Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru Botanika a učitelství biologie

Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru Botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/15.0316 Molekulárně biologické metody v biotechnologické a zemědělské praxi a výzkumu

1. GM plodiny Vznikají procesem zvaným transgenóze přenos genu z jednoho organizmu do druhého (rostliny). Proces genetické modifikace začíná identifikací donorového genu, jeho izolací a amplifikaci a vnesení do vektoru plasmidová DNA Vektor s daným genem je do rostliny přenesen buď mechanickou cestou (nastřelování zlatými mikročásticemi na jejichž povrchu je vektor nanesen) nebo pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens. Rostliny po genetické modifikaci jsou podrobeny genetické analýze a selekci. Následně jsou dále šlechtěny a u úspěšných linií je množeno osivo.

Metodika přípravy GMO

Biolistika nastřelování pletiv rostlin zlatými mikročásticemi s vektorem Přírodní transgenóze skrze Agrobacterium

Proč vůbec vznikají GM plodiny Experimenty základního výzkumu Potřeby nových vlastností pěstovaných plodin Nízká genetická diverzita současných plodin, není dostatečně velký gene-pool Nesnadné mezidruhové křížení Náročné mutační šlechtění Mnoho plodin klonální rostliny - banán

Jaké jsou cíle produkce GM plodin 1) Rezistence proti škůdcům 2) Rezistence vůči nemocem 3) Tolerance k herbicidům 4) Tolerance ke stresům 5) Výživná hodnota 6) Farmacie 7) Fytoremediace

Rezistence vůči chorobám a Bt kukuřice US 1996 škůdcům

Napadení kukuřice zavíječem: ztráty v USA 1 miliarda $ ročně sekundární infekce houbami kontaminace produktů mykotoxiny

Bt toxin 1902 Bacillus thuringiensis zjištěn v Japonsku vyvolává úhyn bource morušového. Ishiwata sotto disease delta-endotoxin (Cry),tvořící se ve sporách, destruuje střevní výstelku škůdce Součástí biopreparátů - Biobit XL,Biobit WP Bt kurstaki motýli; Novodor Bt tenebrionis..mandelinky, květopas jabloňový Není toxický člověku ani vyšším organismům

Bt kukuřice v ČR 2005 270 ha 52 pěstitelů 2006 1290 ha 85 pěstitelů 2007 5000 ha 131 pěstitelů 2008 8380 ha 171 pěstitelů 2009.pokles asi na 6500 ha problémy s odbytem V USA od roku 1996 Bt kukuřice, bavlník a brambor Příprava i Bt zelenin (květák, brokolice, zelí,..)

Enviromentální rizika a klady Úhyn hmyzu po požití GM pylu s Bt toxinem je v současnosti zpochybňován Únik genů do prostředí křížením s planými příbuznými Omezené používání pesticidů Zjištěna naopak větší druhová diverzita hmyzu na Bt polích Hrozba Bt rezistentního hmyzu

Rezistence vůči chorobám GM švestky Honey Sweet rezistence proti viru šárky GM tykve rezistence proti viru mozaiky GM hrách, paprika, papája opět rezistence proti virovým chorobám rezistence proti virům založena na antisense RNA

Tolerance k herbicidům Roundup Ready Soybeans - plodina je tolerantní vůči komerčnímu herbicidu (glyfosát) dodavaného s osivem - usnadnění agronomických postupů a větší výnosy

HT plodiny HT sója (64% procent světové produkce, 93 % produkce USA) HT bavlník, HT kukuřice, HT cukrová řepa, HT vojtěška Diskuse na téma superplevelů odolných na herbicidy Samovolný přenos HT na jiné odrůdy či blízké příbuzné Menší eroze půd

Tolerance na různé stresy Sucho Salinita Chlad jahody Jedy - Fytoremediace - GM topol

Výživa Zlatá rýže: Golden rice (yellow) with standard rice (white). Worldwide, 7% of children suffer vitamin A deficiency, many of them living in regions in which rice is a staple of the diet.

provitamin A project: Potrykus, Bukhart, Beyer, 1992 1999 postupný přenos 4 genů metabolické dráhy syntézy karotenu (z Narcissus,Erwinia), karoten se ukládá v endospermu rýže a barví jej žlutě - zlatě

Upravené složení olejů řepka, sója FlavrSavr rajčata Farmacie vakcíny, léčiva Vyšší obsah lysinu (aminokyselina) lepší výživná hodnota krmiva Další úpravy proteinů Biopaliva GM topol s nižším obsahem ligninu

