1 2 řenos signálu brasinosteroidů v rostlinách a steroidů u živočichů a) Brasinosteroidy Arabidopsis b) odobné účinky brasinosteroidů a steroidů c) Ecdysteroidy Drosophila Vývoj organismu regulují signály (faktory) Vnitřní Vnější světlo genetická info teplota metabolismus vlhkost R Signál hormony gravitace plyny Zesilovač Martin Fellner 2017 Reakce (např. exprese genů) 3 4 Obecné schéma přenosu signálu Genetické studie - snaha definovat molekulární mechanizmy účinků steroidních hormonů Signál Zesilovač (secondary messenger) Reakce Vnější (světlo, teplota, gravitace, vlhkost) Vnitřní (hormony, metabolity, genetická informace) Intracelulární (pro lipofilní hormony => snadno difundující membránou) Membránové (povrchové) (pro hormony rozpustné ve vodě => neschopné procházet membránou) Cyklický AM a GM, diacylglycerol, inositol-trifosfát, Ca 2+ ionty, NO Exprese genů, indukce aktivity kanálů a pump, atd. Brasinosteroidy - Arabidopsis thaliana (26 tisíc genů) Detailní popis biosyntézy brasinosteroidů Znalost signálních drah Steroidy savci, hmyz - Drosophila melanogaster (12 tisíc genů) Detailní popis transkripce genů aktivované hydroxyecdysonem Znalost biosyntézy ecdysteroidu 5 a) Brasinosteroidy Arabidopsis Biosyntéza brasinosteroidů (BR) a homeostáza 1 miliarda let Rostliny Živočichové 6 1979 brasinolid (BL) koncový produkt biosyntetické dráhy - stimuluje prodlužování stonku - stimuluje prodlužování kořene (nízké koncentrace) Brasinolid - inhibuje prodlužování kořene (vysoké koncentrace) - stimuluje růst listů - stimuluje vývoj a klíčení semen - stimuluje vývoj průduchů HO - indukuje zavírání průduchů - stimuluju toleranci k chladu O HO H O OH OH rodlužování 2. internodu stonku fazole Hormony - polyhydroxylované steroidní molekuly Brasinosteroidy a auxiny mají synergické účinky. Stimulace: - tvorby laterálních kořenů BR a steroidy kontrolují: - regulaci genové exprese - buněčné dělení - expanzi buněk - diferenciaci buněk - CD - homeostázu Update 2015 Untterholzner SJ et al. (2015) lant Cell 27: 2261-2272 Brassinosteroidy stimulují biosyntézu GAs. Update 2016 Shahnejat-Bushehri et al. (2016) Nature lants 2: 1-9 Interakce signálních drah brassinosteroidů a GAs; protein JUB1 Auxin rychlý účinek - prodlužování stonku - růstu pylové láčky - ohýbaní listů a epinastie - aktivity protonové pumpy - diferenciace xylému Ohýbání listů Update 2016 Brasinolid pomalý účinek Favero DS et al. (2016) lant J, Nov. 21, doi: 10.1111/tpj.13451 Interakce signálních drah brassinosteroidů, auxinů a světla 1
7 8 oužití brasinosteroidů v zemědělství: - zvyšování výnosů - stimulace rezistence ke stresům Existence BR a biologická aktivita velké množství literatury Fungování a signální dráhy objeveny nedávno Genetický přístup fyziologická, biochemická a molekulární charakterizace mutantů Výskyt: - ve všech testovaných pletivech - nejvíce v apikálních částech stonků Selekce mutantů s redukovanou biosyntézou BR (rajče, hrách, rýže, Arabidopsis) Výrazný fenotyp mutantů; Arabidopsis pleiotropický efekt mutací Brasinosteroidy nejsou pravděpodobně transportovány na dlouhé vzdálenosti Symons GM et al. (2008) J Exp Botany 59: 17-24 