J02 Kultivace bakterií a kvasinek

Transkript

1 VLLM0421c (jaro 2016) J02 Kultivace bakterií a kvasinek

2 Osnova množení mikrobů, růstová křivka výživa mikrobů a podmínky kultivace kultivace tekuté půdy pevné půdy očkování na pevné půdy 2/38

3 Množení bakterií binární dělení (mitóza je složitější proces typický pro většinu eukaryot) mitochondrie se množí také binárním dělením generační doba (doba od vzniku nové buňky do jejího rozdělení ve dvě buňky dceřinné) E. coli: generační doba 20 (až 70) minut čas nutný pro replikaci DNA 41 minut (nová replikace ale může začínat dříve, než je předchozí ukončena) v rostoucí bakterii mohou být před rozdělením více než dva jaderné ekvivalenty) 3/38

4 Růstová křivka 4/38

5 Růstová křivka (2) lag fáze (počáteční, latence) bakterií nepřibývá (adaptace na nové prostředí, přechod z klidového metabolismu na metabolismus aktivně se množící buňky) log fáze (exponenciální, logaritmická) množení bakterií geometrickou řadou s kvocientem 2 stacionární fáze rychlost přibývání a odumírání buněk jsou si rovny vyčerpání limitující živiny, nahromadění toxických zplodin metabolismu fáze odumírání hynutí bakterií (vysoká koncentrace zplodin) 5/38

6 Množení kvasinek nemnoží se binárním dělením, eukaryota nepohlavní rozmnožování: pučení (1) pohlavní rozmnožování: konjugace (2) dvou buněk (haploidní, opačné párovací typy) zygota (diploidní) spory (3) sporulace častá při nedostatku živin 6/38

7 Výživa bakterií (obecně) zdroj energie, elektronů, uhlíku, dusíku, dalších biogenních prvků a případné růstové faktory teplota ph dostupnost vody osmotický tlak oxidoredukční potenciál každý mikrob má své růstové optimum, meze růstu (rozuměj množení) a meze přežití rozdíly v růstových podmínkách mikrobů se využívají také v diagnostice! 7/38

8 Výživa bakterií klinicky významné druhy většina je chemoheterotrofní (zdroj E a C organické sloučeniny) akceptory elektronů: fermentace (akceptor elektronů vzniká katabolismem a nemusí být přítomen v prostředí) např. pyruvát laktát (mléčné kvašení) aerobní respirace (konečným akceptorem je O 2 ) anaerobní respirace (konečným akceptorem je kyslíkatá sloučenina, ne přímo O 2 ) NO 3 -, NO 2 - SO 2-4 H 2 S CO 2 CH4 N 2 O a N 2 (denitrifikace) fumarát sukcinát 8/38

9 Výživa bakterií klinicky významné druhy (2) vztah bakterií ke kyslíku: aerobní a fakultativně anaerobní (případně aerotolerantní) bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry striktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku bakterie se speciálními nároky na kyslík: mikroaerofilní snížená tenze O2 kapnofilní zvýšená tenze CO2 9/38

10 Pěstování anaerobních bakterií anaerostat, anaerobní box medmicro.info 10/38

11 Výživa bakterií klinicky významné druhy (3) teplota: zpravidla okolo 37 C ptačí patogeny okolo 42 C (Campylobacter sp.) mikroby pocházející z vnějšího prostředí okolo 30 C chladničkové teploty snáší dobře listerie, kvasinky a plísně ph: vyžadují kolem ph 7 acidofily se lépe množí při ph < 7 (lactobacily ph 6, tolerují i ph 3, helikobaktery žijící v žaludku ještě méně) alkalofily se lépe množí při ph > 7 (Vibrio cholerae optimum mezi 7,4 a 9,6, některé entrokoky se množí až do ph 11) 11/38

12 Výživa bakterií klinicky významné druhy (4) osmotický tlak v praxi nejčastěji koncentrace NaCl běžně koncentraci NaCl okolo 0,9 % (fyziologický roztok) halotolerantní druhy: stafylokoky (množí se do 10 % NaCl) enterokoky (množí se do 6,5 % NaCl) halofilní druhy: vibria (některé druhy nevyrostou, pokud není přítomno alespoň 1 % NaCl) 12/38

13 Výživa bakterií klinicky významné druhy (5) oxidoredukční potenciál kladný potenciál = prostředí je oxidující (aerobní podmínky), běžné půdy E h = mV záporný potenciál = prostředí je redukující (anaerobní podmínky) půdy pro anaerobní kultivaci: přelité vrstvou sterilního oleje, možné přidat i malé množství agaru (obojí snižuje prostupnost kyslíku) přidané redukující látky (glukóza, L-cystein, kys. askorbová thioglykolát sodný atp.) 13/38