Shrnutí využití GMO Oblast aplikace GMO Přínosy GMO (i potenciální) Potraviny GM plodiny Větší výnosy, potraviny s menším obsahem škodlivých látek pesticidy, herbicidy, mykotoxiny, obohacené (funkční) potraviny např. rýže obsahující provitamín A. Medicína Průmysl GM zvířata GM mikroorganismy, rostliny a zvířata GM viry GM mikroorganismy, plodiny a zvířata Větší produkce, odolnější zvířata. Produkce léčiv a vakcín. Genové terapie, genová vylepšení, prodloužení věku. Produkce chemických sloučenin, enzymů a nových materiálů, produkce energie a paliv. Ekosystém GM plodiny Redukce používání pesticidů, herbicidů a hnojiv v zemědělství, šetrnější hospodaření s půdou, zachycení skleníkových plynů. GM rostliny Fytoremediace oblastí kontaminovanými toxickými organickými látkami, těžkými kovy, radioizotopy.

Pěstování GM plodin ve světě

M Acres Global Adoption Rates (%) for Principal GM Crops (Million Hectares) 2007 396 346 297 160 140 120 standard GM crops 148 247 100 91 198 80 148 60 99 40 35 27 49 20 0 0 64% 43% 24% 20% Soybean Cotton Maize Canola Source: Clive James, 2008

GM Crop Countries and Mega-Countries, 2007

Problémy spojené s pěstováním GM plodin Nedůvěra a neznalost lidí hraničící až s ekoterorismem Nejsou dlouhodobé studie na lidské zdraví ale u většiny pěstovaných GM plodin není předpoklad pro ohrožení zdraví obyvatel Přenos transgenů na jiné druhy ošetřováno agronomickými postupy a monitoringem Selekčním markerem rezistence k antibiotikům - odstraněno Bt rezistentní škůdci možnost refugií pro škůdce

Socio-ekonomické problémy globální producenti osiva a postřiků (např. Monsanto), závislost zemědělců na několika firmách, malý počet odrůd, nemožnost produkce vlastního osiva a jeho cena v rozvojových zemích; patentování genů

Klady pěstování GM plodin Technologie může přinést zajímavé vlastnosti plodin Není náhodnost vzniku dobrých šlechtitelských vlastností jako u mutačního šlechtění Může být záchranou při velkých klimatických změnách na planetě tolerance k suchu, zvýšené salinitě půdy apod. Může v budoucnu nakrmit lidstvo Potraviny z GMO obsahují méně pesticidů Má pozitivní dopad na přírodu a půdu

Detekce transgenů Samples Sampling Tested Samples Saved Samples Protein Detection Methods Nucleic Acids Detection Methods ELISA Lateral Flow Strip DNA Extraction Conventional PCR Negative No GM contents Positive Contained GM contents Quantitative PCR GM Contents (xx%)

Vzorky Detekce úspěšnosti transgenóze Detekce transgenů ve šlechtitelském materiálu Monitoring transgenů v odrůdách Monitoring transgenů v životním prostředí Monitoring transgenů v potravinách

Detekce proteinů - Detekce proteinových produktů transgenů metodou ELISA (enzyme Linked immunosorbent assay) - např. Cry (Bt) proteiny

- Detekce proteinů na papírku

Histochemická detekce markerů GUS, GFP - Reportérový gen uida (β-glucuronidase, GUS) - Exprese GFP (green fluorescent protein) v transformovaném protoplastu

Southern blot detekce - Detekce transgenu a počtu jeho kopií v genomu Genomická DNA štípaná nukleázou, např. EcoR1 Elektroforéza na agarózovém gelu Přenos DNA na membránu Hybridizace se specifickou DIG značenou próbou Chemiluminiscenční reakce na membráně Zachycení signálu na film a jeho vyvolání

Molekulární detekce části konstruktu (T-DNA) - Klasická PCR s primery specifickými na promotory např. PCaMV35S, transgen, selekční markery.