Review o transportu brasinosteroidů Tma: krátký vzrůst, tlustý hypokotyl, otevřené zvětšené dělohy, přítomnost primárních listových pupenů Světlo: trpasličí vzrůst, tmavozelená barva, redukovaná apikální dominance, pylová sterilita, zpožděnásenescence chloroplastů a listů, narušené fotoperiodické reakce, změny v reakci ke světlu. bri1 det2 WT WT cpd det2 WT WT 9 10 Výrazný fenotyp mutanta Aplikace exogenních BR vede k normalizaci mutantních fenotypů Identifikace genů zapojených v syntéze BR CL - campesterol CT - cathasterone orozumění mechanizmu homeostáze orozumění mechanizmu signalizace TE - teasterone DT - dehydroteasterone TY - typhasterol CS - castasterone BL - brassinolide Signalizace Biosyntéza Mutanti v signálních drahách mají vyšší hladinu endogenních hormonů Homeostáza BR-mutanti Cytokinin-mutanti Auxin-mutanti 11 12 Kontrolní mechanizmy regulující hladinu BR: - regulace biosyntézy - inaktivace BR - zpětná vazba od signální dráhy Dvě biosyntetické dráhy BR ranná C-6 oxidace pozdní C-6 oxidace Biosyntetické dráhy BR Rostliny Campesterol BR Živočichové Cholesterol Steroidy Taiz L, Zeiger E (2006) lant hysiology, 4th. ed., str. 617-634 Klíčové kroky syntézy BR a steroidů jsou vysoce konzervované přítomnost 5 -reduktázy Hmyz přítomnost 5 -reduktázy nebyla zatím prokázána Update 2016 Tarkowska D et al. (2016) Anal Bioanal Chem, August 16; doi: 10.1007/s00216-016-9807-2 Nová metoda identifikace brasinosteroidů (LRR Olomouc) 2
13 řenos signálu brasinosteroidů Identifikace BR-insensitivních mutantů 14 Fyziologické studie Identifikace BR jako růstových regulátorů Mutovaná populace rostlin Genetické studie Identifikace BR jako růstových hormonů 0 BL Vysoká konc. BR Identifikace BR receptoru na plazmatické membráně + dalších elementů dráhy BR-insensitivní mutanti Obrovský nárůst znalostí mol. základů účinků BR Update 2015 Enormní nárůst publikací o BR Belkhadir Y, Jaillais Y (2015) New hytologist, doi: 10.111/nph.13269 Singh A, Savaldi-Goldstein S (2015) J Exp Botany 66: 1123-1132 Lozano-Durán R, Zpfel C (2015) TIS 20: 12-19 Clouse SD (2015) J lant Growth Regul 34: 828-844 Saini S et al. (2015) Frontiers in lant Science 6, art. 950 Nejnovější review o signálních drahách brasinosteroidů a historii výzkumu signalizace BRs Wild type a brd2 mutant rýže Mutant bri1 (brassinosteroid-insensitive1) BR-insensitivní mutanti jsou podobní mutantům s defektem v syntéze BR. Jejich fenotyp však nelze změnit exogenními BR. 15 16 Struktura receptoru BRI1 Laboratoř J. Chory identifikace dalších trpasličích alel bri1 N-terminal signal peptide Cysteine pair utative leucine zipper Další geny této skupiny: BRL1, BRL2 a BRL3 BRL1 a BRL3 váží BR. Ektopická exprese těchto genů řízená promotorem BRI1 je schopna zrušit účinek mutace bri1. BRL1 a BRL3 se specificky exprimují ve vaskulárním systému => mutace brl1 a brl3 vedou k abnormálnímu poměru v diferenciaci floému a xylému. Trojitý mutant bri1brl1brl3 - zesílený trpasličí vzrůst a vaskulární fenotyp 70-amino acid island LRR22 Leucine-rich repeats (LRR) BL-binding site Transmembrane region M BRI1 kóduje leucin-rich repeat (LRR) transmembránovou receptor-like kinázu (RLK) (LRR-RLK) (poziční klonování) Lokalizace: plazma membrána (exprese BRI1-GF) bri1 bri1brl1brl3 Vazebné studie: vysoká specificita vazby BL k BRI1 proteinu Ser/Thr kinase domain (KD) Juxtamembrane domain WT brl1 brl3 BRI1 je receptorem brasinosteroidů C-terminal tail Cytoplazma 17 18 LRR-RLK největší skupina receptorů v Arabidopsis genomu: ~230 členů 70 amino+lrr obecný proteinový motiv, který se vyskytuje u rodiny proteinů zvaných LRR-R (LRR--like) s velmi odlišnými funkcemi u všech druhů organizmů. Fosforylace receptoru BRI1 Analýza mutantů s defekty v BRI1 Identifikace domén nutných pro přenos signálu BRI1 CLV1 Cf-9 Toll Unikátní znak BRI1: obsahuje 70 amino acid island a zároveň KD Jiné LRR-R neobsahují KD a přenáší signál prostřednictvím intracelulární protein-protein interakce (CLV1, Cf-9). Xa21 je zapojen v rezistenci k patogenům, má KD, ale neobsahuje 70 amino acid island. BL-binding site 70-amino acid island LRR22 Toll receptor u Drosophily obsahuje intracelulární protein (interleucin doménu), který po aktivaci receptoru váže protein podobný KD. Juxtamembrane domain Ser/Thr kinase domain (KD) Hothorn M et al. (2011) Nature 474: 467-471 C-terminal tail 3
19 Buněčná stěna Buněčná stěna řítomnost BL = vazba BL k receptoru 20 Cytozol lazm. membrána Absence BR: Fosforylace proteinů BES1 a BZR1 konstitutivně lokalizovaných v jádře. Fosforylované BES1 a BZR1 se nemohou vázat k DNA a jsou degradovány Cytozol CDG1 lazm. membrána Aktivovaný BRI1/BAK1 heterodimer inhibuje aktivitu BIN2 kinázy prostřednictvím BSK (Brassinosteroid-Signaling Kinases) a BSU1 (bri1 SUpressor 1) + římá aktivita BSU1 Akumulace defosforylované formy BES1 a BZR1 v jádře BR-indukované geny nejsou exprimovány BES1 (bri1-ems-suppressor 1) BZR1 (brassinazole-resistant 1) BES1 a BZR1 transkripční faktory BR-indukovaných genů; krátká životnost; degradace 26S proteasome Jádro BR-responzivních genů (Tch4, SAUR-Ac) BR biosyntetických genů (CD, DWF4, OT3) Jádro BR-responzivních genů (Tch4, SAUR-Ac) BR biosyntetických genů (CD, DWF4, OT3) Aktivace či potlačení genové exprese 21 Duální fyziologická role BAK1 a BKK1 Double mutant bak1bkk1 letální: BAK1/BKK1 BAK1 BRI1 - konstitutivní exprese obr. genů? FLS2 - ukládání kalózy 22 Regulace genové exprese transkripčními faktory BES1 a BZR1 Sekvenování Arabidopsis genomu metoda exprese genů - mikroaray - akumulace ROS - spontánní CD ve sterilních podmínkách BR flg22 Identifikace stovek BR-indukovaných genů M BKK1 = BAK1- like1 FLS2 = flagelin-sensitive LRR receptor kináza 2 BR-závislá (RR = patern-recognition receptor) signální dráha Jádro AM = pathogen-associated molecular pattern Brasinosteroidy zprostředkované buněčné prodlužování a proliferace Update 2016 Lozano-Durán R, Zipfel C (2016) TIS 20: 12-19 Review o úloze BRs v rostlinné imunitě. BR-nezávislá signální dráha BR-nezávislá buněčné smrti signální dráha Konstitutivní AM - obranná reakce a imunitní spontánní buněčná reakce smrt odle He et al. (2007) Current Biology 17: 1109-1115 Up-regulované a down-regulované geny zapojené pravděpodobně v: - syntéze a modifikaci buněčné stěny - formaci cytoskeletu - biosyntéze BR - signálních