14 Důvody kultivace mikrobů udržení mikrobů při životě a pomnožení kultivace na tekutých a pevných půdách získání kmene pouze pevné půdy vzájemné odlišení a oddělení mikrobů (diagnostické a selektivní půdy, sloužící k identifikaci) vzorek = odebráno pacientovi, přichází na vyšetření do laboratoře (kusový či tekutý materiál ) kmen = izolát (čistá kultura jednoho druhu mikroba) 14/38

15 Kolonie útvar na povrchu pevné půdy pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) CFU (KTJ) = colony forming units (kolonie tvořící jednotky) odhad počtu mikrobů popis kolonií má význam pro diagnostiku 15/38

16 Tekuté půdy a pevné půdy tekuté půdy: základem masopeptonový bujon (hovězí vývar + bílkovinný hydrolyzát) používají se především k pomnožení hodnocení výsledku: čirý bujon = neroste; zakalený bujon nebo přítomný sediment = roste pevné půdy: bujon zpevněný agarem (výtažkem z agarové řasy) bakterie rostou pomaleji, ale velmi rozmanitě bakterie lze rozočkovat někdy předem bakterie pomnožíme (tekutá půda), poté až očkujeme na pevnou půdu 16/38

17 Tekuté půdy pomnožovací: nejběžnější a univerzální bujón pro aerobní kultivaci a VL-bujón pro anaerobní kultivaci (VL = viande-levure, obsahuje masokvasničný extrakt) selektivně pomnožovací: pomnožení určité bakterie a potlačení množení jiných selenitový bujón pro salmonely obohacené pomnožovací: z kvalitnějších extraktů (např. BHI = mozkosrdcová infuze), hydrolyzátů (kasein), vitamínů (kvasničný hydrolyzát) atd. pro náročnější bakterie (streptokoky, hemofily, patogenní neisserie) 17/38

18 Pevné půdy základní: základem je masopeptonový bujon, NaCl a 1,5 % agaru pro málo náročné bakterie obohacené: přidávají se další složky jako cukry, růstové faktory, krev atp. diagnostické: přidání složek, které různě reagují na různé druhy metabolismu krevní agar, půdy pro biochemické určení mikrobů, půdy chromogenní a fluorescenční 18/38

19 Pevné půdy (2) selektivní: látky potlačující růst některých skupin mikrobů, podporují růst cílových mikroorganismů KA s 10 % NaCl pro stafylokoky KA s amikacinem pro streptokoky a enterokoky KA s azidem sodným pro enterokoky selektivně diagnostické: kombinace dvou předchozích skupin ENDO selektivní složka fuchsin, diagnostická složka fuchsin odbarvený siřičitanem a laktóza) XLD, MAL pro detekci salmonel 19/38

20 Půdy pro speciální účely MH agar (Müllerův-Hintonové agar): in vitro testování citlivosti na antimikrobiální látky slouží zároveň ke sledování pigmentů bakterií podobný MPA místo peptonu (brání difuzi antimikrobiálních látek) kaseinový hydrolyzát a škrob (detoxikuje některé metabolity mikrobů) půdy pro sledování faktorů virulence: půda s kongočervení pro detekci stafylokokového biofilmu žloutková půda pro histotoxická klostridia 20/38

21 Úkol 1a: Půdy v klinické mikrobiologii a jejich charakteristika prohlédněte si předložené půdy a zaznamenejte jejich vlastnosti 21/38

22 Úkol 1a: Půdy v klinické mikrobiologii (2) Název Druh Barva Typ Bakterie selenitový bujon bujon tekuté půdy nažloutlá pomnožovací VL-bujon Sabouraudův agar Löwentein- Jensen krevní agar Endova půda pevné půdy ve zkumavce pevné půdy v misce skoro bezbarvá bílá až velmi světle zelená červená růžová selektivně pomnož. selektivní* obohacená obohacená diagnostická selektivně diagnostická aeroby anaeroby salmonely houby mykobakteria (pův. TBC) většinu bakterií především enterobakterie 22/38

23 Úkol 1a: Půdy v klinické mikrobiologii (3) Název Druh Barva Typ Bakterie MH NaCl pevné půdy na Petriho miskách skoro bezbarvá červená -hnědá speciální selektivní atb citlivost stafylokoky VL-agar červená jako KA anaeroby XLD (a blízký MAL) čokoládový agar Levinthalův agar Slanetz- Bartley oranžová selektivně diagnostická salmonely hnědá obohacená hemofily, neisserie nažloutlá obohacená hemofily světlounce růžová selektivně diagnostická enterokoky 23/38

24 Úkol 1b: video Příprava krevního agaru prohlédněte si video a dopište do následujícího textu, co v něm chybí věnujte pozornost postupu, který zaručuje, že budou vyrobené půdy sterilní povšimněte si, v jakém kroku se přidává do půdy krev 24/38

