTKA: 30S (16SrRNA, 21 PRTEINŮ) VELKÁ PDJEDNTKA: 50S (5SrRNA, 23SrRNA, 31 PRTEINŮ) TRANSLACE INICIACE TRANSLACE INICIAČNÍ FAKTRY IF-1, IF-2, IF-3 mrna (AUG) PDJEDNTKY RIBSMU fmet-trna GTP) Tetracyklin reversibilní vazba na 30S, ne AA-tRNA Aminoglykosid ireversibilní vazba na 30S, ne IK TRANSLACE: elongace a terminace ELNGAČNÍ FAKTRY EF-Tu, EF-Ts (GTP, aa-trna) EF-G (GTP, posun po mrna) Chloramfenikol: reversibilní vazbana50s, ne transpeptidace Makrolidy a linkosamidy: ireversibilní vazba na 50S, ne translokace po mrna TERMINAČNÍ FAKTRY RF-1, RF-2 (vazba UAA, UAG, UGA) RF-3 (GTP, štěpení proteintrna) 4

5 REGULACE SUHRU TRANSKRIPCE S TRANSLACÍ Trp-PERN 4 MÍSTA PR TVRBU VLÁSENKY MÍST 1 BSAHUJE Trp KDNY VLÁSENKA 3-4 a polyu TERMINACE (a) BEZ RIBSMU, VLÁSENKA 1-2 A 3-4, TERMINACE (b) NEDSTATEK TrptRNA, PMALÁ TRANSLACE, VLÁSENKA 2-3, TRANSLACE PRBĚHNE (c) DSTATEK Trp-tRNA, VLÁSENKA 3-4, TERMINACE ATENUACE REGULACE ENZYMVÝCH REAKCÍ FEED BACK 1954 Novick, Szilard: syntesa Trp v E.coli) zpětnovazebná inhibice E1 produktem D, A (E1) B (E2) C (E3) D + indukce E1 katabolitem A ALLSTERIE 1963 Monod, Changuex, Jacob: allosterie (E1 má regulační místo pro D) KVALENTNÍ MDIFIKACE fosforylace/defosf. adenylace: glutamin syntetasa E.coli, vstup amonných iontů do metabolismu ADP-ribosylace: alfa podjednotka RNApol do 4minut po infekci E.coli T4fágem ox./red. SH-skupin: pyruvát lyasa E.coli RYCHLST DEGRADACE diferenciace (sporulace), hladovění, stres (ATPdependentní proteasy) REGULACE ENZYMVÝCH REAKCÍ RYCHLST SYNTÉZY ENZYMU: transkripce: teorie PERNU modifikace RNApol (sigma podjednotky) variace promotoru (rozdílná vazebná interakce) negativní regulace em (indukce lac-operon, represe his-operon) positivní regulace na promotoru (katabolická represe Glc, DIAUXIE) translace: interakce mrna a ribosomu (frekvence iniciace rozdílnou komplementaritou mrna s 3 koncem 16SrRNA) Souhra transkripce a translace: atenuace (syntéza Trp) CHYBY DNA CHYBY PŘI REPLIKACI: E.coli: 10-9 /REPLIKVANÉ bp, 10-6 /GEN/GENERACE CHYBĚJÍCÍ BASE: DEPURINACE ZMĚNA BASE NA ŠPATNU SPNTÁNNÍ DEAMINACE C U A hypoxanthine UV-INDUKVANÉ PIRIMIDIN DIMERY cyclobutan nebo 6-4 fotoprodukt ŠPATNÁ REPLIKACE (inkorporace) tautomerní formy basí imino forma adeninu - cytosin enol forma thyminu - guanin 5