dráhách - transportu BR BES1 a BZR1 jsou z 90% identické, ale regulují odlišné skupiny genů. 23 Identifikace nových transkripčních faktorů interagujících s BES1 24 Buněčná stěna Cytozol lazm. membrána BES1 + BIM1 (BES1-interacting Myclike 1) Cytozol CDG1 BZR1 vazba k BRRE (BRresponsive element) Inhibice exprese BR-biosyntetických genů BES1/BIM1 heterodimer Aktivace genové exprese vazbou k E-boxu Zpětnovazebná regulace biosyntetické dráhy BR Jádro BR-responzivních genů (Tch4, SAUR-Ac) BR biosyntetických genů (CD, DWF4, OT3) Update 2016 Salazar-Henao JE et al. (2016) J Exp Botany 67: 4951-4961 BES1 reguluje lokalizaci brasinosteroidového receptoru BRL3 Jádro BR-responzivních genů (Tch4, SAUR-Ac) BR biosyntetických genů (CD, DWF4, OT3) 4
25 26 Endozomální lokalizace BRI1 lazma membrána Endozom Endocytóza běžná u živočichů a kvasinek - inaktivace receptoru (např. BOR1) - aktivace signálu Brasinosteroidy kontrolují vlastní signalizaci. BRI1 BRI1 Transport k cíli nebo transport do lysozomu a degradace - distribuce BRI1 v M či endozomech není změněna v BR-deficientních mutantech či po ovlivnění BR => endocytóza není závislá na aktivačním stavu BRI1 - endozomální BRI1 je konstitutivně aktivní Důvody existence signální dráhy BRI1 prostřednictvím endozomů: - doplňkový k M BRI1 (nedostatek místa na M) - degradace BRI1 utlumení signální dráhy BRI1 cykluje mezi membránou a endozomem. Když je BRI1 aktivován = fosforylován, tak v endozomální formě stimuluje expresi SBI1 (Suppressor of bri1). SBI1 kóduje leucine carboxylmethyltransferázu (LCMT), a proto metyluje protein fosfatázu 2A. Tím se usnadňuje asociace 2A s aktivním BRI1. To vede k defosforylaci a degradaci receptoru BRI1. Tím dochází k inhibici signálu. Brasinosteroidy tak kontrolují vlastní signalizaci. 27 28 b) odobné účinky brasinosteroidů a steroidů Klíčová slova pro příští přednášku Účinky ecdysteroidu na růst a vývoj hmyzu: Drosophila Insect hormone receptor Ecdysone Nuclear receptor Ecdysteroid olytene chromosome Ecdysteroid signaling EcR/US 20-hydroxyecdysone Google: http://www.google.cz/ NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ - morfogeneze - proliferace - syntéza kutikuly - vývoj vajíčka - časování vývoje - CD Společné prvky s vývojovými a fyziologickými reakcemi rostlin k BR, které zahrnují: - regulaci genové exprese - diferenciaci buněk - expanzi buněk - buněčné dělení - homeostázu - CD 29 30 1) BR a ecdysteroid regulují změny tvaru buněk spojené s dozráváním BR: regulace exprese genů kódujících proteiny spojené s buněčnou stěnou a zapojené v expanzi buněk Ecdysteroid: spouštění morfogeneze struktur dospělců během metamorfózy - - změna tvaru buněk na úrovni cytoskeletálního aktinu 2) BR a ecdysteroid regulují programovou smrt buňky Ecdysteroid: spouští masivní smrt tkání larev během ranných fází metamorfózy Ecdysteroid (slinné žlázy larev během regulace) Rostliny řítomnost rigidní buněčné stěny Regulace tvaru buňky změnami v hladině proteinů spojených s buněčnou stěnou Hmyz Integrita buňky interní cytoskelet Regulace tvaru buňky změnami cytoskeletu Indukce tkáňově specifických genů klíčových pro CD Ecdysone = prekurzor (periferní tkáně) Např. geny: E93 reaper hid ark dronc croquemort 5