Levels of specificity GM targets (DNA) enomic DNA promoter intron gene terminator plant genomic D Screening targets LOW Gene specific targets Construct specific Event specific targets Arne HA et al., Euro Food Res Tech, 2007 HIGH

CaMV35s promoter Anti- EFE NOS terminator A EcoR I 195bp PCaMV35S Hin d III B C 180bp Nos Terminator 153bp Huafan construct specific fragment

- Optimalizace specificity a citlivosti PCR

- kompetiční PCR

- Kvantitativní PCR - Nutný standart a kalibrační křivka

Princip qpcr

Tomato seeds Ketchup tomato juice

DNA Microarray Total: 46 genes 31 inserted genes e.g. EPSPS 7 reference genes 8 event-specific genes e.g. Roundup Ready Soybean e.g. lectin - detekce, identifikace kvantifikace velkého množství transgenů

Princip microarrays

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

Vizualizace produktu zákalem pyrofosfátu hořčíku, Fluorescencí (SYBR Green), calceinem

2. Plevele Definice pojmu plevel Nejstarší definice pojmu plevel z roku 1795 zní: Slovem plevel rozumí zemědělec ony rostliny, které na újmu jím úmyslně pěstovaným, užitečným, zkroceným proti jeho a bez jeho námahy na polích divoce rostou, bují a do polí se šíří a dobrým rostlinám potravu odnímají a jejichž vyhubení mu způsobuje mnohé obtíže práce a výlohy. (Mehler, 1795) Základem současného pojetí plevelů a asi nejvýstižnější definicí je : Plevelem je každá rostlina, která se vyskytuje na poli proti vůli pěstitelově vedle určité pěstované plodiny. (Hron&Vodák, 1959) Za plevele je označováno až 250 tisíc druhů rostlin, tedy asi 3% druhů.

Biologie plevelů Schopnost klíčit za širokého rozpětí podmínek prostředí (světlo, teplota, roční období) a v průběhu delšího období semenná banka v půdě Rychlý růst Rychlý přechod do generativní fáze Vysoká konkurenceschopnost negativní interakce s plodinou Průběžné dozrávání, vysoká a dlouhá produkce semen Široká tolerance k ekologickým podmínkám Šíření na krátké i delší vzdálenosti U vytrvalých vegetativní šíření a vysoká regenerace z malých fragmentů, odolnost proti mechanickému odstraňování Jednoleté, dvouleté, vytrvalé Šíření autochorie (formou např. barochorie), anemochorie (větrem), zoochorie (epi- na srsti (svízel), endo- např. myrmekochorie (violky, bažanky, pryšce)), antropochorie záměrný výsev, osivem, dopravou, zemědělskou mechanizací

Negativní vztah s plodinou Kompetice je soutěž rostlin o využívání stejných zdrojů např. zdroj energie, půdní vlhkosti. (Kohout et al., 1996) Dochází k ní, když v určitém prostoru roste více jedinců než je zdrojů pro jejich výživu. Například ozimá řepka je ze začátku vývoje velmi citlivá na zaplevelení, protože její prvotní vývoj je oproti vývoji plevelů pomalý. Parazitismus je vztah mezi hostitelskou rostlinou a parazitem, který odebírá hostiteli látky potřebné pro jeho výživu (vodu, živiny ). Jako příklad můžeme uvést rod kokotice (Cuscuta), který je tzv. pravým parazitem, zcela závislým na hostitelské rostlině. Zárazy (Orobanche) napadjí pouze podzemní orgány, napojují se na vodivá pletiva. Z čeledi krtičníkovitých například černýš rolní (Melampyrum arvense), který je poloparazitickým plevelem, majícím schopnost fotosyntézy. (Jursík et al., 2011a) Aleopatie je specifický vliv jednoho druhu (donora) na klíčení, růst a vývoj druhého druhu (recipienta). (Kohout et al., 1996) Donor neboli inhibitor uvolňuje do prostředí látky, které brání růstu recipienta neboli akceptora. Jako příklad inhibitora můžeme uvést pýr plazivý (Elytrigia repens). (Jursík et al., 2011a)

Formy škodlivosti plevelů z hlediska zemědělce Snížení kvality produkce - odebírání půdní vláhy pěstovaným plodinám - ochuzování pěstovaných plodin o živiny - zastiňování a potlačování pěstovaných plodin, brzdění jejich vývoje - snižování produktivity práce - snížení výnosu sklizně - náklady na chemické ošetření a mechanizaci - znehodnocení zemědělských výrobků - zhoršují jakost semen či hlíz u některých plodin - zvyšují náklady na sklizeň, posklizňovou úpravu a pěstování - mohou parazitovat Hostitelství chorob a škůdců - působí jako hostitelské rostliny a přenašeči patogenů např. nádorovka kapustová - poskytují útočiště škůdcům a parazitům Zdravotní rizika - ohrožování zdraví člověka - mohou způsobovat alergie (pelyněk, ambrózie, bolševník), nebo být toxické (durman, blín, lilek) - plevele mohou způsobit otravy hospodářského zvířectva - působí obtíže dobytku mechanickým zraňováním

