Úvod k biochemickému praktiku Pavel Jirásek
Úvodní informace 4 praktika B1 B2 B3 B4 4 týdny 8 pracovních stolů rozdělení kruhu do 8 pracovních skupin (v každé 2-3 studenti)
Co s sebou na praktika plášť kalkulačku papír A4 na vypracování protokolu k úloze B1 milimetrový papír formátu A5 a vlastní moč znalosti
Pravidla bezpečnosti práce v laboratoři v celém znění na výuce
Práce s pipetou
Analýza vzorku kvalitativní složení vzorku kvantitativní množství jednotlivých složek ve vzorku
Jaké analytické metody budeme používat na praktikách? B1 Stanovení koncentrace kreatininu v moči pomocí spektrofotometrie B2 Chromatografie lipofilních barviv na tenké vrstvě (TLC) B3 Stanovení acidity žaludeční šťávy metodou titrace B4 Měření ph fosfátového pufru potenciometrií
Spektrofotometrie
Spektrofotometrie analytická metoda založená na interakci elektromagnetického záření se stanovovanou látkou měří se, kolik záření se absorbovalo, z toho lze vypočítat koncentraci dané látky (kvantitativní analýza) podle charakteru látky lze měřit ve viditelné, UV příp. infračervené části spektra
Proč jsou látky barevné? řada látek obsahuje valenční elektrony excitovatelné fotony viditelného světla (400-800 nm) látka tak dokáže pohltit určitou část světelného spektra, my pak vidíme barvu doplňkovou k pohlcené
Chemické vlastnosti barevných látek látky se systémem konjugovaných dvojných vazeb s asymetrickou molekulou - některé aromatické či heterocyklické struktury, azobarviva látky obsahující koordinačně-kovalentní vazby komplexní sloučeniny přechodných kovů CuSO 4 5H 2 O, hemoglobin, cytochromy ionty obsahující jako centrální atom přechodný kov s vysokým oxidačním číslem - MnO 4-, Cr 2 O 7 2-
Spektofotometr zdroj světla vhodná žárovka nebo výbojka monochromátor získáme světlo o žádané vlnové délce = monochromatické záření kyveta se vzorkem z různého materiálu - optické sklo (VS), křemenné sklo (UV) detektor měří množství světla, které prošlo vzorkem
Co spektrofotometr měří? transmitance - udává, kolik světla prošlo vzorkem T transmitance I intenzita světla, které prošlo vzorkem I 0 intenzita světla, které do vzorku vstoupilo (prošlo slepým vzorkem) slepý vzorek (blank) obsahuje všechny složky vyjma stanovované látky
Co spektrofotometr měří? absorbance udává, kolik světla bylo vzorkem pohlceno Lambert-Beerův zákon c molární koncentrace stanovované látky l délka absorpčního prostředí (kyvety) e molární absorpční koeficient (konstanta)
Kalibrační křivka k sestrojení kalibrační křivky se používají koncentrace standardních roztoků přímá úměra mezi A a c
Ředění ředěním se snižuje pouze koncentrace, samotné látkové množství stanovované látky se nemění ředění 5krát (příp. 1:5) znamená, že se původní koncentrace 5krát sníží k 1 dílu ředěného vzorku jsme přidali 4 díly rozpouštědla příklad: K 0,2 ml roztoku o koncentraci 40mg/l jsme přidali 0,3 ml vody. Jaká je koncentrace výsledného roztoku? 16 mg
Význam spektrofotometrie v medicíně stanovování mnoha látek přítomných v biologickém materiálu ionty - Ca 2+, Mg 2+, Fe 2+ /Fe 3+, HPO 4 2- /H 2 PO 4 - významné metabolity: urea, kreatinin, kyselina močová, cholesterol, glukóza, bilirubin
Chromatografie
Chromatografie metoda sloužící k separaci a analýze složitých směsí analýza kvalitativní i kvantitativní založena na rozdílné afinitě jednotlivých složek vzorku ke dvěma různým fázím stacionární a mobilní stacionární nepohyblivá pevná látka nebo film kapaliny zakotvený na pevné látce mobilní pohyblivá kapalina nebo plyn
Kapalinová chromatografie nejvýznamnější technika HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ) analyzuje se kapalný vzorek mobilní fáze prochází pod vysokým tlakem kolonou, která je naplněná stacionární fází na výstupu z kolony připojen detektor, kterým v různém čase prochází mobilní fáze spolu s jednotlivými složkami dělené směsi