31 32 BR: indukují CD vznik tracheálních elementů (xylém transport vody rostlinami) BR stimulují diferenciaci tracheid - modelový systém zinia (Zinnia elegans) Mezofylové buňky diferencují v tracheální elementy vlivem auxinů, GA a BR. BR-deficientní mutant det2 Uniconazol (inhibitor BR) Abnormální xylém Chrání buňky před diferenciací X BR překonává ochranu BR jsou zapojeny v tvorbě xylému BR iniciuje poslední krok cytodifereneciace = CD X Xylém je tvořen tracheidy Molekulární mechanizmus není znám Mezofylové buňky inkubované 2-3 dny v médiu s BR 33 34 Unikátní struktura jaderného receptoru c) Ecdysteroidy - Drosophila Klasická signální dráha R Jaderné receptory vývojově velice staré Signální dráha s receptorem uvnitř buňky (jaderný receptor) V jednom kroku: - příjem signálu - reakce k signálu Unikátní struktura jaderného receptoru Ligand-binding doména (LBD) méně konzervovaná C-terminální DNA-binding doména (DBD) vysoce konzervovaná AF-1, AF-2 domény s Aktivační Funkcí pro transkripci Drosophila 2 fyziologicky aktivní lipofilní hormony (, JH); genom obsahuje pouze 18 genů pro jaderné receptory (člověk 48 genů) Drosophila jednoduché signální dráhy modelový systém 35 6 odlišných podskupin jaderných receptorů rincip fungování jaderného receptoru 36 se společnou konzervovanou doménou DBD 2 zinc fingers: mezi DBD a LBD. 1. oskytuje DNA-binding specificitu prostřednictvím 18 jaderných receptorů u Drosophily (+ -boxu (5 aminokyselin) 3 pouze z DBD) Známé jaderné receptory obratlovců pro: - estrogen (ER) - glukokortikoid (GR) - thyrodní hormon (TR) 2. Dovoluje dimerizaci DBD oblastí LBD tvořena 11-13 -helixy, které formují vazebné místo pro ligand TC Transkripční koaktivátor - retionovou kyselinu (RAR) - retinoid X (RXR) Ligandy jaderných receptorů = lipofilní molekuly Hormon AF2 DBD LBD 1 2 Vazba k LBD Aktivace LBD (rotace helixu 12) AGGTCA Exprese Vazba ke genu pro jiný receptor Orfan receptor jaderný receptor bez známého přirozeného ligandu; mohou fungovat nezávisle na ligandu ři aktivaci genů prostřednictvím jaderných receptorů dochází ke změnám v organizaci chromatinu. TC NURF - NUcleosome Remodeling Factor transkripční koaktivátor; AT-dependent chromatin remodeling enzym; váže se na LBD v závislosti na koncentraci. 6
CH3 37 Regulační kaskády 20-hydroxyecdysonu Konec embryogeneze Molekulární a 38 genetické studie ulzy produkce Drosophily rotorakální žláza Ecdysteroid -ecdyson Hemolymfa rodukce ecdysteroidů v protorakální žláze je ovlivňována výživou serotonergické neurony propojují protorakální žlázu s nervovým systémem trávicího traktu (vnějším prostředím) HO HO H3C H H3C H3C O OH OH H CH3 OH 3 larvální stádia Metamorfogeneze roces dospívání E U je klíčový hormon v determinaci časování vývoje hmyzu Nukleární receptor hormonu : Reakce: morfogenetické fyziologické chování apoptické reproduktivní Heterodimer EU Absence : EcR působí jako represor diferenciace sensorických neuronů v křídlech Drosophily řítomnost : Vazba k EcR - uvolnění represe EcR receptor pro US ultraspiracle Další funkce : - nezbytný regulátor dlouhodobé paměti - reguluje formování neuronů - nezbytný regulátor spánku - regulátor imunitních reakcí embrya Drosophily Update 2015 Huang L-X et al. (2015) Insect Science 22: 95 105 Existují izoformy EU: EcRA/US2 EcRB1/US1 Spodoptera litura 39 reguluje transkripčně EcR + 6 dalších genůpro jaderné receptory Množství mrna těchto genů se mění synchronně s pulzy ecdysteroidů 40 reguluje signální dráhy exprese genů pro jaderné receptory, a to prostřednictvím vazby na receptorový komplex heterodimeru EcR/US. Geny pro jaderné receptory: E75 E78 DHR3 DHR4 DHR39 ftz-f1 DHR = Drosophila Hormone ftz-f1 = fushi tarazu transcription factor1 1 EcR/US TC Transkripční koaktivátor 2 3 4 5 6 AGGTCA Exprese 41 42 Geny ftz-f1 a DHR39 jako cíle komplexu -EcR/US Geny E75 a E78 jako cíle komplexu -EcR/US E75 a E78 jsou orfan receptory nemají známé ligandy; E75 nepostradatelný pro samičí fertilitu E75 má hemovou skupinu na LBD => možnost vazby NO (oxid dusnatý) a CO (oxid uhelnatý) => NO a CO modulují aktivitu E75 ftz-f1 raná fáze embryogeneze; βftz-f1 pozdní stádia vývoje, zapojen do syntézy ecdysteroidu, nezbytná úloha v pozdní fázi vývoje larvy a kukly; oba geny nutné pro životaschopnost uls vysoké koncentrace na konci 3. larválního stádia Exprese βftz-f1 Iniciace metamorfózy + 2. puls Geny DHR3 a DHR4 jako cíle komplexu -EcR/US DHR3 a DHR4 orfan receptory; DHR3 nezbytná funkce během embryogeneze; DHR4 nezbytný pro načasování zakuklování Vývoj hlavy dospělce Založení celého těla dospělce CD v larválních tkáních DHR39 sekvenčně podobný s ftz-f1; předchází expresi βftz-f1; DHR39 je downregulován, když hladina βftz-f1 je maximální 7
43 44 řehled všech 18 jaderných receptorů u Drozofily Schéma regulace genů pro jaderné receptory komplexem -EcR/US během metamorfózy 45 46 Studie zvětšování polytenních chromozomů ve slinných žlázách larev Znalost molekulárních mechanizmů účinků ecdysteroidů 1) otlačují svoji vlastní expresi samo-zeslabující funkce 2) Indukují expresi velké řady genů zapojených v sekundárních reakcích; pozdější geny kontrolují biologické reakce k ecdysteroidům http://en.w ikipedia.org/wiki/drosophila Becker (1959) Ashburner (1974) kultivace slinných žláz v přítomnosti Clever a Karlson (1960) Molekulární studie v posledních letech =>potvrzení Ashburnerova modelu fungování ecdysteroidu Charakterizace nafukovacích reakcí chromozomů (puffing) Důkazy: genetická reakce k ecdysteroidu zahrnuje > 100 puffů Genetické reakce k brasinosteroidům a steroidům - podobnosti a rozdíly Microaray výsledky: Arabidopsis: 8000 testovaných genů => 50 regulovaných BL http://www.ucsf.edu/sedat/polytene_chrom.html ostulace steroidy-indukované regulační kaskády: přímo indukuje malé skupiny ranných regulačních genů reprezentujících asi 6 puffů na polytenních chromozomech. roteiny ranných genů jsou lokalizovány v místech puffů a mají pravděpodobně 2 opačné funkce: Arabidopsis: 27 tisíc genů Drosophila: 14 tisíc genů Drosophila: 31% ze 465 testovaných EST ukazuje silnou indukci ecdysteroidy (až 3x silnější) 1) Genetické reakce u Drosophily jsou složitější než u Arabidopsis 47 48 očet steroidy indukovaných genů kódujících transkripční faktory: Drosophila > Arabidopsis Mimojaderná regulace ecdysteroidních signálních drah ~ 12 genů kódujících transkripční faktory indukovaných Důkazypro regulaci signální dráhy v cytoplazmě = Fosforylační kaskáda spouštěná BR Ranné puffy: BR-C, E74, E75 Elementy signálních drah (forhead, cryptocephal) Zvýšená exprese koreluje s pulzy : DMef2, bagpipe, tinman Arabidopsis: BR indukují relativně malé změny v genové aktivitě ( 2-4x); silněji indukované geny nebyly identifikovány Drosophila: indukuje velmi silné změny v aktivitě ranných genů ( >>4x) Úrovně mimojaderné regulace signálních drah: 1) Binding aktivita EcR/US vyžaduje interakci s chaperony; chaperony se však vyskytují v cytoplazmě 2) Metabolická inaktivace hormonu; (existuje i u brasinosteroidů); enzymy 450 inaktivují 2) Genetické reakce k ecdysteroidům u Drosophily jsou řádově silnějsí než reakce genů u Arabidopsis indukovaných BR Hmyzí metamorfóza rychlá a masivní změna plánu Složitější indukce genové aktivity 3) Modulace hladiny ecdysteroidů gen E23 indukovaný hormonem moduluje hladinu hormonu (tj. sám sebe) v buňce 8
49 50 4) Hormon má přímé a rychlé účinky nezávisle na expresi jaderných genů < 15 minut => bez transkripce a syntézy proteinů? Indukce exprese genu E23? E23 Exprese Existuje receptor pro hormon na plazmatické [ NO ] Oxid dusnatý!! membráně či v cytoplazmě? Gen E23 kóduje transportér typu ABC aktivní transport malých sloučenin. E23 transportuje z buňky redukce koncentrace hormonu v buňce. roliferace neuroblastů během metamorfózy G-protein-coupled receptor (Gαq) GCR ABC transportér Studie gain-of-function: E23 funguje jako obecný negativní regulátor signální dráhy tlumí expresi genů indukovaných. Update 2015 DeLalio LJ et al. (2015) Journal of Insect hysiology, March (2015) Update 2014, 2015 M anduca sexta NO Ecdysone sekretovaný Ren J et al. (2015) J Ster Biochem 144: 313-323 Hypoxie protorakální žlázou Jing Y- et al. (2015) J Biol Chem, Feb. 10, doi: 10.1074/jbc.M114.622696 Acetylace lysinu GCR Ca 2+ signaling CaMKII Usp1 E U Exprese genů Aktivace Aktivace fosforylace CaMKII = Ca 2+ /Calmodulin-dependentní protein kináza GRC = G-protein-coupled receptor Obecné schéma inositol-lipidové signální dráhy 51 52 Neznámé hmyzí hormonální receptory souvislost s rostlinami Vnější prostor (apoplast) lazmatická membrána Hormon Fosfolipáza C rotein kináza C BR ABA cytokininy etylén auxin Vnitřní prostor (cytozol) Gbg G G protein I2 I3 Ca 2+ DAG DAG Aktivní (fosforylovaný) protein Neaktivní protein Ca 2+ kanál Buněčné reakce Endoplazmatické retikulum nebo vakuola citlivý k I3 Buněčné reakce antagonisticky, synergisticky Alan M Jones The University of North Carolina at Chapel Hill, USA Ca 2+ I 2 - Fosfoinositol-bifosfát I 3 - Inositol-trifosfát DAG - Diacylglycerol odle Taiz L and Zeiger E (2006) lant hysiology, 4th ed. Diptera (Drosophila) není pozorována modifikace účinků ectysteroidů juvelním hormonem JH při procesu svlékání Málo známo o molekulárních mechanizmech účinků JH v interakci s ecdysteroidy 53 54 Kukla Drosophily: interakce s JH JH US? Struktura LBD receptoru US není konzistentní se strukturou JH Exprese Ranný gen BR-C Koevoluce