Užitečnost plevelů - při zaorávání jsou cenným humusotvorným materiálem - mohou chránit půdu před erozí vodní a větrnou; před výparem v době sucha - poskytují pastvu včelám (chrpy, hluchavky, rozrazily, ) - slouží jako zdroj potravy pro hospodářská zvířata i zvěř (ta má zažívací problémy v monokulturách) - jsou vhodné pro výživu lidí - v minulosti v dobách neúrody i zdroj potravy pro člověka (laskavce, merlíky, ježatka semena i saláty, dnes dostání v bio obchodech, hlízy hrachoru hlíznatého) - léčivé bylinky (pampelišky, zemědým, kostival, heřmánek, kopřiva, přeslička rolní, jitrocel) - přispívají k udržení biodiverzity a mají ekologickou funkci - i regulace patogenů a pokud se vyskytují v malé míře i zvýšení výnosů (koukol v žitě) - mohou poskytovat: technický olej, kaučuk, barviva - okrasné rostliny bytel (Kochia)

Dlouhodobé změny výskytu plevelů v ČR a jejich regulace Archeofyty - Ihned se vznikem zemědělství před cca 7,5 tis. Lety doprovázejí plodiny plevele merlíky, sveřepy, bér, svízel, ježatka, rdesna, koukol, kokoška, zemědým, - V době bronzové oves hluchý, chrpa, bažanka, lopuchy - V době železné hluchavka objímavá, úhorník - Ve středověku heřmánkovec, mléč rolní, locika kompasová Neofyty - Ze s. Ameriky a z Asie - 1750 turanka kanadská - 1809 durman obecný - 1818 laskavec ohnutý - 1851 heřmánkovec terčolistý - pol. 20. stol. Pěťour - Ústup plevelů se změnou pěstovaných plodin - Změny vyvolané změnou agronomických postupů a používání herbicidů

Bažanka roční Mercurialis annua L. - Dvoudomá rostlina - V minulosti pěstována jako léčivka - Původem ze Středomoří, dnes plevel v celé Evropě a S. Americe - Objevuje se od dubna - Okopaniny, zeleniny, kukuřice Jursík et al., 2011

Bolehlav plamatý Conium maculatum L. - Jedna z nejjedovatějších rostlin - Ze Středozemí a západní Asie - Zavlečen do Ameriky a na Nový Zéland - Lemové společenstva polí - Ozimá řepka, cukrovka, slunečnice, luskoviny Jursík et al., 2011

Bršlice kozí noha Aegopodium podagraria L. - Velmi intenzivní vegetativní rozmnožování oddenky - Vytváří až monokulturní porosty - Vysoce odolná vůči většině herbicidů díky husté síti podzemních orgánů - Okrasné výsadby, sady, trvalky - Opakování postřiků neselektivních herbicidů (Agritox, Lontrel, Tomigan, Starane, Amin Jursík et al., 2011

Durman obecný Datura stramonium L. - Silně jedovatý, halucinogenní - V teplejších oblastech, nově expanduje - Kukuřice, cukrovka, rumiště Jursík et al., 2011

Ježatka kuří noha Echinochloa crus-galli L. - Kosmopolitní rozšíření - Vysoká produkce semen až tisíce z jedné rostliny - kukuřice, brambory, cukrovka Jursík et al., 2011 - Důležité střídání plodin

Kopřiva žahavka Urtica urens L. Jursík et al., 2011 - Časný jarní plevel - Poranění popáleniny na kůži velmi bolestivé - Obtížný plevel zelenin - Komplikuje ruční sklizeň - Ničí ji zasetí obilovin střídání plodin

Lilek černý Solanum nigrum L. - Primárně z jižní Evropy - Teplomilný - Jedovatý - Okopaniny, zeleniny, kukuřice, ruderální stanoviště Jursík et al., 2011

Merlík bílý Chenopodium album L. - Dnes rozšířen po celém světě, původně z v. Evropy - Jeden z deseti nej plevelů světa - Produkce velkého množství semen i přes 100 tisíc z jedné rostliny - světlomilný - Okopaniny, obiloviny, rumiště Jursík et al., 2011

Pampelišky (Taraxacum), sekce Ruderalia - Dříve smetánky - Velký počet druhů, prý až 250, ale je zbytečné je rozlišovat - Léčivka - Domácí v Evropě a Asii, zavlečena do S. Ameriky a Austrálie - Partenogeneze - Silné vegetativní rozmnožování - Odolná proti mrazu - Víceleté pícniny, pastviny, trávníky a okrasné výsadby - Regulace hlavně podzimní orba, růstové herbicidy clopyralid, 2,4-D Jursík et al., 2011