Jak vypadá záznam z chromatografu? záznam = chromatogram tvořen soustavou píků (=odezvy detektoru), každý pík odpovídá jedné ze složek směsi poloha píku retenční čas čas od nástřiku vzorku k maximu zaznamenanému detektorem - určuje, o jakou látku se jedná kvalitativní analýza plocha nebo výška píku určuje koncentraci látky ve směsi kvantitativní analýza
Plynová chromatografie analyzují se hlavně těkavé látky, které lze snadno převést do plynné fáze mobilní fází je inertní plyn (neúčastní se separace), stacionární fází je pevný sorbent nebo tenký film kapaliny nanesený na inertní nosič na výstupu z kolony opět připojen detektor, záznam podobný jako u HPLC
Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) modifikace kapalinové chromatografie stacionární fází je silikagel nanesený v tenké vrstvě na hliníkové fólii mobilní fází je toluen toluen vzlíná podél desky a unáší s sebou jednotlivá barviva, ty mají různou afinitu k silikagelu (různě pevně se na něj adsorbují) vyhodnocení pomocí hodnoty retardačního faktoru a vzdálenost středu skvrny látky od startu b vzdálenost kam doputovala mobilní fáze
Význam chromatografie v medicíně kapalinová organické kyseliny, polyaromatické uhlovodíky, bílkoviny, sacharidy, vitamíny, léčiva, různé metabolity plynová alkoholy, nižší uhlovodíky, mastné kyseliny, PCB, těkavější metabolity
Titrace
Titrace kvantitativní analytická metoda založená na reakci stanovované látky s titračním (odměrným) činidlem odměrné činidlo o známé koncentraci zreaguje beze zbytku s přesně daným množstvím stanovovaného roztoku o neznámé koncentraci (bod ekvivalence detekce vhodným indikátorem) z objemu použitého titračního činidla lze dopočítat koncentraci stanovovaného roztoku x, y stechiometrické koeficienty n = c. V pokud titrační činidlo není chemicky stálé, vzít v úvahu faktor odměrného roztoku (stanovuje se titrací na standard, který se chemicky nemění např. kyselina šťavelová)
Druhy titrací neutralizační reakce kyseliny a zásady, bod ekvivalence se stanovuje pomocí acidobazických indikátorů (fenolftalein, methylová oranž atd.) oxidačně-redukční dochází k přenosu elektronů mezi oxidačním a redukčním činidlem, bod ekvivalence - oxidačně-redukčních indikátory (methylenová modř, difenylamin), příp. může být indikátorem samo titrační činidlo (případ KMnO 4 manganometrie) komplexotvorné tvorba málo disociovaných, ale ve vodě rozpustných kovových komplexů srážecí vznik nerozpustné sraženiny
Průběh titrace (titrační křivka) neutralizační titrace A titrace silné kyseliny silnou zásadou B titrace slabé kyseliny silnou zásadou C titrace velmi slabé kyseliny silnou zásadou (nepoužívá se)
Potenciometrie
Potenciometrie elektrochemická metoda založená na bezproudém měření potenciálového rozdílu mezi indikační a referentní elektrodou ponořených do analyzovaného roztoku potenciál indikační elektrody závisí na aktivitě (u zředěných roztoků a=c) stanovované látky v roztoku v praktiku budeme stanovovat koncentraci H + pomocí skleněné elektrody (z ní přístroj dopočte ph) k stanovení účinnosti fosfátového pufru druh iontově selektivní elektrody (ISE)
Pufr konjugovaný pár kyseliny a zásady (liší se o H + ) schopný v určitém rozmezí (dáno jeho pufrační kapacitou) udržovat stabilní ph i po přidání silné kyseliny nebo zásady do systému směs slabé kyseliny a její soli směs slabé zásady a její soli směs dvou solí vícesytné kyseliny amfoterní látky (více funkčních skupin) - proteiny pufrační kapacita závisí na koncentraci pufru a na jeho složení pk a = -logk a (K a disociační konstanta kyseliny) pk b = -logk b (K b disociační konstanta zásady) c aktuální koncentrace c koncentrace před smícháním
v jednom těle s referentní (většinou argentochloridovou) elektrodou speciální membrána ze sodnovápenatého skla propustná pro H + výměna sodných iontů z krystalové mřížky skla za vodíkové ionty z roztoku Skleněná elektroda
Otázky na procvičení Absorbance je nepřímo úměrná koncentraci NE Retenční čas se v chromatografii používá ke kvantitativnímu vyhodnocení chromatogramu NE Potenciál indikační (měřící) elektrody, používané v potenciometrii, závisí na množství analyzované látky v roztoku ANO