rostlin a hmyzu: fytosteroidy Rostliny produkují ecdysteroidy s aktivitou u hmyzu = fytoecdysteroidy (jsou ligandy pro EcR) 5 6% testovaných druhů rostlin Existují hormonální signální dráhy paralelně s nebo ve spojení s. Manduca sexta? roliferace neuroblastů během ranného vývoje kukly Ecdysone (inaktivní prekurzor ) = EcR/USB (nízká transkripční aktivita k ecdysonu) Ecdysone funguje jako hormon Fytoecdysteroidy: ponasteron Hladina fytoecdysteroidů je závislá na: makisteron A cyasteron ecdyson Účinné u hmyzu Syntetická dráha fytoecdysteroidů není objasněna - druhu rostliny - části rostliny - ročním období - habitu - vývojovém stádiu 9
55 56 Fytoecdysteroidy - nechutenství u hmyzu (prostřednictvím chuťových receptorů) Obrana rostlin proti hmyzu Interakce signální dráhy a inzulinu regulace finální velikosti těla hmyzu ecdyson ponasteron Způsobují vývojové změny: - Inhibice růstu - Zvýšení larválních stádií - ředčasné kuklení Hmyz si vytváří rezistenci k fytoecdysteroidům, které konzumuje. X neznámý faktor Y neznámý faktor dfoxo transkripční faktor I3K fosfatidyl inositol 3-kináza Insulin receptor - citlivý k teplotě Důkaz existence metabolických drah, které detoxifikují fytoecdysteroidy. Ecdysteroidy nemají škodlivé účinky na savce Update 2012 Zhu JQ et al. (2012) LoS ONE 7: e38572 Možnost využití ecdysteroidů v zemědělství jako insekticidů Juvenilní hormon a inzulin-like peptide regulují expresi Vg Vg (vitellogenin) = glycoliprotein, prekurzor lipoproteinů a fosfoproteinů, základních součástí žloutku Larvy H. armigera (Černopáska bavlníková) krmená listy transgenního tabáku exprimujícího EcR dsrna, měly velice nízkou hladinu EcR mrna. To způsobovalo úmrtí larev a defekty ve vytváření zámotků. => Důkaz, že transgenní rostliny exprimující dsrna zaměřující se na geny hmyzu, mohou zvyšovat svoji rezistenci ke škodlivému hmyzu. (ekvivalent jater a tukové tkáně) Colombani J et al. (2005) Science 310: 667-670 King-Jones, Thummel (2005) Science 310: 630-631 Update 2013 Boulan L et al. (2013) Current Biology 23: 473 478 57 58 Kdo jsou? Inzulin Ecdyson máduálnífunkci: 1) Maximální sekrece stimuluje vývojové změnyadospívání Thomas Altmann University of otsdam, Golm Steven D Clouse North Carolina State University, Raleigh Joanne Chory The Salk Institute, La Jolla 2) Základní produkce ecdysonu vedek potlačenírůstu Bishop Gerard J Růst těla Drosophily je kontrolován nově objevenou microrna bantam. Bantam v buňkách prothorakálnížlázy stimulujerůsttím, že potlačuje akumulaciecdysonu. Inzulinprostřednictvímbantam kontrolujehladinuecdysonua tím růstjedince. University of Wales Aberystwyth, Aberystwyth Müssig C University of otsdam, Golm Sally M Assmann ennsylvania State University, eter McCourt University of Toronto, Toronto 59 60 Klíčová slova pro příští přednášku Ubiquitination Constitutive photomorphogenic 1 hotomorphogenesis E3 ubiquitin ligase Mammalian CO1 Tumorigenesis Kirst King-Jones University of Utah, Salt Lake City Carl S Thummel University of Utah, Salt Lake City Anthony Bishopp University of Helsinki, Helsinki Google: http://www.google.cz/ NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 10