Chundelka metlice Apera spica-venti L. - Z v. Evropy a z. Asie - Dnes značná část Evropy, s. Afrika, S. Amerika a Nový Zéland - Produkce velkého množství obilek - Obiloviny, okopaniny, ozimá řepka - Brání ukládání asimilátů do zrna - Dozrávání semen vždy před obilninou

Turanka kanadská Conyza canadensis L. - Ze S. Ameriky, u nás od roku 1750 - Železnice, silnice, rumiště, lemová společenstva, uplatnění na polích hlavně v USA - Vznik rezistence na glyfosát z důvodu pěstování herbicid rezistentních GM plodin (sój Jursík et al., 2011

Herbicidní regulace plevelů Zhruba od 50. let 20. století se k regulaci plevelů používají herbicidy, sloučeniny s fytotoxickými účinky. Ve vývoji herbicidů hrála roli 2. světová válka spolu s vývojem chemických zbraní - objevení syntetických auxinů. Narušením biochemických procesů v plevelné rostlině dochází k jejímu úhynu nebo poškození. Herbicidy se vyskytují ve formě kapaliny, prášků nebo granulí. V ČR najdeme široký výběr herbicidů, každoročně dochází k řadě změn. Proces vývoje herbicidu, ověření účinnosti a zavedení na trh je velmi zdlouhavý a nákladný. Celosvětově najdeme 8-10 výrobců. Výhodou je nenáročnost lidské práce a nízké náklady. Kombinace s GM plodinami. Na druhou stranu jejich používání je spojeno s množstvím negativních vlivů. Mohou způsobit poškození kulturní plodiny, mít negativní vliv na obsluhu postřikovačů a ostatních strojů, zatěžují životní prostředí. Mohou zamořovat podzemní či povrchové vody, nebo být obsaženy ve vypěstovaných potravinách. Dalším problémem je chronická toxicita pro člověka a teplokrevná zvířata, ničení nebo Parametry oslabení nových přirozených herbicidů: konkurentů škodlivých činitelů (dravců, škůdců), či vznik - Vysoká rezistentních selektivita populací. k plodině - Vysoká a rychlá účinnost - Levná syntéza a dostupná cena - Rychlá a bezpečná degradace v prostředí, nízká toxicita pro člověka a zvířata

Mechanismy působení herbicidů 1. Inhibitory fotosyntézy 2. Inhibitory biosyntézy rostlinných pigmentů chlorofylu a karotenoidů 3. Inhibitory syntézy aminokyselin např. EPSP glyfosát, ALS inhibitory sulfonylmočoviny 4. Inhibitory syntézy lipidů inhibitory ACCasy (graminicidy) 5. Růstové herbicidy syntetické auxiny 2,4 -D Absorp tion Conta ct Movem ent Toxicity

60 let působení herbicidů plevele reagují a vyvíjejí se evoluce v přímém přenosu!

www.weedscience.org

Jak rezistence k herbicidům vzniká? Jedním z hlavních mechanismů vzniku rezistence je mutace změna v genetické inform změna v DNA

Analýza, detekce herbicid rezistentních plevelů

Pokusná aplikace herbicidů na rostliny chundelky metlice ve skleníkových podmínkách

Genetická analýza genu ALS chundelky metlice - Detekce mutace způsobující rezistenci na ALS inhibitory - Změny v sekvenci aminokyselin proteinu v aktivním místě Pro19 7

TaqMan real-time PCR

TaqMan SNP genotyping

www.weedscience.or g

Mapa zjištěných rezistencí Ch. metlice k ALS inhibitorům? D. Massa, 2011

Lokality sběru chundelky metlice a procentuální zastoupení rezistentních jedinců 22 23 3 4 5 6 24 25 7 1 2 11 21 20 19 18 17 15 16 14 4 - lokalita bez rezistentních jedinců 2 - lokalita 1-25 % rezistentních jedinců 6 - lokalita 26-50 % rezistentních jedinců 3 - lokalita více než 50 % rez. jedinců

Genetická analýza genu ALS turanky kanadské

etekce rezistence na glyfosát postřikovými experimenty u turanky kanadské Olomouc-Holice Rezistentní populace turanky v USA

Hlavní zdroj informací k přednášce: Jursík et al. Plevele biologie a regulace. (2011) Kurent s.r.o., České Budějovice, 232 s.