6 PREREPLIKAČNÍ PRAVNÉ SYSTÉMY DNA FTREAKTIVACE DNA FTLYASA ŠTĚPÍCÍ TT- PYRIMIDIN DIMER NUTNÉ UV FADH 2 EXCISE DNApol III 3 5 EXNUKLEASVÁ AKTIVITA ε- PDJ. DNApol III LIGASA PSTREPLIKAČNÍ PRAVY DNA PSTREPLIKAČNÍ EXCISE ENDNUKLEASY uvrabcd ATPdep (uvrab-scan, UvrBCexonukleasa/12-13bp, UvrD-helikasa) DNApol I a LIGASA ŠPATNÉ PÁRVÁNÍ: muthls methylace Ade v sekvenci GATC DNA adenin methylasa (dam) DSTRANĚNÍ ŠPATNÉ INKRPRACE (U) Uracil-DNA N-glycosylasa a APIRIMIDINVA endonukleasa DNApol I A LIGASA DSTRANĚNÍ REPLIKAČNÍ MEZERY REKMBINACÍ PRTEIN reca: VAZBA VLNÉ ssdna, NAJITÍ SESTERSKÉ DNA, ŠTĚPÍ HMLGNÍ REGIN DNApol I A LIGASA INDUCIBILNÍ SS PRAVY PRTEIN reca VÁŽE ssdna A STÁVÁ SE PRTELYTICKY AKTIVNÍ K REPRESRU lexa REGULUJE (reca, uvra,b,c,...) PRAVA NÁCHYLNÁ K ZMĚNÁM: MUTACE>> ZASTAVENÍ muthls versus SS REKMBINACE Dle legitimity LEGITIMNÍ MÍST HMLGIE DNA PRDUKTY recgenů NELEGITIMNÍ HMLGIE TRANSPNVATELNÝCH ELEMENTŮ Dle výměny ss/dsdna BUSTRANNÁ (HLLIDAY MDEL) JEDNSTRANNÁ (BĚHEM TRANSFRMACE) PDMÍNKY REKMBINACE BAKTERIE: HAPLIDNÍ, ASEXUÁLNÍ DĚLENÍ, BEZ MEISY REPLIKACE PRŮNIK DNRVÉ DNA (ZABRÁNĚNÍ DEGRADACE ENDNUKLEASAMI) Integrace do genomu (homologie) Simulace genomu (plasmid) 6

7 JEDNSTRANNÉ REKMBINACE PŘI PŘENSU DNA ASCIACE HMLGNÍCH SEKVENCÍ (RecA) SEPARACE A PÁRVÁNÍ ŘETĚZCŮ ŠTĚPENÍ ENDNUKLEASU DPLNĚNÍ MEZER (DNApol-I) A LIGACE PŘENS DNA KNJUGACE (přenos mezi bakteriemi) TRANSFRMACE (průnik fragmentu volné DNA) TRANSDUKCE (transport DNA bakteriofágem) KNJUGACE 1946 J.Ledeberg, E.L.Tatum Plasmid F+ Polární nereciproční přenos F + donor F - akceptor Častá frekvence, bez přenosu genomu host. Extrachromosomální F faktor (plasmid) Nositel genů pro F-pilus a přenos plasmidu (tra- operon) Replikace rolling-circle (?) Přenos přes pilus X jiný mechanismus Plasmid Hfr (high frequency of recombination) Rekombinace a integrace F-plasmidu do chromosomu hostitele Častý přenos chromosomu hostitele 100min/E.coli nekompletní přenos F-fakt. F - akceptor F konjugace Integrace plasmidu do chromosomu host. Špatné vyštěpení plasmidu: F plasmid, přenos několika genů hostitele Po přenosu akceptor (recipient) částečně diploidní merozygot Přednostní přenos některých genů (sexdukce) Užití pro gen. mapping (studium uspořádání genů v chromosomu) KMPETENTNÍ BUŇKY APARÁT PR PŘENS FRAGMENTU DNA D BUŇKY INDUKCE EXTRACEL. Ca 2+ TRANSFRMACE PLASMIDY 1949 Cavali-Sforza a Heston Kruhová dsdna ( Da, nk, genů) geny vlastní replikace, distribuce do dceřiných b., konjugační pili (u autonomě přenosných plasmidů) vlivnění fenotypu nositele Kryptické: geny pouze pro plasmid vlivňující fenotyp hostitele F (fertilisační faktor: sex pilus, konjugace) R (resistence na ATB) Col (bakteriociny: coliciny, vibriony, pesticiny, pyociny), Tox (toxiny) Vir (adherační fimbrie, kolonizační faktory) Hly (hemolysiny) Deg (kuriozní zdroje C, siderofory, redukce těžkých kovů) Inkompatibilita (neslučitelnost podobných plasmidů) 7