25 Úkol 2a: závislost na kyslíku prohlédněte si misky a doplňte, kde bakterie rostou a kde nikoliv rozhodněte, jaký mají bakterie vztah ke kyslíku: striktní aeroby rostou jen v přítomnosti kyslíku striktní anaeroby rostou jen tam, kde kyslík není fakultativní anaeroby a od nich nerozeznatelné aerotolerantní bakterie rostou za všech podmínek mikroaerofilní bakterie rostou jen tam, kde jsou stopy kyslíku kapnofilní bakterie vyžadují více CO 2 25/38

26 Úkol 2b: růst bakterií na selektivních půdách prohlédněte si růst stafylokoků, streptokoků a enterokoků na různých selektivních půdách vyhodnoťte a zaznamenejte do tabulky případný růst 26/38

27 Úkol 2b: růst bakterií na selektivních půdách (2) prohlédněte si růst stafylokoků, streptokoků a enterokoků na různých selektivních půdách vyhodnoťte a zaznamenejte do tabulky případný růst: KA s 10 % NaCl jen pro stafylokoky KA s 6,5 % NaCl pro stafylokoky a enterokoky KA s amikacinem pro streptokoky a enterokoky KA s azidem sodným pro enterokoky 27/38

28 Úkol 2c: Závislost růstu bakterií na teplotě zaznamenejte, při jakých podmínkách rostou dva druhy pseudomonád 28/38

29 Úkol 2c: Závislost růstu bakterií na teplotě (2) zaznamenejte, při jakých podmínkách rostou dva druhy pseudomonád Pseudomonas aeruginosa roste při 37 C a 42 C Pseudomonas fluorescens roste při 4 C a 37 C 29/38

30 Úkol 3a: Krevní agar viridace a hemolýza půdy s krvinkami (krevní agar, VL krevní agar, agar s pranými erytrocyty apod. netýká se ale krevního agaru s 10 % NaCl, kde jsou krvinky lyzovány) jsou schopny rozlišit: úplnou hemolýzu (β-hemolýza) částečnou hemolýzu (β-hemolýza) nepřítomnost hemolýzy (γ-hemolýza) viridaci (zezelenání) (α-hemolýza) 30/38

31 Úkol 3a: Krevní agar viridace a hemolýza (2) 31/38

32 Úkol 3b: Vlastnosti Endovy půdy na Endově půdě rostou pouze G- bakterie (Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, GNFB) laktóza pozitivní (červené, včetně okolí, jinak může jít pouze o pigment!) a negativní (bledé) laktóza pozitivní bakterie jsou zpravidla mírnějšími patogeny než bakterie laktóza negativní 32/38

33 Úkol 4: Popis morfologických vlastností kolonií v praxi většinou nepopisujeme všech deset vlastností, které máte uvedeny v protokolu, z cvičných důvodů se o to nyní pokuste tam, kde to nejde, napište, proč to nejde nezapomeňte na okolí kolonie, tj. hemolýzu na krevním agaru či štěpení laktózy na Endově půdě 33/38

34 Úkol 4: Popis morfologických vlastností kolonií (2) Votava M. (2005) Lékařská mikrobiologie obecná 34/38

35 Úkol 5a: Naočkování vzorku na agarovou půdu naneste tamponem vzorek na část misky (asi tak do jedné třetiny průměru misky) vyžíhejte kličku rozočkujte z plochy, kam jste nanesli vzorek, do další části vyžíhejte kličku rozočkujte z čar, kde jste rozočkovali minule (už se nedotýkejte plochy, kam jste očkovali tamponem vyžíhejte kličku rozočkujte hádka 35/38

36 Úkol 5b: Přeočkování agarové kultury vyžíhejte kličku naberte kmen (pouze teď, nikdy znovu v dalších krocích!) naočkujte první úsek vyžíhejte kličku rozočkujte druhý úsek vyžíhejte kličku rozočkujte třetí úsek vyžíhejte kličku rozočkujte hádka 36/38

37 Po skončení práce nezapomeňte vrátit všechny Petriho misky do původních beden provést dezinfekci stolů provést dezinfekci rukou (případně je i umýt vodou a mýdlem) dát všechny Petriho misky z úkolu 5b na boční stůl (pokud je chcete nechat kultivovat, označte si je čitelně jménem či přezdívkou a dnešním datem) 37/38

38 Po tomto cvičení byste měli umět: popsat množení mikrobů a růstovou křivku diskutovat nároky mikrobů na výživu a s tím související podmínky kultivace popsat způsob aerobní a anaerobní kultivace diskutovat použití tekutých a pevných půdy, včetně vhodných příkladů a jejich diagnostické hodnoty očkovat na pevné půdy 38/38