8 TRANSPRT DNA bakteriofágem PŘI SBALVÁNÍ HLAVIČKY (2% NAVÍC) REKMBINACE S GENMEM A SBALENÍ VĚTŠÍ ČÁSTÍ GENMU GENVÉ IN.: VNESENÍ DNA D HSTITELE TRANSDUKCE VIRY PŘEDNÁŠKA VIRLGIE SYSTÉM: s obálkou DNA RNA dsdna dsrna Plasmaviridae (L2) SSV1 group Lipothrixviridae Cystoviridae (o6) bez obálky Corticoviridae (PM2) Tectiviridae (PRD1) Myoviridae, isomeric head (P2) Myoviridae, elongated head (T2, T4) dsdna ssdna ssrna Siphoviridae (λ, T5) Podoviridae (T3, T7) Microviridae (ΦX174) Inoviridae, Plectrovirus (L51) Inoviridae, Inovirus (fd) Leviviridae (MS2, Qβ) Metody molekulární biologie Vlastnosti DNA/RNA párování bazí, ds/ss, rekombinace (NC1980, P.Berg "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-dna ) ELEKTRFRÉZA V AGARZVÉM GELU SUTHERN BLT+NTHERN BLT sekvenace (NC1980, W. Gilbert, F. Sanger "for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids") Enzymy endo/exonukleasy, ligasy, (NC1978 W. Arber, D. Nathans, H.. Smith "for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics") polymerasy (PCR, RT-PCR) (NC1993, Kary B. Mullis "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method") Vektory manipulace s DNA insertem plasmidy, fágy/kosmidy, YAC Multienzymové komplexy: Proteosynthesa (in vivo, in vitro) rekombinantní protein Replikace DNA v plasmidu (mini/maxi prep) cdna insertu Genomová knihovna uchováni a selekce genu/insertu Restrikční endonukleasy - bakterie chrana před virovou (fágovou) infekcí Naštěpení cizorodé DNA, odbourání pomocí exonukleas chrana vlastní DNA methylací: Ade-NH-CH3, Cyt-(5)-CH3 Typy RE (3) Typ I (endonukleasa + methyltransferasa) Štěpí (náhodně?) v místě vzdáleném od rozpoznávané sekvence nejméně 1000 bp Typ III (endonukleasa + methyltransferasa) Štěpí v místě vzdáleném od rozpoznávané sekvence nejméně bp Typ II (endonukleasa only) Štěpí v místě rozpoznávané sekvence EcoRI: E rod, co druh, R sérotyp/kmen (kmen RY13), I pořadí objevu Četnost mist v genomu: 4 n = počet nukleotidů počet nukleotidů v rozpoznávací sekvenci Palindromová sekvence většina rozpoznávaných sekvencí 8

9 Nosiče klonovací vektory Plasmidy kruhová dsdna 1-200kbp max 10kbp insert (díky času replikace, náhodné delece) MINI/MAXI PREP KLNVACÍ/SEKVENAČNÍ/EXPRESNÍ PLASMID TRANSFRMACE DEFINVANÝCH KMENŮ Bakteriofágy lin./circ. dsdna, do hlavičky 36-51kbp) bakteriofág λ (48,5kbp): max 16 kbp insertu do střední části fágu Kosmidy: sekvence 14bp na obou koncích, důležité při balení DNA max 49kbp insertu bakteriofág M13: circ. ssdna max 1kbp insertu YAC (yeast artificial chromosome) lin dsdna, max insert 100kbp 9